CN111394374A - 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新颖的编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691，该基因是从珊瑚体内共生微生物宏基因中克隆而得，其具有序列表SEQ ID NO.1的核苷酸序列，并提供了所述编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶GK2691的氨基酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示。同时本发明还提供了含有上述基因的表达载体，以及由所述表达载体转化的宿主细胞。应用本发明的纤维素酶基因gk2691编码的纤维素酶在纤维素的降解中具有广泛的用途。

Description

一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用。

背景技术

纤维素是世界上最多的可再生能源，每年由植物体光合作用生成的生物质高达1500亿吨，但是因为纤维素结构复杂，有很大部分不能直接利用，所以需要纤维素酶降解作用。纤维素是以葡萄糖为单元通过β-1,4-糖苷键连接而成的大分子。纤维素酶是能将纤维素降解并最终转化成葡萄糖的一类酶的总称，包括内切纤维素酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，简称 EG）；外切纤维素酶（exo-1,4-β-D-glucanase ，EC3.2.1.91，简称 CBH）；β-葡糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称 BG）。纤维素酶的作用是纤维素酶解的最后一步，通过作用于纤维二糖，将其水解成葡萄糖，葡萄糖可成为人类的各种化工生产的重要原料。然而纤维素酶系的中多数糖苷酶含量少、活性低，成为纤维素酶解的瓶颈。因此通过构建工程菌异源表达酶活性高的纤维素酶对于工业生产具有重要的意义。研究发现，珊瑚中含有丰富的纤维素酶类，该类纤维素酶能帮助珊瑚防御并入侵藻类，降解藻类以及分解纤维素来给珊瑚提供生长发育所需要的营养物质。

获取纤维素酶的方法是从纯培养的细菌微生物中筛选出高产纤维素酶的菌株，通过高通量测序获得功能基因，然后进行克隆最后诱导获得纯酶。珊瑚体内有丰富的纤维素酶，因为珊瑚体内有共生虫黄藻，珊瑚需要降解体内凋亡的虫黄藻，所以体内有丰富的纤维素酶，而且种类与功能与陆地上的纤维素酶有很大的差别。通过高通量测序，可以从中筛选到新颖的性质优良的纤维素酶基因。

本实验通过高通量测序，获得了新的编码纤维素酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产纤维素酶，用于纤维素的降解。

发明内容

本发明提供的编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691，具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

所述基因序列SEQ ID NO.1是从珊瑚共生微生物高通量测序中获得，命名为gk2691。该基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，总共由1500个碱基组成。经过对其进行分析，在去除序列首端的起始密码子和末端的终止密码子后，找到该基因内含的最大开放阅读框为自N端的第3～1494位碱基，将其转换成氨基酸序列后检索GenBank数据库得知其属于β-葡萄糖苷酶家族，与Puniceicoccales bacterium有最高一致性，一致性为61%，从而确定本发明的基因mg2691具有编码β-葡萄糖苷酶的开发价值。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1的功能等同变异体，均属于本发明保护范围之列。所述核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的核苷酸序列。此核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括缺失变异体、无义变异体、***变异体和错义变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的缺失、无义、***、错义，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

同时，本发明还提供了上述纤维素酶基因gk2691编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该蛋白质是纤维素酶基因gk2691编码的纤维素酶，命名为GK2691，其由499个氨基酸组成。GK2691与其它内切葡聚糖酶具有一定的相似性。

同时，本发明还提供一种含有上述纤维素酶基因gk2691的表达载体。

同时，本发明还提供一种宿主细胞，其含有上述表达载体转化的原核细胞和真核细胞。

同时，本发明还提供上述纤维素酶基因gk2691在制备纤维素酶GK2691中的应用。具体的所述的应用为：构建含纤维素酶基因gk2691的重组载体，将所述重组载体转化至宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组纤维素酶液。

同时，本发明还提供上述纤维素酶在纤维素降解中的应用。具体所述的应用为：利用上述重组基因工程菌经培养后制备纤维素酶GK2691酶解液，然后利用纤维素酶GK2691酶解液处理纤维素原料。

本发明的有益效果：

本发明的编码纤维素酶基因来自珊瑚，原料取材简单，该基因可以在宿主细胞中大量表达生产纤维素酶，增加了纤维素酶的获得途径和产量，为纤维素的降解提供了新的降解酶，提高了纤维素的降解效率，从而使纤维素得到有效的利用。

附图说明

图1为七叶苷平板功能筛选图，从原始菌株中筛选出来单一菌落后分别接种到七叶苷平板上，黑斑为纤维素酶功能的菌落，纤维素酶可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

图2为设计引物的PCR扩增产物电泳图，图中M0为2000bp的MAKER，G1和G2是扩增出来的gk2691，大小为1500bp。

图3为纯化后的GK2691酶的聚丙烯酰胺电泳图，图中M0为蛋白Maker；t1为未纯化蛋白；纯化蛋白分别为t2：80kDa、t3:80kDa、t4:80kDa、t5:80kDa。

图4为GK2691酶对致病菌v545的作用图，通过染色剂对v545染色；图中横坐标为k1:空白对照；t1：GK2691实验组；纵坐标：OD350吸光度。

图5为GK2691酶对温度的响应；图中横坐标为温度梯度10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；纵坐标为GK2691酶的酶活性大小，以最高酶活100%为对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例使用的珊瑚活体样本采自西沙群岛。

实施例1：纤维素酶基因gk2691的获取

（1）称取25g珊瑚活体样本，放置于50mL无菌离心管中，加入20mL无菌海水，漩涡震荡5～10min，使珊瑚组织完全充分分散于海水中；然后将震荡后的海水稀释100倍后涂布2216E平板，在室温下培养24h，长出单菌落；

（2）将单菌落在七叶苷平板中进行筛选，使培养基变为黑色的即为有功能的菌落；选取有功能的菌落在2216E平板上纯化，纯化后有功能菌落移至MA培养基继续纯化，最后用DNA试剂盒提取功能细菌的DNA，并进行高通量测序，得到纤维素酶基因gk2691；

如图1所示，为七叶苷平板功能筛选图，从单菌株中筛选出来单一菌落后分别接种到七叶苷平板上，黑斑为有纤维素酶功能的菌落，纤维素酶可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

实施例2：纤维素酶基因gk2691的克隆和表达。

将经过高通量测序的得到的基因进行NCBI比对，得到纤维素酶氨基酸序列（SEQID NO.2），比对氨基酸序列无误，即为目的基因，然后对其进行引物设计。

用上游引物gk2691F:GGCGGAATTATGAAAATGACCTCTCTCATGGCGTTATC，下游引物gk2691R:GCCGAAGCTTAGGGTGGCTAATTACAACTGTCTGTAACG，以高通量测序基因作为模板PCR扩增纤维素酶基因gk2691，再用限制性内切酶EcoRⅠ和hind酶切扩增产物，与经相同内切酶酶切的pET-22b表达载体进行连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上筛选阳性克隆，进一步提取质粒DNA，双酶切验证正确后命名重组质粒为pET-gk2691。将质粒pET-gk2691转化至大肠杆菌BL21或DE3中，转化子用IPTG诱导后，在平板上能降解羧甲基纤维素，而含有空载体的大肠杆菌转化子则不能降解羧甲基纤维素。

具体步骤如下：

（1）目的基因的PCR扩增

NCBI比对得出完整ORF序列，在ORF序列上进行引物设计，PCR目的基因扩增，胶回收纯化、酶切，用pET-22b做载体进行克隆，软件完成引物设计，其中包括酶切位点和保护碱基，得到pcr扩增的目的基因G1和G2，G1和G2的电泳图见图2。

（2）连接目的基因

将酶切完成的质粒和目的基因进行胶回收纯化，回收完的目的基因要进行试剂盒纯化，其中质粒浓度为100～200ng/μL最益，基因片段浓度不低于50ng/μL。

连接体系如下：

DDH₂O 2μL

T4 1μL

BUFFER 2μL

质粒 3μL

目的基因 2μL

Total 10μL

质粒与目的基因的比例按照定量后的浓度计算，如果质粒浓度与基因片段浓度比超过3:1，则体系中质粒与基因的体积比为2:3。（列如：质粒浓度：200ng/μL,基因片段浓度80ng/μL，则质粒比基因=2:3）

v1/v2=c1*3*M1/c2*1*M2

式中：V1:质粒；v2:基因；M1:质粒质量；M2:基因质量。

T4为高效连接酶，26℃连接30～60min即可得到连接产物。

（3）转化

3.1：准备冰盒冰浴，42℃水浴锅，超净工作台紫外打开。

3.2：将感受态细胞（克隆trans5ａ或者trans1-T1）于冰浴中，取四支1.5ml的离心管于冰浴中预冷，5分钟后待感受态溶解，100μL的感受态分为4管使用，10μL的连接产物只需要50ul的感受态。

3.3：加入10μL的连接产物，手指轻弹，做标记，冰浴冰封30min，期间不能移动。然后后水浴42℃热激1min，再冰浴3min，再在超净工作台加入新鲜的LB培养基400mL，摇床37℃，160r/min培养1h。

3.4：取amp-lb平板于工作台内晾干，将预培养的感受态细胞在4200r/m下离心45s后收集，弃上清200μL，然后用枪头混匀，涂布到AMP-lb平板，做好标记，37℃培养16h。

3.5：将1μL的质粒全部转化到50μL的DE3感受态细胞中，涂布到amp-lb平板，培养24h，然后将菌落进行pcr检验。

（4）IPTG诱导

将检验转化成功的DE3细胞用10毫升amp-lb培养10h作为种子液保存，取其中1mL甘油管保存；一级种子液培养好后，按照1%的接种量接种到200mL的amp-lb培养基中37℃培养5～6h，OD约为0.5左右，加入1mL的IPTG（IPTG终工作浓度为0.1mM～1mM），20℃～22℃摇床培养12h，不超过16h。

实施例3：纤维素酶GK2691的制备。

将培养12h的诱导后菌体在8000r下收集完，用PBS缓冲液清洗三次，最后加入15～20mL的PBS缓冲液将菌体混匀，冰浴中用超声波破胞仪破胞，（功率为23%，工作时间：20min）。然后在4℃、8000r下离心15min，收集上清，得到粗酶液。最后用底物检测粗酶酶活，将粗酶液通过氯化镍纯化柱纯化后得到纯酶，在通货脱盐柱进行脱盐，得到最终产物纤维素酶GK2691，最后进行聚丙烯酰胺电泳验证，结果见图3。

纤维素酶GK2691对致病菌的作用分析，包括以下步骤：

收集培养至对数期的v545致病菌菌体，加入脱盐后的GK2691进行30℃三个小时反应后染色，发现GK2691作用过后v545细胞壁变薄（见图4），说明GK269不仅是一种新的纤维素酶还对致病菌有特殊的作用，酶活力大约为52U/mg，GK2691是中温酶9，具体见图5，具有很高的利用和开发价值。

实施例4：应用实施例4制备的纤维素酶GK2691粗酶液降解纤维素。

1、收集虫黄藻：用洗牙器将珊瑚上的共生虫黄藻冲洗下来，用梯度离心法收集虫黄藻，约收集800 mL 的冲洗液，先于500 r/min下 离心2 min去除珊瑚碎片以及细沙沉淀等杂质，再于800 r/min下离心2 min去除上清液珊瑚粘液，用50 mL离心管收集完后加入pH为7.0的PBS缓冲液5 mL，洗涤两次，得到虫黄藻。

2、虫黄藻预处理：在洗涤完成的虫黄藻中加入1 mL PBS缓冲液稀释混匀，再加入DNA提取试剂盒中的蛋白裂解酶1µL后快速混匀，静止5 min然后在800 r/min下离心2 min，去上清液，再用10 mL PBS缓冲液清洗2次去上清液，得到预处理虫黄藻。

3、降解反应：将预处理虫黄藻用10 mL PBS稀释混匀并均分为10份，1000 r/min离心2 min，去上清液，加入80 µL的PBS溶液稀释后加入再20 µL的GK2691粗酶液，在37℃下反应1小时后于12000 r/min离心2min，取上清液加入100 µL DNS，100℃水浴加热5min后用分光光度计在520 nm处测定吸光度；对照组取20 µL纤维素酶粗酶液加80 µL PBS溶液同样处理后在520 nm处测定吸光度。

4、葡萄糖标注曲线的制作：取9支试管，按表1加入1.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水，混合均匀后在废水中加热5min，取出后用冷水冷却至室温，再向每个试管中加入21.5ml蒸馏水，混合均匀后，用分光光度计在520nm出测量吸光度；然后以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

表1

测试结果：葡萄糖标准曲线为y＝0.989x；R²＝0.992。

将样品组和对照组测得的吸光度代入葡萄糖标准曲线，计算出葡萄糖含量x。

最终计算得到样品组和对照组的酶解后的葡萄糖含量（平均值）分别为15.23mg和14.68mg。

由上述数据可知，本发明的纤维素酶基因gk169制备的纤维素酶GK2691具有纤维素降解能力，相比于普通的纤维素酶，酶活力高出4.2%。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> gk2691

<400> 1

atgatgaaaa tgacctctct catggcgtta tcggcgtcag tcttaattgg ccctgctagc 60

gcagttgcat ccttcgaaat tttccagaca tctcgtcaag gcgatcgctt ggacaaagta 120

gatgcggagg caaccggccc ttctacctac acactgacgt tgaatcctga aaaaacctat 180

cagacgctgg ttggtatcgg tggctctttt acggagtctg ggggccaggt tctcagcgaa 240

ctttccaaga cgaagcgtga gcttgcgctg cgaagttatt tctcgccagc tggcgctcat 300

tacacgctca cgcgtactca cattgcaagc agtgactttt ctgtaaccaa ctacacctat 360

gcgccggttc cgggagacaa cgaattggcg catttctcaa tcgatccgga ccgcaaatat 420

ttgttgccca tgatcaagga ggcgcaggga attgcaggcg cggaatttag tattctctcg 480

tcgccatgga cgccaccgcc ttggatgaaa actaacaatg attggaatgg aggtcatctt 540

aagcgtgagc attatcagac attcgccgat tatattgtta agtacattaa ggcatatgaa 600

gctgagggaa tccccatctg gggcatcacg ccggctaatg aaccactggg caatggttcg 660

aattgggaga gtgttcattt ttctgctcag gagatgagtg aatacattgg ggactacctt 720

gggcccgtac tcgaaaagca cgcgccggcc gtcaaaatat gggcctacga tcaaaaccgc 780

ggccatcacc ttgtcgagtg ggcggaggcg attctgggca attcgaagtc ggccaagtat 840

gtcgaaggta tggcgatcca ttggtaccaa agtacagtcg acattgacgc agagtcgttg 900

gacaaagtgc atgaggaatt tccgaacaaa cagattttgc attccgaagg atgcattgac 960

gccataggag acgatgaaga aattggtgtc tggctggaag acgattggta ttggcgtgct 1020

gaagcgactg attggggcta cacttgggct gctgacgaaa ataaggtgca ccatcccaag 1080

tatcgtccgt tttaccgcta tgctcgcgac ttgattggcg gctttaatca ccaccttgtt 1140

ggctgggttg attggaatat gtttctcaac actcgtggcg gcccaaatca tgcgcgcaat 1200

tattgtttag ccccaattct ggtggatagt ggaaaggatg agttctaccg tactcccttg 1260

ttctatgcag tggcccattt cagtcgctac atgcgtcccg gtgccaagcg cattgatttg 1320

accggccatg accagttttt aatggcgact gctttcaaga atcctgatga ttcaattgcc 1380

gttgctgtgt ttaacacgtc tgaagagagt attaactacg agttgaaaat gggtgctagt 1440

caaaagttgt gttcgatccc cggtcaggcg ttacagacag ttgtaattag ccacccttaa 1500

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> GK2691

<400> 2

Met Met Lys Met Thr Ser Leu Met Ala Leu Ser Ala Ser Val Leu Ile

1 5 10 15

Gly Pro Ala Ser Ala Val Ala Ser Phe Glu Ile Phe Gln Thr Ser Arg

20 25 30

Gln Gly Asp Arg Leu Asp Lys Val Asp Ala Glu Ala Thr Gly Pro Ser

35 40 45

Thr Tyr Thr Leu Thr Leu Asn Pro Glu Lys Thr Tyr Gln Thr Leu Val

50 55 60

Gly Ile Gly Gly Ser Phe Thr Glu Ser Gly Gly Gln Val Leu Ser Glu

65 70 75 80

Leu Ser Lys Thr Lys Arg Glu Leu Ala Leu Arg Ser Tyr Phe Ser Pro

85 90 95

Ala Gly Ala His Tyr Thr Leu Thr Arg Thr His Ile Ala Ser Ser Asp

100 105 110

Phe Ser Val Thr Asn Tyr Thr Tyr Ala Pro Val Pro Gly Asp Asn Gly

115 120 125

Leu Ala His Phe Ser Ile Asp Pro Asp Arg Lys Tyr Leu Leu Pro Met

130 135 140

Ile Lys Glu Ala Gln Gly Ile Ala Gly Ala Glu Phe Ser Ile Leu Ser

145 150 155 160

Ser Pro Trp Thr Pro Pro Pro Trp Met Lys Thr Asn Asn Asp Trp Asn

165 170 175

Gly Gly His Leu Lys Arg Glu His Tyr Gln Thr Phe Ala Asp Tyr Ile

180 185 190

Val Lys Tyr Ile Lys Ala Tyr Glu Ala Glu Gly Ile Pro Ile Trp Gly

195 200 205

Ile Thr Pro Ala Asn Glu Pro Leu Gly Asn Gly Ser Asn Trp Glu Ser

210 215 220

Val His Phe Ser Ala Gln Glu Met Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Tyr Leu

225 230 235 240

Gly Pro Val Leu Glu Lys His Ala Pro Ala Val Lys Ile Trp Ala Tyr

245 250 255

Asp Gln Asn Arg Gly His His Leu Val Glu Trp Ala Glu Ala Ile Leu

260 265 270

Gly Asn Ser Lys Ser Ala Lys Tyr Val Glu Gly Met Ala Ile His Trp

275 280 285

Tyr Gln Ser Thr Val Asp Ile Asp Ala Glu Ser Leu Asp Lys Val His

290 295 300

Glu Glu Phe Pro Asn Lys Gln Ile Leu His Ser Glu Gly Cys Ile Asp

305 310 315 320

Ala Ile Gly Asp Asp Glu Gly Ile Gly Val Trp Leu Glu Asp Asp Trp

325 330 335

Tyr Trp Arg Ala Glu Ala Thr Asp Trp Gly Tyr Thr Trp Ala Ala Asp

340 345 350

Glu Asn Lys Val His His Pro Lys Tyr Arg Pro Phe Tyr Arg Tyr Ala

355 360 365

Arg Asp Leu Ile Gly Gly Phe Asn His His Leu Val Gly Trp Val Asp

370 375 380

Trp Asn Met Phe Leu Asn Thr Arg Gly Gly Pro Asn His Ala Arg Asn

385 390 395 400

Tyr Cys Leu Ala Pro Ile Leu Val Asp Ser Gly Lys Asp Glu Phe Tyr

405 410 415

Arg Thr Pro Leu Phe Tyr Ala Val Ala His Phe Ser Arg Tyr Met Arg

420 425 430

Pro Gly Ala Lys Arg Ile Asp Leu Thr Gly His Asp Gln Phe Leu Met

435 440 445

Ala Thr Ala Phe Lys Asn Pro Asp Asp Ser Ile Ala Val Ala Val Phe

450 455 460

Asn Thr Ser Glu Glu Ser Ile Asn Tyr Glu Leu Lys Met Gly Ala Ser

465 470 475 480

Gln Lys Leu Cys Ser Ile Pro Gly Gln Ala Leu Glu Thr Val Val Ile

485 490 495

Ser His Pro

Claims (6)

1. 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种如权利要求1所述的纤维素酶基因gk2691编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于：其含有权利要求1所述的纤维素酶基因gk2691。

4.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求4所述的表达载体转化的原核细胞和真核细胞。

5.一种如权利要求1所述的纤维素酶基因gk2691在制备纤维素酶GK2691中的应用。

6.一种如权利要求5所述的纤维素酶GK2691在纤维素降解中的应用。

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