CN102933603A - 用于治疗胰腺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及使用与胃泌素原特异性结合的抗体治疗受试者中胰腺癌的方法。

Description

用于治疗胰腺癌的方法
1.相关申请的交互引用 
本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2010年1月8日提交的临时申请号61/293,612号的权益，该临时申请的内容完整引入作为参考。 
2.序列表、表格或计算机程序的引用 
序列表在此同时提交。 
3.发明领域
本公开尤其涉及通过施用组合物至患有原发性和/或转移性胰腺癌的受试者来治疗该受试者的方法，所述组合物包含对胃泌素原特异的抗体。 
4.背景技术
尽管数十年的基础及临床研究，癌症仍是人类的最大祸患之一。根据世界卫生组织收集的统计数据，癌症是世界范围主要死亡原因之一，在2004已经杀死七百四十万人或占这年全部死亡人数的约13％。尽管对于什么造成癌症和在分子水平上癌症如何运作已经了解甚多，然而癌症死亡率的最大降低仍归功于公共卫生介入，如反吸烟运动和因成像技术和分子诊断术进步而变得可能的更早期诊断。然而，当提及实际杀死癌细胞的努力工作时，临床医生仍依赖于前一代肿瘤学家们已经熟悉的治疗模式如手术、辐射和化疗。虽然全部这些疗法的功效已经改进多年，但是治愈率的改善和寿命的增加已经是递增的。甚至，因分子肿瘤学革命产生的新的靶向疗法在大多数情况下仅适度地改善结局。 
胰腺癌(胰的一种恶性肿瘤)是对于治疗而言特别有挑战性的癌症形 式，因为它在不再可治疗之前一般检测不到((Jemal等，2008，CA CancerJ.Clin.58(2)：71-96))。预后不良-少于5％的诊断患有胰腺癌的那些人在诊断后5年仍活着((Jemal等，2010，CA Cancer J.Clin.60(5)：277-300))，并且完全缓解是罕见的((Ghaneh等，2007，Gut 56(8)：1134-1152))。从诊断伊始的中位存活期仅是3-6个月((Stathis和Moore，2010，Nat.Rev.Clin.Oncol.7(3)：163-172))。在2010年已经估计，仅美国约43,000位个体将诊断患有胰腺癌，并且约36,800位死于本病(见，www.cancer.gov/cancertopics/types/pancreatic)。虽然胰腺癌仅占每年诊断的新癌症病例的2.5％，但是它导致6％的年度癌症死亡((Jemal等，2007，Cancer J.Clin.57(1)：43-46))，代表全部癌症的最高致死率之一。实际上，在美国，胰腺癌是男性和女性中第四高的癌杀手。 
防治癌症的另一个富有挑战性的方面是治疗来自原发性(原始)肿瘤的细胞已经破裂四散并且在身体内通过称作“转移”过程一般经淋巴液或血液移行至另一个位置以形成另一个转移性(或继发)肿瘤的患者。继发或转移性肿瘤一般与原始肿瘤是相同类型，无论其新位置在哪里，从而这种疾病称作转移性癌症，并且不称作新居留组织的癌症。例如，已经扩散至肝脏的胰腺癌是转移性胰腺癌，不是肝癌。由于原发性胰腺癌在晚期之前经常得不到诊断，转移的发病率高。实际上，大约80％的患者在诊断时已经存在转移((Sohn等，2000，J.Gastrointest.Surg.4(6)：567-579))。 
转移限制了治疗选项，因为切除或去除原发性肿瘤不再是充分的治疗选项。基于吉西他滨的化疗目前代表用于任何转移性疾病患者的标准治疗法。用吉西他滨治疗的转移性疾病患者的存活期仅是约6个月(范围从4.0至7.1个月，根据这项研究)。采用联合治疗的当前试验(例如吉西他滨连同化疗(奥沙利铂、5-FU或依立替康)或吉西他滨连同靶向疗法(厄洛替尼、贝伐单抗或西妥昔单抗))报道存活期增加仅1至2个月((Sathis和Moore，2000，Nat.Rev.Clin.Oncol.7(3)：163-172))。 
尽管近年来原发性胰腺癌和转移性胰腺癌的治疗选项取得适度进展(见上文)，但是仍迫切需要备选的和/或更有效的疗法。 
5.发明概述 
胃泌素是刺激胃酸分泌的肠肽激素。在成年哺乳动物中，它主要由胃窦中和某种程度在上部小肠和胰中的G细胞产生。参照图1，胃泌素基因翻译为101个氨基酸的多肽(称为前胃泌素原(pre-progastrin))，其包含被切除从而产生胃泌素原(“PG”)(80个氨基酸残基的多肽)的信号序列(加下划线)。胃泌素，主要以三种形式G34、G17和G14(未显示)存在，自胃泌素原加工产生。 
已经在胰腺肿瘤中观察到酰胺化胃泌素的存在((Goetze等，2000，Cancer 88(11)：2487-2494))并且研究者已经尝试使用抗胃泌素手段来治疗胰腺肿瘤(见，例如，Chau等，2006，Br.J.Cancer 94：1107-1115；Brett等，2002，J.Clin.Oncol.20：4225-4231)。还观察到患有胰腺癌的患者在其胰腺肿瘤中具有可检测水平的胃泌素原((Caplin等，2000，Br J Surg.87(8)：1035-1040))。现在已经发现，抗胃泌素原手段可以用来诊断、监测和治疗原发性和转移性胰腺癌。如本文首次所示，原发性和转移性胰腺癌患者具有升高的胃泌素原血浆和/或血清水平，并且源自原发性和转移性胰腺肿瘤的细胞系的增殖在用特异性结合胃泌素原的抗体处理时被抑制，而这些细胞系在低黏附条件下形成癌球的能力也被抑制。这些发现为诊断、治疗、阻止胰腺癌复发和监测胰腺癌进展的过程和/或治疗提供强有力的新工具。 
因此，在一个方面，本公开提供了治疗胰腺癌(其可以是原发性胰腺癌或转移性胰腺癌)的方法，所述方法包括施用有效提供治疗益处的量的特异性结合胃泌素原的抗体(“抗PG抗体”)至诊断患有原发性或转移性胰腺癌的受试者。抗PG抗体可以作为单药治疗单独施用或组合或从属于其他治疗模式(如肿瘤切除法、辐射疗法、化疗法等)来施用。 
在组合或从属于肿瘤切除法使用时，抗PG抗体可以在去除肿瘤之前和/或之后施用，并且可以在肿瘤去除后继续施用指定的时间段，直至实现低于指定阈值水平的血浆和/或血清胃泌素原水平，或直至实现血浆和/或 血清胃泌素原水平在指定时间段的下降。 
组合或从属于化疗法使用时，抗PG抗体可以在化疗之前、与化疗法同时或在化疗法之后施用。再次，可以将抗PG抗体施用指定的时间段，直至实现低于指定阈值水平的血浆和/或血清胃泌素原水平，或直至实现血浆和/或血清胃泌素原水平在指定时间段的下降。 
如下文将以更多细节讨论，诊断患有原发性和/或转移性胰腺癌的患者具有升高的PG血浆和/或血清水平。例如，参照图4，健康个体中的胃泌素原血清和/或血浆水平一般是可忽略的。患有胰腺癌的个体具有约50pM的可测量水平。这种发现在诊断和医治胰腺癌方面产生几种有用和重要的新工具。 
首先，由于胰腺癌可以难以诊断，测量的PG血浆和/或血清水平可以与其他诊断试验组合地使用以证实胰腺癌的诊断或有助于初步诊断。例如，通常已知当存在胰腺癌时，胰腺癌的迹象与许多其他疾病的迹象相似。常见症状包括在上半腹部内放射至背部的疼痛、食欲丧失和/或恶心和呕吐、明显体重减轻和无痛性黄疸。较少见的症状包括远端静脉血栓形成和肺栓塞、糖尿病和胰腺炎。由于早期检测提供更多的治疗选项和更好的预后，因此可以在表现胰腺癌的这些和/或其他症状的患者中测量血浆和/或血清PG水平以辅助诊断，其中升高的水平，例如约50pM或高于约50pM的血浆和/或血清水平将提示患者患有胰腺癌。 
测量血浆和/或血清PG水平以辅助诊断可以特别用于显示胰腺癌风险因素的受试者中，包括但不限于吸烟、膳食和环境因素、幽门螺杆菌(H.pylori)感染、代谢综合征(例如，肥胖症、糖耐量受损、长期糖尿病)和家族史的受试者，这占据大约5-10％的胰腺癌患者((Maisonneuve和Lowenfels，2010，Dig.Dis.28(4-5)：645-656))。在显示此类或其他风险因素的受试者中的血浆和/或血清PG水平可以定期监测，观察到随时间推移增加或观察到在阈值约50pM或之上的水平表示该个体可能形成胰腺癌。这种对风险个体的监测可能有助于本病的早期检测，从而提供更好的治疗选项。 
其次，测量的血浆和/或血清PG水平可以用来监测任何胰腺癌疗法(包 括本文所述的抗PG疗法)的有效性和/或潜在复发或转移。尽管不意图受任何具体操作理论约束，预期当肿瘤在治疗期间缩小时，血浆和/或血清PG水平将下降并且可以返回至正常。 
因而，在另一个方面，本公开提供了用于诊断和/或监测受试者中胰腺癌(无论是原发性胰腺癌或转移性胰腺癌)的治疗功效和/或复发的方法。这种方法总体上包括在不同时间点或在某个时间段测量相关受试者中的血浆和/或血清PG水平并且确定该水平是否高于或低于阈值水平或随时间推移增加或下降。在存在形成胰腺癌的风险的受试者中或在显示一个或多个与胰腺癌相关的症状的受试者中高于阈值水平的水平或随时间推移增加的水平表示该受试者患有胰腺癌。低于阈值水平的水平或随时间推移下降的水平表示特定疗法是有效的。考虑到胰腺癌患者的短存活时间，测量应当合理地经常进行，例如每两周或甚至以更短的间隔期测量一次。 
6.附图简述 
图1提供信号肽序列加下划线的人前胃泌素原(SEQ ID NO：100)，人成熟胃泌素原(SEQ ID NO：20)和胃泌素原加工的某些产物(包括G34(SEQ ID NO：102)、G34-Gly(SEQ ID NO：103)、G17(SEQ ID NO：104)、G17-Gly(SEQ ID NO：105)和CTFP(SEQ ID NO：106))的氨基酸序列。 
图2提供某些示例性鼠抗hPG单克隆抗体的可变轻链和可变重链的多核苷酸序列和氨基酸序列。在每种情况下，3个CDR以粗体加下划线的字体显示。具体而言： 
图2A提供鼠抗hPG MAb3的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：12)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：16)； 
图2B提供鼠抗hPG MAb3的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：13)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：17)； 
图2C提供鼠抗hPG MAb4的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：14)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：18)； 
图2D提供鼠抗hPG MAb4的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：15)和编 码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：19)； 
图2E提供鼠抗hPG MAb8的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：59)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：67)； 
图2F提供鼠抗hPG MAb8的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：63)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：71)； 
图2G提供鼠抗hPG MAb13的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：60)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：68)； 
图2H提供鼠抗hPG MAb13的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：64)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：72)； 
图2I提供鼠抗hPG MAb16的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：61)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：69)； 
图2J提供鼠抗hPG MAb16的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：65)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：73)； 
图2K提供鼠抗hPG MAb19的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：62)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：70)；和 
图2L提供鼠抗hPG MAb19的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：66)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：74)； 
图3提供了本文所述选择的抗hPG单克隆抗体的人源化可变重链和轻链的突出的(projected)多肽序列。在每种情况下，3个CDR以粗体加下划线的字体显示。具体而言： 
图3A提供人源化MAb3的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：21)； 
图3B提供人源化MAb3的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：22)； 
图3C提供人源化MAb4的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：23)； 
图3D提供人源化MAb4的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：24)； 
图3E提供人源化MAb8(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：75)； 
图3F提供人源化MAb8(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：76)； 
图3G提供人源化MAb8(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：77)； 
图3H提供人源化MAb8(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：78)； 
图3I提供人源化MAb8(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：79)； 
图3J提供人源化MAb8(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：76)； 
图3K提供人源化MAb13(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：80)； 
图3L提供人源化MAb13(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：81)； 
图3M提供人源化MAb13(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：82)； 
图3N提供人源化MAb13(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：83)； 
图3O提供人源化MAb16(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：84)； 
图3P提供人源化MAb16(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：85)； 
图3Q提供人源化MAb16(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：86)； 
图3R提供人源化MAb16(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：87)； 
图3S提供人源化MAb16(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：88)； 
图3T提供人源化MAb16(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：89)； 
图3U提供人源化MAb19(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：90)； 
图3V提供人源化MAb19(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：91)； 
图3W提供人源化MAb19(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：92)； 
图3X提供人源化MAb19(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：93)； 
图3Y提供人源化MAb19(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：94)；和 
图3Z提供人源化MAb19(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：95)。 
图4提供与健康对照相比，说明在来自原发性(M-)或转移性(M+)胰腺癌患者的血浆或血清中的胃泌素原浓度的图。 
图5提供了说明胃泌素原在多种类型的原发性和转移性胰腺癌细胞系中表达水平的图。 
图6提供了说明由多种类型的原发性和转移性胰腺癌细胞系分泌的胃泌素原的图。 
图7提供了与阴性对照单克隆抗体相比，在Capan 1细胞(转移性胰腺肿瘤细胞)上比较示例性抗hPG MAb3的抗增殖特性的图。 
图8提供了与阴性对照单克隆抗体相比，在BxPC-3细胞(原发性胰腺肿瘤细胞)上比较示例性抗hPG MAb8的抗增殖特性的图。 
图9提供了与阴性对照单克隆抗体相比，在MIA PaCa2细胞(原发性胰腺肿瘤细胞)上比较示例性抗hPG MAb8的抗增殖特性的图。 
图10提供这样的图，其显示与未处理的对照细胞相比，示例性抗hPGMAb3对Capan 1细胞(转移性胰腺肿瘤细胞)在低黏附条件下形成癌球的长期能力的抑制特性。 
图11提供这样的图，其显示与未处理的对照细胞相比，示例性抗hPG MAb8、MAb13、MAb16和MAb19对SU.86.86细胞(转移性胰腺肿瘤细胞)在低黏附条件下形成癌球的长期能力的抑制特性。 
7.具体实施方案
7.1胰腺癌 
胰是一个约6英寸长的薄腺体，具有两个主要功能：产生帮助消化食物的胰液和产生帮助控制血糖水平的激素，如胰岛素和胰高血糖素。消化液由外分泌胰细胞产生，并且激素由内分泌胰细胞产生。大约95％或更多的胰腺癌源自外分泌细胞((Yao等，2007，Oncology 14(12)：3492-3450))。在外分泌胰腺癌中，大约95％是腺癌，而剩余5％包括腺鳞状癌、指环状细胞癌、肝样癌、胶质癌、未分化癌和具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌(见，http://pathology.jhu.edu/pancreas/BasicTypes1.php)。 
早期胰腺癌经常不引起症状((Jemal等，2008，CA Cancer J.Clin.58(2)：71-96))，并且由晚期胰腺癌引起的症状通常是不同的并且不是特定的((Stathis和Moore，2010，Nat.Rev.Clin.Oncol.7(3)：163-172))。因此，胰腺癌在它成为晚期之前经常诊断不到((Jemal等，2008，CA Cancer J.Clin.58(2)：71-96))。常见症状包括但不限于上腹部和背部疼痛、食欲丧失和/或恶心和呕吐、明显体重减轻和无痛性黄疸、远端静脉血栓形成、肺栓塞以及糖尿病和/或胰腺炎。 
多种风险因素与胰腺癌相关，并且包括但不限于吸烟；长期糖尿病；慢性胰腺炎；和某些遗传病，如遗传性胰腺炎、多内分泌性腺瘤1型综合征、遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC；林奇综合征)、希佩尔-林道(von-Hippel-Lindau)综合征、毛细管扩张性运动失调和家族性非典型多痣黑素瘤综合征(FAMMM)。 
用来诊断胰腺癌的诊断方法包括成像研究如计算机断层成像(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影(PET)扫描、内窥镜超声术(EUS)、腹腔镜检查术、内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)和经皮经肝胆管镜检查术(PTC)，但是通过内镜针活组织检查或手术切除放射学疑似组织 作出确诊。这些多样的诊断技术还用来对癌症分期，这影响治疗选项。以下分期通常用来评估胰腺癌： 
0期(原位癌)：在本期，在胰的衬层内发现异常细胞。这些异常细胞可以是癌性的并扩散至周围的组织。 
I期：在本期，癌已经形成并且仅存在于胰中。取决于肿瘤的尺寸，I期进一步划分为两个亚期：IA期(肿瘤是2cm或更小)和IB期(肿瘤大于2cm)。 
II期：在本期，癌已经扩散至附近的组织和器官，并且可能已经扩散至***。基于癌已扩散至何处，这个期进一步划分为亚期。IA期(扩散至附近的组织和器官但是不扩散至淋巴)；和IIB期(扩散至淋巴并且可能扩散至其他的附近组织和器官)。 
III期：在本期，癌已经扩散至胰附近的主要血管，并且也可能已经扩散至附近的***。 
IV期：在本期，癌可以是任何大小的，并且已经扩散至远处组织和器官，如肝、肺和腹腔(即，癌症已经转移)。 
存在依照分期而变动的三种主要治疗选项(手术、辐射疗法和化疗)。I期和II期原发性胰腺癌的治疗可以包括手术，伴以基于吉西他滨或基于5-FU方案的辅助化疗，伴以或不伴以辐射疗法。 
经常地，原发性胰腺癌在治疗后复发(称作复发性胰腺癌)。基于吉西他滨的化疗也通常用于复发性和局部进展的胰腺癌患者，有时随后给予放疗法或放化疗法。 
7.2转移 
如背景部分指出，转移指癌症扩散的过程。简而言之，肿瘤细胞离开原发性肿瘤，经血液循环或淋巴液***行进至新组织部位并且形成继发性肿瘤。在新组织部位的肿瘤称作转移性肿瘤，并且一般地鉴定原发性肿瘤的来源。例如，已经扩散至其他组织的胰腺癌称作“转移性胰腺癌”，无论继发性、转移性肿瘤的组织位置在哪里。 
癌细胞经常扩散至原发性肿瘤附近的***，这称作***累及或区 域性疾病。 
转移由众多不同的步骤组成：侵入和移行、进入血管、循环、外渗和定居、增殖和血管生成。在侵入和移行期间，各个细胞从原发性肿瘤脱离并侵入相邻的健康组织。为实现这一点，肿瘤细胞必须变得能动，并且推定经历表型转化，称作上皮至间质转变。Kalluri等，2009，J.Clin.Invest.119(6)：1420-28。此外，此类细胞经常产生降解胞外基质的酶，从而促进从原发性肿瘤移行出来并进入周围健康组织。在肿瘤细胞遇到血管或***时，它将自身***内衬脉管的内皮细胞之间并且渗入血流或淋巴***中。异常的肿瘤细胞随后经循环***或淋巴***行至新的器官或行至***。肿瘤细胞随后可以寄宿在器官如肝脏、肺或其他组织或器官的毛细血管或***中，并且随后通过渗透内皮而外渗至组织间隙中。最后，在定居、增殖和血管生成期间，肿瘤细胞在它们的新宿主组织中占据居所并且开始生长。当新的转移性肿瘤达到足够尺寸时，它可以分泌生长因子，如VEGF，以刺激新血管生长至肿瘤中，从而供应氧和营养给快速生长的肿瘤。 
肿瘤可以通过转移作用扩散至身体的几乎任何部分。局部复发、肝转移和腹腔扩散是切除胰腺肿瘤后最常见的复发部位。常见的局部-区域侵入存在于胰腺后神经组织、十二指肠、门静脉(PV)和肠系膜上静脉(SMV)或局部***中。胰腺癌中最寻常的远距离转移部位是肝和腹腔。其他较不常见的部位是肺、骨和脑。不寻常的部位如肌肉、皮肤、心脏、胸膜、胃、脐、肾、盲肠、精索和***也已经报道((Howard，1996，Curr.Prob.lCancer 20(5)：281-328；Borad等，2009，Yale J.Biol.Med.82(1)：1-6))。 
7.3原发性和转移性胰腺癌的治疗 
诊断患有胰腺癌的患者一般具有不良预后，部分是因为胰腺癌通常在早期不引起症状，导致诊断时局部进展的疾病或转移性疾病。上文讨论的治疗选项取决于诊断时疾病的分期。 
7.4抗hPG抗体和它们对原发性和转移性胰腺癌的效果 
如本文公开，已经报道了患有胰腺癌的受试者在其胰腺肿瘤中具有可检测水平的胃泌素原((Caplin等，2000，Br J Surg.87(8)：1035-1040))。本 文报道和在实施例部分中讨论的数据表明，胰腺癌细胞系BxPC-3、MIAPaCa-2、Capan 1和SU.86.86表达胃泌素原编码基因(GAST)的mRNA(实施例7)，并且还表明胰腺癌细胞系分泌胃泌素原(实施例8)。现在已经发现，原发性和转移性胰腺癌患者具有升高的胃泌素原血浆和/或血清水平(实施例6)，源自原发性和转移性胰腺肿瘤的细胞系的生长因采用特异性结合人胃泌素原(“hPG”)的抗体处理而抑制(实施例9、10和11)，并且胰腺癌细胞在低黏附培养条件下生长为肿瘤球的能力也在用抗hPG抗体预处理后被显著抑制(实施例12)。基于这些令人惊讶和令人鼓舞的发现，预期这类抗hPG抗体可以用来辅助胰腺癌的诊断、监测胰腺癌治疗方案的功效、治疗处于任何发展阶段的胰腺癌，包括原发性和转移性胰腺癌，和阻止胰腺癌的复发。 
如Hollande等最近所示，胃泌素原通过抑制ICAT(β-联蛋白/Tcf-4信号传导的负向调节物)而刺激结肠直肠癌细胞的β-联蛋白/Tcf-4途径(见WO 2007/135542)。β-联蛋白/Tcf-4信号传导引起细胞增殖。在缺乏这种信号传导的情况下，它们分化和经历正常细胞周期，包括程序性细胞死亡或凋亡。Hollande等还已经显示，使此类细胞暴露于抗hPG抗体阻断了β-联蛋白/Tcf-4诱导的增殖并且CRC细胞的生长或增殖被抑制(见，例如，WO 2007/135542)。应答于胃泌素原处理或暴露于胃泌素原(无论胃泌素原内源或外源产生)而增殖和其中在用抗PG抗体处理或暴露于抗PG抗体时抑制增殖的细胞在本文中称作“胃泌素原敏感的”。 
如上文指出，已经发现原发性肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞均是胃泌素原敏感的，并且应答于用抗PG抗体处理或暴露于抗PG抗体。虽然不意图受任何操作理论约束，但认为，抗PG抗体通过以下方式发挥它们的抗增殖特性：结合PG并且阻断PG与其推定性受体相互作用，转而阻抑因ICAT表达增加产生的β-联蛋白/Tcf-4诱导的增殖。抗PG抗体可以干扰原发性和/或转移性癌细胞的存活和/或生长的其他机制也是可能的，并且不意图限制本文中公开的本发明范围。 
7.5治疗方法 
因此，在一个方面，本公开提供治疗患有或诊断患有胰腺癌的受试者的方法。这种方法包括将有效提供治疗益处的量的一种或多种抗PG抗体施与受试者。在稍后部分总体地描述抗PG抗体和用于所述方法中的特定抗PG抗体。 
治疗的受试者可以是任何动物，例如，哺乳动物如家畜(例如，奶牛、猪、马等)或家养宠物(例如，犬、猫等)或人。施用的抗PG抗体应当是对正在治疗的动物的物种特异的。对于治疗人受试者，抗PG抗体应当特异性结合人胃泌素原(在本文中称作“抗hPG抗体”，下文更详细地描述)。 
正在治疗的胰腺癌可以处于任何发展期，从0期至I期、II期、III期、或甚至IV期。实际上，本文所述的抗PG疗法的显著优点在于，预期它有效对抗转移性胰腺肿瘤以及原发性胰腺肿瘤，从而为患有甚至处于发展晚期的胰腺癌提供益处。还预期它阻止胰腺癌的复发。 
抗PG疗法可以单药疗法单独使用，或组合或从属于常用来治疗特定分期的胰腺癌的其他疗法来使用。此类常见的疗法在上文提到，并且包括采用例如吉西他滨、5-FU或其他化疗剂的化疗法；和靶向疗法，如用贝伐单抗治疗。在一个具体实施方案中，抗PG疗法与采用靶向肿瘤细胞的其他抗体(如贝伐单抗)治疗组合或从属于这种疗法应用。在与其他疗法组合使用时，抗PG抗体和其他疗法可以同时、相继或分别施用。 
如本文所使用，如果将抗hPG抗体和第二治疗剂在同一日(例如在同一次患者就诊期间)施与患者，则称它们相继施用。相继施用可以间隔1、2、3、4、5、6、7或8小时或更多小时发生。相反地，如果将抗hPG抗体和第二治疗剂在不同日施与患者，则称它们分别施用。例如，抗PG抗体和第二治疗剂可以按1日、2日、3日、4日、5日、6日、1周、2周或每月间隔期施用。抗PG抗体的施用可以先于或晚于第二治疗剂的施用。 
备选地，抗PG抗体和第二治疗剂可以同时施用一段时间，然后在第二段时间中交替施用抗PG抗体和第二治疗剂。 
类似地，如果可能，抗PG抗体可以与手术去除肿瘤组合或从属于这种疗法施用。抗PG抗体可以在去除肿瘤之前、期间或之后施用。 
7.6药物组合物 
抗PG抗体将一般以药物制剂或组合物的形式施用。此类制剂或组合物可以任选地包括额外的活性物质和/或治疗药，如本领域已知。制剂一般地将包括可药用载体、赋形剂或稀释剂。使用的具体载体、赋形剂和/或稀释剂取决于所需的施用模式。组合物可以是任意适合的形式，这取决于所需的施用它至患者的方法。 
抗PG抗体可以通过多种途径，一般肠胃外地施与受试者，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内或肌内注射。施用可以作为一个或多个快速浓注(bolus)或作为一个或多个输注实施。根据本领域普通技术人员的知识，其他施用途径也是可能的。在任意给定的情况下最合适的施用途径将取决于具体的抗体、受试者和正在治疗的胰腺癌的分期。 
药物组合物可以便利地以每剂量含有预定量的抗PG抗体的单位剂量形式提供。这种单位可以包含例如但不限于5mg至5g，例如10mg至1g或20至50mg。 
可以通过将具有希望的纯度的抗体与可选的本领域中通常利用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(在本文中全都称为“载体”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂(isotonifier)、非离子型去垢剂、抗氧化剂和其他多种混合添加物)混合，将药物组合物制备为冻干制剂或水溶液进行保存。见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol编辑1980)。这类添加物应当在所用的剂量和浓度对接受者无毒。 
缓冲剂帮助维持pH在接近生理条件的范围内。它们可以按约2mM至约50mM的范围内的浓度存在。适合用于本公开的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐二者，如柠檬酸缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡 索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐(如Tris)。 
可以添加防腐剂来延缓微生物生长，且可以按0.2％-1％(w/v)的范围内的量添加。适合用于本公开的防腐剂包括酚、苄醇、间甲酚、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苄烷铵卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己双铵和尼泊金烷基酯(如尼泊金甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。 
可以加入等渗剂(有时称为“稳定剂”)来确保本公开的液体组合物的等渗性，其包括多元糖醇，例如三元糖醇或高级糖醇，如丙三醇、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂指一大类赋形剂，其功能可以从填充剂至稳定治疗剂或帮助防止变性或黏附于容器壁的添加剂。常见的稳定剂可以是多元糖醇(上文所列)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、丙三醇等，包括环多醇，如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少残基的肽)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖；三糖，如蜜三糖；和多糖，如葡聚糖。稳定剂可以以每份重量的活性蛋白质0.1至10,000重量存在。 
可以添加非离子型表面活性剂或去垢剂(也称为“湿润剂”)来帮助溶 解治疗剂，以及保护治疗性蛋白质免受搅拌诱导的聚集，其还允许制剂暴露于应力剪切表面而不导致蛋白质变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、Polyoxamer(184、188等)、多聚醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单醚( 
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等)。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。然而，表面活性剂具有与抗体结合的倾向性并且可以损害抗体的构象。因此，在使用表面活性剂时，起稳定作用的浓度应当是低的并且实验地断定。 
其他的多种赋形剂包括螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。 
7.7有效剂量 
将抗PG抗体以足够或有效提供治疗益处的量施与受试者。在治疗原发性和/或转移性胰腺癌的情形时，如果实现以下一个或多个情况，则可以推断有治疗益处：停顿或减缓肿瘤生长、减少患者内肿瘤的数目和/或尺寸、缩减不可手术的肿瘤至可以手术去除它们的尺寸和位置、增加寿命和/或改善患者生活质量。 
对于治疗益处存在而言，不要求完全治愈，尽管完全治愈是所希望的。实际上，因为从胰腺癌诊断伊始的中位存活期仅是3-6个月((Stathis和Moore，2010，Nat.Rev.Clin.Oncol.7(3)：163-172))，个体的存活期超出这个中位数增加额外3个月提供了巨大的治疗益处。见，例如，Philip等，2009，J.Clin.Oncol.24(33)：5660-5669。 
在一些情况下，根据本领域普通技术人员的知识，治疗益处可以与一个或多个代用终点相关。例如且不限于如下情形，可以在受试者中随时间推移测量血浆和/或血清PG浓度，而PG水平的下降或低于阈值水平例如低于约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM或5pM的水平指示治疗益处。 
肿瘤尺寸、数目和代谢可以使用多种扫描技术，如但不限于，CT、MRI、功能MRI、SPECT和PET以及本领域普通技术人员已知的其他方 法测量。 
不要求结合全部游离PG以实现治疗功效，虽然这可以是合乎需要的。游离PG意指通过抗PG抗体结合可获得的PG。相反地，降低游离PG在肿瘤内部或周围的浓度、全身浓度、尤其体液或其他地方的浓度至更有限的程度也可以是有效的。其中可以通过施用抗PG抗体组合物降低游离PG浓度的示例性组织和体液包括但不限于从患者去除的肿瘤样品、腹水、来自胸膜渗出液、脑脊液、淋巴、血液、血浆、血清等。PG在这些组织或体液的一种或多种中的浓度可以使用本领域普通技术人员熟悉的ELISA技术或其他技术定量。 
根据本领域普通技术人员的知识，可以在患者中用滴定法测量抗PG抗体的剂量，从而在施用后在预定时间降低目的组织或体液中的游离PG浓度至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或约5％-10％、约10％-15％、约15％-20％、约20％-25％、约25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约45％-50％、约50％-55％、约55％-60％、约60％-65％、约65％-70％、约70％-75％、约75％-80％、约80％-85％、约85％-90％、或约90％-95％、或范围在任何前述值之间的游离PG浓度降低百分数。 
所施用的抗PG抗体的量将取决于多种因素，包括正在治疗的胰腺癌的性质和分期，施用的形式、途径和部位，治疗方案(例如是否使用第二治疗剂)，正在治疗的具体受试者的年龄和病症，正在治疗的患者对抗PG抗体的敏感性。本领域技术人员可以容易地测定适宜剂量。最终，临床医生将决定待使用的适当剂量。可以根据需要重复此剂量。如果出现副作用，可以按照正常临床实践改变或降低剂量的量和/或频率。适当的剂量和治疗方案可以通过用本领域普通技术人员已知的常规技术监测治疗进展来建立。 
最初可以从体外测定法估计有效剂量。例如，可以配制用于动物的起始剂量以达到抗PG抗体的循环血液浓度或血清浓度，该浓度处于或高于体外测量的特定抗PG抗体的结合亲和常数。考虑具体抗体的生物利用率 来计算达到这类循环血液或血清浓度的剂量良好地处于技术人员的能力范围之内。对于指导，读者可参考第1部分：总原则(General Principles)，引自″Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第11版，Hardman，J.G.等，编著，McGraw-Hill Professional及其中引用的参考文献。 
也可以从体内数据(如动物模型)估计起始剂量。用于测试药剂治疗胰腺癌的功效的动物模型是本领域熟知的。技术人员可以常规地改编这类信息来确定适合用于人施用的剂量。 
在具体实施方案中，可以通过以下方式确定个体受试者的静脉内剂量；在治疗之前一些日至一些周测量该个体的血清或血浆PG浓度若干次并且计算将具有饱和作用的抗PG抗体量，即，足以结合全部PG的量。如技术人员将理解，对给定PG血清或血浆浓度实现饱和作用所需要的任何特定抗体的量将部分地取决于特定抗体的亲和常数。用于计算特定目的抗PG抗体的饱和量的方法是熟知的。 
为确保饱和，可以施用大于计算饱和量的量，例如，可以施用大于计算饱和量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或甚至10倍的量。对于除静脉内施用之外的施用模式，如本领域熟知，可以基于药物代谢动力学和生物利用率调整这个量。 
取决于正在治疗的胰腺癌的分期、施用途径及受试者的年龄、体重和状态，抗PG抗体的有效剂量预期是每个单次施用(例如，快速浓注)、多次施用或持续施用(例如，输注)从约0.001mg/kg至约250mg/kg或其中任意有效范围或值。在某些实施方案中，每个剂量可以是从约0.1mg/kg至约0.5mg/kg；约0.25mg/kg至约0.75mg/kg；约0.5mg/kg至约1mg/kg；约2mg/kg；约1.5mg/kg至约2.5mg/kg；约2mg/kg至约3mg/kg；约2.5mg/kg至约3.5mg/kg；约3mg/kg至约4mg/kg；约3.5mg/kg至约4.5mg/kg；约4mg/kg至约5mg/kg；约5mg/kg至约7mg/kg；约6mg/kg至约8mg/kg；约7mg/kg至约9mg/kg；约8mg/kg至约10mg/kg；约10mg/kg至约15mg/kg；约12.5mg/kg至约17.5mg/kg；约15mg/kg至 约20mg/kg；约17.5mg/kg至约22.5mg/kg；约20mg/kg至约25mg/kg；约22.5mg/kg至约27.5mg/kg；约25mg/kg至约30mg/kg；约30mg/kg至约40mg/kg；约35mg/kg至约45mg/kg；约40mg/kg至约50mg/kg；约45mg/kg至约55mg/kg；约50mg/kg至约60mg/kg；约55mg/kg至约65mg/kg；约60mg/kg至约70mg/kg；约65mg/kg至约75mg/kg；约70mg/kg至约80mg/kg；约75mg/kg至约85mg/kg；约80mg/kg至约90mg/kg；约85mg/kg至约95mg/kg；约90mg/kg至约100mg/kg；约95mg/kg至约105mg/kg；约100mg/kg至约150mg/kg；约125mg/kg至约175mg/kg；约150mg/kg至约200mg/kg；约175mg/kg至约225mg/kg；约200mg/kg至约250mg/kg。其他剂量范围也是可能的。 
施用的量、频率和持续时间将取决于多种因素，如患者年龄、体重和疾病状态。因而，在非限制性实例中，治疗性施用方案可以持续1日或更长、2日或更长、3日或更长、4日或更长、5日或更长、6日或更长、1周或更长、2周至无限期、2周至6个月、3个月至5年、6个月至1年或2年、8个月至18个月等。可选地，提供治疗方案用于反复施用，例如每日一次、每日两次、每两日、三日、五日、一周、两周或一个月。可以按相同的剂量或按不同的剂量反复施用。可以反复施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。可以作为单次剂量或在治疗方案的过程内(例如在一周、两周、三周、一个月、三个月、六个月、一年或更长的过程内)施用治疗有效量的抗PG抗体。 
7.8诊断和监测患者以确定治疗功效的方法 
如上文指出，诊断患有原发性和/或转移性胰腺癌的患者具有升高的PG血浆和/或血清水平。参照图4，PG在健康个体中的基线水平是可忽略的，一般地处于检测限。在患有原发性和/或转移性胰腺癌的患者中，PG血浆和/或血清水平是可测量的并且是约50pM。基于这种观察结果，PG的血浆和/或血清水平可以用来辅助原发性或转移性胰腺癌的诊断或监测原发性或转移性胰腺癌治疗的有效性。 
因而，本公开还提供诊断原发性或转移性胰腺癌或监测其治疗过程的 功效的方法。为辅助诊断，来自接受诊断的个体的血浆或血清样品的PG水平可以与阈值相比进行测量，其中高于阈值的水平表示有胰腺癌，尤其在其他诊断试验表示该个体可能正患有胰腺癌的情况下。在一些实施方案中，至少约50pM的血浆或血清PG浓度表示有胰腺癌，尤其与其他阳性试验结果组合时。 
为了监测疗法功效，可以在指定时间点测量血液、血浆或血清PG水平。浓度随时间推移下降和/或在特定时间点低于阈值的测量水平表示有功效。阈值可以是上文讨论的阈值，或可以是在疗法启动之前或在一轮治疗期间的某些早期时点从正在治疗的受试者中获得的受试者特定的值。 
不希望受任何具体的操作理论约束，认为随着患者中肿瘤的数目和/或尺寸因本轮治疗而缩减，由肿瘤产生的PG的总量也下降。相反地，在一轮治疗结束后没有明显变化或PG水平上升可能表明该疗法不是有效的。这种信息可以由护理提供者用来决定是否应当启动新一轮治疗。 
PG水平可以是使用本领域普通技术人员熟悉的分析技术(如但不限于RIA和ELISA)测量。在稍后部分中描述用于测量人受试者的PG水平的抗hPG抗体。 
在一个具体实施方案中，可以使用夹心ELISA测量PG水平，其中所述夹心ELISA采用一个靶向胃泌素原N端的抗PG抗体和一个靶向胃泌素原C端的第二抗PG抗体。在稍后部分中描述用于这种夹心测定法的示例性N端和C端抗PG抗体。在这种测定法中，制备了与已知量的第一“捕获”N端或C端抗PG抗体结合的表面，如96孔板中的孔。随后将测试样品施加至该表面，随后是孵育时期。随后将表面洗涤并且施加含有第二“检测”抗PG抗体的溶液，其中检测抗体结合PG的不同表位(例如，如果捕获抗体是C端抗PG抗体，则使用N端抗PG抗体作为检测抗体，并且反之亦然)。然后直接(如果例如将检测抗体与可检测标记缀合)或间接(通过结合检测抗PG抗体的标记第二抗体)测量PG水平。对于这种测定法，应当过量使用抗体，从而结合和定量全部PG。在实施例1中提供用于测量血浆和/或血清PG水平的具体夹心测定法。 
可以在治疗结束后以不同间隔期取得多个量值，并且随后绘图以确定趋势是否存在。在非限制性实例中，可以在一轮治疗结束后的头六个月每周或每月测定PG水平。其他时间间隔也是可能的。 
在包括使用抗PG抗体的一轮治疗的一个实施方案中，也可以在治疗过程期间取得一个或多个量值，从而可以估计抗体对PG水平的影响。在其他此类实施方案中，如果治疗有效的话，在残余抗PG抗体在采样期间存在于患者中的情况下，数据可以显示为PG水平因PG被抗体阻隔而降低，随后因这种作用削弱而升高，然后接着下降。在其他实施方案中，可以在估计抗PG抗体已经从患者中清除，从而此类抗体对PG的结合不影响测量PG浓度的准确度后取得治疗后量值。 
可以使用与患者中检测到的PG水平相比较的不同基线。在一些实施方案中，由来自相同患者的先前量值建立基线，所述量值可以按预定的间隔期取得。在非限制性实例中，可以在治疗结束后头六个月每周或每月、随后每三个月直至治疗结束第二年并且随后每6个月或一年测定PG水平。其他时间间隔也是可能的。 
在其他实施方案中，可以在与接受监测的那些患者具有相似特征的患者群体中从平均PG水平建立基线。此类特征可以包括，但是不必然地限于性别、年龄、原发性癌症类型、暴露于某些类型的治疗、这些特征的任何组合等。在其他实施方案中，可以在监测特定患者时使用多于一条基线。例如，可以使用患者特异性基线以及群体衍生基线。 
在一些实施方案中，在事先治疗过的癌症患者中的平均PG浓度处于正在与该患者相比较的相关群体的正常范围内并且保持稳定时，该患者将评定为没有转移和因而不需要新治疗。相反地，在事先治疗过的癌症患者中观察到PG浓度经过一段时间上升的情况下，并且在某些实施方案中，超过源自群体数据的阈值，则该患者可以是评定为可能具有转移，并且因而是针对转移性癌症的新治疗的候选人。 
因为进食通常增加胃泌素合成和分泌，所以它也可以造成血液PG水平的短暂增加，这可以干扰在正就治疗功效和转移存在进行监测的患者中 精确测量PG水平。为避免这种影响，尤其待测定血样中的PG浓度的情况下，可以从禁食后的患者取得样品。 
7.9抗PG抗体 
用于本文公开的方法中的抗体是这些抗体，它们与人胃泌素原特异性结合胜过与胃泌素基因的其他产物的结合。参照图1，胃泌素基因翻译为101个氨基酸的多肽(称为前胃泌素原(pre-progastrin))，其包含被切除从而产生胃泌素原(80个氨基酸的多肽)的信号序列(加下划线)。胃泌素原转而经切割以产生在序列上与胃泌素原的残基38-71相应的34个氨基酸的产物，所述产物然后在其羧基端用甘氨酸残基延长，产生甘氨酸延长的G34(“G34-Gly”)。这种切割的副产物是一种6个氨基酸的肽(称为C端侧翼肽或CTFP)，其在序列上与胃泌素原的残基75-80相对应。G34-Gly然后经进一步切割以产生一种17个残基的多肽，该多肽在序列上与胃泌素原的残基55-71相对应，称为G17-Gly。去除G34-Gly和G17-Gly的C端甘氨酸，然后C端酰胺化，分别产生G34和G17，二者都是C端酰胺化的。 
如本文所用，如在标准结合测定法中测量的那样，如果一种抗体结合于全长胃泌素原但是完全不结合于CTFP、酰胺化胃泌素或甘氨酸延长的胃泌素，则它是“对hPG高度特异的”或“高度特异性结合”hPG，并且如果该抗体显示与hPG的结合至少约5倍高于CTFP和胃泌素基因的其他产物，则它是“对hPG特异的”或“特异性结合”hPG。实施例2中提供可以用来评估特定抗hPG抗体的特异性的具体ELISA测定法。 
此类高度特异性和/或特异性抗hPG抗体(在本文中称作“抗hPG抗体”)可以是多克隆的(“抗hPG PAb”)或单克隆的(“抗hPG MAb”)，不过对于治疗性用途并且在一些情况下，对于诊断或其他体外用途，单克隆抗体是优选的。 
被抗hPG抗体结合的表位不是关键的。有用的抗hPG抗体可以结合hPG的N端区域、hPG的C端区域或hPG的不同区域。最近，已经发现，至少对于单克隆抗hPG抗体，用来产生抗hPG抗体的抗原的选择可能是 重要的(见，2010年10月15日提交的国际申请号PCT/EP2010/006329和2010年10月15日提交的美国申请号12/906,041，所述公开及其具体公开的抗hPG抗体通过引用方式并入本文；下文分别称作‘329申请和‘041申请)。如‘329申请和‘041申请中所公开，并非所有衍生自hPG的抗原均在生理条件下刺激特异性结合hPG的单克隆抗体的产生。实际上，已经用来成功产生多克隆抗hPG抗体的某些抗原(如全长重组hPG(见例如Singh的WO 08/076454)和与hPG的C端最后十个氨基酸相对应的肽(见例如Hollande的WO 07/135542))未能产生抗hPG单克隆抗体。如在‘329申请和‘041申请中所指出，已经在hPG序列内鉴定出可以用来产生特异性结合hPG的单克隆抗体的抗原性N端和C端序列。令人感兴趣的是，抗原性序列不需要限于对其独特的hPG序列区域。与胃泌素基因的其他产物(例如G17、G34和CTFP)具有共同序列区域的肽抗原产生了不但结合hPG，而且特异性结合hPG的单克隆抗体。 
可用具有对应于hPG N端区域的序列的肽抗原获得和/或与hPG N端区域结合的抗hPG抗体在本文中称为“N端抗PG抗体”。可以用来构建适于获得对hPG特异的多克隆和单克隆抗体的免疫原的具体示例性hPG抗原区对应于hPG的残基1至14：SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO：25)。在下表1A中和实施例部分中提供用于获得N端抗hPG抗体的示例性免疫原以及用这些示例性免疫原获得的N端抗hPG单克隆抗体的CDR和VH和VL序列： 
Figure BDA00002114784100241
使用具有对应于hPG C端区域的序列的肽抗原可获得的和/或与hPGC端区域结合的抗hPG抗体在本文中称为“C端抗PG抗体”。可以用来构建用于获得多克隆和单克隆C端抗hPG抗体的免疫原的具体示例性抗原区对应于hPG的残基55至80：QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO：27)。在下表1B中和实施例部分中提供用于获得C端抗hPG抗体的示例性免疫原(包括这种抗原)以及用这些示例性免疫原获得的C端抗hPG单克隆抗体的CDR和VH和VL序列： 
Figure BDA00002114784100271
Figure BDA00002114784100281
使用分别在Laune等，2002，J.Immunol.Methods 267：53-70和Laune，1997，J.Biol.Chem.272：30937-30944中描述的SPOT技术和丙氨酸扫描法图谱定位了由表1A和表1B中提供的示例性抗hPG单克隆抗体MAb1-MAb23结合的具体表位(也见，‘329申请的实施例6)。 
在SPOT技术中，产生跨越推定的表位的15个氨基酸肽序列，并点在硝酸纤维素膜上，然后用测试抗体探测来确定抗体识别的最小表位序列。丙氨酸扫描法用来确定表位内部对抗体结合关键的残基。将推定的表位内部的每个残基逐一突变成丙氨酸，并且随后用测试抗体探测含有丙氨酸的肽。 
对于N端抗hPG单克隆抗体MAb1-4和15-20，表位至少包含以下序列：DAPLG(SEQ ID NO：28)、PDAPLG(SEQ ID NO：29)、PRSQQPD(SEQ ID NO：30)、WKPRSQQPD(SEQ ID NO：31)或WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO：32)，如以下表2A中所示。 
Figure BDA00002114784100291
对于C端抗hPG单克隆抗体MAb 5-7、9-12、14和21-23，表位至少包含以下序列：FGRR(SEQ ID NO：33)、MDFGR(SEQ ID NO：34)、AEDEN(SEQ ID NO：35)和GWMDFGRR(SEQ ID NO：36)，如以下表2B中所示。 
Figure BDA00002114784100301
表位图谱定位实验揭示，抗hPG MAb 2和MAb 4结合相同的表位；抗hPG MAb 1和MAb 3结合大致相同的表位；MAb 17、MAb 18、MAb19和MAb 20结合大致相同的表位；MAb 15和MAb 16结合大致相同的表位；抗hPG MAb 5、MAb 6、MAb 7、MAb 9和MAb 12结合相同的表位，且与抗hPG MAb 10结合大致相同的表位；抗hPG MAb 11和MAb14结合大致相同的表位。 
用于本文所述的方法和试剂盒中的N端抗hPG单克隆抗体的具体实施方案结合以下表位的抗体，所述表位包括hPG的残基10至14(SEQ ID NO：28)、hPG的残基9至14(SEQ ID NO：29)、hPG的残基4至10(SEQ ID NO：30)、hPG的残基2至10(SEQ ID NO：31)或hPG的残基2至14(SEQ ID NO：32)的表位。 
用于本文所述的方法和试剂盒中的C端抗PG抗体的具体实施方案包括结合以下表位的抗体，所述表位包括hPG的残基71至74(SEQ ID NO：33)、hPG的残基69至73(SEQ ID NO：34)、hPG的残基76至80(SEQ ID NO：35)或hPG的残基67至74(SEQ ID NO：36)。 
除表1A和表1B中提供的那些之外，用于本文公开的方法和试剂盒中的N端和C端抗hPG抗体还可以在竞争性结合测定法中采用示例性MAb1-23或采用结合N-或C端表位的其他参考抗体来鉴定，如在稍后部分中更详细地描述。 
还如‘329申请和‘041申请中所报道，全部抗hPG抗体，甚至对hPG显示高程度特异性和亲和力的那些并非都可以中和hPG的生物学活性。例如，虽然抗hPG MAb14以约6pM的KD结合hPG，它在体外测定法中不抑制结肠直肠癌细胞的生长，而其他抗hPG单克隆抗体显示明显的抑制活性(见例如，‘329申请的实施例7)。尽管特异性结合hPG的非中和抗体和中和抗体均用于本文所述的多种诊断方法和监测方法，但是用于治疗方法的抗hPG抗体应当显示中和活性。 
如本文所用，“中和性抗hPG抗体”是这样的抗hPG抗体，与用非特异性抗体处理的对照样品相比，其在抗hPG抗体处理的测试样品中导致活BxPC-3细胞数目的统计显著减少。实施例3中描述了用于评估任意特定抗hPG抗体中和hPG的能力的具体测定法。虽然预期在这个测定法中显示较低中和活性水平(例如统计显著地减少活细胞数目40％、30％、20％、15％或甚至10％)的抗hPG抗体提供治疗益处，但是认为在这个测定法中显示使活细胞数目减少至少约50％的那些抗hPG抗体在治疗胰腺癌方面尤其有用。 
因此，在一些实施方案中，例如治疗性实施方案，有用的抗hPG抗体是中和性的。如‘329申请和‘041申请中公开，抗hPG单克隆抗体的能力不是表位依赖的，因为N端和C端抗hPG单克隆抗体均在胰腺癌细胞的测定法中显示中和活性。因而，在一些具体实施方案中，中和性抗hPG抗体是N端中和性抗hPG抗体。在其他实施方案中，中和性抗hPG抗体是C端中和性抗hPG抗体。 
任何特异性抗hPG抗体的亲和力不是关键的。然而，对于一些用途，可以优选显示至少约1μM亲和力的抗体。对于治疗性用途，可能想要至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或甚至更大的亲和力。如下表3中所示，在表1A和表1B中鉴定的抗hPG单克隆抗体的测定的亲和性是10-6至10-12M： 
Figure BDA00002114784100321
具有尤其适合于所希望的具体应用的亲和力的抗PG单克隆抗体可以容易地从这些中选择，或者使用本文所述的多种免疫原、抗hPG抗体的互补决定区(CDR)序列、可变重链VH和可变轻链VL序列来产生或设计。可以用本领域公知或本文所述的技术测定任意具体的抗PG单克隆抗体的亲和力，例如ELISA、等温滴定量热法(ITC)、BIAcore或荧光偏振测定法。在实施例4中提供具体的测定法。 
如表1A和表1B中所示，已经鉴定几种N端和C端单克隆抗hPG抗体。全部这些抗体均对hPG是特异的，并且除MAb14之外，在采用结肠直肠癌细胞的试验中均显示中和活性。用胰腺癌细胞测试的全部抗体(MAb 8、13、16和19)均显示中和活性。用于获得这些抗体的几种杂交瘤根据布达佩斯条约在2010年10月6日保藏于法国国立微生物保藏中心 (CNCM，位于巴斯德研究所25杜博士路75724法国巴黎15)。在表1A和表1B中提供了产生抗hPG MAbs1-23的杂交瘤的命名名称和那些保藏的杂交瘤的保藏注册编号。此外，对于这些抗体的几种，已经确定了它们的可变重链(VH)、可变轻链(VL)、VL互补决定区(CDR)和VHCDR的氨基酸序列。在表1A和表1B中还提供在本公开中自始至终用来指称它们的这些氨基酸序列和缩写命名。简而言之，鼠重链可变区和轻链可变区在本文中称作mVH和mVL，后接相应单克隆抗体的编号，例如mVH.3和mVL.3分别用于抗hPG MAb3的可变轻链和可变重链。类似地，人重链可变区和轻链可变区在本文中称作hVH和hVL，后接相应单克隆抗体的编号。3个可变重链CDR和3个可变轻链CDR分别称作VHCDR 1、2或3和VLCDR 1、2或3，后接特异性抗hPG单克隆抗体的编号。例如，MAb3的VHCDR 1表示为VHCDR 1.3，并且MAb3的VLCDR 1表示为VLCDR 1.3。MAb3的VHCDR 2表示为VHCDR 2.3，并且MAb3的VLCDR 2表示为VLCDR 2.3。 
预期结合大致相同表位的抗hPG单克隆抗体的相应CDR和/或VH和VL链可以互换以产生用于本文所述的方法和试剂盒中的新抗hPG单克隆抗体。例如，如上文指出，示例性抗hPG单克隆抗体MAb5和MAb6结合相同的表位。可以设计在其VL链中包含这两种抗体的VL CDR的多种组合和/或在其VH链中包含这两种抗体的VH CDR的多种组合的抗hPG单克隆抗体。作为说明多种可能的组合的具体非限制性实例，这种抗体可以在其VL链中包含MAb5的CDR 1和2(分别为VL CDR1.5和VLCDR2.5)及MAb 6的CDR 3(VLCDR3.6)，在其VH链中包含MAb 6的CDR 1(VHCDR1.6)及MAb 5的CDR 2和3(分别为VHCDR2.5和VHCDR 3.5)。可以使用常规手段获得由已经保藏的杂交瘤产生的抗体的CDR的氨基酸序列(也称作高变区)。 
如本领域已知，取决于背景和本领域已知的多种定义，描述抗体高变区的氨基酸位置/边界可以不同。可变结构域内的一些位置可以视为杂合高变位置，因为可以在一组标准下认为这些位置在高变区内，而在不同的一组标准下认为这些位置在高变区外。这些位置中的一个或多个也可以见于 延长的高变区中。本文所述的抗PG抗体可以在这些杂合高变位置中含有修饰的。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR区，该FR区主要采用β-折叠构象，通过三个CDR连接，这些CDR形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。每条链中的CDR通过FR区以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序近距离保持在一起，并与来自另一条链的CDR一起促成抗体靶结合部位的形成(见Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，Md.)。如本文所用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号体系进行，除非另外说明。 
参照表1A，用于本文所述的方法和试剂盒中的N端抗hPG抗体的具体实施方案包括但不限于以下抗体： 
(a)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VLCDR相对应的VLCDR和在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VHCDR相对应的VHCDR； 
(b)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VLCDR和VHCDR相对应的VLCDR和VHCDR； 
(c)抗体，其中： 
(i)VLCDR 1选自QSIVHSNGNTY(“VL CDR 1.3”；SEQ ID NO：4)、QSLVHSSGVTY(“VL CDR 1.4”；SEQ ID NO：10)、QSLLDSDGKTY(“VL CDR 1.16”；SEQ ID NO：50)和SQHRTYT(“VLCDR 1.19”；SEQ ID NO：51)； 
(ii)VLCDR 2选自KVS(“VL CDR 2.3”或“VL CDR 2.4”；SEQ ID NO：5)、LVS(“VL CDR 2.16”；SEQ ID NO：53)和VKKDGSH(“VLCDR 2.19”；SEQ ID NO：54)； 
(iii)VLCDR 3选自FQGSHVPFT(“VL CDR\3.3”；SEQ ID NO：6)、SQSTHVPPT(“VL CDR 3.4”；SEQ ID NO：11)、WQGTHSPYT(“VL CDR 3.16”；SEQ ID NO：57)和GVGDAIKGQSVFV(“VL CDR 3.19”；SEQ ID NO：58)； 
(iv)VHCDR 1选自GYIFTSYW(“VH CDR 1.3”；SEQ ID NO：1)、GYTFSSSW(“VH CDR 1.4”；SEQ  ID  NO：7)、GYTFTSYY(“VHCDR 1.16”；SEQ ID NO：39)和GYSITSDYA(“VH CDR 1.19”；SEQ ID NO：40)； 
(v)VHCDR 2选自FYPGNSDS(“VH CDR 2.3”；SEQ ID NO：2)、FLPGSGST(“VH  CDR 2.4”；SEQ  ID  NO：8)、INPSNGGT(“VHCDR 2.16”；SEQ ID NO：43)和ISFSGYT(“VH CDR 2.19”；SEQ ID NO：44)；和 
(vi)VHCDR 3选自TRRDSPQY(“VH CDR 3.3”；SEQ ID NO：3)、ATDGNYDWFAY(“VH CDR 3.4”；SEQ ID NO：9)、TRGGYYPFDY(“VH CDR 3.16”；SEQ ID NO：47)和AREVNYGDSYHFDY(“VH CDR 3.19”；SEQ ID NO：48)； 
(d)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VL相对应的VL和在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VH相对应的VH；和 
(e)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VL和VH相对应的VL和VH。 
参照表1B，用于本文所述的方法和试剂盒中的C端抗hPG抗体的具体实施方案包括但不限于以下抗体： 
(f)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VLCDR相对应的VLCDR和在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VHCDR相对应的VHCDR； 
(g)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VLCDR和VHCDR相对应的VLCDR和VHCDR； 
(h)抗体，其中： 
(i)VLCDR 1选自KSLRHTKGITF(“VL CDR 1.8”；SEQ ID NO：49)和QSLLDSDGKTY(“VL CDR 1.13”；SEQ ID NO：50)； 
(ii)VLCDR 2选自QMS(“VL CDR 2.8”；SEQ ID NO：52)和LVS(“VLCDR 2.13”；SEQ ID NO：53)； 
(iii)VLCDR 3选自AQNLELPLT(“VL CDR 3.8”；SEQ ID NO：55)和WQGTHFPQT(“VL CDR 3.13”；SEQ ID NO：56)； 
(iv)VHCDR 1选自GFTFTTYA(“VH CDR 1.8”；SEQ ID NO：37)和GFIFSSYG(“VH CDR 1.13”；SEQ ID NO：38)； 
(v)VHCDR 2选自ISSGGTYT(“VH CDR 2.8”；SEQ ID NO：41)和INTFGDRT(“VH CDR 2.13”；SEQ ID NO：42)；和 
(vi)VHCDR 3选自ATQGNYSLDF(“VH CDR 3.8”；SEQ ID NO：45)和ARGTGTY(“VH CDR 3.13”；SEQ ID NO：46)； 
(i)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VL相对应的VL和在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VH相对应的VH； 
(j)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VL和VH相对应的VL和VH。 
如技术人员将理解，用于诊断方法中的抗hPG抗体可以是任何来源的，包括例如哺乳动物(例如，人、灵长类、啮齿类、山羊或兔)、非哺乳动物或是在性质上嵌合的(源自多于一个起源物种)。适于在动物(包括人)中治疗性使用的抗体是优选地源自意在进行治疗的相同物种，或已经经修 饰或设计以在正在治疗的动物中无免疫原性或具有减少的免疫原性。下文更详细地讨论，在人类中治疗性使用的抗hPG抗体的具体类型是人源化抗体类型。用于本文所述的方法和试剂盒中的抗hPG抗体还可以属于或衍生自任何同种型，包括例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。设计用于治疗性使用的抗hPG抗体优选地是IgG同种型的。 
在一些实施方案中，用于本文所述的治疗方法的抗hPG抗体是人源化的。一般而言，人源化抗体包含至少一个(并且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，全部或基本上全部构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些，且可以称为“CDR移植的”。人源化抗体还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白共有序列的恒定区。用于人源化抗体的方法(包括用于设计人源化抗体的方法)是本领域熟知的。见例如Lefranc等，2003，Dev.Comp.Immunol.27：55-77；Lefranc等，2009，Nucl.Acids Res.37：D1006-1012；Lefranc，2008，Mol.Biotechnol.40：101-111；Riechmann等，1988，Nature 332：323-7；Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370；EP239400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan，1991，Mol.Immunol.，28：489-498；Studnicka等，1994，Prot.Eng.7：805-814；Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973；和美国专利号5,565,332；所述文献在此以通过引用方式完整并入。 
可以使用这些熟知的方法获得具有与非人抗hPG抗体的CDR相对应的CDR序列的抗体的人源化形式，例如包括并且不限于表1A中提供的多种N端抗hPG单克隆抗体和表1B中提供的多种C端抗hPG单克隆抗体。在表1A和表1B中提供了选择的抗hPG抗体的人源化VL和VH链的突出序列。人源化抗体的具体实例包括了包含以下区域的抗体： 
本文中公开的任何3个VLCDR和任何3个VHCDR； 
(k)包含与SEQ ID NO：21相对应的氨基酸序列的重链可变区和包含 与SEQ ID NO：22相对应的氨基酸序列的轻链可变区； 
(l)包含与SEQ ID NO：23相对应的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO：24相对应的氨基酸序列的轻链可变区； 
(m)包含选自SEQ ID NO：75、77和79的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：76和78的氨基酸序列的轻链可变区； 
(n)包含选自SEQ ID NO：80和82的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：81和83的氨基酸序列的轻链可变区； 
(o)包含选自SEQ ID NO：84、86和88的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：85、87和89的氨基酸序列的轻链可变区；和 
(p)包含选自SEQ ID NO：90、92和94的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：91、93和95的氨基酸序列的轻链可变区。 
(q)如技术人员将认识到，可以使用本文所述的多种抗原和免疫原并且评估它们与目的参考抗体竞争结合hPG的能力，轻易地获得具有特异性结合特性(如结合特定目的表位的能力)的抗hPG抗体。本文所述的任何抗hPG抗体可以用作这种竞争测定法中的参考抗体。实施例5中提供了用于评估抗体与生物素酰化的目的参考抗hPG抗体竞争结合hPG的能力。 
在参考抗hPG抗体和任意测试抗体(不考虑物种或同种型)之间实施抗体竞争研究时，可以首先用可检测标记物(如放射性同位素或荧光团)直接标记或用例如生物素(与荧光标记的链霉亲和素结合是可检测的)或酶(通过酶促反应是可检测的)间接标记参考抗体，以能够进行后续鉴定。在这种情况下，将标记的抗hPG参考抗体(以固定浓度或增加的浓度)与已知量的hPG孵育，形成hPG：标记的抗hPG抗体复合物。随后将未标记测试抗体添加至这种复合物。测量复合的标记物的强度。如果测试抗体通过结合重叠表位与标记的参考抗hPG抗体竞争hPG，则相对于测试抗体不存在时所实施的对照实验，复合的标记物的强度将降低。 
用于实施结合竞争测定法的许多方法是已知的并且可以进行修改，以产生与上文和实施例5中所述的测定法可比的结果。 
如果一种抗体在竞争性结合测定法中并且尤其在实施例5的竞争性结 合测定法中以0.01-100μg/ml范围内的测试抗体浓度(例如，0.01μg/ml、0.08μg/ml、0.4μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml或所述范围内的其他浓度)减少参考抗hPG抗体与hPG的结合至少50％，不过更高水平的减少(例如，60％、70％、80％、90％或甚至100％)可以是合乎需要的，则认为该抗体与参考抗hPG抗体竞争结合hPG并且因而认为它大体上结合与参考抗hPG抗体相同或重叠的hPG表位。 
技术人员会理解是在一些环境下，例如，诊断和监测环境下，将抗PG抗体标记可以是合乎需要的。此类标记物用于检测和定量。合适的标记物是本领域熟知的，并且可以是“直接”的，在于它们是直接可观察的或可检测的(例如，荧光团或放射性同位素)或“间接的”，在于它们与产生可观察或可检测信号的其他物质(例如，作用于底物以产生可检测信号的酶或结合标记链霉亲和素分子的结合性分子如生物素)相互作用。众多标记***以及采用它们标记抗体的手段是本领域熟知的并且构思用于本文中。 
虽然用于本文所述方法中的多种抗hPG抗体已经用全长抗体例举，但是技术人员会理解，也可以使用从全长抗体或结合片段设计或衍生的结合片段或替代抗体。合适的片段、替代物等包括但不限于Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、vIgG、scFv片段和替代抗体(surrobody)。除非另外指明，否则本文所用的“抗体”意在包括抗体和“抗体样”替代的全部形式，包括单链抗体、替代抗体和结合片段。具有天然存在抗体的一般结构的抗体在本文中称作“天然抗体”。 
7.10产生抗PG抗体的方法 
用于本文所述方法中的抗PG抗体可以使用标准的熟知方法获得。为了表达用于本文所述方法中的抗PG抗体，将编码部分或全长轻链和重链的DNA***表达载体中，从而基因与转录和翻译控制序列有效连接。在这种情形下，术语“有效连接”指将抗体基因连接入载体，从而载体内的转录和翻译控制序列执行它们调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因***分别的载体，或者通常将两个基因***同一表达 载体。 
通过标准方法将抗体基因***表达载体(例如，抗体基因片段和载体上互补限制性位点的连接，或如果不存在限制性位点，则平末端连接)。在***抗PG抗体相关轻链或重链序列之前，表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，将抗PG抗体VH和VL序列转化成全长抗体基因的一种途径是分别将它们***已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段有效连接，VL区段与载体内的CL区段有效连接。额外地或备选地，重组表达载体可以编码便于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体，使得信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。 
除抗体链基因外，本公开的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，San Diego，CA，1990)中描述。本领域技术人员将理解，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质表达水平等的因素。适合用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述，见例如Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等的美国专利号4,510,245和Schaffner等的美国专利号4,968,615。 
除抗体链基因和调节序列外，重组表达载体还可以携带其他序列，如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择已将载体引入其中的宿主细胞(见例如美国专利号 4,399,216、4,634,665和5,179,017，全都属于Axel等)。例如，选择标记基因一般对其中已经导入载体的宿主细胞赋予针对药物(如G418、嘌呤霉素、杀稻瘟素、潮霉素或甲氨蝶呤)的耐药性。适宜的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于DHFR-宿主细胞中进行氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一个或多个表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的多种形式旨在涵盖通常用来将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔法、脂转染法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染法等。 
可能在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体。在某些实施方案中，在最佳分泌正确折叠且具有免疫学活性的抗体的真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中进行抗体的表达。用于表达本公开的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中所述的DHFR-CHO细胞，其与例如Kaufman和Sharp，1982，Mol.Biol.159：601-621中所述的DHFR选择标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。在将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或允许抗体分泌进入培养宿主细胞的培养基中的一段时间。可以用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。还可以用宿主细胞来产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。应理解，以上方法的变型也处于本公开的范围内。例如，可以希望用编码本文所述的抗PG抗体的轻链或重链(但不是二者同时)的DNA转染宿主细胞。 
还可以用重组DNA技术来去除编码重链和轻链之一或二者的DNA的并非结合PG所必需的一些或全部序列。从这类截短DNA分子表达的分子也用于本文所述的方法中。 
为了重组表达抗PG抗体，可以用两个表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。一般，这两 个载体各自含有独立的选择标记。备选地，可以使用编码重链和轻链多肽二者的单一载体。 
还可以通过化学合成(例如通过Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.中所述的方法)产生抗PG抗体。还可以使用无细胞平台产生变体抗体(见例如Chu等，2001，Biochemia No.2(Roche Molecular Biologicals))。 
一旦通过重组表达或合成手段产生了的抗PG抗体，则可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法来纯化它，例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析(尤其借助蛋白A或蛋白G选择后对PG的亲和力)和筛分柱层析(sizing column chromatography))、离心、差别溶解度，或通过用于纯化蛋白质的任意其他标准技术。此外，还可以将抗PG抗体或其结合片段与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合以促进纯化。 
8.实施例 
8.1实施例1：血浆或血清PG水平的定量 
使用以下测定法，可以便利地测定PG的血浆和/或血清水平。96孔微量滴定板用0.5和10μg/mL之间的C端抗hPG抗体(例如，兔C端抗hPG多克隆抗体，或本文描述的C端抗hPG单克隆抗体)包被并且孵育过夜。然后将平板在PBS-Tween(0.05％)中洗涤3次，并且用PBS-Tween(0.05％)中的2％(w/v)脱脂乳封闭。分别在适宜的稀释液(例如PBS-Tween 0.05％)中制备测试样品、对照样品(空白或PG阴性血浆或血清样品)和约5pM(0.5×10-11M)和约0.1nM(1×10-10M)之间的hPG参考标准品(稀释于PG阴性血浆或血清中的冻干hPG)。样品在包被的平板上37℃孵育2至4小时，或者备选地，在21℃孵育12至16小时。在孵育后，将平板用PBS-Tween(0.05％)洗涤3次，并且用0.001和0.1μg/mL之间的与辣根过氧化物酶(HRP)(见，Nakane等，1974，J.Histochem.Cytochem.22(12)：1084-1091)偶联的N端抗hPG抗体(例如， 如本文所述的多克隆N端抗hPG抗体或N端单克隆抗hPG抗体)在21℃孵育30分钟。平板随后在PBS-Tween(0.05％)中洗涤3次，并在21℃添加HRP底物15分钟。通过添加100μL 0.5M硫酸来终止反应，并在405nm获取光密度测量结果。通过与从源自hPG参考标准品的测量结果中构建的标准曲线比较来确定测试样品hPG水平。 
8.2实施例2：用于评估抗HPG抗体的特异性的ELISA测定法 
使用如下ELISA测定法，可以便利地测定抗hPG抗体的特异性。96孔平板用磷酸缓冲盐水(PBS)中的适宜浓度的测试肽(例如25和50ng重组人PG，及50和250ng CTFP或胃泌素衍生的其他基因产物)在4℃过夜孵育，此后，各孔用洗涤溶液(PBS和0.1％吐温20)洗涤3次，并且随后每孔用100μL封闭溶液(PBS、0.1％吐温20、0.1％牛血清白蛋白或酪蛋白水解物)在22℃孵育2小时。封闭后，将孔洗涤三次，并且添加待测定的抗体(测试抗体)。将PBS和0.1％吐温20中的100μL测试抗体(0.3至1ng/mL)添加至每个孔。平板随后在22℃孵育2小时，此后，将测试抗体溶液弃去并且在洗涤步骤(3×100μL洗涤溶液，如上文指出)后替换为含有第二抗体(与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Fc)抗体)的封闭溶液。在与第二抗体孵育1小时后，将100μL底物溶液(例如Fast OPD或二盐酸邻苯二胺，从Sigma-Aldrich Co.可获得，根据制造商的说明配制)添加入每个孔并且在22℃暗处孵育20分钟。反应通过添加50μL 4N硫酸终止，并通过在492nm测量光密度(O.D.)来确定所催化的底物量。底物转化与结合抗原的第一(测试)抗体的量成比例。实验一式两份进行，并且将OD测量结果作为抗原浓度的函数作图。如果对hPG的测量O.D.在0.2和1.5之间，且用CTFP或任意其他胃泌素基因衍生肽不存在高于背景的统计上显著的信号，则将测试抗体评分为对PG特异，其中背景是来自仅包含PBS的对照孔的平均信号。 
8.3实施例3：用于评估抗hPG抗体的中和活性的测定法 
用于评估特异性抗hPG抗体是否具有中和性的具体测试可以如下进行。将BxPC-3胰腺癌细胞以约150,000个细胞/孔接种在6孔板的6个孔 中。然后用测试抗hPG抗体或对照抗体以12小时的间隔处理细胞48小时，抗体浓度为约5μg/ml。使用双尾曼-惠特尼检验(p＜0.05时认为差异显著)，与用对照非特异性抗体处理的细胞的数目相比，如果用测试抗体处理的细胞的数目显示存活细胞数目统计上显著地减少至少10％，则将测试抗体定义为在此测定法中是中和性的。针对处理期开始时(称为T0)的细胞数目校正总细胞数。 
8.4实施例4：用于评估抗hPG抗体的亲和力的测定法 
可以根据Nahshol等，2008，Analytical Biochemistry 383：52-60(在此通过引用的方式完整并入)，使用Proteon Technique(BioRad)测量抗hPG抗体的亲和常数。简言之，对于鼠抗PG抗体，首先将抗小鼠IgG抗体(50μg/ml)包被在传感芯片上，确保注射抗体后通过芯片检测的信号落在10,000和11,500响应单位(RU)之间。随后(以常见浓度30μg/ml)注射鼠抗hPG目的抗体(测试抗体)。如果测试抗体充分地结合，则将观察到至少500RU的额外信号。然后通过注射不同浓度的hPG(例如200nM、100nM、50nM、25nM和12.5nM)并检测结合水平，获得测试抗体和hPG之间结合的时程。通常，几个通道可用于在单个实验中平行测试多个抗体，这使得可能以不同的hPG浓度平行测定单一测试抗体的结合。一个通道应当用非对hPG特异的鼠单克隆抗体注射作为非特异性结合的对照，另一个通道应当仅用稀释缓冲液注射作为背景信号的基线。通常，在注射非特异性鼠抗体的通道中检测不到结合。可以针对更低的hPG浓度(50nM、25nM、12.5nM、6.25和3.125nM)测试在此情形(其可以导致hPG饱和捕获的单克隆抗体)中显示高水平结合的抗体，以允许获得更精细的测量结果。 
将亲和常数(KD)计算为解离常数(kd)和结合常数(ka)之间的比值。可以通过分析基于结合测量结果的实验曲线和理论廓线间统计上相关的相似性来验证实验值。 
非鼠抗hPG抗体的亲和常数可以按相似方式，使用对于抗hPG测试抗体的起源物种特异的IgG进行评估。 
8.5实施例5：用于评估与参考抗hPG抗体竞争性结合的测定法 
可以如下进行用于评估目的抗体(测试抗体)是否与生物素酰化的参考抗hPG抗体竞争结合hPG的具体测定法。96孔板用捕获抗hPG抗体(识别hPG的N端或C端区域的多克隆或单克隆抗体，该区域不同于生物素酰化的参考抗hPG抗体识别的表位)以1-10μg/ml范围内选择的浓度在4℃包被过夜(0.1-1μg/孔)。用封闭缓冲液(PBS中的0.1％吐温20，0.1％BSA)在22℃封闭2小时后，将重组hPG按10pM至1nM(10至1000pg/孔)的浓度添加并在22℃孵育2小时。然后，将生物素酰化的参考抗hPG抗体(或含有生物素酰化的参考抗hPG抗体的混合物)连同渐增浓度的未标记测试抗体一起添加，并在22℃孵育1小时。在洗涤以除去未结合的抗体后，通过将混合物与50ng/mL链霉亲和素-HRP在22℃孵育1小时，然后与辣根过氧化物酶的生荧光底物在22℃孵育1小时，并且随后在发光计中定量相对发光单位(RLU)来进行结合的标记参考抗hPG抗体的检测。测定法一式两份进行。 
与参考抗hPG抗体竞争的抗体抑制参考抗体与hPG的结合。如观察到的RLU减少所证明，与参考抗体结合基本上相同的表位的抗体或与重叠表位结合的抗体显著减少(例如，至少50％)所结合的参考抗hPG抗体的量。 
高对照值从通过将标记的参考抗体与重组hPG在无测试抗体情况下孵育的对照实验中获得。低对照值从这样的对照实验中获得，所述对照试验通过将标记的参考抗体与重组hPG在过量浓度的未标记的参考抗体存在下孵育(未标记的参考抗体因而与标记的抗体竞争与hPG结合)。随后通过将标记的参考抗体与重组hPG在渐增浓度的未标记的测试抗体存在下孵育，确定测试抗体与参考抗hPG抗体竞争的能力。 
在测试测定法中，所观察的RLU在测试抗体存在下显著降低表示测试抗体识别表示测试抗体识别与参考抗hPG抗体基本上相同的表位。 
结合作用的抑制可以表示为根据以下公式计算的抑制常数或Ki： 
Ki＝IC50/[1+(参考抗hPG Ab浓度/KD 参考抗hPG Ab)] 
其中“IC50”是产生参考抗体的结合作用减少50％的测试抗体的浓度，KD 参考抗hPG Ab是参考抗hPG Ab的解离常数(其对hPG的亲和力的量度)。与参考抗hPG抗体竞争的有用测试抗体(例如，本文所述的抗hPG抗体之一)一般在本文所述的测定条件下具有范围从10pM至100nM的Ki。 
8.6实施例6：诊断患有原发性和转移性胰腺癌的患者中的血浆或血清胃泌素原浓度。 
这个实施例表明诊断患有原发性或转移性胰腺癌的患者具有升高的血浆或血清胃泌素原水平。 
8.6.1方法 
测量健康个体中的血浆或血清胃泌素原浓度作为对照，并且测量诊断患有胰腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌或乳腺癌的患者中的血浆或血清胃泌素原浓度。健康对照样品(n＝104)从血库获得。参与本分析的患者当中，25/32的胰腺癌患者具有转移性疾病，其中十位的原发性肿瘤切除。 
使用与下文预先描述的一种技术相似的胃泌素原特异的夹心ELISA技术，进行血浆或血清胃泌素原水平定量。 
Nunc MaxiSORP 96孔板的孔用胃泌素原特异的第一抗体包被如下。在MilliQ水中的50mM，pH 9.6碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的溶液内稀释对胃泌素原羧基端区域特异的抗胃泌素原多克隆抗体至浓度3μg/ml。随后将总计100μl抗体溶液添加至96孔板的每个孔并且在4℃孵育过夜。在结合后，从各孔中移去抗体溶液，各孔随后用100μl洗涤缓冲液(1X PBS/0.1％吐温20)洗涤3次。随后将总计100μl封闭缓冲液(1X PBS/0.1％吐温20/0.1％BSA)添加至每个孔并且在22℃孵育2小时。随后移去封闭缓冲液，并且各孔用洗涤缓冲液洗涤3次。随后将分离自患者的血浆或血清样品以100μl体积以稀释系列(一般1∶1、1∶2、1∶5和1∶10稀释度)添加至各孔并且随后在22℃孵育2小时。将血浆或血清样品一式两份分析。 
测定法还包括两条标准曲线。使用至每孔最终量1ng、0.5ng、0.25ng、0.1ng、0.05ng、0.01ng和0ng的重组胃泌素原稀释物制备第一标准曲线。第二标准曲线，充当阴性对照，是从在封闭缓冲液中以与测试样品相同的 度即1∶1、1∶2、1∶5和1∶10稀释的胃泌素原阴性的人血清制备的。备选地，在测定血浆样品时，第二标准曲线，充当阴性对照，是从在封闭缓冲液中以与测试样品相同的度即1∶1、1∶2、1∶5和1∶10稀释的胃泌素原阴性的人血浆制备的。 
与血浆或血清样品的孵育完成后，移去孔内容物并且各孔用洗涤缓冲液洗涤3次，100μl/孔，此后，如下使用对胃泌素原特异的第二抗体检测与第一抗体结合的胃泌素原。 
在封闭缓冲液中稀释对胃泌素原氨基端区域特异的生物素偶联的抗胃泌素原多克隆或单克隆抗体至浓度0.1至10μg/ml，这取决于抗体。随后将总计100μl抗体溶液添加至每个孔并且在22℃孵育1小时。 
在第二抗体结合完成后，平板用洗涤缓冲液洗涤3次，100μl/孔，此后，将100μl的链霉亲和素-HRP溶液(封闭缓冲液中的25ng/mL)添加至每个孔并且在22℃孵育1小时。与链霉亲和素-HRP溶液的孵育完成后，平板用洗涤缓冲液洗涤3次，100μl/孔。此后，每孔添加使用PierceSuperSignal ELISA Femto最大灵敏度化学发光底物试剂盒制备的100μl化学发光底物，在室温暗处孵育5分钟，并且在发光计上随后读数。 
基于发光计读数，使用线性回归分析来推导与标准曲线数据相对应的线的等式。使用这个等式，随后计算多种患者样品中胃泌素原的浓度。 
8.6.2结果 
图4中的箱图显示与健康对照相比，所测定的癌症患者血浆或血清胃泌素原浓度第25百分位数、中位数和第75百分位数。须状图标表示血浆或血清胃泌素原浓度的第5和第95百分位数。这份数据表明，与健康个体相比，包含原发性和转移性胰腺癌的患者的群体在其血浆或血清中具有升高水平的胃泌素原。 
8.7实施例7：原发性和转移性胰腺癌细胞系中胃泌素基因的表达 
本实施例显示GAST基因在原发性和转移性胰腺癌细胞系中表达。 
8.7.1方法 
测试的细胞来自原发性胰腺癌细胞系BxPC-3和MIA PaCa-2和转移 性胰腺癌细胞系Capan 1和SU.86.86。在生长一段时间后，将细胞重悬并裂解，并且使用QIAGEN Rneasy Mini-试剂盒根据制造商的操作方案，提取总mRNA。使用Superscript II RT(Invitrogen)在寡(dT)15引物(Roche Applied Science)存在下逆转录RNA。使用Quantifast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)和Eppendorf Mastercycler ep realplex(Eppendorf)进行实时PCR。用于GAST和GAPDH基因扩增的引物从Sigma Life Science获得。每个PCR扩增在三重复孔中使用以下条件进行：95℃5分钟，随后总计45个双温度循环(95℃10秒和60℃30秒)。 
8.7.2结果 
在图5和图6中报道不同细胞系中表达的胃泌素mRNA的相对水平。水平相对于在充当阳性对照的LS174T结肠直肠癌细胞系中表达的GASTmRNA的量进行归一化，并且数据相对于LS174T CRC细胞系中的表达水平来表述。测试的全部胰腺癌细胞系均表达编码胃泌素原基因(GAST)的mRNA。 
8.8实施例8：胃泌素原由胰腺癌细胞系分泌 
本实施例表明胰腺癌细胞系分泌胃泌素原。 
8.8.1方法 
在从胰细胞获得的条件培养基中，使用夹心ELISA技术定量胃泌素原的分泌，所述胰细胞在2D培养下使用以下操作方案培育。细胞在75cm2瓶中培育直至它们达到60％汇合度。随后移去培养基并且用PBS漂洗细胞1次。细胞随后在20ml的M11培养基(无酚红)中培育48小时。随后将培养基收集、以1,000g离心5分钟以除去细胞碎片，并且在-80℃冷冻。细胞随后用胰蛋白酶消化并计数。 
为了测量分泌的胃泌素原，将冷冻的培养基缓慢在冰上融化并且随后使用蛋白质浓缩器(Icon Pierce)通过以2,500g离心45分钟而浓缩40倍至500μl体积。随后使用夹心ELISA技术测量胃泌素原浓度。 
8.8.2结果 
在图6中报道胃泌素原在由胰腺癌细胞系条件化的培养基中的浓度。 数据表示为每生长48小时每百万个细胞的胃泌素原浓度，单位pM。 
8.9实施例9：抗hPG单克隆抗体对培养的Capan 1转移性胰腺癌细胞生长的影响。 
本实施例表明抗hPG抗体抑制转移性胰腺肿瘤细胞的增殖。 
8.9.1方法 
将Capan 1细胞接种至6孔板(50,000个细胞/孔)并且在含有20％胎牛血清的DMEM中培育8小时。对细胞进行过夜血清饥饿，并且在接种后24小时(时间T0)开始，将细胞如所述在0.5％PanexinH存在下每12小时用1μg/ml单克隆对照抗体(小鼠抗人IgG1，Calbiochem，Ref#411451)或用1μg/ml抗hPG MAb3处理，持续48小时。技术人员不知晓有关处理溶液的内容。 
8.9.2结果 
图7中所示的结果计算为在实验结束时每孔平均细胞数减去实验开始时接种的细胞数。这个实验的结果表明与对照抗体相比，抗hPG MAb3在体外有效减少Capan 1转移性胰腺癌细胞的生长。 
8.10实施例10：抗hPG单克隆抗体2D处理对BxPC-3细胞生长的抑制性作用 
本实施例显示抗hPG单克隆抗体对培养的BxPC-3原发性胰腺癌细胞生长的抑制性作用。 
8.10.1.方法 
对于每个实验，将150,000个BxPC-3细胞接种至6孔板中并且在含有10％胎牛血清的培养基中培育8小时。对细胞进行过夜血清饥饿，并且在接种后24小时(时间T0)开始，将细胞如所述在0.5％PanexinH存在下每12小时用1μg/ml对照单克隆抗体(P3X63Ag8，ATCC，Ref TIB-9)或用1μg/ml抗hPG MAb8处理，持续48小时。 
在48小时计数对照Mab处理的和抗hPG Mab处理的细胞中活细胞的数目。在48小时处测量的测试细胞计数和对照细胞计数减去开始处理(T0)时的细胞计数。 
8.10.2.结果 
在图8中显示结果。在下表4中提供对照和测试样品的实际细胞数和测试样品相对于对照而言的细胞数： 
Figure BDA00002114784100501
8.11实施例11：抗hPG单克隆抗体2D处理对MIA PaCa-2细胞生长的抑制性作用 
8.11.1本实施例显示抗hPG单克隆抗体对培养的MIA PaCa-2原发性胰腺癌细胞生长的抑制性作用。 
方法 
对于每个实验，将100,000个MIA PaCa-2细胞接种至6孔板中并且在含有10％胎牛血清+2.5％马血清的培养基中培育8小时。对细胞进行过夜血清饥饿，并且在接种后24小时(时间T0)开始，将细胞如所述在0.5％PanexinH存在下每12小时用10μg/ml对照单克隆抗体(P3X63Ag8，ATCC，RefTIB-9)或用10μg/ml抗hPG MAb8处理，持续72小时。在72小时处计数对照MAb处理的和抗hPG MAb处理的细胞中活细胞的数目。在72小时处测量的测试细胞计数和对照细胞计数减去开始处理(T0)时的细胞计数。 
8.11.2结果 
在图9中提供本实验的结果。在下表5中提供对照和测试样品的实际细胞数和测试样品相对于对照而言的细胞数： 
Figure BDA00002114784100502
8.12实施例12：抗胃泌素原单克隆抗体2D预处理对悬浮状态下胰腺癌细胞后续生长为癌球的抑制作用 
本实施例显示用抗胃泌素原单克隆抗体预处理转移性胰腺癌细胞对这些细胞在低黏附培养条件下生长为癌球的后续能力产生的抑制性用。 
8.12.1实验1：方法 
将100,000个Capan 1细胞/孔首先接种至6孔板中具有20％FCS的DMEM内，进行血清饥饿过夜并且在具有0.5％Panexin H的DMEM中在抗胃泌素原单克隆抗体MAb3或对照单克隆抗体(小鼠抗人IgG1；Calbiochem ref#411451)存在下培育48小时。在处理结束时，对于每个处理组，将500个细胞/孔铺种至超低黏附性24孔板的8个孔中的含有bFGF和EGF的500μl无血清M11培养基内，并且培育另外11日而不处理。在这个期间结束时，拍摄照片，计数每孔球状体的数目，并且测量球状体表面。 
8.12.2实验1：结果 
在11日“洗出”期结束时拍摄照片，在此期间，来自所有原始处理条件的Capan 1细胞在相同的M11培养基中培育。此后，不知晓全部孔的身份的操作员计数球状体。 
如图10中所示，Capan 1胰腺癌细胞在低黏附性平板中生长为球体的能力因先前采用针对胃泌素原的单克隆抗体处理48小时而显著降低。 
8.12.3实验2：方法 
将150,000个细胞/孔(转移性胰腺癌细胞系SU.86.86)首先接种至6孔板(常规的贴壁培养器具)中具有10％FCS的RPMI内8小时，进行血清饥饿过夜并且在具有0.5％Panexin H的RPMI中在抗胃泌素原单克隆抗体MAb8、MAb13、MAb16或MAb19不存在或存在下培育48小时。在处理结束时，对于每个处理组，将50个细胞/孔铺种至超低黏附性96孔板的8个孔中的含有bFGF和EGF的100μl无血清M11培养基内，并且培育另外6日而不处理。在这个期间结束时，拍摄照片，计数每孔球状体的数目，并且测量球状体表面。 
8.12.4实验2：结果 
在6日“洗出”期结束时拍摄照片，在此期间，来自所有原始处理条件的SU.86.86细胞在相同的M11培养基中培育。此后，不知晓全部孔的身份的操作员计数球状体。 
如图11中所示，SU.86.86胰腺癌细胞在低黏附性平板中生长为球状体的能力因先前采用针对胃泌素原的单克隆抗体处理48小时而显著降低。 
本申请中引用的所有出版物、专利和专利申请在此为了所有目的以相同的程度以其整体引入作为参考，就如同每一单个出版物、专利、专利申请或其他文件被单独地说明为了所有目的引入作为参考一样。 
虽然已说明和描述了多种具体实施方案，但应理解，可以进行多种改变而不背离本发明的精神和范围。 
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Claims (28)

1.用于治疗受试者中胰腺癌的方法，包括将足以提供治疗益处的量的抗PG抗体施与诊断患有胰腺癌的受试者。
2.权利要求1的方法，其中受试者是人并且抗PG抗体是抗hPG单克隆抗体。
3.权利要求2的方法，其中抗hPG单克隆抗体是人源化抗hPG单克隆抗体。
4.权利要求2的方法，其中抗PG抗体是N端抗hPG单克隆抗体。
5.权利要求4的方法，其中N端抗hPG单克隆抗体结合表位，所述表位包含选自DAPLG(SEQ ID NO：28)、PDAPLG(SEQ ID NO：29)、PRSQQPD(SEQ ID NO：30)、WKPRSQQPD(SEQ ID NO：31)和WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO：32)的序列。
6.权利要求4的方法，其中针对包含具有序列SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO：25)的肽的免疫原产生N端抗hPG单克隆抗体。
7.权利要求4的方法，其中N端抗hPG单克隆抗体包含在序列上与MAb3、MAb4、MAb15、MAb16或MAb19的VHCDR相对应的3个VHCDR和在序列上与MAb3、MAb4、MAb15、MAb16或MAb19的VLCDR相对应的3个VLCDR。
8.权利要求4的方法，其中N端抗hPG单克隆抗体包含在序列上与MAb3、MAb4、MAb15、MAb16或MAb19的CDR相对应的CDR。
9.权利要求4的方法，其中抗hPG单克隆抗体与选自MAb3、MAb4、MAb15、MAb16和MAb19的参考抗体竞争结合hPG。
10.权利要求2的方法，其中抗PG单克隆抗体是C端抗hPG单克隆抗体。
11.权利要求10的方法，其中C端抗hPG单克隆抗体结合表位，所述表位包含选自FGRR(SEQ ID NO：33)、MDFGR(SEQ ID NO：34)、AEDEN(SEQ ID NO：35)和GWMDFGRR(SEQ ID NO：36)的序列。
12.权利要求10的方法，其中针对包含具有序列QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO：27)的肽的免疫原产生C端抗hPG单克隆抗体。
13.权利要求10的方法，其中C端抗hPG单克隆抗体包含在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb11、MAb12或MAb13的CDR相对应的3个VHCDR和在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb11、MAb12或MAb13的CDR相对应的3个VLCDR。
14.权利要求10的方法，其中C端抗hPG单克隆抗体包含在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb11、MAb12或MAb13的CDR相对应的CDR。
15.权利要求10的方法，其中C端抗hPG单克隆抗体与选自MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb11、MAb12和MAb13的参考抗体竞争结合hPG。
16.权利要求2的方法，其中胰腺癌是原发性胰腺癌。
17.权利要求2的方法，其中胰腺癌是转移性胰腺癌。
18.权利要求2的方法，其中抗hPG单克隆抗体辅助手术切除肿瘤而施用。
19.权利要求2的方法，其中抗hPG单克隆抗体辅助化疗法而施用。
20.抑制胰腺肿瘤细胞增殖的方法，其包括使细胞暴露于足以抑制其增殖的抗PG抗体量。
21.权利要求20的方法，其在体外实施。
22.权利要求20的方法，其在体内实施。
23.权利要求20方法，其中抗PG是抗hPG单克隆抗体。
24.权利要求20的方法，其中抗PG抗体是N端抗hPG单克隆抗体。
25.权利要求20的方法，其中抗PG抗体是C端抗hPG单克隆抗体。
26.在显示胰腺癌的至少一个症状的受试者中诊断胰腺癌的方法，其包括确定该受试者是否具有约50pM或高于约50pM的血浆或血清胃泌素原浓度，其中当与胰腺癌的至少一个症状联合时，这种浓度表示该受试者可能患有胰腺癌。
27.监测胰腺癌治疗的有效性的方法，包括确定因胰腺癌而治疗的受试者是否具有低于约10pM的血浆或血清胃泌素原浓度，其中这种浓度表示治疗是有效的。
28.监测胰腺癌治疗的有效性的方法，包括监测因胰腺癌而治疗的受试者的血浆或血清胃泌素原浓度作为时间的函数，其中血浆或血清胃泌素原浓度随时间推移下降表示这种胰腺癌疗法是有效的。
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