CN102965316A - 含类细菌素与乳酸片球菌的饲料添加剂，预混料及配合料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）新菌株HT，以及含有芽孢杆菌类细菌素与乳酸片球菌的饲料添加剂。本发明的乳酸片球菌新菌株HT，其保藏号为CGMCC No.6500。将枯草芽孢杆菌CGMCC No.6511的类细菌素冻干粉和乳酸片球菌HT菌粉按照比例充分混合，得到饲料添加剂。该饲料添加剂是一种绿色饲料添加剂，提高饲料转化率，提高动物生产性能和免疫力，防治腹泻发生，发挥改善畜禽产品品质的作用。

Description

含类细菌素与乳酸片球菌的饲料添加剂,预混料及配合料

技术领域

本发明具体涉及一种含类细菌素与乳酸片球菌的饲料添加剂，预混料及配合料，属于微生物饲料添加剂领域。

背景技术

抗生素的不但解决了生长快与抗病力低之间的矛盾，而且给养殖业带来了巨大的经济效益，使得抗生素作为饲料添加剂普遍使用。然而，抗生素在饲料中的长期使用带来了诸多负面效应如药物残留、耐药和环境污染等，危害着人类健康。

随着食品安全问题在全球范围内得到越来越广泛的关注，畜牧生产中减少或停止使用抗生素的呼声越来越高，因此使用与抗生素功能相似但无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境的饲料添加剂原料成为一种必然趋势。

近年来，微生态制剂、酶制剂、中草药制剂和有机酸类添加剂的出现，对于解决这一问题起了很大的作用，但很多产品的使用并不理想，如：使用微生物饲料添加剂能起到补充或接种菌种的作用，但不能充分起到调动肠道内其它益生菌的作用；单独使用小肽等益生元添加剂功效比较单一，能够激活内源性的益生菌发挥作用，但是会缺少具有独特营养功能，刺激免疫和抗疾病能力的特殊菌种。总之，目前全价配合饲料并无法彻底摆脱对抗生素类生长促进剂的依赖。

发明内容

为解决上述问题，本发明首先提供一种乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）新菌株及其冻干菌粉。

本发明还提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）类细菌素冻干粉。

本发明还提供含有枯草芽孢杆菌类细菌素与乳酸片球菌的饲料添加剂，预混料和配合料。

本发明提供的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）新菌株HT为申请人从鸭空肠内容物中分离得到。生物学特征如下：细胞圆球状，在直角两个平面交替***形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。可利用葡萄糖、核糖、木糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、果糖、七叶灵、甘露糖、鼠李糖，但不能利用L-***糖、麦芽糖、蔗糖等；不分解蛋白质，不能水解淀粉，不还原硝酸盐，不产吲哚；接触酶反应阴性，过氧化氢酶阴性。可在含6%~8%的NaCl环境中生长，耐NaCl浓度13%~20%。生长温度15-45℃，pH4.5-9.6，pH为微酸性至中性时生长发育良好。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）新菌株HT已于2012年09月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6500。

将所述的乳酸片球菌发酵后，进行冷冻干燥，可制备成冻干菌粉，因此本发明还提供所述乳酸片球菌的冻干菌粉。

本发明还提供所述冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：

1）制备乳酸片球菌HT的种子液；

2）将步骤1）制备的种子液以1-3%的接种量进行液体深层发酵培养；

3）将发酵液离心、浓缩，加入冻干保护剂，真空冷冻干燥，制备冻干菌粉。

其中，步骤1）所述的种子液的制备方法如下：将试管斜面培养的菌种HT接种至MRS培养基中，25-37℃恒温厌氧培养16-24h，按1~5%接种至种子培养基中，25-37℃厌氧培养16-24h，作为种子液。

其中，步骤2）中液体深层发酵培养的培养参数为：温度，25-37℃；搅拌速度，30~100rmp；pH值，6.0±0.5；培养时间，16-24h；发酵过程中加入发酵总体积0.5-1%的CaCO₃，调节pH在6.2-6.5；发酵8h后进行补料30~60%的葡萄糖。

本发明提供的枯草芽孢杆菌类细菌素冻干粉按照如下方式进行制备：发酵培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.6511，用硫酸铵盐析法提取枯草芽孢杆菌发酵液中的类细菌素，透析脱盐，冷冻干燥得到浓缩冻干粉。

本发明提供的含有所述乳酸片球菌的冻干菌粉和所述芽孢杆菌类细菌素冻干粉的饲料添加剂，其中，所述类细菌素冻干粉优选占40-60%；乳酸片球菌冻干粉优选占60-40%。

其中，所述饲料添加剂中，类细菌素冻干粉≥100mg/g，乳酸菌活菌数≥10¹⁰CFU/g。

本发明提供的饲料添加剂，可以添加到常规的畜禽预混料中，如维生素矿物质预混料中，因此本发明还提供含有所述饲料添加剂的预混料。

进一步的，可以将本发明的饲料添加剂添加到常规的畜禽基础日粮，如玉米-豆粕型日粮中，或将所述的预混料添加到常规的基础日粮中，制备成配合料，因此本发明还提供含有所述饲料添加剂的配合料。

本发明的类细菌素与乳酸片球菌混合饲料添加剂，可以减少或避免养殖生产中抗生素的使用，既而减少和消除药物残留，提高肉蛋奶产品品质问题，改善肠道微生物环境，防治腹泻产生，提高生产性能，提高饲料转化效率，降低生产成本，提高免疫力和抗病力。

本发明的类细菌素与乳酸片球菌混合饲料添加剂，充分利用了类细菌素和乳酸片球菌的优点：

（1）乳酸片球菌作为一种安全有效，广泛使用的乳酸菌之一，产酸能力强，可竞争性地克制病原微生物，调节胃肠道菌群，从而保持肠道微生态均衡，对加强动物机体的免疫功效有一定的作用。

（2）乳酸片球菌耐酸能力强，耐胆盐能力强，且可以耐高温，说明其对不良环境有很强的耐受性，在饲料加工、贮存及消化道中稳定性好，故可以广泛应用。

（3）枯草芽孢杆菌类细菌素具有广谱抗菌性，可抑制大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，以及黑曲霉和黄曲霉，具有较强的热稳定性，可以促进肠道内芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌等有益微生物的生长增殖和活跃代谢作用，且活性高。因此，将类细菌素与乳酸菌组合会所发挥的作用或功效远远超过单一使用的效果。

（4）本发明产品可以广泛应用于猪、禽、牛、羊、水产和经济动物，是一种绿色饲料添加剂，具有经济效益和生态效益。

本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下：单个细胞，0.7-0.8×2-3μm菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢0.6-0.9×1.0-1.5μm，形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。需氧菌。本发明中的枯草芽孢杆菌的有益效果在于：

（1）本发明中的枯草芽孢杆菌耐酸性强，耐胆盐，耐高温（可耐受80℃的制粒温度），既而在进入动物肠道后能够保持改的生物活性，有效抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，促进有益菌生长。

（2）能够菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能够提高饲料养分消化率，提高动物生产性能，有利于减少养殖周期和养殖成本。

（3）能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，为动物机体的正常生长和生理机能的发挥提供保障，并提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，增强免疫机能和抗疾病能力。

本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）已于2012年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6511。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1枯草芽孢杆菌CGMCC No.6511类细菌素的制备

1）枯草芽孢杆菌发酵液的制备

在30℃培养温度下采用MNB培养基进行发酵20h，初始pH为7，接种量3%，摇床转速225rpm。

MNB培养基的配方为：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；MgSO₄·7H2O，0.5g/L；MnSO₄·H₂O，0.005g/L；pH，7.0。

2）硫酸铵盐析法提取类细菌素

将培养好的枯草芽孢杆菌菌液制备无菌滤液，将研磨好的硫酸铵粉末缓慢添加到无菌滤液中，并且轻轻搅动确保硫酸铵完全溶解，缓慢搅动1h后，放置于4℃冰箱中。硫酸铵梯度处理为70%。过夜后，将不同饱和度的溶液取出，分别离心（10000×g，30min，4℃），收集沉淀。

3）透析脱盐

将收集的沉淀，溶解于20mMTris-HCl缓冲溶液（pH 8.01），装入截留相对分子质量3500Da的透析袋（Amersham，Sweden）中，在相同浓度的Tris-HCl缓冲溶液中透析后，用进行冷冻干燥得到浓缩干粉，4℃保存。

4）蛋白浓度的测定

将制备所得到的类细菌素采用BCA试剂盒（Pierce，Rockford，IL）进行蛋白浓度的测定，样品加在酶标板上，在570nm处测定吸光度，按照试剂盒所附标准和计算方法计算蛋白质含量，70%时提取的类细菌素蛋白浓度57.1μg/mL。

5）抗菌活性的测定

将得到的类细菌素浓度调节到1mg/mL，采用杯碟法测定其对乳酸片球菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和鼠伤寒沙门氏菌的抗菌活性，待对照（20mM Tris-HCl缓冲液）菌苔长满平板后，测量抗菌粗蛋白质的抑菌圈直径（d），每个处理3个重复。

表1枯草芽孢杆菌类细菌素物质的抗菌活性测定

指示菌	培养基	温度（℃）	抑菌圈（mm）
				乳酸片球菌CGMCC No.6500	MRS	37	0
金黄色葡萄球菌IVDC C56005	BHI	30	31
				肠炎沙门氏菌IVDC C79-52	BHI	37	20
大肠杆菌k88IVDC C83901	BHI	30	23
				大肠杆菌k99IVDC C83529	BHI	30	27
鼠伤寒沙门氏菌IVDC C77-31	BHI	37	22

从上表1可以看出，枯草芽孢杆菌产生的类细菌素对我们选择添加的乳酸片球菌没有抑制作用，对致病菌金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和鼠伤寒沙门氏菌的生长繁殖抑制作用较强。这些病原菌都是畜牧养殖中动物的主要致病菌。

实施例2乳酸片球菌菌粉的制备

1）乳酸片球菌CGMCC No.6500种子液的制备

将试管斜面保藏菌种接种至装有20mL MRS液体培养基的厌氧管中，37℃恒温厌氧培养20h，待活菌数达10⁷CFU/mL，按1%接种于装有100mL MRS液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃厌氧培养20h，待活菌数达107CFU/mL（MRS琼脂培养基平板计数）以上，作为种子液备用。

2）液体深层发酵培养

将上述乳酸片球菌液体种子液以1%的接种量加入到50L发酵罐中，培养参数为：温度，37℃；搅拌速度，50rmp；pH值，6.0±0.5；培养时间，20h。发酵过程中加入发酵总体积0.5%的CaCO₃，调节pH在6.2-6.5；发酵8h后进行补料，即加入50%的葡萄糖1L。

培养乳酸片球菌所用的MRS液体培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，4.0g/L；葡萄糖，20.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2。

MRS琼脂培养基是在MRS液体培养基的基础上添加琼脂15g/L。

50L发酵罐增殖培养乳酸片球菌所用的优化培养基配方如下：蛋白胨，10.0g/L；牛肉膏，8.0g/L；酵母膏，6.0g/L；葡萄糖，25.0g/L；吐温80，1mL/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；三水乙酸钠，5.0g/L；柠檬酸三铵，2.0g/L；七水硫酸镁，0.2g/L；硫酸锰，0.05g/L；pH 6.2±0.2。

3）冻干菌粉制备

通过发酵液的离心、浓缩、加入冻干保护剂（含有5%海藻糖、15%脱脂奶粉、4%蔗糖、1%D-异抗坏血酸和2.0%谷氨酸钠）、真空冷冻干燥及菌粉活菌数检验等生产程序，最终制备出粉状活菌制剂。

4）成品检测

取制备完的粉状活菌制剂1g，按国际GB/T 4789.35-2003方法测定每克菌粉中的活菌数，且菌粉中活菌数大于10⁸CFU/g。

实施例3类细菌素与乳酸片球菌混合饲料添加剂的制备

将实施例1中制备得到的芽孢杆菌类细菌素干粉50%（wt）与实施例2制备的乳酸片球菌菌粉50%（wt）混合均匀而成。其质量标准为：类细菌素干粉102mg/g，乳酸菌活菌数120亿/g，水分≤10%，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。

试验例1

本发明类细菌素与乳酸片球菌混合饲料添加剂对仔猪生长的应用效果

1、试验动物

平均初始体重为23.12±1.58kg的杜×长×大三元健康生长猪72头。

2、试验设计

按体重相近和遗传基础相似的原则，随机分为三个处理，每个处理6个重复，每个重复（圈）4头猪，公、母各半，试验期为20-50kg。组一为空白对照组，饲喂基础日粮；组2为抗生素对照组，基础日粮添加100g/t金霉素，50g/t黄霉素；组三为试验组，基础日粮中添加0.2%实施例3制备得到的混合饲料添加剂。

3、试验日粮，见表2

表2试验日粮配方及营养成分表

4、饲养管理

圈养，自由采食和饮水，每天记录投料量和剩余饲料和异常情况，在试验结束时对猪进行称重。按常规程序和方法进行免疫。

5、试验结果与分析

与空白对照组相比，试验组的各项指标改善如下：平均日采食量提高10.7%，平均日增重提高12.1%，饲料转化率改善13.0%，腹泻率降低71.2%；与抗生素对照组相比，试验组的各项指标改善如下：平均日采食量提高9.3%，平均日增重提高10.8%，饲料转化率改善12.3%，腹泻率降低56.5%。有上述结果亦可得知，添加本发明中的混合预混料的促生长和降低腹泻率的作用优于添加抗生素所得到的结果。

试验例2

本发明类细菌素与乳酸片球菌混合饲料添加剂对肉仔鸡生产性能的影响

1、试验动物与设计

选用日龄相同的产蛋后期海兰蛋鸡180只，分为三组，每组10个重复，每个重复6只鸡。组一为空白对照组，饲喂基础日粮；组2为抗生素对照组，基础日粮添加100g/金霉素，50g/黄霉素；组三为试验组，基础日粮中添加0.2%实施例3制备得到的混合饲料添加剂。

2、试验日粮

饲料配制参照NRC（1994）肉鸡营养需要标准配制玉米-豆粕型基础日粮。各处理基础日粮配方和营养水平见表3。所有日粮均为粉料。

表3试验日粮配方及营养成分表

3、试验结果与分析

从表4中可以看出，在0-21天阶段，22-42天阶段以及0-42天，三组之间平均日采食量、平均日增重不存在明显差异，只有饲料增重比存在显著差异。与组二即抗生素对照组相比，组三混合饲料添加剂组在0-21天，22-42天，0-42天，饲料增重比分别提高14.1%，14.06%，9.39%。虽组三与组二空白对照组之间不存在显著差异，但与相比，组三肉仔鸡饲料增重比仍有降低的趋势。说明本产品能够在一定程度上提高肉仔鸡的生产性能，而且无毒，无耐药性，绿色安全，对动物体不仅添加了有用的外源益生菌，添加的类细菌素还能够促进动物肠道内菌群的生长，从而实现提高饲料养分消化和吸收，提高免疫和抗病力的功效，且有减少和消除抗生素使用的功能，长久使用能够产生经济效益、社会效益和生态效益。

表4混合饲料添加剂对肉仔鸡生产性能的影响

注：a,b同一行的肩标无相同字母为差异显著（P<0.05）；SEM为平均标准误。

试验例3

本发明类细菌素与乳酸片球菌混合饲料添加剂对草鱼养殖的影响

选用草鱼9000条，分为三个处理组，组一为空白对照组（基础日粮组）；组二为基础日粮+100g/t金霉素+100g/t黄霉素；组三为基础日粮+0.2%混合饲料添加剂（由实施例3制备），每个处理3个重复，每个重复1000条。与组一相比，组三饲料系数降低8.2%，平均日增重提高12.6%，成活率提高23.7%；与组二相比，组三饲料系数降低7.3%，平均日增重提高11.8%，成活率提高20.9%，且组三的整齐度好，抗病能力强。水质控制方面，水深3米，3亩投放实施例3得到的混合饲料添加剂1kg。结果在24h内，水中氨态氮浓度由组二的0.72mg/L降低到试验组的0.21mg/L，降低三倍多，说明本发明产品不仅有能够提高水产养殖生产效率的作用，还能够净化水产动物的生长环境，改善水质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）新菌株HT，其保藏号为CGMCC No.6500。

2.含有权利要求1所述菌株的冻干菌粉。

3.权利要求2所述冻干菌粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备乳酸片球菌HT的种子液；

2）将步骤1）制备的种子液以1-3%的接种量进行液体深层发酵培养；

3）将发酵液离心、浓缩，加入冻干保护剂，真空冷冻干燥，制备冻干菌粉。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的种子液的制备方法如下：将试管斜面培养的菌种HT接种至MRS培养基中，25-37°℃恒温厌氧培养16-24h，按1~5%接种至种子培养基中，25-37℃厌氧培养16-24h，作为种子液。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中液体深层发酵培养的培养参数为：温度，25-37℃；搅拌速度，30~100rmp；pH值，6.0±0.5；培养时间，16-24h；发酵过程中加入发酵总体积的0.5-1%的CaCO₃，调节pH在6.2-6.5；发酵8h后进行补料30~60%的葡萄糖。

6.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）类细菌素冻干粉，其特征在于，按照如下方式进行制备：发酵培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.6511，用硫酸铵盐析法提取枯草芽孢杆菌发酵液中的类细菌素，透析脱盐，冷冻干燥得到浓缩冻干粉。

7.一种饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求2所述冻干菌粉和权利要求6所述类细菌素冻干粉。

8.如权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，所述类细菌素冻干粉占40-60%；所述乳酸片球菌冻干粉占60-40%。

9.含有权利要求7或8所述的饲料添加剂的预混料。

10.含有权利要求7或8所述的饲料添加剂的配合料。