CN102937653A - 基于免疫的血清型a肉毒杆菌毒素活性测定 - Google Patents

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Abstract

本发明为基于免疫的血清型A肉毒杆菌毒素活性测定，涉及一种药物组合物，包含血清型A肉毒杆菌毒素（BoNT/A），其中其效能在制造所述药物过程中被特异性地确定。

Description

基于免疫的血清型A肉毒杆菌毒素活性测定
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年3月13日，申请号为200980117157.X（国际申请号PCT/US2009/037046），名称为“基于免疫的血清型A肉毒杆菌毒素活性测定”。
本专利申请根据35U.S.C.§119(e)，要求以2008年3月14日提交的美国临时专利申请No.61/036,723作为优先权基础，该临时申请的全部内容均以援引的方式纳入本文。
梭菌毒素——例如肉毒神经毒素(BoNT)BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)——抑制神经元传递的能力已经被用于多种治疗和美容用途，参见例如，William J.Lipham，Cosmetic and Clinical Applications ofBotulinum Toxin(Slack、Inc.，2004)。市售的梭菌毒素药物组合物包括：BoNT/A制剂，例如，
Figure BDA00002373359300011
(Allergan、Inc.，Irvine，CA)、
Figure BDA00002373359300012
(Ipsen Ltd.,Slough,England)、(Mentor Corp.,Santa Barbara,CA)、
Figure BDA00002373359300014
(Merz Pharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)、(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,South Korea)和BTX-A(Biogen-tech Ltd.,University，Yantai,Shandong,China)；以及BoNT/B制剂，例如
Figure BDA00002373359300016
(Solstice Neurosciences,Inc.,South SanFrancisco,CA)。例如，
Figure BDA00002373359300017
目前已被美国批准用于在成年人中治疗颈肌张力障碍以减轻与颈肌张力障碍有关的异常头位和颈痛的严重度；用于治疗外用剂不恰当处理的严重原发性腋部多汗症；以及用于治疗与张力障碍相关的斜视和睑痉挛，包括年龄在12岁和以上的患者中的良性原发性睑痉挛或VII神经病症。
现在，一种致死试验小鼠LD50生物测定仍是所有药物制造商用于表示其制剂效能的“黄金标准”。S.S.Arnon et al.,JAMA 285:1059-1070(2001)。事实上，药物制剂标签上的单位是小鼠LD50单位，并且产生统计学可用的LD50数据需要的动物数目是很大的。小鼠LD50生物测定的优点是，它测量对肉毒毒素摄取（例如，毒素结合于细胞表面受体、毒素-受体复合体内化、轻链易位至细胞质、底物的轻链剪切）所必需的所有步骤，而不只是对此中毒过程的一部分测定活性，例如仅测量轻链酶活的体外测定。不幸的是，小鼠LD50生物测定有许多缺点，包括由于需要大量实验动物所导致的高操作成本，因为所有BoNT血清型都会引起相同的可测量终点而造成的无特异性，以及如果不使用大量动物的不准确的可能性。另外，动物权利组织已经向美国（FDA/NICEATM/ICCVAM）和欧洲（MHRA和EDQM）的监管机构以及制造肉毒神经毒素制品的制药公司施压，以减少动物试验并且——更重要地——替换用于产品发布的小鼠LD50生物测定。监管机构要求制药公司将三“R”原则应用于肉毒杆菌神经毒素的效能试验：减少（Reduce）、精简（Refine）、替换（Replace）。D.Straughan,Progress inApplying the Three Rs to the Potency Testing of Botulinum Toxin Type A,Altern.Lab.Anim.34(3):305-313(2006)。在最近几年中，已经采取了数项措施来减少和精简小鼠LD50生物测定，目的是标准化方案以及在每次测定中使用更少的动物产生更一致的数据。
因此，可以评估肉毒杆菌毒素摄取中必需的所有步骤的完整性的简单、可靠、经验证且政府机构可接受的肉毒毒素活性测定将会有重要价值，因为这种不基于动物的测定将减少对动物试验的需求以及与这类基于动物的测定相关的所有缺点、成本和伦理问题。本说明书提供了测定可用于在多个产业例如制药业和食品工业中的肉毒杆菌毒素A的活性的新型组合物、细胞和方法，并且还提供了相关的优点。这些组合物、细胞和方法不使用活动物或者取自活动物的组织，但能够评估对神经毒素作用所必需的所有步骤。
附图说明
图1为中枢和周围神经元中的神经递质释放和梭菌毒素中毒的现行范例的示意图。图1A为中枢和周围神经元中的神经递质释放机制的示意图。所述释放过程可被描述为包括两个步骤：1)囊泡停靠，其中含有神经递质分子的囊泡上的与囊泡结合的SNARE蛋白和位于质膜上的与膜结合的SNARE蛋白相结合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜相融合并以胞吐方式释放神经递质分子。图1B为破伤风毒素和肉毒毒素在中枢和周围神经元中活动的中毒机制的示意图。这一中毒过程可被描述为包括四个步骤：1)受体结合，其中梭菌毒素与梭菌受体复合体相结合并启动中毒过程；2)复合体内化，其中在毒素结合之后，含有毒素/受体***复合体的囊泡被胞吞至细胞内；3)轻链易位，其中认为发生了多个事件，包括囊泡内部pH的改变、包含梭菌毒素重链的HN结构域的通道孔的形成、梭菌毒素轻链和重链的分离以及轻链的释放；和4)酶促靶标修饰，其中梭菌毒素的轻链对其靶标SNARE底物(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)进行蛋白酶解剪切，由此阻止囊泡停靠和神经递质释放。
图2示出了通过蛋白质印迹分析对4种细胞系中的BoNT/A摄取的比较。图2A示出了基于用于处理所述细胞系的BoNT/A的量检测到的SNAP-25剪切产物的曲线图。在SigmaPlot中使用4参数逻辑模型分析了这些数据，并获得了每种细胞系的EC50值。检测到的SNAP-25剪切产物信号的排序是：SiMa>>Neuro-2a>LA1-55n>PC12。图2B示出了对所述测定计算的300pM对0pM以及1.2pM对0pM的原始信号的信噪比。SiMa细胞产生了最高信噪比和最低EC50值。
图3示出了对已建立细胞系的细胞分化培养基的优化，所述细胞系可用于本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。
图4示出了对已建立细胞系包含的细胞的细胞分化时间的优化，所述细胞系可用于本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。
图5示出了对已建立细胞系包含的细胞的BoNT/A处理的优化，所述细胞系可用于本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。结果表明，任一试验的BoNT/A处理均获得了小于2pM的EC50。
图6示出了本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法的灵敏度。结果表明，细胞对BoNT/A的摄取花不到1分钟，然后产生相对背景显著量的SNAP-25剪切产物。
图7示出了本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法特异性。结果表明，本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法可以测量BoNT/A中毒中包括的所有步骤。
图8示出了使用本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法用BoNT/A复合体处理的分化SiMa细胞的剂量反应曲线。
图9示出了使用本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法对制成制剂的BoNT/A药物产品进行基于免疫的BoNT/A活性测定的结果。
图10示出了使用本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法中和人血清中的α-BoNT/A抗体的检测。
具体实施方式
本说明书提供了用于测定样品中是否存在活性BoNT/A以及用于测定BoNT/A制剂的活性/效能的新型测定。本说明书中公开的基于细胞的新型测定倚赖能够使所述测定检测样品中皮摩尔量的BoNT/A的细胞、试剂和检测方法。本说明书中公开的基于细胞的新型测定减少了对动物毒性研究的需求，但仍可用于分析有关BoNT/A的多种功能，即毒素的结合和细胞摄取，易位至细胞胞质溶胶，以及蛋白酶活性。如下文进一步讨论的，所述新型方法和组合物可以用于分析粗样品和大量样品以及高度纯化的双链毒素和制成制剂的毒素产品，并且还可以适用于自动高通量测定形式。
因此，本说明书中公开的一个方面提供了用于产生α-SNAP-25抗体的组合物，所述抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。组合物可包含佐剂和这样的组成，即所述组成包含SNAP-25抗原、连接于SNAP-25抗原的载体或者连接于与SNAP-25抗原连接的柔性间隔物的载体，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体之间。可想象的是，可触发产生α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的免疫反应的任一和所有SNAP-25抗原都可用作SNAP-25抗原，非限制地包括源自天然SNAP-25的SNAP-25抗原、源自非天然SNAP-25的SNAP-25抗原和包含天然或非天然SNAP-25的免疫反应性片段的SNAP-25抗原。可用于产生α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的SNAP-25抗原非限制地包括包含连接于载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25肽的SNAP-25抗原，非限制地包括SEQ ID NO:38。用于制备α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的其他组合物非限制地包含这样的组成，即该组成包含连接于与具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原连接的柔性连接体的载体，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体之间。可想象的是，任一和所有佐剂都可用于这类组合物中，非限制地包括：聚乙二醇（PEG）、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）、聚乙烯醇（PVA）、完全和不完全弗氏佐剂。
本说明书中公开的另一方面提供了生产α-SNAP-25抗体的方法，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。该方法的一些方面包括以下步骤：(a)给予动物本说明书中公开的组合物；(b)从所述动物采集包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品；和(c)从所述样品分离所述α-SNAP-25抗体。所公开方法可用于制备α-SNAP-25单克隆抗体或α-SNAP-25多克隆抗体，所述单克隆抗体和多克隆抗体都可以结合含有SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位。
本说明书中公开的又一方面提供α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。除了包括单克隆α-SNAP-25抗体或多克隆α-SNAP-25抗体之外，这类α-SNAP-25抗体还包括天然和非天然抗体。可用作α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的单克隆α-SNAP-25抗体非限制地包括杂交瘤细胞系1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的单克隆α-SNAP-25抗体。
本说明书中公开的再一方面提供了检测BoNT/A活性的方法。该方法的一些方面包括步骤：(a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；(b)从所述处理的细胞分离包含在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；(c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；和(d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中通过所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A活性。步骤c的α-SNAP-25抗体可任选地连接于固相支持物。
本说明书中公开的再一方面提供了检测BoNT/A活性的方法。该方法的一些方面包括步骤：(a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可摄取BoNT/A；(b)从所述处理的细胞分离包含在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25组分；(c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；和(d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中通过所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A活性。步骤c的α-SNAP-25抗体可任选地连接于固相支持物。
本说明书中公开的又一方面提供了检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法。该方法的一些方面包括步骤：(a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物获得的试验样品中；(b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；(c)从所述处理的细胞分离包含在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；(d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；(e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；(f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤a-e；和(g)将步骤(e)中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤(f)中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤(f)中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤(e)中检测到的抗体-抗原复合体的较低量的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。步骤d的α-SNAP-25抗体可任选地连结于固相支持物。除了阴性对照样品之外，步骤f中的对照样品还可包括阳性对照样品。
由肉毒杆菌（Clostridium botulinum）、破伤风杆菌（Clostridiumtetani）、巴氏梭菌（Clostridium baratii）和丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）产生的梭菌毒素非常广泛地用于人和其他哺乳动物的治疗性和美容性治疗中。肉毒梭菌（C.botulinum）菌株产生七种具有不同抗原性的肉毒毒素(BoNT)血清型，它们通过研究人中(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)和动物中(BoNT/C1和BoNT/D)的肉毒菌中毒的发生而被识别；或从土壤中分离得到(BoNT/G)。虽然全部七种肉毒毒素血清型都具有相似的结构和生物学性质，但每一种也表现出不同特征，例如不同的药理学性质。与之相反，破伤风毒素(TeNT)由唯一的破伤风梭菌(C.tetani)群产生。其他两种梭菌——巴氏梭菌（C.baratii）和丁酸梭菌（C.butyricum）——还产生分别与BoNT/F和BoNT/E类似的毒素。
每种梭菌毒素都被翻译成大约150kDa的单链多肽，该单链多肽随后通过以下方式被剪切：由天然蛋白酶例如内源性梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然蛋白酶在二硫环内进行蛋白酶解切断。该翻译后加工产生双链分子，该分子包含通过单个二硫键和非共价相互作用而连在一起的大约50kDa的轻链（LC）和大约100kDa的重链（HC）。每种成熟的双链分子均包括三个功能上不同的结构域：1)酶促结构域，位于LC上，含有具有锌依赖性的内肽酶活性的金属蛋白酶区域，可特异性地靶向于神经递质释放机构的核心组件；2)易位结构域，位于HC的氨基端一侧(HN)，它促进LC从细胞内的囊泡中释放至靶细胞的胞质中；和3)结合结构域，位于HC的羧基端一侧(HC)，它决定毒素与位于靶细胞表面的受体复合体的结合活性和结合特异性。
这三个功能性结构域的结合活性、易位活性和酶促活性都是对毒性所必需的。虽然尚未精确地获知这一过程中的所有细节，但不管是何种血清型或亚型，梭菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放的总的细胞中毒机制是类似的。虽然本申请并不希望被下列描述所限制，但是该中毒机制可被描述为包括至少四个步骤：1)受体结合；2)复合体内化；3)轻链易位；和4)酶促靶向修饰(见图1)。这一过程开始于梭菌毒素的HC结构域与位于靶细胞的质膜表面的毒素特异性受体***的结合。受体复合体的结合特异性部分地来自于似乎独特地构成每种梭菌毒素受体复合体的蛋白受体和神经节苷脂的特定组合。一旦结合，所述毒素/受体复合体通过胞吞作用内化，内化的囊泡被分派至特定胞内途径。易位步骤似乎是通过囊泡区室的酸化而被引发的。这一过程似乎可以启动重要的依赖于pH的结构重排，所述结构重排增加疏水性、促进孔隙形成并有利于毒素的重链和轻链分开。一旦分开，毒素的轻链内肽酶从胞内的囊泡释放至胞质溶胶中，在此它似乎能特异性地靶向神经递质释放机构的核心组件。这些核心蛋白为囊泡相关膜蛋白(VAMP)/突触小泡蛋白、25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)和突触融合蛋白，它们是突触囊泡在神经末梢上停靠和融合所必需的蛋白，并且它们都属于可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE)家族的成员。BoNT/A和BoNT/E剪切SNAP-25的羧基端区域，分别释放九个氨基酸或二十六个氨基酸的片段，BoNT/C1也剪切SNAP-25靠近羧基端的区域，释放八个氨基酸的片段。肉毒毒素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，并使得VAMP的氨基端部分释放至胞质溶胶中。BoNT/C1剪切突触融合蛋白中接近细胞质膜表面的单个位点。突触SNARE蛋白被选择性地蛋白酶解使得梭菌毒素可以在体内阻断神经递质释放。对于在多种非神经元类型细胞中的胞吐作用，梭菌毒素的SNARE蛋白靶标是相同的；和在神经元中一样，在这些细胞中，轻链的肽酶活性抑制胞吐作用，参见例如，Yann Humeau et al.,HowBotulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release,82(5)Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton et al.,Botulinum andTetanus Neurotoxins:Structure，Function and Therapeutic Utility,27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；Giovanna Lalli et al.,The Journeyof Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons,11(9)TrendsMicrobiol.431-437,(2003)。
本公开的一些方面部分地包括一种用于产生α-SNAP-25抗体的组合物，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。本公开的另一些方面部分地包括一种用于产生α-SNAP-25抗体的诱导免疫反应的组合物，该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。本文中使用的“诱导免疫反应的组合物”是指一种包含SNAP-25抗原的组合物，当所述组合物被给予动物时可刺激对所述SNAP-25抗原的免疫反应，从而产生α-SNAP-25抗体——该抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。术语“免疫反应”是指动物免疫***对诱导免疫反应的组合物的任何应答。示例性免疫反应包括但不限于局部的和全身的以及细胞的体液免疫，例如CTL应答，包括CD8+CTL的抗原特异性诱导；辅助T细胞应答，包括T细胞增殖应答和细胞因子释放；以及B细胞应答，包括例如抗体产生应答。术语“诱导免疫反应”是指给予诱导免疫反应的组合物或者编码所述诱导免疫反应的组合物的多核苷酸，这时免疫反应被影响，即被刺激、被启动或者被诱导。
组合物包含SNAP-25抗原。本文使用的术语“抗原”是指诱发免疫反应的分子，非限制地包括肽、多糖和脂质缀合物例如脂蛋白和糖脂。本文使用的术语“SNAP-25抗原”是指可诱发免疫反应的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的任意抗原。在诱导免疫反应的组合物中使用的SNAP-25抗原必须大至足以在序列上基本是独特的，从而降低产生与SNAP-25之外的抗原交叉反应的抗体的可能性。另外，在诱导免疫反应的组合物中使用的SNAP-25抗原必须小至足以基本上仅触发对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的免疫反应，从而增加产生将在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25与在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25区分开的α-SNAP-25抗体的可能性。再者，还非常希望以高产率生成单一氨基酸序列的α-SNAP-25抗体，所述抗体的选择性是可以再现的，并且以满足要求的亲合力结合，以使得可设计高度灵敏的测定。
存在于SNAP-25中的BoNT/A剪切位点周围的序列表示为P5–P4–P3–P2–P1–P1’–P2’–P3’–P4’–P5’，以P1–P1’代表所述易切断键。在被BoNT/A剪切时，所形成的剪切产物包括包含P5–P4–P3–P2–P1序列的片段和包含P1’–P2’–P3’–P4’–P5’的片段。因此，本文使用的术语“在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25”是指将所述P1残基作为其羧基端氨基酸的任意SNAP-25。例如，人SNAP-25（SEQ ID NO:5）Q197–R198代表所述BoNT/A剪切位点的P1–P1’易切断键。照此，“具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25”将为在其羧基端氨基酸位置上具有谷氨酰胺的任意SNAP-25剪切产物，这里所述谷氨酰胺代表所述易切断键的Q197。又例如，石纹电鳐（Torpedo marmorata）SNAP-25(SEQ ID NO:16)的K204–H205代表所述BoNT/A剪切位点的P1–P1’易切断键。照此，“具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端赖氨酸的SNAP-25”将为在其羧基端氨基酸位置上具有赖氨酸的任意SNAP-25剪切产物，这里所述赖氨酸代表所述易切断键的K204。
可以将在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原进行修饰，以增强如下物质的免疫原性：SNAP-25抗原、半抗原或者当未修饰时有免疫原性、无免疫原性或有弱免疫原性的任何其他抗原性化合物。在该实施方案的一个方面中，SNAP-25抗原的易切断键的羧基端P1残基可以被羧化。羧化可以在两方面增加需要的SNAP-25抗原的免疫原性质。第一，因为带电荷的氨基酸可增强免疫原性，所以将COO–基团添加至所述羧基端残基将会增加SNAP-25抗原的总体免疫原性。第二，因为所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基在剪切时处于带电荷状态，所以将COO–基团添加至所述羧基端残基将会更好地模拟这样的实际抗原，即该抗原是本说明书中公开的α-SNAP-25抗体被设计以结合的。
在该实施方案的一个方面中，SNAP-25抗原的氨基端残基可通过添加适于将所述SNAP-25抗原连接于载体蛋白的氨基酸进行修饰，所述载体蛋白例如钥孔傶血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、甲状腺球蛋白（THY）、牛血清白蛋白（BSA）、大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）或多附着肽（multiple attachment peptide，MAP）。例如，可以将半胱氨酸残基放置在氨基端，以缀合所述载体蛋白KLH。
因此，在一个实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的长度可以为例如至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25或至少30个氨基酸。在另一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的长度可以为例如至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25或至多30个氨基酸。在又一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原可以为例如7-12个氨基酸、10-15个氨基酸或13-18个氨基酸。
在另一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:32。在该实施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的所述SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148。在又一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:38。
仍在另一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:39。在该实施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。在又一实施方案中，在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQ IDNO:45。
可想象的是，触发产生α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的免疫反应的任一和所有SNAP-25抗原都可以用作SNAP-25抗原。因此，包括SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148的氨基酸序列变体可用作触发产生α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的免疫反应的SNAP-25抗原。因此，在一个实施方案中，SNAP-25抗原可相对包括SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:147或SEQ ID NO:148的SNAP-25抗原具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸的置换、缺失或添加。在又一实施方案中，SNAP-25抗原与包括SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148的SNAP-25抗原可以有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性。
可想象的是，一种或多种载体可连接于SNAP-25抗原，目的是增强当未与所述载体缔合时有免疫原性、无免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。非限制性实例包括，例如钥孔傶血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、甲状腺球蛋白（THY）、牛血清白蛋白（BSA）、大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）或多附着肽（MAP）。如本领域中公知的，可以通过将无抗原性或弱抗原性的抗原偶联于载体而使所述抗原有抗原性。用于将抗原偶联于载体的多种其他载体和方法是本领域中公知的。参见，例如Harlow和Lane，见上文，1998a；Harlow和Lane，见上文，1998b；以及David W.Waggoner，Jr.等人，Immunogenicity-enhancingcarriers and compositions thereof and methods of using the same，美国专利公开文本No.20040057958(2004年3月25日)。表位还可以通过将所述表位作为融合蛋白表达而生成。用于表达多肽融合物的方法是本领域技术人员公知的，例如记载于Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 47),John Wiley & Sons,New York(1999)中。由于所述SNAP-25抗原的羧基末端必须是所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基，因此载体必须连接于所述SNAP-25抗原的氨基端。
可想象的是，一个或多个柔性间隔物可连接于SNAP-25抗原，目的是增强当未与所述柔性连接体缔合时有免疫原性、无免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。柔性间隔物可增加所述SNAP-25抗原的总肽长度并提供柔性，从而有利于所述SNAP-25抗原正确地呈递于所述免疫细胞。一个非限制性实例是，组合物可包含这样的SNAP-25抗原，即该抗原连接于串联的一个或多个柔性间隔物以将SNAP-25抗原更好地呈递于免疫细胞，从而有利于所述免疫反应。
由肽构成的柔性间隔物的长度为至少1个氨基酸，并且包含具有小侧链R基团的不带电荷氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸。因此，在一个实施方案中，柔性间隔物的长度可以为例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸。在另一个实施方案中，柔性间隔物的长度可以为例如至少1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个氨基酸。在又一个实施方案中，柔性间隔物的长度可以为例如1-3个氨基酸、2-4个氨基酸、3-5个氨基酸、4-6个氨基酸或5-7个氨基酸。柔性间隔物的非限制性实例包括例如G间隔物如GGG、GGGG(SEQ ID NO:55)和GGGGS(SEQ ID NO:56)或者A间隔物如AAA、AAAA(SEQ IDNO:57)和AAAAV(SEQ ID NO:58)。柔性间隔物在阅读框内连接于所述SNAP-25抗原成为融合蛋白。
如上文详述的，柔性间隔物部分地用于增加所述SNAP-25抗原的总体肽长度。例如，5-10个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接3-5个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，5-10个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接4-6个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，5-10个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接7-10个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，7-12个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接1-3个氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。再例如，7-12个氨基酸的SNAP-25抗原可以通过在其氨基端连接4-个6氨基酸的柔性间隔物而增加其总长度。由所述柔性间隔物提供的长度增加使得可选择较小大小的SNAP-25抗原，从而增加所述SNAP-25抗原基本上仅触发对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的免疫反应的可能性，因此增加产生将在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25与在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25区分开的α-SNAP-25抗体的可能性。
可想象的是，本说明书中公开的组合物可任选地包含本说明书中公开的SNAP-25抗原和一种或多种佐剂。本文使用的术语“佐剂”在述及SNAP-25组合物时是指可增加或改变对SNAP-25抗原的免疫反应的任何物质或物质混合物。佐剂可以例如用于减少免疫次数或者保护性免疫需要的抗原量。佐剂在诱导免疫反应的组合物中的用途是公知的。使用这些佐剂的主要目的是使得所述免疫反应增加。非限制性佐剂包括例如脂质体、油相，非限制性地包括弗氏类型的佐剂，例如弗氏完全佐剂（FCA）；弗氏不完全佐剂（FIA）；皂苷元糖苷如皂苷；聚羧乙烯；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺（通常称为胞壁酰二肽或“MDP”）；以及脂多糖（LPS）。这类佐剂通常以与水相形成的乳剂的形式使用，或者更通常地可由不溶于水的无机盐组成。这些无机盐可包括例如氢氧化铝、硫酸锌、氢氧化铁胶体、磷酸钙或氯化钙。氢氧化铝（Al(OH)3）是一种常用的佐剂。当前，FDA批准在人中使用的佐剂只有铝盐（Alum），所述铝盐用于通过沉淀所述抗原而“贮藏”抗原。上面提供的佐剂仅仅是示例性的。事实上，任何佐剂都可以用于本说明书中公开的SNAP-25组合物中，条件是所述佐剂满足诱导免疫反应的必要特征。
本说明书中公开的载体也可以作为佐剂。具体的佐剂以及制备和使用方法公布于例如Gupta et al.Vaccine,11:993-306,1993；Arnon,R.(Ed.)Synthetic Vaccines 1:83-92,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.,1987；和David W.Waggoner，Jr.et al.,Immunogenicity-Enhancing Carriers andcompositions Thereof and Methods of Using the Same，美国专利公开文本No.20040057958(Mar.25,2004)中。另外的佐剂包括″Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach″(eds.Powell,M.F.and Newman,M.J.)Pharmaceutical Biotechnology，Volume 6,Plenum Press(New York)第7章（第141-227页）中描述的任意化合物。来自该概论的实例包括胞壁酰二肽（MDP）和Montanide 720。分子例如聚肌苷:胞嘧啶（Poly I:C）或包含CpG基序的质粒DNA也可作为佐剂与封装在微粒中的抗原组合给药。再例如，所述佐剂是一种有利于所述抗原性化合物进入细胞胞质中的试剂，例如李斯特菌素、链球菌溶血素或它们的混合物。
因此，在一个实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于载体肽的具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原。在该实施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148。在该实施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:38。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔傶血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、甲状腺球蛋白（THY）、牛血清白蛋白（BSA）、大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）或多附着肽（MAP）。
在另一实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于载体肽的具有羧化羧基端赖氨酸的SNAP-25抗原。在该实施方案的一些方面中,具有羧化羧基端赖氨酸的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。在该实施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:45。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔傶血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、甲状腺球蛋白（THY）、牛血清白蛋白（BSA）、大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）或多附着肽（MAP）。
仍在另一实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于一个或多个柔性连接体和载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体肽之间。在该实施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148。在另一实施方案中，SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:46。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔傶血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、甲状腺球蛋白（THY）、牛血清白蛋白（BSA）、大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）或多附着肽（MAP）。在该实施方案的一些方面中，所述柔性连接体为G间隔物或A间隔物。
在又一实施方案中，SNAP-25组合物包含连接于柔性连接体和载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25抗原和所述载体肽之间。在该实施方案的一些方面中,具有羧化羧基端赖氨酸的SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。在该实施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:47。在该实施方案的一些方面中，所述载体肽为钥孔傶血蓝蛋白（KLH）、卵白蛋白（OVA）、甲状腺球蛋白（THY）、牛血清白蛋白（BSA）、大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）或多附着肽（MAP）。在该实施方案的一些方面中，所述柔性连接体为G间隔物或A间隔物。
本公开的一些方面部分地包括用于生产α-SNAP-25抗体的方法，所述抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可通过本领域中熟知的多种方法制备。检测和测量抗体结合特异性、结合亲和性及结合亲合力，以及制备和使用抗体的具体方案是本领域中已知的。参见，例如ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Edward Harlow & David Lane,eds.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.1998a)；和USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL:PORTABLE PROTOCOL No.I(Edward Harlow & David Lane,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1998b)；Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2001以及Current Protocols in Molecular Biology，2004；DavidAnderson et al.,Therapeutic Polypeptides，Nucleic Acids Encoding Same，and Methods of Use，美国专利7,034,132(2005年4月25日)；以及BeatrizM.Carreno et al.,Antibodies Against CTLA4，美国专利7,034,121(2006年4月25日)。
作为非限制性实例，α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可通过用本说明书中公开组合物的一种或多种注射剂注射动物如兔、山羊、小鼠或另一种哺乳动物而制备。作为另一非限制性实例，α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可通过用本说明书中公开组合物的一种或多种注射剂注射卵如鸡的卵而制备。免疫动物中的抗体效价可通过标准技术随时间监测，例如通过使用固定抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）或基于细胞的活性测定。根据需要，可以将α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的多克隆抗体从所述哺乳动物中（例如从血液中）分离并通过公知的技术例如为获得IgG部分的蛋白A亲和色谱法，或者通过对用于产生所述抗体的肽的亲和纯化进行进一步纯化。
作为另一个非限制性实例，α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在来自SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——可使用杂交瘤方法产生。参见，例如MonoclonalAntibodies,pp.196-244,Harlow & Lane，见上文，1998a的第6章；和Growing Hybridomas,pp.245-282,Harlow & Lane，见上文,1998a的第7章；以及Goding,pp.59-103,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,(1986)。在该方法中，一般将宿主动物如小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物暴露于本说明书中公开SNAP-25抗原的一种或多种注射剂，以诱发产生或者能够产生α-SNAP-25抗体——该抗体会特异性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25——的淋巴细胞。免疫动物中的抗体效价可通过标准技术随时间监测，例如通过使用固定抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）或基于细胞的活性测定。或者，可以使用合适的培养细胞系在体外免疫所述淋巴细胞。在免疫后合适的时间，例如当抗体效价最高时，从所述动物分离产生抗体的细胞。一般而言，如果需要人源的细胞则可使用外周血淋巴细胞，如果需要非人哺乳动物来源则可使用脾细胞或***细胞。使用合适的融合试剂如聚乙二醇将所分离的产生抗体的细胞与一种永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。一般将鼠科动物骨髓瘤细胞系与从恰当免疫的小鼠中采集的脾细胞融合，以产生所述杂交瘤。优选的永生化细胞系是对含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT）的培养基敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。多种骨髓瘤细胞系的每一种均可根据标准技术用作融合伴侣，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。然后使用HAT培养基——其杀死未融合的和非增殖性融合的骨髓瘤细胞（未融合的脾细胞在培养数日后死亡，因为它们是未转化的）——来选择融合形成的杂交瘤细胞。然后，可以对培养所述杂交瘤细胞的培养基检测α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的存在情况。例如，可以在免疫沉淀测定、体外结合测定例如放射免疫测定（RIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA）中，或者在基于细胞的活性测定中，使用α-SNAP-25阳性培养基筛查杂交瘤上清液。这类技术和测定是本领域中已知的。参见，例如Harlow & Lane，见上文，1998a的第11章Immunoprecipitation，第421-470页；Harlow &Lane，见上文,1998a的第12章Immunoblotting，第471-510页；Harlow& Lane，见上文,1998a的第14章Immunoassays，第553-612页。然后可进行另外的研究，以确定所述抗体是否还对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25无反应性。还可例如通过Scatchard分析确定α-SNAP-25单克隆抗体的结合亲和性。参见，例如Peter J.Munson and David Rodbard,Ligand：A Versatile ComputerizedApproach For Characterization of Ligand-Binding Systems,107(1)Anal.Biochem.220-239(1980)。在鉴定出需要的杂交瘤细胞后，使用有限稀释步骤来分离源自单个细胞的克隆，直至获得表达需要的单克隆抗体的克隆细胞系。选择那些对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25有足够的选择性并以足够高的亲合力结合的抗体，用于进一步表征和研究。
用于制备α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的另一可选方法是通过用SNAP-25肽和分离的免疫球蛋白文库成员——该成员可结合在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25——筛查重组组合免疫球蛋白文库如抗体噬菌体展示文库。用于生成和筛查噬菌体展示文库的试剂盒可市购，例如Recombinant PhageAntibody System(Amersham GE Healthcare,Piscataway，NJ)；和SurfZAPTM Phage Display Kit(Stratagene,La Jolla,CA)。另外，用于生成和筛查抗体展示文库的方法和试剂的实例可以见于例如Ladner等人，美国专利5,223,409；Borrebaeck等人，美国专利5,712,089；Griffiths等人，美国专利5,885,793；Griffiths等人，美国专利5,962,255；McCafferty等人，美国专利5,969,108；Griffiths等人，美国专利6,010,884；Jespers等人，美国专利6,017,732；Borrebaeck等人，美国专利6,027,930；Johnson等人，美国专利6,140,471；McCafferty等人，美国专利6,172,197，上述每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
本公开的一些方面部分地包括，采集包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品。本文使用的术语“包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品”是指包含或者可能包含至少一种α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的任何生物物质。可想象的是，可包含α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的任一和所有样品都可用于该方法中，非限制地包括血液、血浆、血清和淋巴液。还可想象的是，能够产生α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的任何细胞都可用于该方法中，所述细胞非限制地包括CD8细胞、CTL细胞、辅助T细胞和B细胞。多种公知的方法可用于从个体中采集包含所述α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品，参见，例如Harlow & Lane，见上文，1998a；和Harlow & Lane，见上文，1998b。类似地，多种公知的方法可用于加工样品，以分离α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。可基于待分离的抗体的类型选择用于采集样品的方法。作为一个非限制性实例，当分离α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——时，合适的样品可以是包含这类α-SNAP-25抗体的血液样品，而当分离α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——时，合适的样品可以是产生α-SNAP-25抗体的细胞，例如脾细胞或杂交瘤细胞。
本公开的一些方面部分地包括从所述样品中分离α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。分离这类α-SNAP-25抗体例如α-SNAP-25多克隆抗体或α-SNAP-25单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，所述α-SNAP-25多克隆抗体和α-SNAP-25单克隆抗体均可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。参见，例如Harlow and Lane，见上文，1998a；和Harlowand Lane，见上文，1998b。例如，可通过公知的技术从所述样品中分离这类α-SNAP-25多克隆抗体，所述技术例如使用蛋白A或蛋白G的亲和色谱法，该方法主要提供免疫血清的IgG部分。随后或者另外，可以将特异性SNAP-25抗原固定于柱上或磁珠上，以通过免疫亲和色谱法来纯化α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。可通过常规的免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水液中分离α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位，所述常规免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。
因此，在一个实施方案中，一种生产α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的方法包括步骤：(a)给予动物包含连接于载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的组合物；(b)从所述动物中采集包含α-SNAP-25抗体或产生α-SNAP-25抗体的细胞的样品；和(c)从所述样品分离所述α-SNAP-25抗体组分。在该实施方案的一个方面中,所述α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是多克隆抗体。在该实施方案的另一方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是单克隆抗体。在该实施方案的又一方面中，产生的α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是IgG亚型。在该实施方案的其他方面中，SNAP-25组合物还包含佐剂，例如聚乙二醇（PEG）、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）或聚乙烯醇（PVA）。
在另一实施方案中，一种生产α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——的方法包括步骤：(a)给予动物包含连接于柔性连接体和载体肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的组合物，其中所述柔性连接体介于所述SNAP-25肽和所述载体肽之间；(b)从所述动物采集包含α-SNAP-25抗体或产α-SNAP-25抗体的细胞的样品；和(c)从所述样品分离所述α-SNAP-25抗体。在该实施方案的一个方面中,所述α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是多克隆抗体。在该实施方案的另一方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是单克隆抗体。在该实施方案的又一方面中，产生的α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位——是IgG亚型。在该实施方案的其他方面中，SNAP-25组合物还包含佐剂，例如聚乙二醇（PEG）、单甲氧基聚乙二醇（mPEG）或聚乙烯醇（PVA）。
本公开的一些方面部分地包括一种分离的α-SNAP-25抗体，该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。本文中使用的术语“分离的”是指通过人的介入从分子的天然环境中分离分子。本文使用的“抗体”是指由免疫***生成的分子，该分子通过应答特定抗原而产生并可特异性地结合于该抗原，抗体包括天然抗体和非天然抗体。本文使用的术语“α-SNAP-25”与“SNAP-25抗体”同义，是指可结合于SNAP-25抗原的抗体。例如，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双功能抗体、细胞相关抗体如Ig受体、线式抗体、双链抗体或微抗体——只要所述片段表现出需要的生物活性——以及它们的单链衍生物。抗体可以是包含VH和VL区以及轻链恒定区（CL）和重链恒定区CH1、CH2和CH3的全长免疫球蛋白分子，或者全长免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如Fab片段、F(ab′)2片段、Fc片段、Fd片段或Fv片段。抗体可源自于任何脊椎动物物种（例如人、山羊、马、驴、鼠科动物、大鼠、兔或鸡），并且可以是任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA）、类别（例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）或亚类（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）。对天然抗体、非天然抗体和它们的抗原性化合物结合片段的结构的一般性公开，参见例如Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Mooreeds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrabeck,Antibody Engineering,第2版(Oxford University Press 1995)，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四体糖蛋白，由两条相同轻（L）链和两条相同重（H）链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链中的二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变区（VH），随后是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区（VL），在其另一端具有一个恒定区。所述轻链的恒定区与所述重链的第一个恒定区对齐，所述轻链的可变区与所述重链的可变区对齐。特定的氨基酸残基被认为形成了所述轻链和重链可变区之间的界面。
完整的抗原识别和抗原结合位点位于抗体可变区内，即Fv片段。该片段包括紧密非共价缔合的一个重链可变区（VH）和一个轻链可变区（VL）的二聚体。每个区包含4个主要采取β片层构型的骨架区（FR），这些框架区由3个超变区连接，所述超变区形成连接所述β片层结构的环，并且在一些情形下形成所述β片层结构的一部分。每个超变区包含对应于互补决定区（CDR）的氨基酸序列。总之，是所述6个CDR区的三维构型界定了所述VH-VL二聚体表面上的赋予抗原结合特异性的抗原结合位点。参见，例如Cyrus Chothia,et al.,Conformations ofImmunoglobulin Hypervariable Regions,Nature 342(6252):877-883(1989);Elvin A.Kabat,et al Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)，以上每一篇通过援引的方式全文纳入本文。抗体恒定区并不直接参与抗体抗原结合，但呈现多种效应物功能，例如使抗体参与抗体依赖的细胞毒性。
靶抗原通常具有一个或多个结合位点，也称为表位，它们可被CDR形成的抗原结合位点识别。本文中使用的“表位”与“抗原决定簇”同义，是指能够特异性地结合于免疫球蛋白或T细胞受体或者以另外的方式与一个分子相互作用的靶抗原上的位点，所述靶抗原例如肽、多糖或包含脂质的分子。特异性地结合于不同表位的每种抗体均具有不同结构。因此，一种抗原可以具有多于一种对应的抗体。
多克隆抗体是指异质的抗体分子群，包含至少2种能够结合于特定抗原的抗体。根据定义，多克隆抗体包括结合至少两种不同表位的两种不同抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”或“多个单克隆抗体”是指基本同质的抗体分子群，仅包含一种能够结合特定抗原的抗体，即除了可能微量存在的可能的天然突变之外，该群包含的各个抗体是相同的。根据定义，单克隆抗体结合于单一表位。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。再者，与多克隆抗体不同，每种单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于，它们可不被其他抗体污染地合成。修饰语“单克隆的”是指从基本同质的抗体群获得的抗体特征，而不可解释为需要以任何具体方法生产所述抗体。例如，可根据本公开使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法制备，该方法首先被Kohler et al(1975)Nature 256:495记载，或者可通过重组DNA方法制备（参见，例如美国专利No.4,816,567；美国专利No.5,807,715）。还可使用例如Clackson et al(1991)Nature,352:624-628;Marks et al(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中记载的技术从噬菌体抗体文库分离所述单克隆抗体。
因此，在一个实施方案中，α-SNAP-25抗体包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，所述重链可变区（VH）为SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:82。在该实施方案的另一方面中，所述轻链可变区（VL）为SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:92。
在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体包含重链可变区（VH）CDR1区、CDR2区、CDR3区或它们的任意组合，该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，所述重链可变区（VH）CDR1为SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:120。在该实施方案的另一方面中，所述重链可变区（VH）CDR2区是SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123。仍在该实施方案的另一方面中，所述重链可变区（VH）CDR3区是SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:124。
在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体包含轻链可变区（VL）CDR1区、CDR2区、CDR3区或它们的任意组合，该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25。在该实施方案的一个方面中，所述轻链可变区（VL）CDR1区是SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ IDNO:107、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ IDNO:128或SEQ ID NO:129。在该实施方案的另一方面中，所述轻链可变区（VL）CDR2区是SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112。仍在该实施方案的另一方面中，所述轻链可变区（VL）CDR3区是SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117。
仍在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体特异性地结合在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的表位。在该实施方案的一个方面中，所述表位包括SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:147或SEQ ID NO:148。在该实施方案的一个方面中，所述表位包括SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。
如上文详述的，存在于SNAP-25中的BoNT/A剪切位点周围的序列表示为P5–P4–P3–P2–P1–P1’–P2’–P3’–P4’–P5’，以P1–P1’代表所述易切断键。在被BoNT/A剪切时，所形成的剪切产物包括包含P5–P4-P3–P2–P1序列的片段和包含P1’–P2’–P3’–P4’–P5’的片段。本文使用的术语“α-SNAP-25抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端”是指这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于包含所述P5–P4–P3–P2–P1序列的任何SNAP-25剪切产物片段，但不结合于包含所述P1’-P2 ’-P3 ’-P4 ’-P5 ’序列的任何SNAP-25剪切产物片段或者具有BoNT/A剪切位点的完整P1–P1’易切断键的任何SNAP-25。本文使用的术语“α-SNAP-25197抗体”是指这样的抗体，即该抗体可选择性地结合于具有对应于SEQ ID NO:5的谷氨酰胺197的羧基端P1残基的SNAP-25。本文使用的术语“α-SNAP-25204抗体”是指这样的抗体，即该抗体可选择性地结合于具有对应于SEQ IDNO:16的赖氨酸204的羧基端P1残基的SNAP-25。
本文使用的术语“选择性地”是指具有独特的效应或影响，或者仅以一种方式或者仅与一种物质反应。本文使用的术语“选择性地结合”在述及抗体时是指所述抗体与指定靶表位的区分性结合，结果是所述抗体基本不与非靶表位交叉反应。本文定义的肽表位的最小大小是约5个氨基酸，肽表位一般包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20个氨基酸。肽表位可以是不连续的，即它包含在肽一级结构上不相邻、但通过所述肽的二级、三级或四级结构集合成表位的氨基酸残基。再者，还应指出，表位可能包含氨基酸序列之外的分子部分，例如碳水化合物部分、脂质部分如脂蛋白或糖脂，或者化学修饰的氨基酸部分如磷酸化的氨基酸。在该实施方案的一些方面中,α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——可选择性地结合包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20个氨基酸的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——可选择性地结合包含至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多15或至多20个氨基酸的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。
选择性结合包括诸如结合亲和性、结合特异性和结合亲合力的结合性质。参见David J.King,Applications and Engineering of MonoclonalAntibodies,pp.240(1998)。结合亲和性是指抗体停留在其表位结合位点的时长，可以看作是抗体结合其表位的强度。结合亲和性可以描述为抗体的平衡解离常数（KD），该常数定义为平衡时的Kd/Ka比。其中Ka是抗体的缔合速率常数，kd是抗体的解离速率常数。结合亲和性由缔合和解离共同决定，仅高缔合或低解离都不能确保高亲和性。所述缔合速率常数（Ka）或结合速率常数（Kon）测量每单位时间结合事件的数目，或者抗体和抗原可逆地缔合成其抗体-抗原复合体的倾向性。缔合速率常数以M-1s-1表示，用符号表示如下：[Ab]×[Ag]×Kon。缔合速率常数越大，抗体结合于其抗体越快，或者抗体和抗原之间的结合亲和性越大。解离速率常数（Kd）或分离速率常数（Koff）测量每单位时间解离事件的数目，或者抗体-抗原复合体可逆地分离（解离）成其组分分子（即抗体和抗原）的倾向性。解离速率常数以s-1表示，用符号表示如下：[Ab+Ag]×Koff。解离速率常数越小，抗体越牢固地结合于其抗原，或者抗体和抗原之间的结合亲和性越大。平衡解离常数（KD）测量平衡时形成的新抗体-抗原复合体的与抗体-抗原复合体解离速率相等的速率。平衡解离常数以M表示，定义为Koff/Kon=[Ab]×[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]是抗体的摩尔浓度，[Ag]是抗原的摩尔浓度，[Ab+Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，其中所有浓度都是这些组分在体系平衡时的浓度。平衡解离常数越小，抗体越牢固地结合于其抗原，或者抗体和抗原之间的结合亲和性越大。
因此，在一个实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如小于1×105M-1s-1、小于1×106M-1s-1、小于1×107M-1s-1或者小于1×108M-1s-1的缔合速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于1×105M-1s-1、大于1×106M-1s-1、大于1×107M-1s-1或者大于1×108M-1s-1的缔合速率常数。在另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有1×105M-1s-1-1×108M-1s-1、1×106M-1s-1-1×108M-1s-1、1×105M-1s-1-1×107M-1s-1或1×106M-1s-1-1×107M-1s-1的缔合速率常数。
在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有小于1×10-3s-1、小于1×10-4s-1或小于1×10-5s-1的解离速率常数。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如小于1.0×10-4s-1、小于2.0×10-4s-1、小于3.0×10-4s-1、小于4.0×10-4s-1、小于5.0×10-4s-1、小于6.0×10-4s-1、小于7.0×10-4s-1、小于8.0×10-4s-1或小于9.0×10-4s-1的解离速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于1×10-3s-1、大于1×10-4s-1或大于1×10-5s-1的解离速率常数。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于1.0×10-4s-1、大于2.0×10-4s-1、大于3.0×10-4s-1、大于4.0×10-4s-1、大于5.0×10-4s-1、大于6.0×10-4s-1、大于7.0×10-4s-1、大于8.0×10-4s-1或大于9.0×10-4s-1的解离速率常数。
在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有小于0.500nM的平衡解离常数。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如小于0.500nM、小于0.450nM、小于0.400nM、小于0.350nM、小于0.300nM、小于0.250nM、小于0.200nM、小于0.150nM、小于0.100nM或小于0.050nM的平衡解离常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有大于0.500nM的平衡解离常数。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合亲和性可以具有例如大于0.500nM、大于0.450nM、大于0.400nM、大于0.350nM、大于0.300nM、大于0.250nM、大于0.200nM、大于0.150nM、大于0.100nM或大于0.050nM的平衡解离常数。
仍在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对完整SNAP-25的结合亲和性可以具有例如小于1×100M-1s-1、小于1×101M-1s-1、小于1×102M-1s-1、小于1×103M-1s-1或小于1×104M-1s-1的缔合速率常数。在另一实施方案中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对完整SNAP-25的结合亲和性可以具有例如至多1×100M-1s-1、至多1×101M-1s-1、至多1×102M-1s-1、至多1×103M-1s-1或至多1×104M-1s-1的缔合速率常数。
结合特异性是抗体区分包含其表位的分子和不包含该表位的分子的能力。一种测量结合特异性的方式是比较抗体对于包含其表位的分子的Kon缔合速率与抗体对于不包含该表位的分子的Kon缔合速率。例如，比较α-SNAP-25抗体对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位与对不含该表位的SNAP-25的缔合速率常数（Ka），所述不含该表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25表位，或者具有BoNT/A剪切位点的完整P1–P1’易切断键的SNAP-25表位。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对不包含其表位的SNAP-25具有例如小于1×100M-1s-1、小于1×101M-1s-1、小于1×102M-1s-1、小于1×103M-1s-1或小于1×104M-1s-1的缔合速率常数（Ka）。在该实施方案的其他方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对不包含其表位的SNAP-25具有例如至多1×100M-1s-1、至多1×101M-1s-1、至多1×102M-1s-1、至多1×103M-1s-1或至多1×104M-1s-1的缔合速率常数（Ka）。
在该实施方案的再一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍的缔合速率常数（Ka）。在该实施方案的又一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍的缔合速率常数（Ka）。仍在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至多1倍、至多2倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍或至多9倍的缔合速率常数（Ka）。仍在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其表位具有相对于对不包含该表位的SNAP-25例如至多10倍、至多100倍、至多1,000倍或至多10,000倍的缔合速率常数（Ka）。
α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——的结合特异性还可表征为α-SNAP-25抗体可以区分其SNAP-25表位与不包含该表位的SNAP-25的这样一个比值，所述不含该表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25表位或者具有BoNT/A剪切位点的完整P1–P1’易切断键的SNAP-25表位。在该实施方案的一些方面中,α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其SNAP-25表位与对不包含该表位的SNAP-25具有例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少64:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1或至少40:1的结合特异性比。仍在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其SNAP-25表位与对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处不含羧基端的SNAP-25具有例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1或至少40:1的结合特异性比。又在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——对其SNAP-25表位与对具有BoNT/A剪切位点的完整P1–P1’易切断键的SNAP-25具有例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少64:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1或至少40:1的结合特异性比。
结合亲合力（也称为功能性亲和性）是指多价抗体和其抗原之间的功能性结合强度的总和。抗体分子可以具有不止一个结合位点（例如IgG有2个，IgM有10个），并且许多抗原包含不止一个抗原性位点。虽然抗体的结合亲合力取决于各个抗体结合位点的结合亲和性，但结合亲合力大于结合亲和性，因为要完全解离抗体必须使所有抗体-抗原相互作用同时断裂。可想象的是，α-SNAP-25抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位——可选择性地结合于该抗体相应的任一和所有表位。
因此，在一个实施方案中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。在该实施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于具有羧基端谷氨酰胺的SNAP-25表位，或者可选择性地结合于具有羧基端赖氨酸的SNAP-25表位。在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于具有对应于SEQ ID NO:5的谷氨酰胺197的羧基端P1残基的SNAP-25表位，或者可选择性地结合于具有对应于SEQ ID NO:16的赖氨酸204的羧基端P1残基的SNAP-25表位。又在该实施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗体是这样的α-SNAP-25抗体，即该抗体可选择性地结合于具有SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148的羧基端氨基酸序列的SNAP-25表位。
本公开的一些方面部分地包括一种基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。本说明书中公开的基于免疫的方法可通过数个参数进行评估，所述参数包括例如准确度、精度、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、范围、特异性、选择性、线性、耐用性和***适用性。方法的准确度是分析方法的正确性的度量，或者测量值与通常公认的真实值或公认参考值之间相符的接近度。方法的精度是当将方法重复地应用于同质样品的多次采样时，各个试验结果之间相符的程度。照此，精度可评估1)测定内变异性；2)日内变异性（重复性）；和3)日间变异性（中间精度）；以及4)实验室间精度（再现性）。变异系数（CV%）是相对于观测或理论平均值表达的精度的定量量度。
本说明书中公开的一种基于免疫的方法必须能够检测包含具有在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的α-SNAP-25抗体-抗原复合体相对于背景的存在情况。方法的检出限（LOD）是指开始给出明显不同于阴性对照或空白对照的信号的分析物的浓度，代表可以与背景区分开的分析物的最低浓度。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的基于免疫的方法可以检测其量明显不同于阴性对照或空白对照的BoNT/A的LOD。在该实施方案的一个方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10ng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、1ng或更少的BoNT/A的LOD。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、800pg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、100pg或更少的BoNT/A的LOD。在该实施方案的又一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、10pg或更少的BoNT/A的LOD。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、1pg或更少的BoNT/A的LOD。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.1pg或更少的BoNT/A的LOD。
在该实施方案的另一方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10nM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者1nM或更少的BoNT/A的LOD。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者100pM或更少的BoNT/A的LOD。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如100pM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者10pM或更少的BoNT/A的LOD。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10pM或更少的BoNT/A,9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者1pM或更少的BoNT/A的LOD。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如1000fM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者100fM或更少的BoNT/A的LOD。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如100fM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者10fM或更少的BoNT/A的LOD。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10fM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者1fM或更少的肉毒神经毒素A的LOD。
定量限（LOQ）是可以以可接受的准确度和精度水平测量的样品或样本中的分析物的最低和最高浓度。定量下限是指检测方法始终可以从背景中测量出的最低剂量。定量上限是指检测方法在信号饱和之前始终可以测量出的最高剂量。所述方法的线性范围是定量上限和下限之间的区域。线性范围通过定量上限减去定量下限计算。本文使用的术语“下限的信噪比”是指所述方法在检测下限检出的信号除以背景信号。本文使用的术语“上限的信噪比”是指所述方法在检测上限检出的信号除以背景信号。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的基于免疫的方法可以检测其量明显不同于阴性对照或空白对照的BoNT/A的LOQ。在该实施方案的方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10ng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、1ng或更少的BoNT/A的LOQ。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、800pg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、100pg或更少的BoNT/A的LOQ。在该实施方案的又一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、10pg或更少的BoNT/A的LOQ。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、1pg或更少的BoNT/A的LOQ。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.1pg或更少的BoNT/A的LOQ。
在该实施方案的另一方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10nM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者1nM或更少的BoNT/A的LOQ。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者100pM或更少的BoNT/A的LOQ。在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如100pM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者10pM或更少的BoNT/A的LOQ。仍在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10pM或更少的BoNT/A,9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者1pM或更少的BoNT/A的LOQ。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如1000fM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者100fM或更少的BoNT/A的LOQ。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如100fM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者10fM或更少的BoNT/A的LOQ。又在该实施方案的另一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如10fM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者1fM或更少的BoNT/A的LOQ。
可用于实施本公开的方法的一个方面的基于免疫的测定必须具有不超过50%的精度。在该实施方案的一些方面中，基于免疫的测定有不超过50%、不超过40%、不超过30%或者不超过20%的精度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有不超过15%、不超过10%或者不超过5%的精度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有不超过4%、不超过3%、不超过2%或者不超过1%的精度。
可用于实施本公开的方法的一个方面的基于免疫的测定必须具有至少50%的准确度。在该实施方案的一些方面中，基于免疫的测定有至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的准确度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有至少85%、至少90%或至少95%的准确度。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的测定有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的准确度。
本说明书中公开的基于免疫的方法必须具有统计上显著的下限信噪比，和具有统计上显著的上限信噪比。在该实施方案的一些方面中，本说明书中公开的基于免疫的方法具有例如至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1或至少20:1的下限信噪比。在该实施方案的另一些方面中，基于免疫的方法具有例如至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1、至少40:1、至少45:1、至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1、至少100:1、至少150:1、至少200:1、至少250:1、至少300:1、至少350:1、至少400:1、至少450:1、至少500:1、至少550:1或至少600:1的上限信噪比。
方法的特异性定义了所述方法为排除其他相关组分例如部分活性的分析物或无活性的分析物而测量目的分析物的能力。方法的选择性描述了分析方法区分样品中不同物质的能力。方法的线性是所述方法得出与所述样品中分析物浓度成正比或者通过定义明确的数学变换而成比例的结果的能力。因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的基于免疫的方法可以区分部分活化的BoNT/A与完全活化的BoNT/A，所述部分活化的BoNT/A具有例如70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少的完全活化BoNT/A的活性。
所述方法的耐用性是在正常（但可变的）试验条件下对相同样品获得的测试结果的再现性。方法的鲁棒性是对所述方法不受方法参数的小而有意的改变影响的能力的量度，并提供了所述方法在正常使用中的可靠性的指示。因此，耐用性可评估不可避免的变化，而鲁棒性可评估有意的改变。用耐用性和鲁棒性评价的一般参数包括冻/融的影响、孵育时间、孵育温度、试剂寿命、样品制备、样品保存、细胞传代数、毒素批次、纯化间变异和切刻(nicking)反应间变异。基于细胞的测定的鲁棒性参数包括细胞库（冷冻的开始、中期和终末）、细胞传代水平、细胞接种密度、细胞原种密度（培养天数）、烧瓶中的细胞年龄（接种的等待时间）、孵育时间、不同的板、过量的血清和试剂来源。方法的***适用性是通过分析参比标准确定随时间的测定性能（包括试剂性能和仪器性能）。***适用性在FDA指导中就以下事实进行了强调：设备、电子器件、测定性能和待分析的样品组成一个整合的***。***适用性可以通过平行性测试进行评估，也就是在将对数剂量相对于反应作图时，参照的连续稀释和样品的连续稀释应给出平行的曲线。
本公开的一些方面部分地包括来自已建立细胞系的细胞。本文使用的术语“细胞”是指对由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的任何真核生物细胞，或者可以摄取BoNT/A的任何真核生物细胞。术语细胞涵盖来自多种生物的细胞，例如鼠科动物细胞、大鼠细胞、猪细胞、牛细胞、马细胞、灵长类细胞和人细胞；来自多种细胞类型的细胞，例如神经细胞和非神经细胞；并且可从异质细胞群、组织或生物体分离或者为它们的一部分。本文使用的术语“已建立细胞系”与“永生化细胞系”或“转化细胞系”同义，是指从源自生物体、组织或器官来源的细胞群中选择用于无限增殖的细胞的细胞培养物。根据定义，已建立细胞系排除了原代细胞的细胞培养物。本文使用的术语“原代细胞”是直接从新鲜组织或器官采集的细胞，不具备无限增殖的能力。已建立细胞系可以包括异质细胞群或均质细胞群。源自单细胞的已建立细胞系被称为克隆细胞系。已建立细胞系可以是这样的细胞系，即其细胞内源性地表达细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——必需的所有组分。或者，已建立细胞系可以是这样的细胞系，即其细胞已从外源导入至少一种对所述细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——必需的组分。还要提及的是通过遗传工程建立的细胞系，来自这种已建立细胞系的细胞可以表达例如外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2、外源性SNAP-25或者它们的任意组合。
本公开的一些方面部分地包括一种来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞。本文使用的术语“对BoNT/A中毒敏感的细胞”、“对由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的细胞”或“来自对由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞”是指可以进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的细胞。根据定义，对BoNT/A中毒敏感的细胞必须表达或者被工程化以表达至少一种BoNT/A受体和至少一种SNAP-25底物。本文使用的术语“可以摄取BoNT/A的细胞”或“可以摄取BoNT/A的已建立细胞系包含的细胞”是指可以进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且该机制涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的细胞。根据定义，可以摄取BoNT/A的细胞必须表达或者被工程化以表达至少一种BoNT/A受体和至少一种SNAP-25底物。
因此，在一个实施方案中，来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的。在该实施方案的一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少或者约100pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约90pM或更少、约80pM或更少、约70pM或更少、约60pM或更少、约50pM或更少、约40pM或更少、约30pM或更少、约20pM或更少或者约10pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。又在另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约9pM或更少、约8pM或更少、约7pM或更少、约6pM或更少、约5pM或更少、约4pM或更少、约3pM或更少、约2pM或更少或者约1pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。仍在另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞对由例如约0.9pM或更少、约0.8pM或更少、约0.7pM或更少、约0.6pM或更少、约0.5pM或更少、约0.4pM或更少、约0.3pM或更少、约0.2pM或者约0.1pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。本文使用的术语“约”在修饰陈述项目、数目、百分数或条件的值时，是指所陈述项目、数目、百分数或条件的值加减百分之十的范围。
在另一实施方案中，已建立细胞系包含的细胞可以摄取BoNT/A。在该实施方案的一些方面中，已建立细胞系包含的细胞可以摄取例如约500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少或者约100pM或更少的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，已建立细胞系包含的细胞具有摄取约90pM或更少、约80pM或更少、约70pM或更少、约60pM或更少、约50pM或更少、约40pM或更少、约30pM或更少、约20pM或更少或者约10pM或更少的BoNT/A的能力。还在另一些方面中，已建立细胞系包含的细胞具有摄取约9pM或更少、约8pM或更少、约7pM或更少、约6pM或更少、约5pM或更少、约4pM或更少、约3pM或更少、约2pM或更少或者约1pM或更少的BoNT/A的能力。仍在另一些方面中，已建立细胞系包含的细胞具有摄取约0.9pM或更少、约0.8pM或更少、约0.7pM或更少、约0.6pM或更少、约0.5pM或更少、约0.4pM或更少、约0.3pM或更少、约0.2pM或更少或者约0.1pM或更少的BoNT/A的能力。
本公开的一些方面部分地包括BoNT/A。本文使用的术语“BoNT/A”与“血清型A肉毒神经毒素”或“A型肉毒杆菌神经毒素”同义，是指天然BoNT/A和非天然BoNT/A，除了包括约150kDa的BoNT/A神经毒素自身之外，还包括包含约150kDa的BoNT/A神经毒素和关联的非毒素相关蛋白（NAP）的BoNT/A复合体。BoNT/A复合体的非限制性实例包括例如900-kDa的BoNT/A复合体、500-kDa的BoNT/A复合体、300-kDa的BoNT/A复合体。约150kDa的BoNT/A神经毒素的非限制性实例包括例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。
本文使用的术语“天然BoNT/A”是指通过天然过程产生的任何BoNT/A，非限制地包括从翻译后修饰、可变剪接转录或自发突变产生的BoNT/A异型体（isoform）；以及BoNT/A亚型，例如BoNT/A1亚型、BoNT/A2亚型、BoNT/A3亚型、BoNT/A4亚型和BoNT/A5亚型。天然BoNT/A非限制地包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，或者从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个氨基酸而得到的序列。可市购的天然BoNT/A的药物组合物非限制地包括
Figure BDA00002373359300371
(Allergan,Inc.,Irvine,CA)、
Figure BDA00002373359300372
(Ipsen Ltd.,Slough,England)、
Figure BDA00002373359300373
(Mentor Corp.,Santa Barbara,CA)、
Figure BDA00002373359300374
(Merz Pharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)、
Figure BDA00002373359300375
(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,South Korea)或BTX-A。
本文使用的术语“非天然BoNT/A”是指其结构借助人的操作被修饰的任何BoNT/A，非限制地包括通过使用随机诱变或合理设计的遗传工程产生的氨基酸序列被改变的BoNT/A；或者通过体外化学合成产生的BoNT/A。非天然BoNT/A的非限制性实例记载于例如Steward,L.E.et al.,Post-translational Modifications and Clostridial Neurotoxins，美国专利7,223,577;Dolly，J.O.et al.,Activatable Clostridial Toxins，美国专利No.7,419,676；Steward,L.E.et al.，Clostridial Neurotoxin compositions andModified Clostridial Neurotoxins,US 2004/0220386；Steward,L.E.et al.，Modified Clostridial Toxins With Enhanced Targeting Capabilities ForEndogenous Clostridial Toxin Receptor Systems，美国专利公开文本No.2008/0096248；Steward,L.E.et al.，Modified Clostridial Toxins WithAltered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells，美国专利公开文本No.2008/0161543；Steward,L.E.et al.，Modified ClostridialToxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered TargetingActivity For Clostridial Toxin Target Cells，美国专利公开文本No.2008/0241881中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
因此，在一个实施方案中，所要检测的BoNT/A活性来自天然BoNT/A。在该实施方案的一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自BoNT/A异型体或BoNT/A亚型。在该实施方案的一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自
Figure BDA00002373359300381
或BTX-A。
在另一实施方案中，所要检测的BoNT/A活性来自非天然BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A变体。在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A变体。仍在该实施方案的另一些方面中，所要检测的BoNT/A活性来自相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A变体。
本公开的一些方面部分地包括SNAP-25。本文使用的术语“SNAP-25”是指优先被BoNT/A剪切的天然SNAP-25或非天然SNAP-25。本文使用的术语“优先被......剪切”是指，BoNT/A对BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A对任何其他底物的剪切速率高至少1个数量级。在该实施方案的一些方面中，BoNT/A对BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A对任何其他底物的剪切速率高至少2个数量级、高至少3个数量级、高至少4个数量级或者高至少5个数量级。
本文使用的术语“天然SNAP-25”是指通过天然过程产生的任何SNAP-25，非限制地包括从翻译后修饰、可变剪接转录或自发突变产生的SNAP-25异型体，以及SNAP-25亚型。天然SNAP-25非限制地包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24，或者从SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23或SEQ ID NO:24置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。
本文使用的术语“非天然SNAP-25”是指其结构借助人的操作被修饰的任何SNAP-25，非限制地包括通过使用随机诱变或合理设计的遗传工程产生的SNAP-25；或者通过体外化学合成产生的SNAP-25。非天然SNAP-25的非限制性实例记载于例如Steward，L.E.et al.，FRET ProteaseAssays for Clostridial Toxins，美国专利7,332,567；Fernandez-Salas et al.,Lipohilic Dye-based FRET Assays for Clostridial Toxin Activity，美国专利公开文本2008/0160561，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。非天然SNAP-25可以从SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸。
因此，在一个实施方案中，SNAP-25是天然SNAP-25。在该实施方案的一些方面中，所述SNAP-25是SNAP-25异型体或SNAP-25亚型。在该实施方案的一些方面中，所述天然SNAP-25是SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24的天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。
在另一实施方案中，SNAP-25是非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在该实施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相对于SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。
SNAP-25可以是内源性SNAP-25或外源性SNAP-25。本文使用的术语“内源性SNAP-25”是指天然存在于细胞中的SNAP-25，因为它天然地在所述细胞的基因组中被编码，使得所述细胞固有地表达所述SNAP-25，而不需要外源SNAP-25或者编码SNAP-25的外源遗传物质。内源性SNAP-25的表达可以需要也可以不需要环境刺激例如细胞分化。根据定义，内源性SNAP-25只能是天然SNAP-25或其变体。例如，如下已建立细胞系表达内源性SNAP-25：BE(2)-M17、Kelly、LA1-55n、N1E-115、N4TG3、N18、Neuro-2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。
本文使用的术语“外源性SNAP-25”是指通过人的操作导入外源性SNAP-25或编码SNAP-25的外源性遗传物质而在细胞中表达的SNAP-25。外源性SNAP-25的表达可以需要也可以不需要环境刺激，例如细胞分化。作为一个非限制性实例，来自已建立细胞系的细胞可以通过SNAP-25的瞬时或稳定转染而表达外源性SNAP-25。作为另一个非限制性实例，来自已建立细胞系的细胞可以通过SNAP-25的蛋白转染而表达外源性SNAP-25。外源性SNAP-25可以是天然SNAP-25或其变体，或者非天然SNAP-2或其变体。
因此，在一个实施方案中，来自已建立细胞系的细胞可表达内源性SNAP-25。在该实施方案的一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23或SEQ ID NO:24。在该实施方案的再一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是天然SNAP-25，例如SNAP-25异型体或SNAP-25亚型。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性SNAP-25是与SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。
在另一实施方案中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达外源性SNAP-25。在该实施方案的一个方面中,来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的天然SNAP-25。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然SNAP-25，例如SNAP-25异型体或SNAP-25亚型。又在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。
在该实施方案的另一方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然SNAP-25。
检测BoNT/A底物在暴露于BoNT/A后的剪切的测定可用于评估细胞是否表达内源性或外源性SNAP-25。在这些测定中，SNAP-25剪切产物的生成会在BoNT/A处理后的表达SNAP-25的细胞中检测到。成熟的试剂、条件和方案以及具体蛋白质印迹分析的非限制性实例可容易地获自商业的供应商，非限制地包括Amersham Biosciences,Piscataway，NJ;Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA;Pierce Biotechnology，Inc.,Rockford,IL;Promega Corporation,Madison,WI,and Stratagene,Inc.,La Jolla,CA。应理解的是，对SNAP-25剪切的这些测定和类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性SNAP-25的细胞。
作为非限制性实例，使用可识别BoNT/A SNAP-25剪切产物或者可识别剪切和非剪切两种形式SNAP-25的抗体的蛋白质印迹分析可用于测定BoNT/A的摄取。可用于这些测定中的α-SNAP-25抗体实例非限制地包括α-SNAP-25小鼠单克隆抗体SMI-81（Sternberger MonoclonalsInc.,Lutherville,MD）、小鼠α-SNAP-25单克隆抗体CI 71.1（SynapticSystems,Goettingen,Germany）、α-SNAP-25小鼠单克隆抗体CI 71.2（Synaptic Systems,Goettingen,Germany）、α-SNAP-25小鼠单克隆抗体SP12（Abcam,Cambridge,MA）、α-SNAP-25兔多克隆抗血清（SynapticSystems,Goettingen,Germany）、α-SNAP-25兔多克隆抗血清（Abcam,Cambridge,MA）和α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684（Sigma,St Louis,MO）。
本公开的一些方面部分地包括一种BoNT/A受体。本文使用的术语“BoNT/A受体”是指以诱发BoNT/A中毒反应的方式优先与BoNT/A相互作用的天然BoNT/A受体或非天然BoNT/A受体。本文使用的术语“优选与......相互作用”是指BoNT/A对BoNT/A受体的平衡解离常数（KD）比BoNT/A对细胞表面的任何其他受体的平衡解离常数低至少一个数量级。所述平衡解离常数是一种测量BoNT/A-BoNT/A受体复合体可逆地分离（解离）成其组分分子（即BoNT/A和BoNT/A受体）的具体平衡常数类型，定义为KD=Ka/Kd（平衡时）。所述缔合常数（Ka）定义为Ka=[C]/[L][R]，所述解离常数（KD）定义为Kd=[L][R]/[C]，其中[L]等于BoNT/A的摩尔浓度，[R]是BoNT/A受体的摩尔浓度，[C]是BoNT/A-BoNT/A受体复合体的摩尔浓度，并且所有浓度都是当***平衡时这些组分的浓度。解离常数越小，BoNT/A与其受体的结合越牢固，或者BoNT/A和BoNT/A受体之间的结合亲和性越大。在该实施方案的一些方面中，BoNT/A对BoNT/A受体的解离常数比BoNT/A对任何其他受体的解离常数低至少2个数量级、低至少3个数量级、低至少4个数量级或者低至少5个数量级。在该实施方案的另一些方面中，优先与BoNT/A受体相互作用的BoNT/A的结合亲和性可以具有例如500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小或者100nM或更小的平衡解离常数（KD）。在该实施方案的另一些方面中，优先与BoNT/A受体相互作用的BoNT/A的结合亲和性可以具有例如90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM,50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小或者10nM或更小的平衡解离常数（KD）。本文使用的术语“诱发BoNT/A中毒反应”是指BoNT/A受体与BoNT/A相互作用以形成神经毒素/受体复合体并随后使该复合体内化至细胞质中的能力。
本文使用的术语“天然BoNT/A受体”是指通过天然过程产生的任何BoNT/A受体，非限制地包括通过翻译后修饰、可变剪接转录或自发突变产生的BoNT/A受体异型体，以及BoNT/A受体亚型。天然BoNT/A受体非限制地包括成纤维细胞生长因子2（FGFR2）、成纤维细胞生长因子3（FGFR3）、突触囊泡糖蛋白（SV2）和复合神经节苷脂如GT1b，例如以下文献中描述的那些：Ester Fernandez-Salas,et al.，BotulinumToxin Screening Assays，美国专利公开文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,et al.，Botulinum Toxin Screening Assays，美国专利公开文本2008/0182799；Min Dong et al.,SV2 is the Protein Receptor forBotulinum Neurotoxin A,Science(2006)；S.Mahrhold et al,The SynapticVesicle Protein 2C Mediates the Uptake of Botulinum Neurotoxin A intoPhrenic Nerves,580(8)FEBS Lett.2011-2014(2006)，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。天然FGFR2非限制地包括SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70，或者从SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。天然FGFR3非限制地包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27，或者从SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。天然SV2非限制地包括SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31，或者从SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸而得到的序列。
本文使用的术语“非天然BoNT/A受体变体”是指借助人的操作或设计产生的任何BoNT/A受体，非限制地包括通过使用随机诱变或合理设计的遗传工程产生的BoNT/A受体以及通过化学合成产生的BoNT/A受体。非天然BoNT/A变体的非限制性实例包括例如保守BoNT/A受体变体、非保守BoNT/A受体变体、BoNT/A受体嵌合变体和活性BoNT/A受体片段。
本文使用的术语“非天然BoNT/A受体”是指其结构借助人的操作被改变的任何BoNT/A受体，非限制地包括通过使用随机诱变或理性设计的遗传工程产生的BoNT/A受体以及通过体外化学合成产生的BoNT/A受体。非天然BoNT/A变体的非限制性实例记载于例如EsterFernandez-Salas,et al.，Botulinum Toxin Screening Assays，美国专利公开文本2008/0003240；Ester Fernandez-Salas,et al.，Botulinum ToxinScreening Assays，美国专利公开文本2008/0182799中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。非天然BoNT/A受体可以从SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70置换、缺失或添加例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多氨基酸。
因此，在一个实施方案中，BoNT/A受体是天然BoNT/A受体，例如FGFR2、FGFR3或SV2。在该实施方案的一些方面中，所述BoNT/A受体是BoNT/A受体异型体或BoNT/A受体亚型。在该实施方案的一些方面中，所述天然BoNT/A受体是SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受体。
在另一实施方案中，BoNT/A受体是非天然BoNT/A受体，例如通过遗传工程产生的FGFR2、通过遗传工程产生的FGFR3或通过遗传工程产生的SV2。在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是相对于SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。仍在该实施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受体是相对于SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。
BoNT/A受体可以是内源性BoNT/A受体或外源性BoNT/A受体。本文使用的术语“内源性BoNT/A受体”是指在细胞中天然存在的BoNT/A受体，因为它天然地在所述细胞的基因组中被编码，使得所述细胞固有地表达所述BoNT/A受体，而不需要外源的BoNT/A受体或编码BoNT/A受体的外源遗传物质。内源性BoNT/A受体的表达可以需要也可以不需要环境刺激，例如细胞分化或启动子活化。例如，如下已建立细胞系可表达至少一种内源性BoNT/A受体：BE(2)-M17、Kelly、LA1-55n、N1E-115、N4TG3、N18、Neuro-2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。内源性BoNT/A受体只能是天然BoNT/A受体或者其天然变体。
本文使用的术语“外源性BoNT/A受体”是指通过经人的操作导入外源BoNT/A受体或编码BoNT/A受体的外源遗传物质在细胞中表达的BoNT/A受体。外源性BoNT/A受体的表达可以需要也可以不需要环境刺激，例如细胞分化或启动子活化。作为非限制性实例，通过编码BoNT/A受体例如FGFR2、FGFR3或SV2的多核苷酸分子的瞬时或稳定转染，来自已建立细胞系的细胞可以表达一种或多种外源性BoNT/A受体。作为非限制性实例，通过所述BoNT/A受体例如FGFR2、FGFR3或SV2的蛋白转染，来自已建立细胞系的细胞可以表达一种或多种外源性BoNT/A受体。外源性BoNT/A受体可以是天然BoNT/A受体或其天然变体，或者非天然BoNT/A受体或其非天然变体。
因此，在一个实施方案中，来自已建立细胞系的细胞可表达内源性BoNT/A受体。在该实施方案的一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。在该实施方案的再一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是天然BoNT/A受体，例如BoNT/A受体异型体或BoNT/A受体亚型。在该实施方案的另一些方面中，由来自已建立细胞系的细胞表达的内源性BoNT/A受体是与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受体。
在另一实施方案中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达外源性BoNT/A受体。在该实施方案的一个方面中,来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的天然BoNT/A受体。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然BoNT/A受体，例如BoNT/A受体异型体或BoNT/A受体亚型。又在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受体。
在该实施方案的另一方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达非天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受体。在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多非连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达相对于SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQID NO:69或SEQ ID NO:70具有例如1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多或者100个或更多连续氨基酸置换、缺失或添加的非天然BoNT/A受体。
在另一实施方案中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2或它们的组合。在该实施方案的一些方面中,来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然FGFR2、天然FGFR3、天然SV2或它们的任意组合。仍在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达非天然FGFR2、非天然FGFR3、非天然SV2或它们的任意组合。又在该实施方案的另一些方面中，来自已建立细胞系的细胞被瞬时或稳定地工程化以表达天然FGFR2或非天然FGFR2、天然FGFR3或非天然FGFR3、天然SV2或非天然SV2或者它们的任意组合。
表达一种或多种内源性或外源性BoNT/A受体的细胞可以通过常规的方法包括毒素摄取的直接和间接测定进行鉴定。确定BoNT/A结合或摄取性质的测定可用于评估细胞是否表达BoNT/A受体。这类测定非限制地包括使用标记的BoNT/A例如[125I]BoNT/A、[125I]的交联测定，参见，例如Noriko Yokosawa et al.,Binding of Clostridium botulinum type Cneurotoxin to different neuroblastoma cell lines,57(1)Infect.Immun.272-277(1989);Noriko Yokosawa et al.,Binding of botulinum type Cl，Dand E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes,29(2)Toxicon261-264(1991);and Tei-ichi Nishiki et al.,Identification of protein receptorfor Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes,269(14)J.Biol.Chem.10498-10503(1994)。其他非限制性测定包括使用标记或非标记抗体检测BoNT/A结合的免疫细胞化学测定，参见例如Atsushi Nishikawa et al.,The receptor and transporter for internalization ofClostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells,319(2)Biochem.Biophys.Res.Commun.327-333(2004)；以及使用标记或非标记抗体检测结合的毒素的免疫沉淀测定，参见例如Yukako Fujinaga etal.,Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridiumbotulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells anderythrocytes,150(Pt 5)Microbiology 1529-1538(2004)。可用于这些测定的抗体非限制地包括选择对抗BoNT/A的抗体；选择对抗BoNT/A受体如FGFR2、FGFR3或SV2的抗体；以及/或者选择对抗神经节苷脂如GD1a、GD1b、GD3、GQ1b或GT1b的抗体。如果抗体被标记，那么分子的结合可以通过多种方式检测，包括蛋白质印迹分析、抗体细胞位置的直接显微镜观察、在洗涤步骤后对细胞或结合有底物的抗体的测量、流式细胞术、电泳或毛细管电泳、本领域技术人员公知的应用技术。如果抗体是未标记的，可应用标记的二级抗体来间接地检测所述结合的分子，检测可同标记的抗体那样进行。应理解的是，确定BoNT/A摄取性质或特征的这些测定和类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性BoNT/A受体的细胞。
检测暴露于BoNT/A后的分子释放的测定还可用于评估细胞是否表达一种或多种内源性或外源性BoNT/A受体。在这些测定中，对分子释放的抑制将出现于BoNT/A处理后的表达BoNT/A受体的细胞中。公知的测定包括测量对放射标记的儿茶酚胺从神经元释放的抑制，例如[3H]去甲肾上腺素或[3H]多巴胺释放，参见例如A Fassio et al.,Evidence forcalcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxinand Botulinum Toxin type F，90(3)Neuroscience 893-902(1999)；和SaraStigliani et al.,The sensitivity of catecholamine release to Botulinum ToxinC1 and E suggests selective targeting of Vesicles set into the readilyreleasable pool，85(2)J.Neurochem.409-421(2003)；或者使用荧光测定量方法测量儿茶酚胺释放，参见，例如Anton de Paiva et al.,A role for theinterchain disulfide or its participating thiols in the internalization ofbotulinum Neurotoxin A revealed by a toxin derivative that binds toecto-acceptors and inhibits transmitter release intracellularly,268(28)J.Biol.Chem.20838-20844(1993)；Gary W.Lawrence et al.,Distinctexocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells aftercleavage of the 25-kDa synaptosomal-associated protein(SNAP-25)orsynaptobrevin by Botulinum Toxin A or B,236(3)Eur.J.Biochem.877-886(1996)和；Patrick Foran et al.,Botulinum Neurotoxin C1 cleaves bothsyntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells:correlation with its blockade of catecholamine release,35(8)Biochemistry2630-2636(1996)。其他非限制性实例包括测量对激素从内分泌细胞例如垂体前叶细胞或卵巢细胞释放的抑制的测定。应理解的是，对于分子释放的这些测定和类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性BoNT/A受体的细胞。
检测暴露于BoNT/A后对BoNT/A底物的剪切的测定还可以用于评估细胞是否表达一种或多种内源性或外源性BoNT/A受体。在这些测定中，BoNT/A底物剪切产物的生成或完整BoNT/A底物的消失可在BoNT/A处理后的表达BoNT/A受体的细胞中检测到。成熟的试剂、条件和方案以及具体蛋白质印迹分析的非限制性实例可容易地获自商业的供应商，非限制地包括Amersham Biosciences,Piscataway，NJ;Bio-RadLaboratories,Hercules,CA;Pierce Biotechnology，Inc.,Rockford,IL;Promega Corporation,Madison,WI,and Stratagene,Inc.,La Jolla,CA。应理解的是，用于BoNT/A底物剪切的这些测定或类似测定可用于鉴定表达内源性或外源性BoNT/A受体的细胞。
作为非限制性实例，使用识别BoNT/A SNAP-25剪切产物或者剪切和非剪切两种形式的SNAP-25的抗体的蛋白质印迹分析可以用于测定BoNT/A的摄取。用于这些测定的α-SNAP-25抗体的实例非限制地包括α-SNAP-25小鼠单克隆抗体SMI-81（Sternberger Monoclonals Inc.,Lutherville,MD）、小鼠α-SNAP-25单克隆抗体CI 71.1（Synaptic Systems,Goettingen,Germany）、α-SNAP-25小鼠单克隆抗体CI 71.2（SynapticSystems,Goettingen,Germany）、α-SNAP-25小鼠单克隆抗体SP12（Abcam,Cambridge,MA）、α-SNAP-25兔多克隆抗血清（SynapticSystems,Goettingen,Germany）、α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684（Sigma,St.Louis,MO）和α-SNAP-25兔多克隆抗血清（Abcam,Cambridge,MA）。
本公开的方面可提供这样的细胞，即这种细胞通过遗传操作或重组工程化制备以表达外源性SNAP-25和/或一种或多种外源性BoNT/A受体。用于通过遗传操作或重组工程化表达外源性SNAP-25和/或一种或多种外源性BoNT/A受体的细胞包括可以表达或者不表达内源性SNAP-25和/或一种或多种内源性BoNT/A受体的神经元细胞和非神经元细胞。还应理解的是，这类遗传操作的或重组工程化的细胞可在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件和/或增强子元件的控制下表达外源性SNAP-25和一种或多种外源性BoNT/A受体。应理解的是，可以使用任何细胞，条件是所述细胞可被遗传操作或者被重组工程化以表达外源性SNAP-25和/或一种或多种外源性BoNT/A受体，并且能够发生BoNT/A中毒。
用于向细胞导入编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物如SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的组分的外源性多核苷酸分子的方法非限制地包括化学介导的递送方法，例如磷酸钙介导的递送方法、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖介导的递送方法、脂质介导的递送方法、聚乙烯亚胺（PEI）介导的递送方法、聚赖氨酸介导的递送方法和聚凝胺介导的递送方法；物理介导的递送方法，例如基因枪、显微注射、原生质体融合和电穿孔；以及病毒介导的递送方法，例如反转录病毒介导的转染，参见例如Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells,pp.16.1-16.62(Sambrook & Russell,eds.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Vol.3,3rd ed.2001)；Alessia Colosimo et al.,Transfer and Expression ofForeign Genes in Mammalian Cells,29(2)Biotechniques 314-318,320-322,324(2000)；Philip Washbourne & A.Kimberley McAllister，Techniques forGene Transfer into Neurons,12(5)Curr.Opin.Neurobiol.566-573(2002)；和Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons,pp9.16.4-9.16.11(2000)，它们的每一篇均通过援引的方式全文纳入本文中。本领域技术人员可以理解的是，对将多核苷酸分子导入细胞的具体方法的选择将部分地依赖于所述细胞是否会瞬时或稳定地包含对所述细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的组分。编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的组分的多核苷酸分子的非限制性实例如下：SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的FGFR2多核苷酸分子；SEQID NO:139、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141的FGFR3多核苷酸分子；SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的SV2多核苷酸分子；以及SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146的SNAP-25多核苷酸分子。
化学介导的递送方法是本领域普通技术人员公知的，并且记载于例如Martin Jordan & Florian Worm,Transfection of Adherent andSuspended Cells by Calcium Phosphate,33(2)Methods 136-143(2004);Chun Zhang et al.,Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery toBrain-Derived Cells,33(2)Methods 144-150(2004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。这类化学介导的递送方法可以通过标准步骤进行并且有市售，参见例如CellPhect Transfection Kit(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)；Mammalian Transfection Kit,Calciumphosphate and DEAE Dextran,(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)；LipofectamineTM Transfection Reagent(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)；ExGen 500 Transfection kit(Fermentas,Inc.,Hanover，MD)，以及SuperFect and Effectene Transfection Kits(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)。
物理介导的递送方法是本领域普通技术人员公知的，并且记载于例如Jeike E.Biewenga et al.,Plasmid-Mediated Gene Transfer in Neuronsusing the Biolistics Technique,71(1)J.Neurosci.Methods.67-75(1997)；John O’Brien & Sarah C.R.Lummis,Biolistic and Diolistic Transfection:Using the Gene Gun to Deliver DNA and Lipophilic Dyes into MammalianCells,33(2)Methods 121-125(2004)；M.Golzio et al.,In Vitro and In VivoElectric FieId-Mediated Permeabilization,Gene Transfer，and Expression,33(2)Methods 126-135(2004)；和Oliver Greschet al.,New Non-ViralMethod for Gene Transfer into Primary Clls,33(2)Methods 151-163(2004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
病毒介导的递送方法是本领域普通技术人员公知的，并且记载于例如Chooi M.Lai et al.,Adenovirus and Adeno-Associated Virus Vectors,21(12)DNA Cell Biol.895-913(2002);Ilya Frolov et al.,Alphavirus-BasedExpression Vectors:Strategies and Applications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996);Roland Wolkowicz et al.,LentiviralVectors for the Delivery of DNA into Mammalian Cells,246Methods Mol.Biol.391-411(2004);A.Huser & C.Hofmann,Baculovirus Vectors:NovelMammalian Cell Gene-Delivery Vehicles and Their Applications,3(1)Am.J.Pharmacogenomics  53-63(2003);Tiziana Tonini et al.,TransientProduction of Retroviral-and Lentiviral-Based Vectors for the Transductionof Mammalian Cells,285 Methods Mol.Biol.141-148(2004);ManfredGossen & Hermann Bujard,Tight Control of Gene Expression inEukaryotic Cells by Tetracycline-Responsive Promoters,美国专利No.5,464,758;Hermann Bujard & Manfred Gossen,Methods for RegulatingGene Expression,美国专利No.5,814,618;David  S.Hogness,Polynucleotides Encoding lnsect Steroid Hormone Receptor Polypeptidesand Cells Transformed With Same,美国专利No.5,514,578;David S.Hogness,Polynucleotide Encoding Insect Ecdysone Receptor,美国专利6,245,531;Elisabetta Vegeto et al.,Progesterone Receptor Having C.Terminal Hormone Binding Domain Truncations,美国专利No.5,364,791;Elisabetta Vegeto et al.,Mutated Steroid Hormone Receptors，Methods forTheir Use and Molecular Switch for Gene Therapy,美国专利No.5,874,534，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。这类病毒介导的递送方法可以通过标准步骤进行并且有市售，参见例如ViraPowerTMAdenoviral Expression System(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和ViraPowerTM Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543version A,Invitrogen,Inc.,(Jul.15,2002)；以及AdEasyTM AdenoviralVector System(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)和AdEasyTM AdenoviralVector System Instruction Manual 064004f，Stratagene,Inc。再者，这类病毒介导的递送方法可以通过标准方法进行并且有市售，参见例如BDTMTet-Off and Tet-On Gene Expression Systems(BD Biosciences-Clonetech,Palo Alto,CA)、BDTM Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems UserManual,PT3001-1,BD Biosciences Clonetech,(Mar.14,2003)、GeneSwitchTM System(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、GeneSwitchTMSystem A Mifepristone-Regulated Expression System for MammalianCells version D,25-0313,Invitrogen,Inc.,(Nov.4,2002)；ViraPowerTMLentiviral Expression System(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)andViraPowerTM Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501version E,Invitrogen,Inc.,(Dec.8,2003)；以及CompleteRetroviral Inducible Mammalian Expression System(Stratagene,LaJolla,CA)和Complete
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Retroviral Inducible MammalianExpression System Instruction Manual,064005e。
因此，在一个实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的一种组分的多核苷酸分子。在另一实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此机制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多种组分的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞瞬时包含编码SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。
在另一实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的一种组分的多核苷酸分子。在另一实施方案中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码对细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多种组分的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在该实施方案的一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQID NO:137或SEQ ID NO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在该实施方案的另一些方面中，来自对BoNT/A中毒敏感的已建立细胞系的细胞稳定地包含编码SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。
如上述，可以将对于细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本说明书中公开的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的组分导入细胞。可用于用递送试剂将这类外源性组分导入细胞群的任一和所有方法都可使用，条件是该方法可将本说明书中公开的外源性组分瞬时导入给定细胞群的至少50%的细胞中。因此，该实施方案的一些方面可包括这样的细胞群，即其中该给定细胞群的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%瞬时包含对于细胞进行全部细胞机制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本说明书中公开的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的外源性组分。本文使用的术语“递送试剂”是指能够实现或者增强共价连接、非共价连接或者以任意其他方式关联的多肽至细胞中的内化的任何分子。因此，术语“递送试剂”非限制地涵盖非限制地将共价或非共价连接的分子转运至细胞膜、细胞质或核的蛋白、肽、拟肽、小分子、多核苷酸分子、脂质体、脂质、病毒、反转录病毒和细胞。还应理解的是，术语“递送试剂”涵盖通过任何机制内化的分子，包括经受体介导的胞吞作用发挥功能的递送试剂，以及不依赖于受体介导的胞吞作用的递送试剂。
递送试剂还可以是例如通过化学轭合或者借助遗传产生的融合蛋白实现或者增强共价连接的组分如FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的细胞摄取的试剂。共价连接递送试剂的方法以及使用这类试剂的方法记载于例如Steven F.Dowdy，Protein Transduction System and Methods ofUse Thereof，国际公开文本No WO 00/34308;Gérard Chassaing & AlainProchiantz,Peptides which can be Used as Vectors for the IntracellularAddressing of Active Molecules,美国专利No.6,080,724;Alan Frankel etal.,Fusion Protein Comprising TAT-derived Transport Moiert,美国专利No.5,674,980;Alan Frankel et al.,TAT-derived Transport PolypeptideConjugates,美国专利No.5,747,641;Alan Frankel et al.,TAT-derivedTransport Polypeptides and Fusion Proteins,美国专利No.5,804,604;Peter F.J.O’Hare et al.,Use of Transport Proteins,美国专利No.6,734,167;Yao-Zhong Lin & Jack J.Hawiger，Method for ImportingBiologically Active Molecules into Cells,美国专利No.5,807,746;Yao-Zhong Lin & Jack J.Hawiger，Method for Importing BiologicallyActive Molecules into Cells,美国专利No.6,043,339;Yao-Zhong Lin et al.,Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with CellMembrane Translocating Activity,美国专利No.6,248,558;Yao-Zhong Linet al.,Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with CellMembrane Translocating Activity,美国专利No.6,432,680;Jack J.Hawiger et al.,Method for Importing Biologically Active Molecules intoCells,美国专利No.6,495,518;Yao-Zhong Lin et al.,Sequence andMethod for Genetic Engineering of Proteins with Cell MembraneTranslocating Activity,美国专利No.6,780,843;Jonathan B.Rothbard &Paul A Wender，Method and composition for Enhancing Transport AcrossBiological Membranes,美国专利No.6,306,993;Jonathan B.Rothbard &Paul A Wender，Method and composition for Enhancing Transport AcrossBiological Membranes,美国专利No.6,495,663;and Pamela B.Davis etal.,Fusion Proteins for Protein Delivery,美国专利No.6,287,817中，它们的每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
递送试剂还可以是实现或者增强非共价连接的组分如FGFR2、FGFR3、SV2c或SNAP-25的细胞摄取的试剂。在无共价连接的情况下发挥功能的方法以及使用这类试剂的方法记载于例如Gilles Divita et al，Peptide-Mediated Transfection Agent and Methods of Use，美国专利No.6,841,535；Philip L Felgner and Olivier Zelphati,Intracellular ProteinDelivery compositions and Methods of Use,美国专利公开文本No.2003/0008813；和Michael Karas,Intracellular Delivery of Small Molecules，Proteins and Nucleic Acids，美国专利公开文本2004/0209797中,它们的每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。这类肽递送试剂可以通过标准方法制备和使用并且有示售，参见例如CHARIOTTM Reagent(ActiveMotif，Carlsbad,CA)；
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Reagent(Gene Therapy Systems,Inc.,San Diego,CA)、BIO TREKTM Protein Delivery Reagent(Stratagene,La Jolla,CA)和PRO-JECTTM Protein Transfection Reagent(PierceBiotechnology Inc.,Rockford,IL)。
本公开的一些方面部分地包括一种包含BoNT/A的样品。本文使用的术语“包含BoNT/A的样品”是指包含或可能包含活性BoNT/A的任何生物物质。多种样品可依照本说明书中公开的方法测定，所述样品非限制地包括纯化的、部分纯化的或未纯化的BoNT/A；天然或非天然序列的重组单链或双链毒素；具有改良蛋白酶特异性的重组BoNT/A；细胞特异性改变的重组BoNT/A；大体积BoNT/A；制成制剂的BoNT/A产品，包括例如
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BTX-A；以及来自例如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物来源的细胞或者粗的、分离的或部分纯化的细胞裂解液；血液、血浆或血清；生、半熟、熟或经加工的食物；饮料；动物饲料；土壤样品；水样；池塘底泥；洗剂；化妆品；以及临床制剂。应理解的是，术语样品涵盖组织样品，非限制地包括哺乳动物组织样品；家畜组织样品如绵羊、牛和猪组织样品；灵长类组织样品；以及人组织样品。这类样品非限制地包括肠样品如婴儿肠样品以及获自伤口的组织样品。作为非限制性实例，检测皮摩尔量的BoNT/A活性的方法可用于确定BoNT/A在血液或饮料样品中的存在情况或活性；可用于测定来自例如暴露于BoNT/A或者具有一种或多种肉毒中毒症状的人或动物的样品；可用于在大体积BoNT/A的产生和纯化中跟踪活性；可用于测定在药物或化妆品应用中使用的制成制剂的BoNT/A产品；或者可用于测定受试者血清中是否存在中和α-BoNT/A抗体。
因此，在一个实施方案中，包含BoNT/A的样品是包含任意量BoNT/A的样品。在该实施方案的一些方面中，包含BoNT/A的样品包含约100ng或更少、约10ng或更少、约1ng或更少、约100pg或更少、约10pg或更少或者约1pg或更少的BoNT/A。在该实施方案的另一些方面中，包含BoNT/A的样品包含约1μM或更少、约100nM或更少、约10nM或更少、约1nM或更少、约100pM或更少、约10pM或更少、约1pM或更少、约100fM或更少、约10fM或更少或者约1fM或更少的BoNT/A。
本公开的一些方面部分地包括从处理细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25组分。本文使用的术语“包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25组分”是指包含所述SNAP-25剪切产物的细胞组分。可想象的是，可以使用适合用于富集或分离SNAP-25组分的任何方法，非限制地包括细胞裂解方案、离心柱（spin-column）纯化方案、免疫沉淀、亲和纯化和蛋白质色谱。
本公开的一些方面部分地包括连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体。本文使用的术语“固相支持物”与“固相”同义，是指可以用于固定化本说明书中公开的α-SNAP-25抗体的任何基质。固相支持物的非限制性实例包括例如管；盘；柱；针或“插棒”；磁性颗粒、小珠或其他球状或纤维状色谱介质，例如琼脂糖（agarose）、琼脂糖凝胶（sepharose）、二氧化硅和塑料；以及片或膜，例如硝酸纤维素和二氟化树脂聚偏氟乙稀（PVDF）。所述固相支持物可以使用很多材料例如玻璃、炭、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、重氮纤维素或淀粉构建。所选的固相支持物可以具有这样的物理性质，即该物理性质使得它易于与可溶性或未结合的物质分离，并且通常可使得未结合的物质如过量试剂、反应副产物或者溶剂从与固相支持物结合的测定组分中分离或者除去（通过例如洗涤、过滤、离心等）。如何制备以及使用固相支持物的非限制性实例记载于例如Molecular Cloning,A Laboratory Manual，见上文，(2001)；和Current Protocols in Molecular Biology，见上文，(2004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
本公开的一些方面部分地包括检测一种包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述α-SNAP-25抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。可想象的是，任何检测体系均可以用于实施这种公开的基于免疫的方法的一些方面，条件是信噪比可以以统计显著的程度将来自所述抗体-抗原复合体的信号与背景信号区分开。基于免疫的检测体系的非限制性实例包括免疫印迹分析如蛋白质印迹和斑点印迹、免疫沉淀分析、酶联免疫吸附分析（ELISA）和夹心ELISA。所述信号的检测可以借助如下技术使用放射自显影实现：成像或磷光成像（AU）、化学发光（CL）、电化学发光（ECL）、生物发光（BL）、荧光、共振能转移、平面极化、比色法或流式细胞术（FC）。基于免疫的检测***的描述公开于例如Michael M.Rauhut,Chemiluminescence,In Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology(Ed.Grayson,3rd ed,John Wiley and Sons,1985);A.W.Knight,A Review ofRecent Trends in Analytical Applications of ElectrogeneratedChemiluminescence,Trends Anal.Chem.18(1):47-62(1999);K.A.Fahnrich,et al.,Recent Applications of ElectrogeneratedChemiluminescence in Chemical Analysis,Talanta 54(4):531-559(2001);Commonly Used Techniques in Molecular Cloning,pp.A8.1-A8-55(Sambrook & Russell,eds.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Vol.3,3rd ed.2001);Detection Systems,pp.A9.1-A9-49(Sambrook & Russell,eds.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Vol.3,3rd ed.2001);Electrogenerated Chemiluminescence,(Ed.Allen J.Bard,Marcel Dekker，Inc.,2004)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
夹心ELISA（或夹心免疫测定）是基于结合所述抗原上不同表位的两种抗体的方法。将对目的抗原具有高度结合特异性的捕获抗体结合于固体表面。然后加入所述抗原，并随后添加被称为检测抗体的二抗。所述检测抗体结合不同于针对捕获抗体的抗原表位。所述抗原因此“被夹在”所述两种抗体之间。所述抗体对所述抗原的结合亲和性通常是免疫测定灵敏度的主要决定因素。随着所述抗原浓度的增加，检测抗体的量也增加，导致测量到更高的反应。为了定量结合的程度，可以使用不同的报告体系，例如连接于二抗的酶和报告底物，这里酶促反应可形成作为检测信号的读数。所形成的信号与样品中存在的靶抗原的量成比例。用于测量所述结合事件的报告底物决定所述检测模式。分光光度计板式酶标仪用于比色法检测。已经开发出了化学发光和电化学发光底物，所述底物可进一步放大信号并且可以在发光酶标仪上读取。所述报告值还可以是荧光读数，这里以荧光团代替所述测定的酶步骤，然后使用荧光酶标仪测量所述读数。对进行ECL夹心ELISA所必需的试剂和方案有市售，非排他地包括MSD夹心ELISA-ECL检测平台（Meso ScaleDiscovery，Gaithersburg,MD）。
因此，在一个实施方案中，可以使用免疫印迹分析、免疫沉淀分析、ELISA或夹心ELISA检测包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述α-SNAP-25抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。在该实施方案的一些方面中，使用AU、CL、ECL或BL免疫印迹分析；AU、CL、ECL、BL或FC免疫沉淀分析；AU、CL、ECL、BL或FC ELISA；或者AU、CL、ECL、BL或FC夹心ELISA进行所述检测。
本公开的一些方面可以以单路或多路的方式实施。以单路方式实施的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法仅检测包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。以多路方式实施的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法同时检测两种或多种抗体-抗原复合体的存在情况；其中一种是包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端；其他的是针对第二、第三、第四等不同蛋白的抗体-抗原复合体。例如可以使用第二蛋白作为内部对照物，以通过将检出的α-SNAP-25/SNAP-25抗体-抗原复合体的量相对于对所述第二蛋白检出的抗体-抗原复合体的量标准化而最小化样品与样品之间的变异性。照此，所述第二蛋白通常是由所述细胞恒定表达的蛋白，例如管家蛋白。可用的第二蛋白的非限制性实例包括例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、突触融合蛋白、细胞因子。以多路方式进行基于免疫的测定的方法记载于例如U.B.Nielsen and B.H.Geierstanger，Multiplexed Sandwich Assays in Microarray Format，J.Immunol.Methods.290(1-2):107-120 2004);R.Barry and M,Soloviev，Quantitative ProteinProfiling using Antibody Arrays,Proteomics,4(12):3717-3726(2004);M.M.Ling et al.，Multiplexing Molecular Diagnostics and Immunoassaysusing Emerging Microarray Technologies,Expert Rev Mol Diagn.7(1):87-98(2007);S.X.Leng et al.,ELISA and Multiplex Technologies forCytokine Measurement in Inflammation and Aging Research,J Gerontol ABiol Sci Med Sci.63(8):879-884(2008)中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。
因此，在一个实施方案中，基于免疫的检测BoNT/A活性的方法通过以下方式以单路的方式实施：仅检测包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。在另一实施方案中，基于免疫的检测BoNT/A活性的方法通过以下方式以多路的方式实施：同时检测包含α-SNAP-25抗体和SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体以及针对SNAP-25之外的其他蛋白例如GAPDH或突触融合蛋白的至少一种其他抗体-抗原复合体的存在情况，所述SNAP-25剪切产物在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。
本公开的一些方面部分地提供了一种测定BoNT/A免疫抗性的方法。本文使用的术语“BoNT/A免疫抗性”是指哺乳动物对于BoNT/A治疗不完全反应，或者由于以下原因显示出降低的BoNT/A治疗的有利效应：所述哺乳动物的免疫反应直接或间接地降低所述治疗的有效性。有效性降低的非限制性实例可以是在哺乳动物中存在至少一种中和α-BoNT/A抗体，所述中和α-BoNT/A抗体可以以降低或阻断所述毒素特异性或活性的方式结合于BoNT/A毒素。本文使用的术语“BoNT/A治疗”是指使用BoNT/A毒素或者给予哺乳动物具有医学、治疗、治愈、美容、矫正或任何其他有利效应的一个或多个受控剂量的BoNT/A毒素的药剂、制剂或混合物，抵消需要神经调制的哺乳动物中的不利事物的治疗、矫正、治愈、愈合、康复或者任何其他方式。BoNT/A治疗非限制地涵盖与任何载体或活性成分组合并通过任何给药途径给药的任何制剂形式的其任何天然或修饰片段的使用。例如，公知的BoNT/A治疗是治疗。
本公开的一些方面部分地提供了一种从被测试是否存在α-BoNT/A中和抗体的哺乳动物中获得的试验样品。本文使用的术语“试验样品”是指包含或可能包含至少一种α-BoNT/A抗体的任何生物物质。α-BoNT/A抗体可以是中和抗BoNT/A抗体或非中和抗BoNT/A抗体。本文使用的术语“中和BoNT/A抗体”是指任何这样的α-BoNT/A抗体，即该α-BoNT/A抗体在生理条件下会以减少或阻止所述毒素在BoNT/A治疗中发挥其效应的方式结合于BoNT/A毒素的一个区域。本文使用的术语“非中和α-BoNT/A抗体”是指任何这样的α-BoNT/A抗体，即该α-BoNT/A抗体在生理条件下会结合于BoNT/A毒素的一个区域，但不阻止所述毒素在BoNT/A治疗中发挥其效应。可想象的是，可包含α-BoNT/A抗体的任一和所有样品均可用于该方法中，所述样品非限制地包括血液、血浆、血清和淋巴液。另外，能够产生抗BoNT/A毒素的α-BoNT/A抗体的任一和所有生物均可用作样品来源，所述生物非限制地包括鸟和哺乳动物，所述哺乳动物包括小鼠、大鼠、山羊、绵羊、马、驴、牛、灵长类和人。用于血液采集和血清制备的具体方案的非限制性实例记载于例如Marjorie Schaub Di Lorenzo & Susan King Strasinger，BLOOD COLLECTION IN HEALTHCARE(F.A.Davis Company，2001)；和Diana Garza & Kathleen Becan-McBride,PHLEBOTOMY HANDBOOK:BLOOD COLLECTION ESSENTIALS(Prentice Hall,6th ed.,2002)中。这些方案是本领域技术人员公知并且在本文中有教导的常规方法。试验样品可在如下时间从生物体获得：暴露于BoNT/A毒素之前、单次BoNT/A处理后、多次BoNT/A毒素处理后、对BoNT/A治疗的抗性发生之前或对BoNT/A治疗的抗性发生之后。
本公开的一些方面部分地提供了一种对照样品。本文使用的术语“对照样品”是指已知其中是否存在试验样品的任何样品，包括阴性和阳性对照样品。对于中和α-BoNT/A抗体，阴性对照样品可以获自未曾暴露于BoNT/A的个体，并且可非限制地包括来自提供所述试验样品的相同个体、但在进行BoNT/A治疗前采集的样品；从未曾暴露于BoNT/A的不同个体中采集的样品；从多个未曾暴露于BoNT/A的不同个体中采集的混合样品。对于中和α-BoNT/A抗体，阳性对照样品可以获自表现出BoNT/A免疫抗性的个体，所述个体非限制地包括在基于患者的测试中测试为阳性的个体；在体内生物测定中测试为阳性的个体；以及显示高免疫性的抗体，例如已接种BoNT/A的个体。
还可预知的是，α-BoNT/A抗体可以从样品中纯化。BoNT/A抗体可以通过多种方法从样品中纯化，所述方法非限制地包括蛋白A/G色谱法和亲和色谱法。从样品中纯化抗体的具体方案的非限制性实例记载于例如ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Edward Harlow & David Lane,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1998)；USINGANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL:PORTABLE PROTOCOL NO.I(Edward Harlow & David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998)；和MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，见上文,(2001)中，它们通过援引的方式纳入本文。另外，成熟的试剂、条件和方案以及抗体纯化方法的非限制性实例可容易地获自商业的供应商，非限制地包括Pierce Biotechnology，Inc.,Rockford,IL；和Zymed Laboratories,Inc.,South San Francisco,CA。这些方案是本领域技术人员熟知的常规方法。
因此，在一个实施方案中，样品包括血液。在该实施方案的一个方面中，所述样品包括小鼠血、大鼠血、山羊血、绵羊血、马血、驴血、牛血、灵长类血或人血。在另一实施方案中，样品包括血浆。在该实施方案的一个方面中,试验样品包括小鼠血浆、大鼠血浆、山羊血浆、绵羊血浆、马血浆、驴血浆、牛血浆、灵长类血浆或人血浆。在另一实施方案中，样品包括血清。在该实施方案的一个方面中，所述样品包括小鼠血清、大鼠血清、山羊血清、绵羊血清、马血清、驴血清、牛血清、灵长类血清和人血清。在另一实施方案中，样品包括淋巴液。在该实施方案的一个方面中，样品包括小鼠淋巴液、大鼠淋巴液、山羊淋巴液、绵羊淋巴液、马淋巴液、驴淋巴液、牛淋巴液、灵长类淋巴液或人淋巴液。仍在另一实施方案中，样品是试验样品。仍在另一实施方案中，样品是对照样品。在该实施方案的一些方面中，对照样品是阴性对照样品或阳性对照样品。
本公开的一些方面部分地提供了，对在步骤(d)中检出的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的量与在步骤(e)中检出的在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25的量进行比较。在一个实施方案中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量高于所述对照样品中SNAP-25剪切产物的量。在该实施方案的一个方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比阳性对照样品中的高指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性降低或者无BoNT/A免疫抗性。在该实施方案的另一方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量与阴性对照样品中的相当指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性降低或者无BoNT/A免疫抗性。在另一实施方案中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比对照样品中的低。在该实施方案的一个方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比阳性对照样品中的低或与之相当指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。在该实施方案的另一方面中，所述试验样品中SNAP-25剪切产物的量比阴性对照样品中的低指示所述哺乳动物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。
可想象的是，适合用于检测样品中的中和α-BoNT/A抗体存在情况的任一和所有测定条件均可用于本说明书中公开的方法中，例如线性测定条件或非线性测定条件。在一个实施方案中，所述测定条件是线性的。在该实施方案的一个方面中，BoNT/A的测定量是过量的。在该实施方案的另一方面中，BoNT/A的测定量是限速的。在该实施方案的另一方面中，试验样品的测定量是限速的。
本公开的一些方面还可以描述如下：
1．一种组合物，包含与连接于SNAP-25抗原的柔性连接体连接的载体，所述SNAP-25抗原在BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端。
2．1的组合物，其中所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基是谷氨酰胺或赖氨酸。
3．1的组合物，其中所述SNAP-25抗原包括SEQ ID NO:147。
4．1的组合物，其中所述柔性连接体和所述SNAP-25抗原的氨基酸序列是SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:46。
5．一种分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。
6．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述α-SNAP-25抗体对不包含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位具小于1×101M-1s-1的缔合速率常数；其中所述α-SNAP-25抗体对于所述表位具有小于0.450nM的平衡解离常数。
7．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体具有包含选自如下序列的氨基酸序列的重链可变区：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:82；并具有包含选自如下序列的氨基酸序列的轻链可变区：SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:92。
8．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQ ID NO:93的VH CDR1、SEQ ID NO:94的VH CDR1、SEQID NO:95的VH CDR1、SEQ ID NO:118的VH CDR1、SEQ ID NO:119的VH CDR1或SEQ ID NO:120的VH CDR1。
9．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQ ID NO:96的VH CDR2、SEQ ID NO:97的VH CDR2、SEQID NO:98的VH CDR2、SEQ ID NO:99的VH CDR2、SEQ ID NO:121的VH CDR2、SEQ ID NO:122的VH CDR2或SEQ ID NO:123的VHCDR2。
10．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQ ID NO:100的VH CDR3、SEQ ID NO:101的VH CDR3、SEQ ID NO:102的VH CDR3或SEQ ID NO:124的VH CDR3。
11．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQ ID NO:103的VL CDR1、SEQ ID NO:104的VL CDR1、SEQ ID NO:105的VL CDR1、SEQ ID NO:106的VL CDR1、SEQ ID NO:107的VL CDR1、SEQ ID NO:125的VL CDR1、SEQ ID NO:126的VLCDR1、SEQ ID NO:127的VL CDR1、SEQ ID NO:128的VL CDR1或SEQ ID NO:129的VL CDR1。
12．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQ ID NO:108的VL CDR2、SEQ ID NO:109的VL CDR2、SEQ ID NO:110的VL CDR2、SEQ ID NO:111的VL CDR2或SEQ IDNO:112的VL CDR2。
13．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体至少包含SEQ ID NO:113的VL CDR3、SEQ ID NO:114的VL CDR3、SEQ ID NO:115的VL CDR3、SEQ ID NO:116的VL CDR3或SEQ IDNO:117的VL CDR3。
14．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体包含包括SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:100的重链可变区；以及包括SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:115的轻链可变区。
15．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体可选择性地结合于SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148的SNAP-25表位。
16．5的分离的α-SNAP-25抗体，其中所述分离的α-SNAP-25抗体可选择性地结合SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的SNAP-25表位。
17．一种检测BoNT/A活性的方法，所述方法包括步骤：a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。
18．一种检测BoNT/A活性的方法，所述方法包括步骤：a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。
19．一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤：a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。
20．一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤：a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。
21．一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤：a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及d)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。
22．一种检测BoNT/A活性方法，所述方法包括步骤：a)用包含BoNT/A的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；b)从所处理的细胞中分离这样的SNAP-25组分，即该SNAP-25组分包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物；c)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；以及e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；其中所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A的活性。
23．一种测定哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤：a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。
24．一种测定哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤：a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性样品对照包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。
25．一种检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤：a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对BoNT/A中毒是敏感的；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；e)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；f)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；g)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-f，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及h)将步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤f中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。
26．一种测定哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤：a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。
27．一种检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤：a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；e)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；f)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-e，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及g)将步骤e中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤e中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。
28．一种检测哺乳动物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步骤：a)将BoNT/A添加至从被测试α-BoNT/A中和抗体是否存在的哺乳动物中获得的试验样品中；b)用所述试验样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞可以摄取BoNT/A；c)从所述处理的细胞中分离包含在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分；d)将所述SNAP-25组分固定于固相支持物；e)将所述SNAP-25组分与α-SNAP-25抗体相接触，其中所述α-SNAP-25抗体可以结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位；f)检测包含所述α-SNAP-25抗体和所述SNAP-25剪切产物的抗体-抗原复合体的存在情况；g)以阴性对照样品代替试验样品重复步骤b-f，所述阴性对照样品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗体的血清；以及h)将步骤f中检测到的抗体-抗原复合体的量与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量对比，其中与步骤g中检测到的抗体-抗原复合体的量相比，步骤f中检测到较低量的抗体-抗原复合体的检测结果指示α-BoNT/A中和抗体的存在。
29．17-22和23-25的方法，其中所述细胞对于由约500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少、约100pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。
30．20-22和26-28的方法，其中所述细胞可以摄取约500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少、约100pM或更少的BoNT/A。
31．17-22的方法，其中所述样品包含约100ng或更少、约10ng或更少、约1ng或更少、100fg或更少、10fg或更少或者1fg或更少的BoNT/A。
32．17-22的方法，其中所述样品包含约100nM或更少、约10nM或更少、约1nM或更少、约100pM或更少、约10pM或更少、约1pM或更少、约100fM或更少、约10fM或更少或者约1fM或更少的BoNT/A。
33．17-28的方法，其中所述α-SNAP-25抗体是5-16的分离的α-SNAP-25抗体。
34．17-28的方法，其中抗体-抗原复合体的存在情况通过免疫印迹分析、免疫沉淀分析、ELISA或夹心ELISA检测。
35．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少3:1、至少5:1、至少10:1、至少20:1、至少50:1或至少100:1的信噪比下限。
36．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少10:1、至少20:1、至少50:1、至少100:1、至少200:1、至少300:1、至少400:1、至少500:1或至少600:1的信噪比上限。
37．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以检测例如至少100ng、至少50ng、至少10ng、至少5ng、至少100pg、至少50pg、至少10pg、至少5pg、至少100fg、至少50fg、至少10fg或至少5fg的EC50活性。
38．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以检测例如至少10nM、至少5nM、至少100pM、至少50pM、至少10pM、至少5pM、至少100fM、至少50fM、至少10fM、至少5fM或至少1fM的EC50活性。
39．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如10pg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、1pg或更少的BoNT/A的LOD。
40．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如100fM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者10fM或更少的BoNT/A的LOD。
41．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如10pg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、1pg或更少的BoNT/A的LOQ。
42．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如100fM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者10fM或更少的BoNT/A的LOQ。
43．17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以将完全活性BoNT/A与具有部分活性BoNT/A区分开：所述部分活性为完全活性BoNT/A的活性的70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少。
实施例
实施例I
候选细胞系的筛查
下述实施例描述了如何鉴定对本说明书中公开的检测BoNT/A活性的方法所必需的对BoNT/A中毒敏感的或者具有BoNT/A摄取能力的已建立细胞系。
1．候选细胞系的原种培养物的生长
为了培养所述细胞系，将合适密度的来自要测试细胞系的细胞铺板于含有30mL合适的生长培养基（见表1）的162cm2组织培养瓶中，并且在37℃的培养箱中于5%或10%二氧化碳下孵育，直至细胞达到所需的密度。
Figure BDA00002373359300751
Figure BDA00002373359300761
2．使用1nM BoNT/A的候选细胞系的单剂量筛查。
为了提高基于细胞的测定的灵敏度而测试的一个参数是鉴定呈现良好的梭菌神经毒素摄取能力以及粘附于底物表面的能力的合适细胞系。首先，测试了细胞系摄取1nM BoNT/A的能力以及粘附于表面的能力。为了确定细胞系是否能够摄取1nM BoNT/A，将合适密度的来自要测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于含有1mL合适的血清生长培养基(表1）的24孔组织培养板的孔中。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞达到所需的密度（大约18–24小时）。从每孔中吸出生长培养基并替换为1)不含毒素的新鲜培养基（不处理的细胞系）或2)含有1nM的BoNT/A复合体的新鲜生长培养基（处理的细胞系）。在孵育过夜后，通过将生长培养基吸出并用200μl的1×PBS漂洗每个孔来洗涤所述细胞。为了收集所述细胞，将1×PBS吸出，通过添加50μl的2×SDS加样缓冲液来裂解所述细胞，将裂解物转移至洁净的试管中，并将所述样品加热至95℃维持5分钟。
为了测定未剪切的SNAP-25底物和剪切的SNAP-25产物的存在情况，通过蛋白质印迹分析了来自每个采集样品的一份样品。在该分析中，使用
Figure BDA00002373359300771
Novex 12%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA），通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性、还原条件下将1份12μl的采集样品分离。使用SD半干电泳转细胞装置（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA），通过蛋白质印迹将分离的肽从所述凝胶转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA）上。将PVDF膜通过在室温下在包含如下组分的溶液中孵育2小时进行封闭：Tris缓冲盐水(TBS)(25mM 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇盐酸(Tris-HCl)(pH 7.4)、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾)、0.1%
Figure BDA00002373359300773
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、2%牛血清白蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉。在4℃下，将封闭的膜在包含1)1:5,000稀释的α-SNAP-25小鼠单克隆抗体作为一抗(SMI-81;Sternberger Monoclonals Inc.,Lutherville,MD)、或者2)1:5,000稀释的S9684α-SNAP-25兔多克隆抗血清作为一抗(Sigma,St.Louis,MO)的TBS、0.1%
Figure BDA00002373359300774
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、2%BSA和5%脱脂奶粉中孵育过夜。α-SNAP-25小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体两者都可以检测所述未剪切的SNAP-25底物和所述SNAP-25剪切产物，使得可以评估每个细胞系中的总体SNAP-25表达以及BoNT/A处理后剪切的SNAP-25百分比，作为评估BoNT/A摄取量的参数。将一抗探测的印迹物在TBS、
Figure BDA00002373359300775
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中洗涤3次，每次15分钟。在室温下，将经洗涤的膜在包含1)1:10,000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G重链和轻链(IgG，H+L)多克隆抗体(Zymed,South SanFrancisco,CA)作为二抗、或者2)1:10,000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔免疫球蛋白G重链和轻链(IgG，H+L)多克隆抗体(Zymed,South San Francisco,CA)作为二抗的TBS、0.1%
Figure BDA00002373359300781
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、2%BSA和5%脱脂奶粉中孵育2小时。将二抗探测的印迹物在TBS、0.1%
Figure BDA00002373359300782
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中洗涤3次，每次15分钟。使用ECL PlusTM蛋白质印迹检测***(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway，NJ)对标记的SNAP-25产物的信号检测进行可视化，对所述膜成像，并用Typhoon 9410Variable Mode Imager和Imager Analysis软件(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway，NJ)定量剪切百分比。像素大小（100–200像素）和PMT电压设定（350–600，通常400）取决于各个印迹物。表2显示在以1nM BoNT/A处理时检测到SNAP-25剪切产物的细胞系。如下的细胞系同时呈现1nM BoNT/A的摄取和对底物表面的适当粘附：BE(2)-M17、IMR-32、Kelly、LA1-55n、N1E-115、N4TG3、N18、Neuro-2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。
为了确定细胞系是否能够粘附于一个表面，将合适密度的来自所测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于含有1mL合适生长培养基的24孔组织培养板的孔中（表1）。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞达到所需的密度（大约18–24小时）。通过粘附于所述组织培养板的孔底表面的细胞相对于接种的总细胞数目的百分比评估细胞的粘附情况。细胞系CHP-126、IMR-32、LA-N-1、MC-IXC、NG115-401L、SK-N-BE(2)-C、SK-N-F1和SK-N-MC被认为是不合适的，原因是每一细胞系均呈现小于50%的粘附（表2）。测试的所有其他细胞系都呈现了合适的细胞粘附特征（表2）。
Figure BDA00002373359300783
Figure BDA00002373359300791
Figure BDA00002373359300801
实施例II
关于候选细胞系中神经毒素摄取的生长条件的评估
下述实施例描述了如何确定对BoNT/A中毒具有最大敏感性的或者具有BoNT/A摄取能力的已建立细胞系的生长条件。
1．细胞分化对候选细胞系的神经毒素摄取的效应。
为了确定细胞分化是否可提高神经毒素摄取，将呈现1nM BoNT/A摄取的细胞系转移至无血清培养基中，以诱导分化。将合适密度的来自所测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于包含1mL的无血清培养基的24孔组织培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约2–3天）。作为对照，将合适密度的来自所测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于含有1mL合适生长培养基（表1）的24孔组织培养板的孔中。在37℃的培养箱中将这些未分化的对照细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞达到所需的密度（大约18–24小时）。从每孔中吸出分化的和未分化的对照培养物的生长培养基并替换为包含0（不处理的样品）、0.1nM、0.3nM或1nM的BoNT/A复合体的新鲜培养基。在孵育过夜后，如实施例I中所述洗涤并收集所述细胞。
为了检测剪切的SNAP-25底物的存在情况，如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析了每个采集样品的一份样品，不同之处是使用12%26孔标准凝胶（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）通过SDS-PAGE分离采集的样品，并且将兔多克隆α-SNAP-25197抗体血清用作一抗（见实施例IV）。表3示出在以1nM BoNT/A处理时出现SNAP-25剪切产物的细胞系。在所测试的细胞系中，仅未分化状态的SiMa和Neuro-2a细胞系呈现0.1nM BoNT/A的摄取。然而，除SiMa和Neuro-2a之外，分化状态的细胞系N18、LA1-55n、PC12和SH-SY5Y也都呈现0.1nM BoNT/A的摄取。
Figure BDA00002373359300811
Figure BDA00002373359300821
2．神经节苷脂处理对分化候选细胞系的神经毒素摄取的效应
为了确定提高神经毒素的低亲和性结合的处理是否可以增加神经毒素摄取，将呈现1nM BoNT/A摄取的分化细胞系用神经节苷脂GT1b处理。将合适密度的来自所测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于包含如上述的无血清培养基的24孔组织培养板的孔中，含有或不含25μg/mLGT1b（Alexis Biochemicals,San Diego,CA）。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过如上述的标准和常规形态学标准评估。从每孔中吸出生长培养基并替换为包含0（不处理的样品）、1.9pM、3.7pM、7.4pM、14.8pM、29.7pM、59.4pM、118.8pM、237.5pM、574pM、950pM和1900pM的BoNT/A复合体的新鲜无血清培养基。将所述细胞系孵育两个不同时间：24小时和48小时。在毒素孵育后，如实施例I中所述洗涤并收集所述细胞。
为了检测剪切的SNAP-25底物的存在情况，如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析了每个采集样品的一份样品，不同之处是使用12%26孔标准凝胶（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）通过SDS-PAGE分离采集的样品，并且将兔多克隆α-SNAP-25197抗体血清用作一抗（见实施例IV）。表4示出神经节苷脂处理对分化细胞系摄取BoNT/A的能力的效应。这些结果表明可在蛋白质印迹中产生可检测的SNAP-25剪切产物带的最小BoNT/A浓度。
Figure BDA00002373359300831
3．具有增强候选细胞系的神经毒素摄取的细胞分化性质的无血清培养基的开发。
为了确定诱导细胞分化的改善处理是否能够提高神经毒素摄取，将SiMa、Neuro-2a和PC12细胞系培养在多种无血清培养基中以诱导分化。将合适密度的来自所测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于包含1mL的各种无血清测试培养基的24孔组织培养板的孔中。测试如下参数：1)不同基础培养基对BoNT/A摄取的效应（MEM和RPMI 1649）；2)神经营养因子是否存在对BoNT/A摄取的效应（N2添加物和B27添加物）；3)分化因子是否存在对BoNT/A摄取的效应（视黄酸和神经生长因子）；以及4)血清是否存在对BoNT/A摄取的效应（无血清培养基和较少血清培养基）。作为对照，将合适密度的来自所测试细胞系的原种培养物的细胞铺板于包含1mL对照无血清培养基（最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的24孔组织培养板的孔中。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约2–3天）。从每孔中吸出所述培养基并替换为包含0（不处理的样品）、0.005pM、0.015pM、0.05pM、0.14pM、0.42pM、1.2pM、3.7pM、11pM、33pM、100pM和300pM的BoNT/A复合体的新鲜无血清培养基。另外，将所述分化细胞用BoNT/A处理24小时，然后更换培养基并在无毒素的新培养基中孵育48小时以使SNAP-25剪切产物积聚。然后如实施例1中所述洗涤并收集细胞。
Figure BDA00002373359300841
为了检测SNAP-25剪切产物的存在情况，如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析了每个采集样品的一份样品，不同之处是使用12%26孔标准凝胶（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）通过SDS-PAGE分离采集的样品，并且使用α-SNAP-25197兔多克隆抗体血清（见实施例IV）。为每个细胞系确定的最优培养基显示于表5。表6显示当所述细胞系在这种优化的无血清培养基中生长时检测到的SNAP-25剪切产物的最小量。使用优化的无血清培养基使得在LA1-55n、Neuro-2a、PC-12和SiMa细胞系中检测到具有可接受的信噪比的BoNT/A活性信号（图2）。例如，对于Neuro-2a和PC12细胞，与对照无血清培养基相比，优化的分化条件使得检测到的SNAP-25剪切产物增加至5倍，对于SiMa细胞增加至几乎50倍。另外，下限3:1以及上限10:1的最小信噪比是开发经得起验证的可靠测定所必需的。在将从1.2pM的剂量检出的信号与0pM BoNT/A的背景信号对比时，除了LA-1-55n之外，所有优化细胞系都提供了下限至少3:1的信噪比（图2）。另外，在将从300pM的剂量检出的信号与0pM BoNT/A的背景信号对比时，所有优化细胞系都提供了上限至少100:1的信噪比（图2）。这些结果表明，这些细胞系的任一个均可以用于开发本说明书中公开的检测BoNT/A活性的基于免疫的方法，因为所述测定检测pM量的BoNT/A的存在。
Figure BDA00002373359300851
实施例III
选择性结合在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有游离羧基端的SNAP-25表位的α-SNAP-25单克隆抗体的开发
如下的实施例描述了如何制备可选择性结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位的α-SNAP-25单克隆抗体。
1.α-SNAP-25单克隆抗体的生成。
为了开发可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位的单克隆α-SNAP-25抗体，设计了13个残基的肽CDSNKTRIDEANQCOOH（SEQ ID NO:38）作为SNAP-25剪切产物抗原。该肽包含用于缀合于KLH的柔性连接体区和N端半胱氨酸残基，以及具有羧化C端谷氨酰胺的人SNAP-25(SEQ ID NO:5)第186-197位氨基酸(SEQ ID NO:38)。对仔细选择的独特肽序列生成单克隆抗体可对表位特异性进行控制，使得可以在紧密相关的异型体集合中鉴定特定的蛋白亚群。Blast搜索表明，该肽仅与SNAP-25有高度的同源性，几乎不可能与神经元细胞中的其他蛋白有交叉反应性。还通过使用计算机算法仔细地检查所述序列，以确定亲水指数、蛋白质表面可及性、柔性区和有利的二级结构，然后确定了所选肽序列的正确定向和呈递。合成所述肽并将之缀合于钥孔傶血蓝蛋白（KLH）以增大免疫原性。用该肽免疫6只Balb/c小鼠，在约8周内进行3次免疫后，对小鼠取血用于测试。通过在4℃下孵育60分钟使所述血液凝固。在4℃下将所述凝固的血液以10,000×g离心10分钟，以使细胞碎片沉淀成块。将所形成的血清样品分成50μl的等份，并且在-20℃下保存至需要时。
基于本说明书中公开的其他SNAP-25抗原的类似方法可用于开发这样的α-SNAP-25单克隆抗体，即该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。例如，SEQID NO:45的SNAP-25抗原可代替SEQ ID NO:38的SNAP-25抗原缀合于KLH。再例如，SEQ ID NO:38的SNAP-25抗原的人SNAP-25第186-197位氨基酸可以替换为SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。
2．对α-SNAP-25单克隆抗体存在情况的筛查。
为了测定可选择性结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的α-SNAP-25单克隆抗体的存在情况，使用提取的小鼠血清进行了比较ELISA和基于细胞的剪切测定。对于比较ELISA，构建了2种融合蛋白：SEQ ID NO:48的
Figure BDA00002373359300861
-SNAP-25134-197和SEQ ID NO:49的
Figure BDA00002373359300862
-SNAP-25134-206。-SNAP-25134-197包含天然生物素化的氨基端连结于包含SEQ ID NO:5第134-197位氨基酸的SNAP-25肽的SEQ ID NO:50的16氨基酸BirA肽。
Figure BDA00002373359300864
-SNAP-25134-206包含天然生物素化的氨基端连结于包含SEQ ID NO:5第134-206位氨基酸的SNAP-25肽的SEQ ID NO:50的16氨基酸BirA肽。将这2种底物以10μg/mL
Figure BDA00002373359300871
-SNAP-25134-197和
Figure BDA00002373359300872
-SNAP-25134-206的浓度悬浮于1×PBS中。将所述
Figure BDA00002373359300873
-SNAP-25134-197和
Figure BDA00002373359300874
-SNAP-25134-206通过以下方式涂覆于不同的板上：加入大约100μl的合适底物溶液并将所述板在室温下孵育1小时。在37℃下，将经洗涤的板在0.5%BSA的1×TBS溶液中孵育1小时，所述溶液中含有1:10-1:100稀释的源自6只免疫小鼠（小鼠1、小鼠2、小鼠3、小鼠4、小鼠5和小鼠6）中的一只的含抗体血清。将经一抗探测的板在200μlTBS、0.1%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中洗涤4次，每次5分钟。在37℃下，将经洗涤的板在1×TBS中孵育1小时，所述TBS中含有1:10,000稀释的缀合于辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）作为二抗。将经二抗探测的板在200μl TBS、0.1%
Figure BDA00002373359300876
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中洗涤4次。通过使用ImmunoPure TMB底物试剂盒（PierceBiotechnology,Rockford,IL）的发色检测使标记SNAP-25产物的发色检测可视化。
Figure BDA00002373359300877
-SNAP-25134-197涂覆的板显现黄色，但
Figure BDA00002373359300878
-SNAP-25134-206涂覆的板未显现黄色，这表明所述α-SNAP-25抗体优先识别所述SNAP-25197剪切产物。结果表明在用于免疫的6只小鼠中，有3只小鼠（小鼠2、小鼠3和小鼠4)对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原具有更高的效价和更大的特异性。
使用ELISA轻链活性测定确认了这些结果。通过加入大约100μl的如下底物溶液制备了Reacti-Bind链亲和素涂覆的96孔板（PierceBiotechnology,Rockford,IL）：A-C排被涂覆以100μL的12种不同浓度的
Figure BDA00002373359300879
-SNAP-25134-197；D-H排被涂覆以100μL的10μg/mL的
Figure BDA000023733593008710
-SNAP-25134-206。通过如下方式洗涤所述板：吸出所述底物溶液并用200μl TBS、0.1%
Figure BDA000023733593008711
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每孔3次。在37℃下，将BoNT/A在BoNT/A孵育缓冲液（50mM pH 7.4的HEPES、1%胎牛血清、10μM ZnCl2、10mM二硫苏糖醇）中的稀释液预还原20分钟，将100μl预还原的BoNT/A添加至底物涂覆的板中并在37℃下孵育90分钟。通过如下方式洗涤BoNT/A处理的板：吸出所述BoNT/A孵育缓冲液并用200μl TBS、0.1%
Figure BDA000023733593008712
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个板3次。在37℃下，将经洗涤的板在0.5%BSA的1×TBS溶液中孵育1小时，所述溶液含有1:10-1:100稀释的含抗体的测试血清。将经一抗探测的板在200μl TBS、0.1%
Figure BDA00002373359300881
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中洗涤4次，每次5分钟。在37℃下，将经洗涤的板在1×TBS中孵育1小时，所述TBS中含有1:10,000稀释的缀合于辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）作为二抗。将经二抗探测的板在200μl TBS、0.1%
Figure BDA00002373359300882
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)中洗涤4次。通过使用ImmunoPure TMB底物试剂盒（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）的发色检测使标记的SNAP-25产物的发色检测可视化。使用来自所有6只免疫小鼠（小鼠1、小鼠2、小鼠3、小鼠4、小鼠5和小鼠6）的含抗体的血清，在BoNT/A处理的样品中检测到黄色显现，但在未处理的对照中未检测到，黄色显现关联所述SNAP-25197剪切产物的存在。因此，所述比较ELISA分析表明，在用于免疫的小鼠中，3只小鼠（小鼠2、小鼠3和小鼠4）对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原具有更高的效价和更大的特异性。
对于基于细胞的剪切测定，将合适密度的PC12细胞铺板于包含3mL合适血清培养基（表1）的60mm2组织培养板中。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳中培养，直至细胞达到合适的密度。通过如下方式制备500μL转染溶液：将在室温下孵育5分钟的包含15μLLipofectAmine 2000(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)的250μLOPTI-MEM低血清培养基添加至含10μg pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体(SEQ ID NO:51)的250μL OPTI-MEM低血清培养基中。所述pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体包含pQBI-25表达载体（QbiogeneInc.,Carlsbad,CA），其启动子元件功能性地连接于编码SEQ ID NO:52的GFP-BoNT/A轻链的多核苷酸。在室温下将该转染混合物孵育大约20分钟。将培养基替换为新鲜的无添加培养基，并将500μL转染溶液添加至所述细胞。然后，在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳中孵育大约6-18小时。如实施例II中所述洗涤并收集细胞。为了检测所述剪切的SNAP-25197产物的存在情况，如实施例II中所述通过蛋白质印迹分析了每个收集的样品的一份样品，不同之处是所用一抗是1:1,000稀释的含抗体血清并且所用二抗是1:20,000的小鼠α-IgG辣根过氧化物酶（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）。使用来自3只小鼠（小鼠2、小鼠3和小鼠4）的含抗体血清，在BoNT/A处理的样品中检测到了对应于所述SNAP-25197剪切产物的单条条带，但在未处理的对照中未检测到。因此，基于细胞的剪切测定表明，在用于免疫的小鼠中，3只小鼠（小鼠2、小鼠3和小鼠4）对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原具有更高的效价和更大的特异性。
3．杂交瘤的生产。
为了制备产生α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原——的杂交瘤，在最后一次“加强”免疫之后3天采集小鼠2的脾，使用标准的杂交瘤方案将脾细胞与骨髓瘤细胞P3-X63Ag8.653融合。将这些细胞铺板于5个96孔板中，并使用HAT培养基选择杂交瘤。在融合后8-14天内，用涂覆于两个不同板中的
Figure BDA00002373359300891
-SNAP-25134-197和
Figure BDA00002373359300892
-SNAP-25134-206肽通过比较ELISA进行对大约480个亲本克隆的第一次筛查。所述比较ELISA可提供快速的筛查方法，来鉴定可产生对所述剪切的SNAP-25197特异的抗体的杂交瘤。使用前述的基于细胞的剪切测定对前18个克隆进行进一步筛查以及并对LC/A转染细胞进行免疫染色。（表7）。
表7.对含α-SNAP-25单克隆抗体的上清液的分析
Figure BDA00002373359300893
Figure BDA00002373359300901
将克隆1D3、1G10、2E2、3C1、3C3和3E8通过有限稀释进一步克隆，因为这些克隆产生的条件培养基包含具有优先结合特异性的α-SNAP-25抗体，其对所述SNAP-25197剪切产物相对于其对所述SNAP-25206未剪切底物的结合特异性之比197/206为至少4:1；并使用基于细胞的剪切测定和被GFP-LC/A转染的PC12细胞的免疫染色来检测所述SNAP-25197剪切产物。类似地，将克隆2C9、2F11、3G2、4D1和4G6通过有限稀释进一步克隆，因为这些克隆产生的条件培养基包含具有优先结合特异性的α-SNAP-25抗体，其对所述SNAP-25206未剪切产物相对于其对所述SNAP-25197剪切底物的结合特异性之比197/206为至少1.5:1；并使用基于细胞的剪切测定来检测所述SNAP-25206未剪切底物。使用比较ELISA、基于细胞的剪切和免疫染色再次筛查这些单细胞衍生的克隆以确认它们的亲和性和特异性，并使用标准的方法区分所述抗体的同种型。由克隆1D3B8(IgM.k)、1G10A12(IgG3.k)、2C9B10(IgG3.k)、2E2A6(IgG3.k)、2F11B6(IgM.k)、3C1A5(IgG2a.k)和3C3E2(IgG2a.k)产生腹水。克隆3E8在克隆过程中停止产生抗体，无法进行进一步评估。
4．对α-SNAP-25单克隆抗体的结合特异性的评估。
为了评估α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可选择性地结合于具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基羧基端的SNAP-25抗原——的结合特异性，通过基于细胞的活性测定、免疫细胞化学和免疫沉淀，将来自克隆1D3B8、1G10A12、2C9B10、2E2A6、2F11B6、3C1A5和3C3E2的腹水用于检测SNAP-25剪切产物。
对于基于细胞的活性测定，通过如下方式确定结合特异性：通过蛋白质印迹分析分析含α-SNAP-25抗体的腹水检测未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物的能力。如上述将合适密度的PC12细胞铺板于包含3mL合适血清培养基的60mm2组织培养板中，在37℃的培养箱中于5%二氧化碳中孵育，直至细胞达到合适的密度，并以如下转染溶液转染：无pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体的转染溶液（未转染的细胞）或者含pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体的转染溶液（转染的细胞）。如实施例I中洗涤并收集所述细胞。为了检测未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物的存在情况，如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析了来自每个收集的样品的一份样品，不同之处是所用一抗是1:100稀释的含所述α-SNAP-25单克隆抗体的腹水并且所用二抗是1:20,000的缀合于辣根过氧化物酶的α-小鼠IgG（PierceBiotechnology,Rockford,IL）。另外，测试了3种可市购的小鼠α-SNAP-25单克隆抗体。依照制造商推荐以15,000的稀释度使用SMI-81(Sternberger Monoclonals Inc.,Lutherville,MD)，制造商指出该α-SNAP-25抗体可检测未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物。依照制造商推荐以1:100的稀释度使用MC-6050(Research &Diagnostic Antibodies,Las Vegas,NV)，制造商指出该α-SNAP-25抗体可检测未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物。依照制造商推荐以1:100的稀释度使用MC-6053(Research & Diagnostic Antibodies,Las Vegas,NV)，制造商指出该α-SNAP-25抗体仅可检测剪切的SNAP-25197产物。
表8显示了仅检测所述SNAP-25197剪切产物的含所述α-SNAP-25抗体的腹水。所述基于细胞的剪切测定表明，从克隆1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的腹水可合成对所述SNAP-25197剪切产物有高度结合特异性的α-SNAP-25单克隆抗体，这使得可相对于所述SNAP-25206未剪切底物选择性识别该剪切产物。市售的抗体SMI-81检测到了所述SNAP-25206未剪切底物，但仅很弱地识别所述SNAP-25197剪切产物（表8）。意外地，市售抗体MC-6050仅检测到了所述SNAP-25206未剪切底物，无法识别所述SNAP-25197剪切产物（表8）。甚至更意外地，市售抗体MC-6050仅检测到了所述SNAP-25206未剪切底物，无法识别所述SNAP-25197剪切产物，虽然制造商宣称该抗体可选择性地检测所述SNAP-25197剪切产物（表8）。因此，该分析表明，虽然1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2对所述SNAP-25197剪切产物呈现合适的选择性，但1G10A12和2F11B6未显现这种选择性。另外，市售抗体SMI-81、MC-6050和MC-6053都不适合用于本申请公开的基于免疫的方法中，因为它们都无法选择性地检测所述SNAP-25197剪切产物。
对于免疫细胞化学分析，通过如下方式确定结合特异性：通过免疫染色分析含α-SNAP-25抗体的腹水检测未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物的能力。参见例如Ester Fernandez-Salas et al.,PlasmaMembrane Localization Signals in the Light Chain of BotulinumNeurotoxin,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.101(9):3208-3213(2004)。如上述将合适密度的PC12细胞铺板、培养并以如下转染溶液转染：无pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体的转染溶液（未转染的细胞）或者含pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体的转染溶液（转染的细胞）。将所述细胞在1×PBS中洗涤，并在室温下于5mL的PAF中固定30分钟。将固定的细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，在5mL的0.5%
Figure BDA00002373359300921
X-100(聚乙二醇辛基酚醚)的1×PBS溶液中孵育，在1×PBS中洗涤，并在-20℃下在5mL甲醇中透化6分钟。将透化的细胞在室温下于5mL的100mM甘氨酸中封闭30分钟，在1×PBS洗涤，并在室温下在5mL的0.5%BSA的1×PBS溶液中封闭30分钟。将封闭的细胞在1×PBS中洗涤并在室温下于0.5%BSA的1×PBS溶液中孵育2小时，所述溶液包含1:10稀释的来自测试克隆杂交瘤细胞系的腹水。将一抗探测的细胞在1×PBS中洗涤3次，每次5分钟。在室温下，将洗涤的细胞在1×PBS中孵育2小时，所述PBS中含有1:200稀释的缀合于FLUOR 568的山羊抗小鼠免疫球蛋白G重链和轻链（IgG,H+L）多克隆抗体（Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA）作为二抗。将二抗探测的细胞在1×PBS中洗涤3次，每次5分钟。将洗涤细胞通过封固于
Figure BDA00002373359300923
封固培养基（Vector Laboratories,Burlingame,CA）中并盖上盖玻片制备用于显微镜检查。信号检测的图像以Leica共聚焦显微镜使用合适的激光设置获得。表8表明了特异性检测所述SNAP-25197切割产物的含所述α-SNAP-25抗体的腹水。所述免疫细胞化学分析表明，从克隆1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的腹水可合成对所述SNAP-25197剪切产物有高度结合特异性的α-SNAP-25单克隆抗体，这使得可相对于所述SNAP-25206未剪切底物优先识别该剪切产物。
对于免疫沉淀分析，通过如下方式确定结合特异性：分析蛋白A（HiTrapTM Protein A HP Columns,GE Healthcare,Amersham,Piscataway,NJ）、纯化的α-SNAP-25单克隆抗体沉淀未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物的能力。参见例如第8章Storing and Purifying Antibodies,第309-311页,Harlow & Lane，见上文,1998a。如上述将合适密度的PC12细胞铺板、培养并以如下转染溶液转染：含pQBI-25/GFP表达构建体的转染溶液（对照细胞；SEQ ID NO:53）或者含pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC表达构建体的转染溶液（实验细胞）。所述pQBI-25/GFP表达构建体包含一个其启动子元件功能性地连接于编码SEQ ID NO:54的GFP的多核苷酸的表达载体。在孵育过夜后，通过以下方式洗涤所述细胞：吸出所述生长培养基并以200μl 1×PBS漂洗每个孔。为了收集所述细胞，将PBS吸出，通过如下方式裂解细胞：添加包含50mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGDT、10%甘油、1%X-100(聚乙二醇辛基酚醚)和1×COMPLETETM蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Biosciences,Indianapolis,IN)的免疫沉淀裂解缓冲液并在4℃下孵育1小时。在4℃下将所述裂解的细胞以3,000×g离心10分钟以除去细胞碎片，并将上清液转移至洁净的管中并稀释至大约1mg/mL的蛋白浓度。将大约5μg的纯化单克隆抗体添加至0.5mL的稀释上清液中并在4℃下孵育2小时。在一抗孵育后，将大约50μl固定的蛋白G（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）添加至所述稀释上清液中并在4℃下孵育1小时。将所述孵育的上清液通过如下方式洗涤3次，每次30分钟：添加0.5mL免疫沉淀裂解缓冲液，在4℃下以300×g离心1分钟以使所固定的蛋白G成块状，并弃上清液。在洗涤后，将所述块状物重新悬浮于30μl的1×SDS加样缓冲液中，并将所述样品加热至95℃维持5分钟。为了检测未剪切的SNAP-25206底物和剪切的SNAP-25197产物二者的存在情况，如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析了来自每个收集的样品的一份样品，不同之处是所用一抗是1:1,000稀释的α-SNAP-25多克隆抗体血清并且所用二抗是1:20,000的兔α-IgG辣根过氧化物酶（Pierce Biotechnology,Rockford,IL）。表8显示了在免疫沉淀分析中特异性结合下所述SNAP-25197剪切产物的含α-SNAP-25抗体的腹水。所述免疫沉淀分析表明，从克隆2E2A6和3C1A5产生的腹水可合成对所述SNAP-25197剪切产物有高度结合特异性的α-SNAP-25单克隆抗体，这使得可相对于所述SNAP-25206未剪切底物优先识别该剪切产物。
表8.对含α-SNAP-25单克隆抗体的克隆腹水的分析
Figure BDA00002373359300941
5.对α-SNAP-25单克隆抗体的结合亲和性的评估。
为了测定对所述SNAP-25197剪切产物或所述SNAP-25206未剪切底物显示高度结合特异性的α-SNAP-25单克隆抗体的结合亲和性，在BIAcore 3000装置上使用羧甲基葡聚糖（CM5）传感器芯片（BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ）进行了结合亲和性测定。在25℃下用包含10mMHEPES(pH 7.4)、150mM氯化钠、3mM EDTA、0.005%(v/v)表面活性剂P20的HBS-EP缓冲液以10μl/min的流速运行。使用标准的胺偶联法，将包含SEQ ID NO:5的第134-197位氨基酸(SNAP-25134-197)或SEQ IDNO:5的第134-206位氨基酸(SNAP-25134-206)的SNAP-25肽共价连接于所述CM5传感器芯片的表面。简而言之，通过注入0.2M 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺的混合物7分钟活化所述CM5芯片；然后将所述SNAP-25肽在10mM醋酸钠（pH 4.0）中以10μL/分钟的流速注入20分钟；并且通过注入pH 8.5的1M乙醇胺盐酸盐7分钟封闭未反应的琥珀酰亚胺酯。所述芯片上固定的SNAP-25134-197或SNAP-25134-206的量表现为增加100-150个反应单位（约0.10-0.15ng/mm2）。市售α-SNAP-25抗体以及包含由克隆1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的腹水或者纯化单克隆抗体的抗体样品通过所述CM5芯片表面，缔合时间是10分钟，解离时间是20分钟。在两次运行之间通过以15μL/分钟的流速注入10mM甘氨酸-HCl(pH 2.5)1分钟再生所述表面。用BIAevaluation 3.0软件将传感图曲线拟合为1:1动力学结合模型。
结果表明，与SNAP-25未剪切底物相比，2E2A6和3C1A5对剪切的SNAP-25197产物是高度特异的（表9）。与MC-6050和MC-6053的结合亲和性相比，1D3B6对所述SNAP-25剪切产物的平衡解离常数是这些市售抗体的大约10倍（表9）。有意思的是，2E2A6对所述SNAP-25剪切产物的平衡解离常数仅比这些市售抗体的稍低（0.405nM相对于0.497和0.508nM）（表9）。由于这两种市售α-SNAP-25抗体均不选择性地识别所述SNAP-25剪切产物（表8），因此小于约0.5nM的平衡解离常数对实现该选择性似乎起一部分决定性作用。类似地，与MC-6050和MC-6053的结合亲和性相比，2E2A6具有慢约至少1倍的解离速率/解离常数（6.74×10-5相对于8.82×10-4s-1和1.18×10-3s-1）（表9）。这还表明，小于约8.82×10-4的解离速率/解离常数对实现对所述SNAP-25剪切产物的选择性结合似乎起一部分决定性作用。该结果与1D3B8是一致的，1D3B8具有5.78×10-5s-1的解离速率/解离常数（表9）。
表9.对α-SNAP-25单克隆抗体的结合亲和性的分析
Figure BDA00002373359300951
Figure BDA00002373359300961
*用两个不同芯片对该抗体进行两次独立运行。
a当最高125nM的α-SNAP-25单克隆抗体1D3B8通过所述CM5传感器芯片表面时，在10分钟的缔合时间后未观察到结合。
b当最高10μM的α-SNAP-25单克隆抗体2E2A6通过所述CM5传感器芯片表面时，在10分钟的缔合时间后未观察到结合。
c当最高100nM的α-SNAP-25单克隆抗体3C1A5通过所述CM5传感器芯片表面时，在10分钟的缔合时间后未观察到结合。
d当最高100nM的α-SNAP-25单克隆抗体2C9B10通过所述CM5传感器芯片表面时，在10分钟的缔合时间后未观察到结合。
6.对分离的α-SNAP-25单克隆抗体的表位的测序。
为了确定分离的α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原——的表位，将编码由杂交瘤1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的α-SNAP-25单克隆抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的多核苷酸分子测序。使用标准方案从每种杂交瘤提取并纯化mRNA，并使用寡聚dT反义引物或基因特异性（鼠类IgG1CH和κCL）反义引物将其反转录成cDNA。特异性鼠类和人恒定区引物用于在cDNA产生后通过PCR扩增cDNA，以确定所述抗体的同种型。简并VH和VL引物用于从所述cDNA扩增所述可变区。对于5’RACE，将同聚dCTP尾巴添加至所述cDNA的3’端。然后用寡dG正义引物和基因特异性（CH/KC）反义引物扩增所述重链和轻链。PCR产物包括至所述反义引物的信号肽、可变区和恒定区的序列。将所述PCR产物进行凝胶纯化以除去小片段，并克隆至平末端或TA载体中以进行测序。对每条链的5个独立克隆测序，对VH和VL链进行比对并确定共有序列（表10）。用于测定VH和VL氨基酸序列的方法记载于例如Roger A.Sabbadini,etal.,Novel Bioactive Lipid Derivatives and Methods of Making and UsingSame，美国专利公开文本2007/0281320；以及Peter Amersdorfer,et al.,Molecular Characterization of Murine Humoral Immune Response toBotulinum Neurotoxin Type A Binding Domain as Assessed by Using PhageAntibody Libraries,65(9)Infect.Immun.3743-3752中，以上每一篇均通过援引的方式全文纳入本文。另外，可通过商业化公司测序抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），并鉴定CDR区，参见，例如FusionAntibodies Ltd.,Northern Ireland。
包含由本说明书中公开的杂交瘤产生的α-SNAP-25单克隆抗体VH和VL链的多核苷酸序列如下：1D3B8VH(SEQ ID NO:71)、2C9B10VH(SEQ ID NO:73)、2E2A6VH(SEQ ID NO:75)、3C1A5VH变体1(SEQ IDNO:77)、3C1A5VH变体2(SEQ ID NO:79)、3C3E2VH(SEQ ID NO:81)；1D3B8VL(SEQ ID NO:83)、2C9B10VL(SEQ ID NO:85)、2E2A6VL(SEQ ID NO:87)、3C1A5VL(SEQ ID NO:89)和3C3E2VL(SEQ ID NO:91)。包含由本说明书中公开的杂交瘤产生的α-SNAP-25单克隆抗体VH和VL链的氨基酸序列如下：1D3B8VH(SEQ ID NO:72)、2C9B10VH(SEQ ID NO:74)、2E2A6VH(SEQ ID NO:76)、3C1A5VH变体1(SEQ IDNO:78)、3C1A5VH变体2(SEQ ID NO:80)、3C3E2VH(SEQ ID NO:82)；1D3B8VL(SEQ ID NO:84)、2C9B10VL(SEQ ID NO:86)、2E2A6VL(SEQ ID NO:88)、3C1A5VL(SEQ ID NO:90)和3C3E2VL(SEQ ID NO:92)。包含由所述杂交瘤1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2产生的α-SNAP-25单克隆抗体的VH和VL CDR区的氨基酸序列在表10中列出。
表10.α-SNAP-25单克隆抗体的VH和VL区的CDR序列
Figure BDA00002373359300971
Figure BDA00002373359300981
Figure BDA00002373359300991
包含由本说明书中公开的杂交瘤产生的α-SNAP-25单克隆抗体的VH CDR区变体的氨基酸序列的非限制性实例包括1D3B8的VH CDR1变体SEQ ID NO:118；2C9B10、2E2A6和3C1A5VH变体2的VH CDR1变体SEQ ID NO:119；3C1A5VH变体1和3C3E2的VH CDR1变体SEQID NO:120；1D3B8和2E2A6的VH CDR2变体SEQ ID NO:121；2C9B10和3C1A5VH变体2的VH CDR2变体SEQ ID NO:122；3C1A5VH变体1和3C3E2的VH CDR2变体SEQ ID NO:123；1D3B8和2C9B10的VHCDR3变体MDY；2E2A6和3C1A5VH变体2的VH CDR3变体MGY；以及3C1A5VH变体1和3C3E2的VH CDR3变体SEQ ID NO:124。包含由本说明书中公开的杂交瘤产生的α-SNAP-25单克隆抗体VLCDR区变体的氨基酸序列的非限制性实例包括1D3B8的VL CDR1变体SEQ IDNO:125；2C9B10的VL CDR1变体SEQ ID NO:126；2E2A6的VL CDR1变体SEQ ID NO:127；3C1A5的VL CDR1变体SEQ ID NO:128；3C3E2的VL CDR1变体SEQ ID NO:129；1D3B8的VL CDR2变体KVS；2C9B10的VLCDR2变体NAK；2E2A6的VLCDR2变体LVS；3C1A5的VL CDR2变体YAT；以及3C3E2的VL CDR2变体YAS。
实施例IV
α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可选择性地结合在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有游离羧基端的SNAP-25表位——的开发
如下的实施例描述了如何制备α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可以选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25表位。
为了开发α-SNAP-25多克隆抗体——该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位，设计了10个残基的肽CGGGRIDEANQ(SEQ ID NO:46)作为SNAP-25剪切产物抗原。该肽包含一个用于缀合于KLH的N端半胱氨酸残基、一个连接于人SNAP-25(SEQ ID NO:5)第191-197位氨基酸的G间隔柔性间隔区（GGG），并具有羧化C端谷氨酰胺。Blast搜索显示，该肽仅与SNAP-25有高度的同源性，而几乎不可能与神经细胞中的其他蛋白有交叉反应性。还通过使用计算机算法仔细地检查所述序列，以确定亲水指数、蛋白质表面可及性、柔性区和有利的二级结构，然后确定了所选肽序列的正确定向和呈递。合成所述肽并将之缀合于钥孔傶血蓝蛋白（KLH）以增大免疫原性。在免疫动物之前，首先在蛋白质印迹中用来自候选细胞系的细胞的裂解液筛查未免疫兔，目的是鉴定对所述细胞裂解液中存在的蛋白无免疫反应性的动物。以该肽免疫2只预筛选的兔，在约8周内进行3次免疫后，对兔取血用于测试。通过在4℃下孵育60分钟使所述血液凝固。在4℃下将所述凝固的血液以10,000×g离心10分钟，以使细胞碎片沉淀成块。将所形成的血清样品分成50μl的等份，并且在-20℃下保存至需要时。
基于本说明书中公开的其他SNAP-25抗原的类似方法可用于开发这样的α-SNAP-25多克隆抗体，即该抗体可结合在SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的表位。例如，SEQID NO:47的SNAP-25抗原可代替SEQ ID NO:46的SNAP-25抗原缀合于KLH。再例如，SEQ ID NO:38的SNAP-25抗原的人SNAP-25第191-197位氨基酸可以替换为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148。
2．对α-SNAP-25多克隆抗体存在情况的筛查。
为了测定可选择性结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的α-SNAP-25多克隆抗体的存在情况，如实施例III中所述使用提取的兔血清进行了比较ELISA和基于细胞的剪切测定。来自两只兔的血清都含有α-SNAP-25多克隆抗体，该抗体可以选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原。将所述α-SNAP-25兔多克隆抗体命名为NTP 22和NTP 23。
3.α-SNAP-25多克隆抗体的纯化。
为了纯化可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的α-SNAP-25多克隆抗体，使用包含SEQ ID NO:46的SNAP-25抗原的亲和柱纯化来自兔血清的NTP 22和NTP 23抗体。
4.对α-SNAP-25多克隆抗体的结合特异性的评估。
为了评估可选择性地结合于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25抗原的α-SNAP-25多克隆抗体的结合特异性，如实施例III中所述将纯化的NTP 22和NTP 23α-SNAP-25多克隆抗体用于通过基于细胞的活性测定、免疫细胞化学和免疫沉淀来检测剪切产物。基于细胞的剪切测定、免疫细胞化学分析和免疫沉淀分析都表明NTP 22和NTP 23α-SNAP-25多克隆抗体与未剪切的SNAP-25无交叉反应。因此，NTP 22和NTP 23均对所述SNAP-25197剪切产物具有高度的结合特异性，所述特异性使得相对于所述SNAP-25206未剪切底物优先识别该剪切产物。如实施例III中所述，对抗原的亲和性可以在BiAcore中使用SPR测定。
实施例V
夹心ELISA的组分和条件制备。
如下的实施例描述了怎样鉴定和制备对进行这样的夹心ELISA所必需的组分和条件，即该夹心ELISA可用于通过如下方式进行基于免疫的检测BoNT/A活性的方法：使用对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25特异的α-SNAP-25单克隆抗体对SNAP-25剪切产物进行检测。
1.来自经BoNT/A处理的细胞的细胞裂解液的制备。
为了获得BoNT/A处理的细胞裂解液用于分析，将合适密度的来自Neuro-2a原种培养物的细胞接种于包含50mL无血清培养基的T175烧瓶中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTMI、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约2–3天）。作为对照，将合适密度的来自Neuro-2a的原种培养物的细胞接种于含有50mL合适生长培养基（表1）的T175烧瓶中。在37℃的培养箱中将这些未分化的对照细胞于5%二氧化碳下孵育，直至达到50%的汇合（大约18小时）。从每孔中吸出分化的培养物和未分化的对照培养物的培养基并替换为包含0（不处理的样品）或10nM的BoNT/A复合体的新鲜培养基。在孵育过夜后，洗涤所述细胞，并通过在4°C下于新制备的Triton X-100裂解缓冲液（50mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%Triton X-100）中不断搅拌地裂解30分钟而收集所述细胞。在4°C下，使用桌面离心机将裂解的细胞以4000rpm离心20分钟以除去碎片。通过Bradford测定测量细胞裂解液的蛋白浓度。
2.夹心ELISA组分的制备和鉴定。
为了鉴定合适的捕获抗体-检测抗体对，对包含11种不同α-SNAP-25捕获抗体和7种不同α-SNAP-25检测抗体的捕获抗体-检测抗体对的26种不同组合进行ECL夹心ELISA分析（表12）。所用的α-SNAP-25抗体是本说明书中公开的2E2A6和3C1A5α-SNAP-25小鼠单克隆抗体；本说明书中公开的SMI-81、MC-6050和MC-6053α-SNAP-25小鼠单克隆抗体；本说明书中公开的NTP 23α-SNAP-25兔多克隆抗体；S9684α-SNAP-25兔多克隆抗体（Sigma,St.Louis,MO）；H-50α-SNAP-25兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）；C-18α-SNAP-25山羊多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）；N-19α-SNAP-25山羊多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）；以及SP12α-SNAP-25小鼠多克隆抗体（Santa CruzBiotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）。
为了制备所述捕获抗体溶液，使用标准的蛋白A纯化方案纯化α-SNAP-25MC-6050和MC-6053单克隆抗体，以及来自杂交瘤细胞系2E2A6和3C1A5的腹水中包含的α-SNAP-25单克隆抗体。所有其他α-SNAP-25抗体均是作为纯化抗体的形式而购买的。
为了制备所述检测抗体溶液，依照制造商的说明（Meso ScaleDiscovery,Gaithersburg,MD）将合适的α-SNAP-25抗体缀合于钌(II)-三-二吡啶-(4-甲基磺酸)NHS酯标记试剂（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）。该缀合反应是通过将30μL的蒸馏水复原的MSDSULFO-TAGTM储备溶液添加至200μL的2mg/mL α-SNAP-25多克隆抗体中，并且在室温下将所述反应于黑暗中孵育2小时而进行的。使用标准的离心柱方案纯化所标记的抗体，并使用标准的比色蛋白测定测定蛋白浓度。使用分光光度计在455nm下测量所述α-SNAP-25抗体/MSDSULFO-TAGTM缀合物的吸光度以测定以每升摩尔表示的浓度。在4℃下保存所述检测抗体至需要之时。
为了制备包含对SNAP-25剪切产物特异的捕获抗体的固相支持物，将大约5μL的合适α-SNAP-25单克隆抗体溶液（1×PBS中20μg/mL）加入至96孔MSD高结合板（MSD High Bind plate）的每孔中，并且将所述溶液在生物安全柜中风干2-3小时，目的是使所述溶液液体蒸发。然后，将结合有捕获抗体的孔通过在室温下加入150μL的包含2%Amersham封闭试剂（GE Life Sciences,Piscataway,NJ）和10%山羊血清（VWR，West Chester,PA）的封闭缓冲液封闭2小时。将封闭的板密封，在4℃下保存至需要之时。
为了通过ECL夹心ELISA分析检测剪切的SNAP-25剪切产物的存在情况，将所保存的板中的封闭缓冲液从每个孔中吸出，如上述将来自经BoNT/A处理的细胞的25μL裂解液加入每个孔，并在4℃下将所述板孵育过夜。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并用200μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301031
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将25μl的5μg/mL检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301032
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液——加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，用200μL1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301033
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将150μL的1×读取缓冲液（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）加入每个孔，并使用SECTORTM成像仪6000图像读取仪（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）读板。用每个抗体对在10nM剂量下获得的信号除以每个抗体对在0nM剂量下获得的信号计算比值（表12）。这些结果表明，在所测试的26组不同抗体对组合中，仅有3个抗体对对于较高的测试剂量具有大于10:1的信噪比：第1对（2E2A6小鼠mAb和S9684兔pAb）、第4对（3C1A5小鼠mAb和S9684兔pAb）和第18对（S9684兔pAb和2E2A6小鼠mAb）。选择第1对抗体用于进一步测定。
表12.对α-SNAP-25抗体组合的筛查
Figure BDA00002373359301041
3.细胞分化条件的优化。
在使用夹心ELISA检测***时，为了确定包含对BoNT/A中毒敏感的细胞的细胞系的最佳分化条件，测试了多种细胞培养基以及分化时长。
为了确定最佳分化培养基，将合适密度的来自SiMa细胞系的细胞铺板于经IV型胶原涂覆的24孔细胞培养板的孔中，其中含有1mL的如下培养基和分化添加物中的一组：1)RPMI 1640、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺和25μg/mL GT1b)；2)RPMI-1640、1×B27添加物、1×N2添加物和25μg/mL GT1b；3)最小必需培养基、1×B27添加物、1×N2添加物和25μg/mL GT1b；以及4)RPMI-1640、10%BSA、1×N2添加物、1×NGF添加物和25μg/mL GT1b。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔中吸出所述培养基并替换为包含0（不处理的细胞系）、0.2pM、2pM或20pM的BoNT/A复合体的新鲜培养基。在处理过夜后，将所述细胞洗涤，再无毒素孵育2天以使得所述SNAP-25底物发生剪切，并如第1节所述进行收集。通过Bradford测定测量细胞裂解液的蛋白浓度。如上述，使用第1组抗体对通过ECL夹心ELISA分析检测剪切的SNAP-25产物的存在情况。如实施例I中所详述的，未分化细胞对毒素的摄取不如分化细胞有效。对于增加BoNT/A摄取和随之发生的SNAP-25剪切的最有效分化培养基是培养基3（MEM+N2+B27），之后是培养基2（RPMI-1640+N2+B27）和培养基4（RPMI-1640+N2+NGF+BSA）（图3）。与其他培养基相比，培养基2中培养的细胞发生了更多的SNAP-25剪切。
为了确定最佳的分化时间，将合适密度的来自SiMa细胞系的细胞铺板于含100μL的无血清培养基的聚D-赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b。将所述细胞分别在不同的4天铺板以获得测试6小时、24小时、48小时和72小时的分化时长，并在37℃的培养箱中于5%二氧化碳下孵育。从每孔中吸出生长培养基并替换为包含0（不处理的样品）、0.1pM、0.2pM、0.4pM、0.8pM、1.6pM、3.1pM、6.25pM、12.5pM或25pM的BoNT/A复合体的新鲜培养基。在处理过夜后，将所述细胞洗涤，再无毒素孵育2天以使得所述SNAP-25底物发生剪切，并如第1节所述进行收集。在收集后，如上述测定细胞裂解液的蛋白浓度并通过ECL夹心ELISA分析检测剪切的SNAP-25产物的存在情况。然后将从ECL成像仪获得的原始数据转移至SigmaPlot v.9.0，并使用4参数逻辑拟合（logistics fit）来确定剂量反应曲线。在对所述数据作图时对4参数逻辑函数没有限制。使用如下的分析生成图形报告：R2（相关系数）、a（数据集最大值）、b（斜率（hillslope））和X0±SE（EC50值±标准误差）。结果表明小于2pM的EC50值可用分化48-72小时的细胞获得（图4）。分化细胞可以在分化的48小时至72小时之间使用，而所述细胞的表现无显著变化，该结果突出表明了所述测定的鲁棒性。虽然少于48小时的分化时长可能不适合于制剂产品的皮摩尔级测试，但这些更短的分化时间对于大量药物底物测试是足够敏感的。
4.BoNT/A处理时间的优化。
为了确定来自细胞系的细胞需要用BoNT/A处理的最佳时长，测试了多个BoNT/A处理时长。将合适密度的来自SiMa细胞系的细胞铺板于含100μL的无血清培养基的聚D赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTMI、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b。将所述细胞铺板，并在37℃的培养箱中于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔中吸出生长培养基并一式三份地替换为在RPMI 1640生长培养基中包含0（不处理的样品）、0.1pM、0.2pM、0.4pM、0.8pM、1.6pM、3.1pM、6.3pM、12.5pM或25pM的BoNT/A复合体的新鲜培养基以得到完整的剂量反应。进行了5种不同BoNT/A处理时长的方案：1)BoNT/A处理6小时，将细胞取出并洗涤，将细胞无BoNT/A孵育18hr，并如第1节中所述收集细胞；2)BoNT/A处理24小时，将细胞取出并洗涤，并如第1节中所述收集细胞；3)BoNT/A处理24小时，将细胞取出并洗涤，将细胞无BoNT/A孵育24小时，并如第1节中所述收集细胞；4)BoNT/A孵育24小时，将细胞取出并洗涤，将细胞无BoNT/A孵育48小时，并如第1节中所述收集细胞；以及5)BoNT/A孵育24小时，将细胞取出并洗涤，将细胞无BoNT/A孵育72小时，并如第1节中所述收集细胞。在收集后，测定细胞裂解液的蛋白浓度，通过ECL夹心ELISA检测SNAP-25剪切产物，并如上述计算EC50。结果表明，小于2pM的EC50值可以用任一所测试的BoNT/A处理获得（图5）。有趣的是，24小时+24小时、24小时+48小时和24小时+73小时BoNT/A处理方案获得基本上相同的EC50值，分别是1.0pM、1.1pM和0.9pM。6小时+18小时和24小时+0小时BoNT/A处理方案获得的EC50值分别是1.7pM和1.6pM。虽然获得的信号量较低，但是这些结果表明6小时至24小时之间的BoNT/A处理时间加1天至3天的处理后孵育可用于获得这样的EC50，即该EC50对于检测BoNT/A活性是足够的，并且使得测定的总时长具有灵活性。
5.基于免疫的检测BoNT/A活性的方法的灵敏性。
为了评估本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法灵敏性，测定了对BoNT/A中毒敏感的细胞的BoNT/A摄取的时机。将合适密度的来自SiMa细胞系的细胞铺板于含100μL的无血清培养基的聚D赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和20μg/mL GT1b。在37℃的培养箱中将细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔中吸出培养基并替换为包含1nM的BoNT/A复合体的新鲜培养基，并将被BoNT/A处理的细胞在0分钟（加入神经毒素，然后立即除去）、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟这6个不同时间点孵育。使用了无BoNT/A（0nM）的阴性对照培养基。在孵育后，如以上第1节所述洗涤并收集所述细胞。在收集后，测定细胞裂解液的蛋白浓度，通过ECL夹心ELISA检测SNAP-25剪切产物，并如上述计算EC50。结果表明，细胞对BoNT/A的摄取不到1分钟就产生相对于背景显著量的SNAP-25剪切产物（图6）。
6.基于免疫的检测BoNT/A活性的方法的特异性。
为了评估本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法的特异性，测定了对BoNT/A中毒敏感的细胞正确区分BoNT/A以排除部分失活的BoNT/A的能力。将合适密度的来自SiMa细胞系的细胞铺板于含100μL的无血清培养基的聚D赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTMI、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b。在37℃的培养箱中将细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔中吸出培养基并替换为包含如下组分的新鲜培养基：1)0（不处理的样品）、0.03pM、0.1pM、0.31pM、0.93pM、2.78pM、8.33pM和25pM的BoNT/A复合体；2)0、0.14nM、0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.11nM、33.33nM和100nM的失活BoNT/A(iBoNT/A)；或者3)0、0.14nM、0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.11nM、33.33nM和100nM的LHN/A片段。所述iBoNT/A在轻链的锌结合区中包含一个突变，该突变使所述神经毒素的金属蛋白酶活性完全失活，参见例如Liqing Zhou,et al.,Expression and Purification of the Light Chainof Botulinum Neurotoxin A:A Single Mutation Abolishes its Cleavage ofSNAP-25and Neurotoxicity after Reconstitution with the Heavy Chain,Biochemistry 34:15175-15181(1995)，它通过援引的方式全文纳入本文。所述LHN/A片段不含所述结合区，但包含完整易位区和轻链，参见例如Clifford C.Shone,et al.,Recombinant Toxin Fragments,美国专利6,461,617，它通过援引的方式全文纳入本文。在24小时处理后，将所述细胞洗涤，再无毒素孵育2天以使得所述SNAP-25底物发生剪切，并如第1节所述进行收集。在收集后，如上述测定细胞裂解液的蛋白浓度，通过ECL夹心ELISA检测SNAP-25剪切产物，并如上述计算EC50。结果表明，细胞对iBoNT/A和LHN/A的结合亲和性（EC50>100nM）至多是其对BoNT/A的结合亲和性（EC50=1.6pM）的1/60,000（图7）。在用所有测试浓度的iBoNT/A处理的细胞中均未检测到SNAP-25剪切产物。虽然在用最高剂量的LHN/A片段处理的细胞中检测到了少量的SNAP-25剪切产物，然而该活性是由于因易位区活性引起的LHN/A片段的非特异性摄取。因此，结果表明，本说明书中公开的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法可以测量所述中毒过程——藉此过程，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且所述过程涵盖BoNT/A与BoNT/A受体的结合、神经毒素/受体复合体的内化、BoNT/A轻链从细胞内囊泡至细胞质的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——中涉及的所有步骤。
实施例VI
使用ECL夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法
如下实施例描述了使用ECL夹心ELISA的基于免疫的通过以下方式检测BoNT/A活性的方法：使用α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体对于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物是特异的——检测SNAP-25剪切产物。
为了制备来自经BoNT/A处理的细胞的裂解液，将合适密度的来自已建立细胞系的细胞铺板于含100μL的无血清培养基的96孔细胞培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b（见实施例I和II）。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔中吸出所述分化细胞的培养基并替换为包含0（不处理的样品）、0.03pM、0.1pM、0.3pM、0.9pM、2.8pM、8.3pM和25pM的BoNT/A复合体的新鲜培养基。在24小时处理后，将所述细胞洗涤，再无毒素孵育2天。如实施例V中所述收集所述细胞。
为了制备所述α-SNAP-25捕获抗体溶液，使用标准的蛋白A纯化方案纯化来自杂交瘤细胞系2E2A6的腹水中包含的α-SNAP-25单克隆抗体。为了制备所述α-SNAP-25检测抗体溶液，依照制造商的说明（MesoScale Discovery,Gaithersburg,MD）将α-SNAP-25兔多克隆抗体S9684（Sigma,St.Louis,MO）缀合于钌(II)-三-二吡啶-(4-甲基磺酸)NHS酯标记试剂（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）。所述缀合反应、标记的α-SNAP-25抗体的纯化、浓度测定和保存如实施例V中所述。
为了制备包含对SNAP-25剪切产物特异的捕获抗体的固相支持物，将大约5μL的α-SNAP-25单克隆抗体2E2A6溶液(1×PBS中20μg/mL）加入至96孔MSD高结合板的每孔中，并且将所述溶液在生物安全柜中风干2-3小时，目的是使所述溶液液体蒸发。然后，将结合有捕获抗体的孔封闭并直接用于检测BoNT/A活性。
为了通过ECL夹心ELISA分析来检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，将所保存的板中的封闭缓冲液从每个孔中吸出，将来自经BoNT/A处理的细胞的25μL裂解液加入每个孔，并在4℃下将所述板孵育过夜。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并用200μL1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301091
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将25μl的5μg/mL检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301101
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液——加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，用200μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301102
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将150μL的1×读取缓冲液（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）加入每个孔，并使用SECTORTM成像仪6000图像读取仪（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）读板。分析收集数据并如实施例V中所述计算EC50。代表性结果显示于图8中。这些结果表明，检测到了平均1.0pM的BoNT/A的EC50（约0.3pM-约2.0pM的区间），所述检测具有约15:1-约20:1的信噪比下限，以及约20:1-约500:1的信噪比上限。
实施例VII
使用CL夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法
如下的实施例描述了使用CL夹心ELISA的基于免疫的通过以下方式检测BoNT/A活性的方法：使用α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体对于在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25是特异的——检测SNAP-25剪切产物。
如实施例VI中所述，制备来自经BoNT/A处理的细胞的裂解液和α-SNAP-25捕获抗体溶液。
为了制备所述α-SNAP-25检测抗体溶液，依照制造商的说明（PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL）将α-SNAP-25多克隆抗体S9684（Sigma,St.Louis,MO）缀合于辣根过氧化物酶（HRP）。该缀合反应是通过将500μL的1mg/mLα-SNAP-25多克隆抗体添加至含冻干活化的过氧化物酶的玻璃瓶中，混合所述组分，然后添加10μL的氰基硼氢化钠而进行的。在室温下将该反应混合物于通风橱中孵育1小时。在淬灭所述反应后，使用标准的离心柱方案纯化所标记的抗体，并使用标准的比色蛋白测定测定蛋白浓度。使用分光光度计在455nm下测量所述α-SNAP-25多克隆抗体/HRP缀合物的吸光度以测定以每升摩尔表示的浓度。在4℃下保存所述α-SNAP-25检测抗体至需要之时。
为了制备包含对SNAP-25剪切产物特异的α-SNAP-25捕获抗体的固相支持物，将大约100μL的α-SNAP-25单克隆抗体2E2A6溶液（1×PBS中1mg/mL）加入至96孔Greiner白色板的每孔中，并且将所述板在4℃下孵育过夜，然后弃去任何多余的抗体溶液。然后，将结合有捕获抗体的孔通过如下方式封闭1小时：在室温下加入150μL的包含2%Amersham封闭试剂（GE Life Sciences,Piscataway,NJ）和10%山羊血清（VWR，West Chester,PA）的封闭缓冲液。弃去封闭缓冲液并通过翻转和轻拍将所述板在纸巾上印干。然后，将结合有捕获抗体的孔封闭并直接用于检测BoNT/A活性。
为了通过ECL夹心ELISA分析来检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，将来自经BoNT/A处理的细胞的50μL裂解液加入每个孔，将所述板密封，并在4℃下将所述密封的板在摇床上以500rpm摇动孵育2-4小时至过夜。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并用200μl 1×PBS、0.05%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将100μl的1mg/mL α-SNAP-25多克隆抗体/HRP检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301112
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液——加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板在摇床上以650rpm摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，用200μl1×PBS、0.05%
Figure BDA00002373359301113
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将100μl的SuperSignal ELISA Pico 1:1混合物（PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL）加入每个孔，并使用光度计（MolecularDevices,Sunnyvale,CA）在395nm下读板。如实施例V中所述分析所采集的数据并计算EC50。这些结果表明，检测到了平均1.0pM的BoNT/A的EC50（约0.3pM-约2.0pM的区间），所述检测具有约15:1-约20:1的信噪比下限，以及约20:1-约500:1的信噪比上限。
实施例VIII
使用多路ECL夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法
如下的实施例描述了多路基于免疫的通过以下方式检测BoNT/A活性的方法：使用对SNAP-25剪切产物特异的α-SNAP-25单克隆抗体和针对另一种蛋白的第二抗体对来检测SNAP-25剪切产物。
1.针对第二蛋白的捕获抗体-检测抗体对的制备和鉴定。
为了获得未处理的细胞裂解液用于分析，将合适密度的来自SiMa细胞系的原种培养物的细胞接种于包含40mL生长培养基的T175烧瓶中，所述培养基包含1×RPMI 1640、10%FBS、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和100U/100μg的青霉素-链霉素。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至大约70-90%的细胞汇合。洗涤所述细胞，并通过在4°C下于新制备的Triton X-100裂解缓冲液（pH 7.5的20mM Tris、150mM氯化钠、0.001M EDTA、1mMEGTA和1%Triton-X-100）中不断搅拌地裂解30分钟而收集所述细胞。在8°C下，使用桌面离心机将裂解的细胞以大约3300-3330×g离心40分钟以除去碎片。
为了鉴定针对第二蛋白的合适捕获抗体-检测抗体对，对包含5种不同蛋白的捕获抗体和检测抗体对的21种不同组合进行了ECL夹心ELISA分析（表13）。所使用的抗体是α-突触融合蛋白1A-HPC小鼠单克隆抗体S0664（Sigma,St.Louis,MO）、α-GAPDH小鼠单克隆抗体MAB374（Chemicon,Temecula,CA）、α-突触融合蛋白1兔多克隆抗体S1172-1（Sigma,St.Louis,MO）、α-GAPDH兔多克隆抗体2275-PC-1（R&D Systems,Minneapolis,MN）、α-突触融合蛋白2兔多克隆抗体S5687（Sigma,St.Louis,MO）、α-人突触融合蛋白2小鼠单克隆抗体MAB2936（R&D Systems,Minneapolis,MN）、α-小鼠突触融合蛋白2山羊多克隆抗体AF2568（Sigma,St.Louis,MO）、α-突触融合蛋白2兔多克隆抗体AB5596（Sigma,St.Louis,MO）、α-突触融合蛋白1兔多克隆抗体S1172-2（Sigma,St.Louis,MO）、α-h,m,r肌动蛋白绵羊多克隆抗体AF4000（R&D Systems,Minneapolis,MN）、α-β肌动蛋白小鼠单克隆抗体A1978（Sigma,St.Louis,MO）、α-β肌动蛋白小鼠多克隆抗体A2228（Sigma,St.Louis,MO）、小鼠α-GAPDH小鼠单克隆抗体G8795（Sigma,St.Louis,MO）、α-GAPDH兔多克隆抗体G9595（Sigma,St.Louis,MO）。
为了制备所述第二蛋白捕获抗体溶液，购买了纯化抗体形式的单克隆抗体。为了制备所述第二蛋白检测抗体溶液，依照制造商的说明（MesoScale Discovery,Gaithersburg,MD）将合适的抗体缀合于钌(II)-三-二吡啶-(4-甲基磺酸)NHS酯标记试剂（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）。该缀合反应是通过将30μL的蒸馏水复原的MSD SULFO-TAGTM储备溶液添加至200μL的2mg/mL多克隆抗体中，并且在室温下将所述反应于黑暗中孵育2小时而进行的。使用标准的离心柱方案纯化所标记的抗体，并使用标准的比色蛋白测定测定蛋白浓度。使用分光光度计在455nm下测量所述抗体/MSD SULFO-TAGTM缀合物的吸光度以测定以每升摩尔表示的浓度。在4℃下保存所述检测抗体至需要之时。
为了制备包含对SNAP-25剪切产物特异的捕获抗体的固相支持物，将大约5μL的α-SNAP-25单克隆抗体2E2A6溶液(1×PBS中20μg/mL）加入至96孔MSD高结合板的每孔中，并且将所述溶液在生物安全柜中风干2-3小时，目的是使所述溶液液体蒸发，然后将封闭的板密封并在4℃下保存至需要之时。然后，将干燥的结合有捕获抗体的孔通过如下方式封闭1-2小时：在室温下加入150μL的包含3%BSA（Pierce,Rockford,IL）、10%山羊血清（Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,PA）和Difco 1%脱脂牛奶（BD BioSciences Franklin Lakes,NJ）的0.05%Tween-20PBS溶液的封闭缓冲液。
为了通过ECL夹心ELISA分析来检测蛋白的存在情况，将所保存的板中的封闭缓冲液从每个孔中吸出，如上述将来自经BoNT/A处理的细胞的25μL裂解液加入每个孔，并在4℃下将所述板孵育过夜。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并用200μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301131
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将25μl的5μg/mL合适的第二蛋白检测抗体重悬浮于上文所述的封闭缓冲液中的溶液加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，用250μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301132
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将150μL的1×读取缓冲液（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）加入每个孔，并使用SECTORTM成像仪6000图像读取仪（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）读板。用对于每个抗体对从未处理细胞的裂解液获得的信号除以对于每个抗体对从裂解缓冲液对照（0nM剂量）获得的信号计算比值（表13）。这些结果表明，在所测试的21组不同抗体对组合中，仅有2组抗体对对于较高的测试剂量具有大于10:1的信噪比：第16对：α-GAPDH小鼠单克隆抗体MAB374和α-GAPDH兔多克隆抗体RDS2275-PC-1；以及第21对：α-GAPDH小鼠单克隆抗体MAB374和α-GAPDH兔多克隆抗体G9545。选择α-GAPDH小鼠单克隆抗体MAB374和α-GAPDH兔多克隆抗体G9545对作为第二蛋白捕获抗体-检测抗体对，用于所述多路ECL夹心ELISA。
表13.对第二蛋白抗体组合的筛查
Figure BDA00002373359301141
Figure BDA00002373359301151
2.使用多路ECL夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法。
为了获得BoNT/A处理的细胞裂解液用于分析，将合适密度的来自SiMa细胞系原种培养物的细胞接种于含无血清培养基的聚D赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔中吸出培养基并替换为包含0（不处理的样品）、0.67U/mL、2.35U/mL、8.23U/mL、28.82U/mL、101U/mL、353U/mL的BoNT/A复合体的新鲜培养基。在24小时处理后，将所述细胞洗涤，再无毒素孵育2天。如上文第1节所述洗涤、收集并处理所述细胞。
如实施例VII中所述制备α-SNAP-25捕获抗体溶液和α-SNAP-25检测抗体溶液。为了制备α-GAPDH捕获抗体溶液，如上文第1节所述制备α-GAPDH单克隆抗体小鼠MAB374（Chemicon,Temecula,CA）。为了制备α-GAPDH检测抗体溶液，依照制造商的说明（Meso ScaleDiscovery,Gaithersburg,MD），将α-GAPDH兔多克隆抗体G9545（Sigma,St.Louis,MO）缀合于钌(II)-三-二吡啶-(4-甲基磺酸)NHS酯标记试剂（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）。所述缀合反应、标记的α-SNAP-25抗体的纯化、浓度的测定和保存如上文第1节所述。
为了制备包含α-SNAP-25捕获抗体和α-GAPDH捕获抗体的固相支持物，使用机器人***以多路形式将大约2.5nL的α-SNAP-25捕获抗体溶液（1×PBS中45μg/mL）和2.5nL的α-GAPDH捕获抗体溶液（1×PBS中120μg/mL）加入至96孔MSD高结合板的每孔中。将所述溶液在生物安全柜中风干至少2-3小时，目的是使所述溶液液体蒸发，然后将结合有捕获抗体的孔封闭，并直接用于检测BoNT/A活性和GAPDH蛋白。
为了通过多路ECL夹心ELISA分析来检测SNAP-25剪切产物的存在情况，将所保存的板中的封闭缓冲液从每个孔中吸出，如上述将来自经BoNT/A处理的细胞的25μL裂解液加入每个孔，并在4℃下将所述板孵育过夜。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并以200μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301161
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，如上述将25μL的5μg/mL α-SNAP-25检测抗体溶液和25μL的5μg/mL α-GAPDH检测抗体溶液加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，用250μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301162
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将150μL的1×读取缓冲液（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）加入每个孔，并使用SECTORTM成像仪6000图像读取仪（Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD）读板。如实施例V中所述分析采集的数据并计算标准化数据的相对效力（potency），不同之处是使用了PLA 2.0软件（Stegmann Systems,GmbH,Germany）。
作为对比，还如实施例VI中所述使用单路ECL夹心ELISA检测了SNAP-25剪切产物。
结果表明，从单路ECL夹心ELISA获得的SNAP-25数据或者从多路ECL夹心ELISA获得的非标准化SNAP-25数据均显示出一个偏离所述剂量-反应曲线的样品剂量异常值。然而，所述SNAP-25数据相对于GAPDH数据的标准化可获得更好的曲线拟合，并且所述效力更接近于期望值。
实施例IX
使用多路EC夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法
如下的实施例描述了多路基于免疫的通过以下方式检测BoNT/A活性的方法：使用对SNAP-25剪切产物特异的α-SNAP-25单克隆抗体以及针对另一蛋白的第二抗体对来检测SNAP-25剪切产物。
如实施例VI中所述制备来自经BoNT/A处理的细胞的裂解液。如实施例VII中所述制备α-SNAP-25捕获抗体溶液、α-SNAP-25检测抗体溶液和α-SNAP-25固相支持物。
为了制备α-GAPDH捕获抗体溶液，购买了纯化抗体形式的α-GAPDH单克隆抗体MAB374(Millipore,Billerica,MA)。为了制备α-GAPDH检测抗体溶液，依照制造商的说明（Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL），将α-GAPDH多克隆抗体G9545（Sigma,St.Louis,MO）缀合于辣根过氧化物酶（HRP）。所述缀合反应、浓度测定和保存如实施例VII中所述。
为了制备包含对所述第二蛋白特异的第二捕获抗体的固相支持物，将大约100μL含1μg/mL α-GAPDH单克隆抗体MAB374的单克隆抗体溶液加入至96孔Greiner白色板的每孔中，并且将所述板在4℃下孵育过夜，然后弃去任何过量的抗体溶液。然后，将结合有α-GAPDH捕获抗体的孔通过如下方式封闭1小时：在室温下加入150μl的包含2%Amersham封闭试剂（GE Life Sciences,Piscataway,NJ）和10%山羊血清（VWR，West Chester,PA）的封闭缓冲液。弃去封闭缓冲液并通过翻转和轻拍将所述板在纸巾上印干。然后，将结合有捕获抗体的孔封闭并直接用于检测BoNT/A活性。
为了通过多路ECL夹心ELISA分析来检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，将来自经BoNT/A处理的细胞的50μL细胞裂解液加入α-SNAP-25捕获抗体固相支持物和α-GAPDH捕获抗体固相支持物的每个孔，将所述板密封，并在4℃下将所述密封的板在摇床上以500rpm摇动孵育2-4小时至过夜。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并用200μl1×PBS、0.05%
Figure BDA00002373359301181
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将100μL的检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301182
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液和1mg/mL α-SNAP-25多克隆抗体/HRP——加入α-SNAP-25捕获抗体固相支持物的每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板在摇床上以650rpm摇动孵育1小时。类似地，将100μL的检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301183
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液和0.25mg/mL α-GAPDH G9545多克隆抗体/HRP（Sigma Co.,StLouis,MO）——加入α-GAPDH捕获抗体固相支持物的每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板在摇床上以650rpm摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，用200μl 1×PBS、0.05%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将100μl的SuperSignal ELISA Pico 1:1混合物（Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL）加入每个孔，并使用光度计（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）在395nm下读板。如实施例V中所述分析所采集数据并计算EC50。结果表明，对检出的α-SNAP-25抗体-抗原复合体的量采集的数据点在标准化后与检出的α-GAPDH抗体-抗原复合体的量更加相符，从而产生更准确的读数。这些结果表明，检测到了平均1.0pM的BoNT/A的EC50（约0.3pM-约2.0pM的区间），所述检测具有约15:1-约20:1的信噪比下限，以及约20:1-约500:1的信噪比上限。
类似的设计可用于通过使用相同α-GAPDH抗体对的ECL夹心ELISA的多路基于免疫的以下方式检测BoNT/A活性的方法中：使用α-SNAP-25单克隆抗体——该抗体对在所述BoNT/A剪切位点易切断键的P1残基处含有羧基端的SNAP-25剪切产物是特异的——检测SNAP-25剪切产物。
实施例X
检测皮摩尔量BoNT/A的基于免疫的方法
如下的实施例描述了怎样进行基于免疫的检测BoNT/A活性的方法，所述方法可以检测皮摩尔量BoNT/A药物产品，例如
Figure BDA00002373359301185
或BTX-A。
1．使用ECL夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A的方法。
为了制备来自经BoNT/A处理的细胞的裂解液，将大约50,000-150,000来自已建立细胞系的细胞铺板于含100μL的无血清培养基的聚D赖氨酸涂覆的96孔细胞培养板的孔中，所述培养基包含最小必需培养基、2mM含Earle盐的GlutaMAXTM I、1×B27添加物、1×N2添加物、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b（见实施例I和II）。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约2-3天）。从每孔中吸出所述分化细胞的培养基并替换为包含以下组分的新鲜培养基：在无氯化钠的溶液中复原的0（不处理的样品）、0.03pM、0.1pM、0.3pM、0.9pM、2.8pM、8.3pM或25pM的BoNT/A药物产品；或者在无氯化钠的培养基中复原的0（不处理的样品）、0.7U/mL、2.1U/mL、6.2U/mL、18.5U/mL、55.6U/mL、166.7U/mL或500U/mL的BoNT/A药物产品。因为所述BoNT/A药物产品含氯化钠，所以将其加入至培养基中形成了对细胞生活力有害的高渗培养基。为了克服所述高渗性问题，将200μL的不使用氯化钠制成的MEM培养基用于复原BoNT/A药物产品，获得25pM BoNT/A的终浓度（500U/mL）。通过以下方式使基质的所有浓度沿剂量-反应曲线保持恒定：在所使用的培养基中添加氯化钠来使得稀释液与以最高使用浓度（25pM或500U/mL）存在的赋形剂的量匹配。在24小时处理后，将所述细胞洗涤，再无毒素孵育2天。为了收集所述细胞，吸出培养基，用1×PBS洗涤，通过如下方式裂解细胞：向每个孔添加30μl包含50mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%
Figure BDA00002373359301192
X-100的裂解缓冲液，并在4℃下将所述板在摇床上以500rpm摇动孵育30分钟。在4℃下将所述板以4000rpm离心20分钟以使细胞碎片沉淀成块，将上清液转移至捕获抗体涂覆的96孔板以进行检测步骤。
如实施例VII中所述制备α-SNAP-25捕获抗体溶液、α-SNAP-25检测抗体溶液和包含对SNAP-25剪切产物特异的捕获抗体的固相支持物。
为了通过ECL夹心ELISA分析来检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，从所保存的板中吸出所述封闭缓冲液，将来自经BoNT/A处理的细胞的25μL裂解液加入每个孔，并在4℃下将所述板孵育2小时或24小时。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并用200μL1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301201
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将25μL的5μg/mL α-SNAP-25检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301202
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液——加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板摇动孵育1小时。在α-SNAP-25检测抗体的孵育后，以200μL 1×PBS、0.1%
Figure BDA00002373359301203
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，如实施例V中所述处理所述板，分析所收集数据并计算EC50。这些结果表明，检测到了平均1.0pM的BoNT/A的EC50（约0.3pM-约2.0pM的区间），所述检测具有约15:1-约20:1的信噪比下限，以及约20:1-约500:1的信噪比上限（图9）。如中实施例VIII所述该方法还可以以多路形式进行。
2.使用CL夹心ELISA的基于免疫的检测BoNT/A的方法。
如实施例VI中所述制备来自以BoNT/A处理的细胞的裂解液和α-SNAP-25捕获抗体溶液。如实施例VII中所述制备α-SNAP-25检测抗体溶液和包含对SNAP-25剪切产物特异性的捕获抗体的固相支持物。
为了通过ECL夹心ELISA分析检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，将来自以BoNT/A处理的细胞的25μL裂解液加入每个孔，将所述板密封，并在4℃下将所述密封的板在摇床上以500rpm孵育2小时或24小时。通过如下方式洗涤所述板孔3次：吸出所述细胞裂解液并以200μl 1×PBS、0.05%
Figure BDA00002373359301204
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)漂洗每个孔3次。在洗涤后，将100μl的1mg/mL α-SNAP-25多克隆抗体/HRP检测抗体溶液——该溶液包含2%Amersham封闭试剂的1×PBS、0.1%(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)溶液——加入每个孔，将所述板密封，并在室温下将所述密封的板在摇床上以650rpm摇动孵育1小时。在检测抗体的孵育后，以200μl1×PBS、0.05%
Figure BDA00002373359301206
(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)洗涤所述孔3次。在洗涤后，将100μl的SuperSignal ELISA Pico 1:1混合物（Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL）加入每个孔，并使用光度计（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）在395nm下读板。如实施例V中所述分析所收集数据并计算EC50。如中实施例VIII所述该方法还可以以多路形式进行。
实施例XI
检测中和α-BoNT/A抗体的基于免疫的方法
如下的实施例描述了怎样进行可以检测中和α-BoNT/A抗体存在情况的基于免疫的方法。
BoNT/A如今用于大范围的医学适应症（medical indications）中，包括眼科、胃肠、泌尿和美容的肌肉活动过度。长期多次进行BoNT/A治疗，患者可能出现对所述毒素的中和α-BoNT/A抗体，导致免疫抗性。中和α-BoNT/A抗体可通过如下方式抑制BoNT/A活性：通过结合于BoNT/A的结合区（HC）和/或易位区（HN）阻断毒素摄取进入神经元细胞。一些研究已表明，多次以BoNT/A制剂治疗张力失常的患者中多达5-10%的由于形成中和α-BoNT/A抗体而有免疫抗性。测定中和α-BoNT/A抗体在患者血液中的存在情况的成熟测定是小鼠保护测定（mouse protection assay）（MPA）。当前，在注入小鼠之前将BoNT/A与患者血清孵育。抗体的存在情况通过所述动物对所述神经毒素的反应降低显示。由于MPA是基于活体的测定，以基于细胞的测定替代该测定会更经济并且更省时。
为了检测是否存在中和α-BoNT/A抗体，可以使用本说明书中公开的基于免疫的测定BoNT/A活性的方法。一种方式是使用蛋白质印迹检测方法在以多种浓度BoNT/A处理后测定存在的SNAP-25剪切产物的量，另一种方式是使用ECL夹心ELISA检测方法。
为制备包含中和α-BoNT/A抗体的样品与已知不含α-BoNT/A中和抗体的阴性对照样品，从不同个体的血液分离血清。未经免疫（declineimmunization）的个体称为未曾免疫过的个体。接纳免疫（acceptingimmunization）的个体称为免疫型个体。取血液至含凝固活化剂的血清管（BD Biosciences,Bedford,MA）中。在4°C下，通过以1000×g将所述血液离心10分钟得到血清。获得两个供体的血清：一个体被以BoNT/A免疫，而另一个体未经BoNT/A免疫。
为了制备来自以包含BoNT/A的样品处理的细胞的裂解液，如实施例VI中所述将SiMa细胞接种于聚D赖氨酸96孔板中并使之分化。使用无血清培养基以2.5倍的增量将人血清连续稀释1:100–1:152,000。将BoNT/A以10pM的浓度悬浮于0.5mL SiMa培养基中。将包含BoNT/A和α-BoNT/A抗体的培养基混合，并在室温下孵育15分钟或1小时。将所述细胞以有人血清的BoNT/A处理2小时，然后在新鲜生长培养基中孵育15小时。还将所述细胞处理15小时，之后不再进行孵育。
为了通过蛋白质印迹分析检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，从每个孔吸出培养基，将细胞悬浮于50μL的SDS-PAGE加样缓冲液中，然后加热至95°C维持5分钟。如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析来自每种采集样品的一份样品，不同之处是使用12%26孔标准凝胶（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）通过SDS-PAGE分离采集的样品，并将兔多克隆α-SNAP-25197抗体用作一抗（见实施例IV）。结果表明，试验样品与阴性对照样品相比导致SNAP25剪切的减少，这证明来自免疫的个体的血清包含中和α-BoNT/A抗体。
为了通过ECL夹心ELISA检测剪切的SNAP-25产物的存在情况，如实施例V中所述从每个孔除去培养基并裂解所述细胞。如实施例VII中所述制备α-SNAP-25捕获抗体溶液、α-SNAP-25检测抗体溶液和α-SNAP-25固相支持物。如实施例V中所述，将上清液转移至α-SNAP-25固相支持物并进行ECL夹心ELISA测定。如实施例V中所述分析所收集数据并计算EC50，不同之处EC50是将BoNT/A的活性抑制至1/2其最大值的血清稀释度，最大信号（SignalMax）与最小信号（SignalMin）的比通过以最大稀释度的血清获得的SNAP-25剪切产物信号除以以最小血清稀释度获得的信号得到。
结果表明，可以检测人血清中存在的中和α-BoNT/A。在来自免疫的个体的血清中孵育的BoNT/A复合体的活性随血清稀释度减小而减少，而未曾免疫过的血清的存在对每个测试稀释度下的测定无影响。该测定可以使用配制的BoNT/A药物产物、大批的BoNT/A复合体或纯化的神经毒素进行。
实施例XII
使用工程化细胞的基于免疫的检测BoNT/A活性的方法
如下的实施例描述了怎样将编码BoNT/A受体的多核苷酸分子导入来自已建立细胞系的细胞，以进一步提高对BoNT/A中毒的敏感性或者提高BoNT/A摄取能力。
为了将外源性BoNT/A受体导入已建立细胞系包含的细胞中，通过阳离子脂质方法将包含编码SEQ ID NO:59的FGFR2的多核苷酸分子SEQ ID NO:130或编码SEQ ID NO:25的FGFR3的多核苷酸分子SEQID NO:139转染至来自已建立细胞系的细胞。将合适密度（约5×106个细胞）的来自已建立细胞系的细胞铺板于包含5mL完全培养基的100mm组织培养板中，并在37℃的培养箱中于5%二氧化碳下培养，直至细胞达到适合于转染的密度。通过如下方式制备3mL转染溶液：将在室温下孵育5分钟、包含60μL LipofectAmine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)的1.5mL OPTI-MEM减少血清的培养基添加至含24μg编码FGFR2或FGFR3的表达构建体或者编码绿色荧光蛋白（GFP）的对照表达构建体的1.5mL OPTI-MEM减少血清的培养基中。在室温下将该转染混合物孵育大约30分钟。将完全培养基替换为3mL转染溶液，并在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下培养大约8小时。将转染培养基替换为3mL新鲜完全培养基，并在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下培养大约24小时。将培养基替换为3mL含大约1mM G418（Invitrogen,Carlsbad,CA）的新鲜完全培养基。在37℃的培养箱中将所述细胞于5%二氧化碳下培养大约1周，将旧培养基替换为包含0.5mM G418的新鲜完全培养基。抗生素抗性集落一旦已建立，将抗性克隆重新铺板于包含补加大约0.5mM G418的新鲜完全培养基的新100mm培养板中，直至这些细胞达到6-20×105个细胞/mL的密度。
为了测定BoNT/A受体的过量表达是否提高细胞对BoNT/A中毒的敏感性或者是否提高BoNT/A摄取能力，使用以不同剂量的BoNT/A复合体处理的细胞生成剂量-效应曲线。为了制备来自以BoNT/A处理的细胞的裂解液，将合适密度的来自已建立转染细胞系的细胞铺板于包含100μL合适无血清培养基的96组织培养板中（表5）。在37℃的培养箱中将这些细胞于5%二氧化碳下孵育，直至细胞分化，分化通过标准和常规形态学标准评估，例如生长停滞和神经突延伸（大约3天）。从每孔的分化细胞吸出培养基，并且对于SiMa或PC12转染细胞系包含的细胞替换为包含0（未处理的样品）、0.01nM、0.04nM、0.12nM、0.37nM、1.1nM、3.3nM和10nM的BoNT/A复合体的新鲜培养基；对于Neuro-2a转染的细胞系包含的细胞替换为包含0（未处理的样品）、0.14nM、0.40nM、1.2nM、3.7nM、11nM、33nM和100nM的BoNT/A复合体的新鲜培养基。将所述细胞以包含BoNT/A的培养基处理6小时，然后以新鲜培养基孵育15小时，并且通过加入40μL的2×SDS-PAGE加样缓冲液并将所述板加热至95℃维持5分钟收集。
为了检测SNAP-25剪切产物的存在情况，如实施例I中所述通过蛋白质印迹分析了来自每个采集样品的一份样品，不同之处是使用12%26孔标准凝胶（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）通过SDS-PAGE分离采集的样品，然后使用的一抗是1:1,000稀释的兔多克隆α-SNAP-25抗体血清（实施例IV）（AGN，多克隆抗体）、1:500稀释的α-FGFR2兔多克隆C-17（Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）或1:500稀释的α-FGFR3兔多克隆C-15（Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）。使用Image Quant（GE Healthcare,Piscataway,NJ）计算每个样品的目标蛋白的密度，使用SigmaPlot软件估计每个细胞系的EC50。
结果表明以FGFR2或FGFR3转染的细胞比以GFP转染的细胞对BoNT/A更加敏感，并且还出现较高水平的SNAP-25剪切（表14）。过量表达FGFR2或FGFR3的细胞的EC50值比过量表达GFP的细胞呈现的EC50值更低，表明导入FGFR2或FGFR3提高了细胞对BoNT/A中毒的敏感性，或者提高了BoNT/A摄取能力。
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如实施例VI-X中所述还可以使用夹心ELISA检测SNAP-25剪切产物的存在情况。
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Claims (11)

1.一种药物组合物，包含血清型A肉毒杆菌毒素（BoNT/A），其中其效能在制造所述药物过程中通过以下步骤确定：
a．将来自表达SNAP-25多肽的已建立细胞系的细胞与所述药物相接触，所述SNAP-25多肽基本上由包含SEQ ID NO:5的人SNAP-25的至少一部分组成，所述至少一部分可被BoNT/A剪切，其中所述已建立细胞系对由每升培养基中约500pmol或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的，这一点由如下事件指示：BoNT/A将所述SNAP-25多肽酶解剪切以产生所述SNAP-25多肽的片段，所述片段包含SEQ ID NO:38的C端氨基酸序列；
b．从所述细胞分离多肽；
c．将所述多肽与特异性结合SEQ ID NO:38的肽的单克隆抗体相接触，其中所述抗体以小于0.450nM的平衡解离常数特异性结合所述SNAP-25多肽的所述片段的表位，所述片段包含SEQ ID NO:38的C端氨基酸序列，其中所述抗体对含SEQ ID NO:5的完整SNAP-25多肽的表位具有小于1×101M-1s-1的缔合速率常数，以及
d．检测包含所述抗体和所述SNAP-25多肽的所述片段的任何抗体-抗原复合体的存在情况，所述片段包含SEQ ID NO:38的C端氨基酸序列，其中所检测到的更高含量的所述抗体-抗原复合体与所述药物中较高含量的BoNT/A相关。
2.一种药物组合物，包含血清型A肉毒杆菌毒素（BoNT/A），其中其效能在制造所述药物过程中通过以下步骤确定：
a．以包含BoNT/A的所述药物组合物的样品处理来自已建立细胞系的细胞，其中所述来自已建立细胞系的细胞对由约500pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；
b．从所处理的细胞分离包含SNAP-25剪切产物的SNAP-25组分，所述SNAP-25剪切产物具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺；
c．将所述SNAP-25组分与连接于固相支持物的α-SNAP-25抗体相接触，
其中所述α-SNAP-25抗体结合含有SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的表位，所述α-SNAP-25抗体对不含SNAP-25剪切产物的BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25的表位具有小于1×101M-1s-1的缔合速率常数，并且所述α-SNAP-25抗体对所述表位具有小于0.450nM的平衡解离常数；
d．检测抗体-抗原复合体的存在情况，所述抗体-抗原复合体包含所述α-SNAP-25抗体和具有所述BoNT/A剪切位点易切断键的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切产物，
其中通过所述抗体-抗原复合体的检测结果指示BoNT/A活性。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述SNAP-25剪切产物是SNAP-25197。
4.权利要求2的药物组合物，使用夹心ELISA检测抗体-抗原复合体的存在情况。
5.权利要求2的药物组合物，其中所述方法具有至少3:1的信噪比下限，和至少10:1的信噪比上限。
6.权利要求2的药物组合物，其中所述样品包含至多100pM的BoNT/A。
7.权利要求2的药物组合物，其中所述来自已建立细胞系的细胞对由约100pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。
8.权利要求2的药物组合物，其中所述方法以单路方式或多路方式进行。
9.权利要求2的药物组合物，其中所述SNAP-25多肽基本上由包含SEQ ID NO:5的人SNAP-25的至少一部分组成。
10.权利要求2-9任一项的药物组合物，其中所述SNAP-25剪切产物包含SEQ ID NO:38的C端氨基酸序列。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述抗体可特异性地结合于SEQ ID NO:38的肽。
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