CN102925508A

CN102925508A - 一种制备环烯醚萜甙元的方法

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Publication number: CN102925508A
Application number: CN2011102280234A
Authority: CN
Inventors: 朱劲柏; 钱鑫; 郭入安
Original assignee: ZHEJIANG BIERRUISI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG BIERRUISI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2011-08-10
Publication date: 2013-02-13

Abstract

一种制备环烯醚萜甙元的方法，包括在酶水解环烯醚萜甙的同时进行连续液－液萃取，用醚类、卤代烷类有机溶剂将水解产物环烯醚萜甙元予以萃取分离，从而高产率地获得环烯醚萜甙元的一种方法。

Description

一种制备环烯醚萜甙元的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，是从环烯醚萜甙类化合物，高产率地制备其甙元的方法。

背景技术

环烯醚萜类化合物广泛存在于植物界，以茜草科、鹿蹄草科、水晶兰科植物中最为普遍，环烯醚萜类成分在植物中大多以甙（Iridoid glycosides）的形式存在，例如茜草科植物栀子中含有栀子甙（gardenoside，C₁₇H₂₄O₁₁）、京尼平甙（geniposide，C₁₇H₂₄O₁₀）、京尼平-1-β-D-龙胆二糖甙(genipin-gentiobioside)、京尼平甙酸（geniposidic acid，C₁₆H₂₂O₁₀），车叶草（别名：猪殃殃）中的车叶草甙（asperuloside，C₁₈H₂₂O₁₁），鸡屎藤中的鸡屎藤甙（paederoside，C₁₈H₂₂O₁₁S）、车前草中的桃叶珊瑚甙（aucubin, C₁₅H₂₂O₉）等。

环烯醚萜甙（Iridoid glycosides）大多数为白色结晶或粉末，该类甙已经被证明易水解，尤其是在β-D-葡萄糖甙酶存在下，易被水解为相应的甙元环烯醚萜（Iridoid），环烯醚萜甙元易与氨基酸类物质反应生成有色物质，可制备天然蓝色素、红色素和黑色素或棕色素。例如，栀子蓝色素和栀子红色素，就是以环烯醚萜甙中的京尼平甙为原料，在具有水解β－葡萄糖甙酶活性的酶存在的下水解，再与氨基酸类物质反应获得的天然色素。已证明该类色素安全性高，可广泛用于食品、化妆品的着色和配色。

另外，大量研究表明，环烯醚萜甙在酶水解脱去糖基，变成环烯醚萜甙元后，其分子中的半缩醛结构，容易开环成为二醛，是一种性能优异的生物交联剂，与戊二醛相比，具有类似的交联作用，却没有戊二醛的毒性和副作用，其生物相容性更好；因此在生物医药领域有广泛的用途；例如人们研究较多的环烯醚萜甙元京尼平，研究者们已成功将其应用于制造生物材料，作为酶固定用的交联剂（US 4983524）、用其制作生物愈伤材料（US 6545042）、制作食品胶（US 5037664）、微囊药丸的壁材（US 5023024），利用其与氨基酸反应显色的特性，将其作为氨基酸检测的显色剂，京尼平还具有多方面的生理活性：能够抑制血小板凝聚、具备抗肿瘤活性〔参见suzuki，yasuhiro，kondo。Planta medica.2001,67(9),807-810页〕，可防治因amyloid蛋白质引起的神经毒性〔M.Yamazaki et，Biolagical&Pharmaceutical Bulletin，2001，24（12），1454-1455〕。总之，环烯醚萜甙的甙元，在各个方面的应用领域中，已经显示出良好的应用价值。

目前，对于环烯醚萜甙，已经有多种方法对其进行提纯和精制，其中采用大孔树脂吸附法是一种经济且能规模化生产的工艺。然而，环烯醚萜甙元是一种半缩醛，性质较为活泼，制备过程中遇酸、碱、羰基化合物、伯氨基化合物均易于发生聚合和降解、变色，因此对于环烯醚萜甙元的生产精制，目前尚缺乏经济有效的方法。CN 200710090208公开了一种京尼平甙的甙元京尼平的提取方法，首先将京尼平甙进行酶解，再通过大孔树脂吸附法，从酶解液中吸附分离京尼平，再经过洗脱、浓缩、冻干获得京尼平。但该方法存在如下问题：1、产率较低；2、京尼平的产品中仍会含有2-10％的京尼平甙和京尼平的二聚体等杂质。

发明内容

本发明提供一种从环烯醚萜甙高产率制备其相应的环烯醚萜甙元的方法。

本发明基于发明人的如下发现：环烯醚萜甙在水解转化为甙元过程中，生成的半缩醛结构的甙元随即在相同的条件下能跟具有蛋白结构的酶发生反应，使水解液颜色变深转蓝，这种副反应一方面钝化了酶的活力，使环烯醚萜甙的水解难以彻底完成，另一方面方面消耗了水解产物环烯醚萜甙元，使产率降低；环烯醚萜甙元在生成后，在水溶液中还会自身发生聚合，生成二聚体，这些情况均可以通过高效液相色谱检测予以证实。

例如，以现有技术对产自栀子的京尼平甙进行水解，为了在合理的时间内获得尽可能高的转化率，每克京尼平甙需要添加多达2000-3000个活性单位的β-D葡萄糖甙酶，才能获得大于90%的转化率，然而酶添加量越多，与酶结合消耗的水解产物京尼平也越多，最终反应完成时目标产物京尼平的产率显著降低；另一方面，如若减少酶的用量，反应时间将延长，产物京尼平对酶的钝化作用显著，京尼平甙的水解不能进行彻底，转化率也降低。

为了克服现有技术存在的问题，本发明人通过研究发现，利用水解产物甙元与环烯醚萜甙的在有机溶剂中溶解性的差异，选用合适的有机溶剂，在酶解反应的同时，从反应液中及时萃取分离出酶解生成的甙元，减少酶的钝化和产物的聚合，可显著提高目的物环烯醚萜甙元的产率。

因此，本发明涉及一种从环烯醚萜甙水解制备环烯醚萜甙元的优化方法。

所述的环烯醚萜甙包括京尼平甙（geniposide）、京尼平酸甙（geniposidic acid）、京尼平龙胆二糖甙(genipin-gentiobioside)、栀子甙（gardenoside）、鸡屎藤甙（paederoside）、车叶草甙（asperuloside）、番目鳖甙（loganin）、桃叶珊瑚甙（aucubin）。

本发明关键点之一，是通过液-液萃取的方法,在环烯醚萜甙水解的同时,及时地从反应体系中将水解产物环烯醚萜甙元分离出来。为了达到分离的即时性,本发明优选采用连续的液－液萃取法，对反应产物环烯醚萜甙元实施分离，本发明优选连续的液－液萃取法还基于如下事实:环烯醚萜甙元在水中溶解度较大,用常规的萃取方法,需要多次萃取才能将其从水溶液中完全分离出来,因此常规的萃取方法不具备良好的可操作性。所述连续液－液萃取法，包括逆流分溶法、液滴逆流层析法、高速逆流色谱法，所述的连续液－液萃取法，对萃取设备并不作特别要求，只要能顺利实现连续萃取过程的设备，均适用于本发明。例如，适用于工业化规模生产的连续液－液萃取塔，可作为实施本发明的一个优选设备。这种萃取塔可以一个或多个串联，内部结构可以是填充塔或者是孔板塔，还可以是带搅拌的多萃取仓的萃取塔。也可以是其它结构的塔。

有机溶剂的选择是本发明的另外一个关键点，虽然只要是能够选择性地溶解反应体系中生成的环烯醚萜甙元，并与水不相互混溶的有机溶剂均可以使用。但本发明优选与水的相对密度差异较大的有机溶剂，例如醚类、卤代烷类，具体优选***、异丙醚、四氢呋喃、甲基异丙醚，甲基叔丁醚，三氯甲烷、二氯甲烷、二氯乙烷作为萃取用溶剂，这样可以方便地实现连续萃取后两相的快速分离。

催化剂的选择，本发明优选含有β-D-葡萄糖酶的酶类，因为酶类常常是一系列酶的混合物，其名称也多有变化，因此只要是对环烯醚萜甙的糖甙键具有催化水解活性的物质，均可以使用。例如苦杏仁甙酶、戊聚糖酶、果胶酶、纤维素酶中的一种或几种的混合。所述的的酶可以是粉末或液体形态。液体酶作为一个优选，更适合本发明的实施。

根据本发明的方法，将一定浓度的酶与环烯醚萜甙的混合水溶液加入液－液连续萃取塔中，其中环烯醚萜甙在溶液中的比例可以在1%-30％（w/w）之间，优选10%-20％，酶与环烯醚萜甙的比例可以保持在200u/g-3000u/g之间。混合液加入萃取塔后，保持合适的温度和PH值，所述的温度可在20-60℃之间，优选30-50℃，更优选在40-50℃，所述的PH可以在2.0-6.0之间，优选3.0-5.0之间。加入混合液后，可随即或在水解1－4小时后，从塔顶（当有机相密度比水相大时）或塔底（当有机相密度比水相小时）连续加入有机相，对反应液进行连续萃取，加入有机相的时间可以根据反应的速度予以调整，有机相在塔中的流动速度可根据产物环烯醚萜甙元在有机相中的分配系数不同以及两相分离的难易程度进行调整。从塔底或塔顶收集的有机相，通过一个装有无水硫酸钠或其它干燥剂的装置，脱除其中含有的水份，再进入到溶剂回收装置，蒸馏回收有机相溶剂,回收的有机相在经过冷凝器冷凝，再经过水饱和装置后，又返回到萃取剂中，参与连续萃取，真空回收溶剂后的剩余物用***和甲醇的混合溶液或其它溶剂进行重结晶，过滤，真空烘干,最后可得到环烯醚萜甙元晶体。

最终采用该方法，可以从环烯醚萜甙以95%以上的转化率获得其相应的甙元环烯醚萜，作为额外的收获，采用上述的方法，可以使酶的消耗降低到常规方法的30%-40%，水解时间缩短到5-6小时，同时因为副反应的减少，可以获得HPLC纯度超过95%、无色的环烯醚萜晶体。

HPLC测定采用下述条件：

色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18柱，150mm×4.6mm，5μm

流动相：甲醇/水＝3/7（V/V）

流速：1ml/min

检测器：岛津SPD-10AVP紫外可见检测器

测定波长：238nm

下面的实施例,是作为对本发明作进一步的说明，并不构成对本发明的限制。

实施例1

将含量98％的京尼平甙（geniposide）10.0g（0.0252mol），3000u/ml的苦杏仁甙酶1ml，加水适量溶解，用柠檬酸/柠檬酸钠调节ph4.0，定容到100ml，加入到Φ25mm×250mm孔板式玻璃萃取塔中，夹套中通入热水，保温到40℃，上下接上进出液管，1小时后，通过蠕动泵或利用高差将***从底部打入萃取塔，保持流速5ml/min, 塔顶流出的萃取轻相通过一个装有无水硫酸钠的管式干燥过滤器,导入到旋转蒸发器中,旋转浓缩,回收***,回收的***用水饱和后再并入到流动萃取相中,如此循环5小时。蒸发器中的浓缩剩余物用***溶解到100ml。从水相和有机相中分别吸取取1ml，用甲醇/水（3/7,v/v）溶解稀释2000倍，用shimadzu 10Avp HPLC色谱仪测定反应后水相京尼平甙的残余量、有机相中的产物京尼平的产量，用作含量标定的对照品京尼平甙（geniposide）、京尼平（genipin）均采购于sigma-aldrich公司，测定结果列于表1中。

比较例1

将含量98％的京尼平甙（geniposide）10.0g（0.0252mol），3000u/ml的苦杏仁甙酶1ml，加水适量溶解，用柠檬酸/柠檬酸钠调节ph4.0，定容到100ml，加入到200ml三角瓶，密塞，50℃保温，酶水解，分别于12小时后和24小时后分别取样1ml，用甲醇/水（3/7,v/v）稀释2000倍，用shimadzu 10Avp HPLC色谱仪测定反应后水相中的京尼平（genipin）的产量以及京尼平甙的残余量，测定结果列于表1中。

比较例2

除苦杏仁甙酶用量为3ml外，与比较例1相同。对反应液进行跟踪检测，结果列于表1中。

实施例2

取已除去栀子黄色素后的栀子提取液（含京尼平甙0.203mol/L,含京尼平龙胆二糖甙0.0432mol/L）100ml，用柠檬酸/柠檬酸钠调节ph4.0，加入液体果胶酶1ml（3000u/ml）,混合溶液加入到孔板式玻璃萃取塔中，夹套中通入热水，保温到50℃，上下接上进出液管，通过蠕动泵将异丙醚从底部打入萃取塔，保持流速5ml/min, 塔顶流出的萃取轻相通过一个装有无水硫酸钠的管式干燥过滤器,导入到旋转蒸发器中,旋转浓缩,回收异丙醚,回收的异丙醚用水饱和后再并入到流动萃取相中,如此循环5小时。蒸发器中的浓缩剩余物用***溶解到100ml，取1ml，水浴挥干溶剂，用shimadzu 10Avp HPLC色谱仪分别测定反应前后反应混合液中京尼平甙、京尼平龙胆二糖甙的残留量，以及反应完成后萃取液中京尼平（genipin）的含量、纯度，测定结果列于以下表2中。

实施例3

取干燥车叶草3000g，粉碎，用60°酒精15L，在50℃下，渗滤提取，提取液浓缩回收酒精，浓缩液用水稀释到3000ml，加入中药澄清剂KBT-ZTC，澄清去除浑浊物，上清液过滤，过500ml装有非极性大孔吸附树脂的树脂柱吸附，饱和后，用水洗涤2BV，再用40°酒精洗脱，收集洗脱液，浓缩回收酒精，得含车叶草甙（asperuloside）的浓缩液，用柠檬酸－柠檬酸钠调节PH4.0，得215ml浓缩液，HPLC检测，车叶草甙含量为0.185mol/L。取100ml浓缩液，加入3000u/g液体果胶酶1g，混匀，加入到孔板式玻璃连续萃取塔中，夹套中通入热水，保温到50℃，上下接上进出液管，通过蠕动泵将异丙醚从底部打入萃取塔，保持流速5ml/min, 塔顶流出的萃取轻相通过一个装有无水硫酸钠的管式干燥过滤器,导入到旋转蒸发器中,旋转浓缩,回收异丙醚,回收的异丙醚用水饱和后再并入到流动萃取相中,如此循环5小时。蒸发器中的浓缩剩余物用异丙醚溶解到100ml，取1ml，水浴挥干溶剂，稀释1000倍，测定萃取液中车叶草甙元的峰面积，另取水相1ml，流动相稀释1000倍测定车叶草甙残留测，定结果列于以下表3中。

比较例3

取上例中的PH4.0车叶草甙浓缩液100ml，加入3000u/g液体果胶酶1g，水浴50℃保温酶解24小时，取1ml，用液相流动相稀释1000倍，测定反应液中车叶草甙及车叶草甙元的峰面积。测定结果列于以下表3中。

从产物的峰面积看，实施例3的车叶草甙转化率和车叶草甙元收率均较现有方法显著提高。

附图说明

图1是实施例1反应完成后***相的HPLC图；图2是比较例1反应后反应液HPLC图。

附图为实施例1和比较例1（24h）的反应结束后的产物以2000倍稀释后HPLC图谱，其中实施例1中，京尼平的产量（峰高）及纯度与比较例1（24h）的相比均有显著提高。

Claims

1.一种制备环烯醚萜甙元的方法，其特征为，在酶水解环烯醚萜甙的同时，进行连续的液－液萃取，用与水不混溶的有机溶剂将水解产物环烯醚萜甙元即时分离出反应体系，从而高产率获得水解环烯醚萜甙元的方法。

2.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中环烯醚萜甙为京尼平甙、京尼平酸甙、京尼平龙胆二糖甙、栀子甙、鸡屎藤甙、车叶草甙、番目鳖甙、桃叶珊瑚甙。

3.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中环烯醚萜甙为京尼平甙、京尼平龙胆二糖甙。

4.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中环烯醚萜甙为京尼平甙。

5.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，所用的酶为具有水解β-D-糖甙键活性的酶。

6.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中的酶为苦杏仁甙酶、果胶酶、纤维素酶、戊聚糖酶中的一种或几种的混合物。

7.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中所使用的有机溶剂，属于醚、卤代烷中的一种或几种的混合物。

8.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，酶水解在PH 3-5下进行。

9.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中酶水解在30-50℃下进行。

10.根据权利要求7所述的有机溶剂，其中的醚代表***、四氢呋喃、异丙醚、甲基异丙醚、、甲基叔丁醚。

11.根据权利要求7所述的有机溶剂，其中卤代烷代表二氯甲烷、三氯甲烷、1,2－二氯乙烷。

12.根据权利要求1所限定的制备环烯醚萜甙元的方法，其中连续液－液萃取法包括逆流分溶法、液滴逆流层析法、高速逆流色谱法。