CN102925478A - 一种水稻雄性育性可控系的构建方法及育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻雄性育性可控系的构建方法，包括：（a）获得水稻雄性育性基因的不育突变系和相应的功能型雄性育性基因；（b）构建由诱导型启动子控制的功能型雄性育性基因表达盒转化载体；（c）以所述表达盒转化载体转化所述不育突变系，获得水稻雄性育性可控系。本发明创制的雄性育性可控系可利用相应的诱导剂诱导重组育性基因表达，使其可育自交繁殖；不施加诱导剂时表现完全雄性不育，因而可与父本杂交生产杂交种子。此育种方法克服了基于细胞质雄性不育的三系杂交稻和基于光温敏不育系的二系杂交稻育种以及其它基因工程方法创制不育系方法的缺点。

Description

一种水稻雄性育性可控系的构建方法及育种方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种条件诱导控制的水稻雄性育性可控系的基因工程育种及其杂交制种的方法。

技术背景

作物不同品种间的异花受粉产生的杂种可能在生长势、适应性、产量等方面具有优势。利用这些杂种优势可以提高农作物的产量、质量和抗性。水稻是一种雌雄同株的自花授粉植物，要生产杂交水稻种子，必须选育一个雄性不育的品系，让雌蕊接受来自异株的花粉。中国育种家利用普通野生稻(Oryza rufipogon)的天然雄性不育株（称为“野败”）为不育细胞质的供体，通过与栽培籼稻（O. sativa ssp. indica）杂交和回交育出三系杂交稻生产上所需的不育系、保持系和恢复系。利用不育系和恢复系做亲本杂交可省去除雄的操作，便于生产高纯度的杂交种子，因此有重要的生产应用价值（袁隆平. 1977. 中国农业科学. 1:27-31，Lin, and Yuan 1980. In: IRRI (eds) Innovative approaches to rice breeding. IRRI, Manila, p35–51）。在中国，已用野败不育细胞质培育了大量的三系杂交稻品种并大规模应用，产生了巨大的经济和社会效益（Cheng等, 2007， Ann. Bot., 100, 959-966)。

多种农作物如水稻、小麦、玉米、油菜等关于雄性不育性及其育性恢复性的研究已有许多报道，在生产上已大规模用于杂交种生产。不育系可分为细胞质不育基因控制的细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，简称为CMS）和核不育基因控制的核不育（genic male sterility，简称为GMS）。从近年发展的基因学来说：细胞质雄性不育系的细胞质通常为携带不育基因的线粒体基因组，其不育基因的表达导致花粉不育；恢复系的核基因组中携带细胞质雄性不育恢复基因（restorer of fertility），简称为恢复基因或Rf基因，其花粉正常可育，可自交结实；保持系具有正常的可育细胞质，但其核基因组不携带有恢复功能的基因，花粉正常可育，可自交结实。生产上配套应用的“三系”中，保持系和不育系具有相同的核基因组，其差别是细胞质基因组不同。由于不同类型的植物细胞质雄性不育是由不育细胞质的线粒体基因组中的特异不育基因产生，其育性的恢复需要特异的恢复基因的作用（Schnable and Wise，1998，Trends Plant Sci. 3：175-180）。水稻细胞质雄性不育有多种类型，主要是：(1)野败型（wild abortive，简称WA型），属于孢子体不育；（2）包台（BT）型，属于配子体不育；（3）红莲（HL）型，属于配子体不育（朱英国，2000，水稻雄性不育的生物学，武汉大学出版社）。其中野败型不育系在“三系”杂交稻的应用最广泛。三系杂交稻育种体系对种质的遗传基础有特殊的要求，即不育系要有不育细胞质（线粒体基因组含有特别的不育基因），保持系要完全不含主效和微效恢复基因，而恢复系要携带主效和微效恢复基因。因此，三系杂交稻的三系培育所能利用的种质资源有限，育种难度较大，杂交配组的自由度不大，不育系和杂交种的繁殖和制种程序较繁琐。

在水稻也成功培育出基于光温敏不育系的二系杂交稻，并在生产中推广应用（朱英国，2000，水稻雄性不育的生物学，武汉大学出版社；Cheng等, 2007， Ann. Bot., 100, 959-966)。光温敏不育系是利用在短日低温的条件下雄性可育自交繁殖，在长日高温的条件下雄性不育，可作为母本与父本杂交制种。任何正常可育的父本的相关野生型育性基因都可以抑制光温敏不育性，杂交种在正常生长季节的花粉育性正常。因此二系杂交稻的父本的筛选配组的自由度较大。中国目前应用的二系杂交稻主要是以温敏不育为主。由于温敏不育系的雄性育性受温度控制，不育系繁殖需要在特定区域的特定季节（如海南省偏南地区的冬季）或特定条件（如深水库低温水灌溉）进行。更严重的问题是在制种季节的育性转换敏感期（一般是减数***期至小孢子发育期）遇到异常的低温天气（25℃或以下）会产生部分可育花粉，造成部分自交结实而降低杂种纯度，严重的情况下使杂交种达不到纯度标准而报废。因此，由于温度变化产生的制种风险是制约二系杂交稻发展的主要因素。

水稻花药发育涉及大量核基因的参与，自然突变或理化诱变可以较高频度产生雄性不育突变。在水稻已经报道了大量的雄性不育突变体，其中已有20多个雄性育性基因已被克隆（Zhang DB and Wilson ZA, 2009，Chinese Science Bulletin, 2342-2353）。但由于大部分突变体是相关基因隐性不育突变，它们的纯合突变体不能自交繁殖，而用野生型亲本与其杂交只能产生相关基因杂合的可育（或部分可育）的杂种，因此核不育突变系不适宜直接作为商业化杂交稻制种的不育系亲本。

另一方面，也有多种基因工程方案创建植物不育系及其恢复系的报道。这些方案归纳起来主要有2种,一是用花药或花粉特异表达启动子驱动细胞毒素基因的表达影响花药或花粉的正常发育。如用花药特异表达启动子TA29控制Barnase基因转化烟草和油菜产生雄性不育（Mariani 等， 1990）。另一种是用花药或花粉特异表达启动子驱动的反义RNA或RNA干扰抑制花药必需基因的表达。如在玉米中表达类黄酮生物合成关键基因CHS反义RNA产生雄性不育（Cie等1981）。这些方案都需要用基因工程技术解决不育系的繁殖问题和杂种雄性育性的恢复问题。例如在Barnase基因工程不育***中，需要用筛选标记基因筛选不育系，以及用Barster基因转化父本作为恢复基因（Mariani等，1992）。目前在水稻中还没有开发出实用性的基因工程杂交制种体系。

基于以上分析，开发优于三系和温敏二系杂交稻制种技术体系和现有的基因工程杂交制种体系，对杂交稻的进一步发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种水稻雄性育性可控系的构建方法。

本发明的第二个目的是利用此水稻雄性育性可控系进行杂交制种的方法。

本发明的第三个目的是提供以此育种方法的关键材料和元件，即水稻雄性不育突变系、包含诱导型启动子和雄性育性基因的重组基因表达盒及其载体、以及合适的诱导剂。

为此，本发明的水稻雄性育性可控系的构建方法包括（a）获得水稻雄性育性基因的不育突变系和相应的雄性育性基因；（b）构建由诱导型启动子控制的雄性育性基因表达盒转化载体；（c）以所述表达盒转化载体转化所述不育突变系，获得水稻雄性育性可控系。

上述方法包括获得一个水稻雄性育性基因的不育突变系，用分子生物学方法克隆该雄性育性基因，和筛选出合适的诱导剂（例如化学诱导剂）和相应的诱导型启动子。构建此诱导型启动子控制的所述雄性育性重组基因表达盒载体，转化所述的雄性不育系，获得水稻雄性育性可控系。本发明建立的雄性育性可控系优选利用化学诱导剂诱导重组育性基因表达使其自交繁殖，而不施加诱导条件的自然生长条件下表现完全的雄性不育，因而可与父本杂交生产杂交一代（F₁）种子。

为获得所述水稻雄性育性基因的不育突变系，本发明从钴60-γ射线诱变水稻品系02428的突变体库筛选得到1个孢子体型雄性不育突变系msl12。该突变系的保藏编号为CCTCC P201207，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市珞珈山武汉大学，保藏日期为2012年8月29日，保藏的生物材料拉丁文学名为Oryza sativa L.，分类命名为稻属水稻。以此突变系与水稻品种黄华占杂交获得F₂遗传群体,以定位克隆技术克隆到导致此雄性不育的功能缺失突变基因（SEQ ID No.1），命名为osabcg15, 及其功能型（野生型）基因（SEQ ID No.2，SEQ ID No.3），命名为OsABCG15。OsABCG15基因编码一个688氨基酸的ABC运转子蛋白(ATP-binding cassette transporter）（SEQ ID No.4）。其功能涉及从花药绒毡层运输脂肪酸到小孢子，合成花粉壁的主要成分花粉素，属于孢子体育性基因。在此突变系中，该基因缺失了包括一个外显子和2个内含子的1479 bp而功能缺失，导致早期小孢子不能正常发育而退化，产生无花粉型败育。

本发明以丙环唑和腈菌唑为有效成分的内吸性杀菌剂（可在植物组织间传导）混合溶液施加到孕穗期的水稻叶片，24h后取处理和对照的花药提取RNA。利用水稻全基因组表达芯片（OsAffx）杂交和定量RT-PCR验证，发现1个芯片探针（OsAffx.13615.1.S1_at）代表的基因在非处理样品的表达水平很低，而在处理样品的表达水平大大高于非处理对照。本发明用PCR技术扩增克隆了这个基因的启动子序列(SEQ ID No.5）。

本发明将所述的启动子和功能型育性基因的全长编码区（CDS）序列、或具有编码该蛋白功能活性序列的部分cDNA序列、或基因组序列在转化载体上构建成重组基因表达盒。如SEQ ID No.6所示的是用所述的启动子和功能型育性基因的全长CDS序列构建的重组基因表达盒。将含有此重组基因表达盒的载体转化导入所述的雄性不育突变系，经下述方法诱导育性恢复，自交繁殖获得转基因纯合的雄性育性可控系。如果在构建重组育性基因转化载体时结合使用一种筛选标记剔除技术，就可以获得无筛选标记的雄性育性可控系。

所述功能型雄性育性基因是指能够实现雄性可育性的基因，其包括野生型雄性育性基因和虽然发生突变但仍保持雄性育性功能的基因，或从其它物种分离的具有相同功能活性的同源基因。

本发明育成的水稻雄性育性可控系的自交繁殖方法为，在花药发育期为减数***期至单核小孢子发育期，用丙环唑或腈菌唑或其混合水溶液喷施叶片或施入土壤，可诱导重组育性基因表达而恢复花粉育性，自交获得种子。

本发明的杂交制种方法为，将所述的水稻雄性育性可控系与正常可育的父本（按适当比例）种植在制种田。在不施用化学诱导剂的正常生长条件下，由于所述的化学诱导型启动子的本底表达水平低，即重组转基因的表达水平低，而内源突变基因（SEQ ID No.1）是功能缺失的，雄性育性可控系的花药发育异常而完全雄性不育，因此可接受父本的花粉受精结实，获得高纯度的F₁种子。父本来源的功能型育性基因OsABCG15（SEQ ID No.2）的正常功能可以使F₁植株的花药和花粉正常发育，因此雄性育性正常，能产生结实种子。

用本发明方法除了利用所述的育性基因OsABCG15（SEQ ID No.2）及其突变基因（SEQ ID No.1）外，还可以获得和利用在OsABCG15 （包括其启动子区）的任何位置产生的等位性突变不育基因，构建具有本实施例所述类似效果的雄性育性可控系。由于通过各种诱变技术或从自然突变中可以获得水稻其它育性基因的雄性不育突变体，并可以用分子生物学技术克隆相应的野生型育性基因，根据本发明的方法，还可以利用水稻其它雄性育性突变基因及其野生型基因，构建具有本实施例所述类似效果的雄性育性可控系及其杂交制种***。类似地，也可以用其它诱导型启动子及其合适的诱导剂替代本实施例所示的启动子(SEQ ID No.5）及其诱导剂丙环唑或腈菌唑，构建具有类似效果的雄性育性可控系及其杂交制种***。

本发明方法构建的雄性育性可控系及其杂交制种方法是一种结合利用内源核不育突变基因和重组转基因的新型二系杂交稻制种***。它克服了基于细胞质雄性不育基因与恢复基因的三系杂交稻和基于光温敏不育基因的二系杂交稻育种方法存在的问题，也比其它基因工程方法创制的不育系和恢复系杂交体系具有更多优点：（1）其它的基因工程培育植物雄性不育技术是基于转基因的表达控制雄性不育的发生，往往转基因的表达效果及其作用效应不稳定，导致不育性不完全或不稳定。本发明产生的雄性育性可控系的花粉不育性由内源的功能缺失突变基因决定，因而不育性完全且稳定，不受环境条件如温度和日长的影响；（2）不需像其它的基因工程植物雄性不育系方法那样用基因工程技术建立不育系繁殖和杂种育性恢复体系，本发明方法对任何可育品种（系）都是潜在的父本恢复系，因而杂交组合配对的自由度大；（3）本发明只在雄性育性可控系的自交繁殖环节才使用化学诱导剂诱导重组育性基因的表达来恢复育性，对育性恢复程度的要求不高，如40-60%左右的结实率即可达到经济实用性；（4）在所有水稻种植区的水稻生长季节都可以繁殖和制种，不必像光温敏不育系那样选择合适日长或温度的季节或地域进行繁殖和制种；（5）需要育性操控（施诱导剂）的繁殖田面积最少（是杂交制种田面积的约1/300），且所用的化学诱导剂是常用的廉价的低毒杀菌剂，因而雄性育性可控系的繁殖简单，成本低；（6）在结合使用筛选标记剔除技术的情况下，本方法产生的雄性育性可控系只携带植物来源（如水稻来源）的转基因组分（启动子和育性基因），不构成超出自然突变事件程度的生物安全性问题。

附图说明

图1 雄性育性可控系创制及其杂交制种方法示意图；ms为育性突变基因，MS为雄性育性功能型基因；P_ind为诱导型启动子。

图2 水稻雄性不育突变体msl12的表型：A为野生型(WT)和突变体的小花；B为花药I₂-k染色，突变体花药内不含花粉粒；C为野生型和突变体灌浆后的株型；A、B小图中标尺为1 mm。

图3（A）雄性不育突变msl12基因座的精细定位；（B）相关功能型育性基因（OsABCG15）及其功能缺失突变基因（osabcg15）的结构；（C）用定量RT-PCR进行OsABCG15在花药的表达分析（以OsActin1为内参）；1-5分别为花粉母细胞期、减数***期，四分体期至单核早期、单核中晚期、二核期；（D）以Pubi::OsABCG15遗传转化msl12突变体恢复雄性育性，以验证其功能。

图4 定量RT-PCR检测水稻化学诱导型启动子（SEQ ID No.4）的本底表达（对照）及其受诱导24 h后的相对表达水平（以OsUbiquitin基因为内参）。

图5 重组基因表达盒结构，所示位点的碱基位置是根据SEQ ID No.5列出。

图6 （A）用所述重组基因转化雄性不育突变体，获得的雄性育性可控系在不施用诱导剂的情况下产生无花粉型不育；(B-D）在减数***期至小孢子发育期施用所示诱导剂的花粉育性和小穗结实。

图7 （A）雄性育性可控系与籼稻父本HNL-1杂交获得的杂种F1；（B）F1的花粉育性和小穗结实。

所述不育突变系的保藏编号为CCTCC P201207，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏日期为2012年8月29日。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不限制本发明的范围。若未特别指明，所用的是本领域技术人员所熟知的常规技术方法。

实施例1 水稻雄性不育突变基因及其功能型育性基因的定位克隆和功能验证

用钴60-γ射线诱变水稻粳稻品种02428，获得1个单座位隐性孢子体雄性不育突变体，命名为msl12（图2）。将msl12与籼稻品种黄华占杂交获得F₂定位群体。以表1所列的基于PCR的***/缺失多态性分子标记，利用约10500株F₂个体将msl12定位在第6染色体的一个43 kb的区间（图3A）。该区间存在2个预测基因（基因号 Os06g006700和Os06g006800）。DNA测序分析表明，与原亲本的基因组序列相比，msl12的Os06g006800没有变异，而在Os06g006700缺失了一段包括1个外显子和2个内含子的1479 bp片段（图3B，SEQ ID No.1）。本发明将该野生型（功能型）基因命名为OsABCG15（SEQ ID No.2，SEQ ID No.3），它编码一个454氨基酸的ABC运转子(ATP-binding cassette transporter）蛋白（SEQ ID No.4）。其功能可能是从花药绒毡层运输脂肪酸到小孢子，合成花粉壁的主要成分花粉素。用特异引物5’-CATGTGTGGCCAACCAAAGA-3 和5’-GTG GTCTTGCCACTGCC AGA-3’对不同发育时期花药进行定量RT-PCR分析表明，OsABCG15主要在四分体期至单核小孢子早期表达（图3C）。

表1  定位msl12所用的***/缺失(insertion/deletion)分子标记引物

标记名	引物序列（5’---3’）
		623652	GGTGCGTATGTTTGTTCCAGT, GGATAATATCAGGAGACCCCT
623715	TGTAATGAGTATGAGTTGTAG, TTGAGTCGTTGACATGTGGGA
		625024	GAGTGAGATTGTCTCCTC, GGCACTAAGGCTTTGCA
625051	GTACCCCGAATTCTAGTTTGGA, GACAAATCTATTTATATCCTAC
		625067	TCCACAAGACTGATACCTG, CAACCTTCACTACCACATG
625070	GCTTACCTAAACTAATAG, GTTCCTAACCAACTATAC
		623939	ACCTAATTTTGGGATTGAGAG, GTGGAATGCAGTTTATCTAAAT

为了验证OsABCG15的功能，用特异引物5’-TTCTTGGTACCTG ATTAAAAGGAGAG-3’(下划线为Kpn I切点)和5’-GCCAAGCTTCGCTTATGCT TACAAGCTGA-3’ (下划线为Hind III切点)以PCR扩增OsABCG15 全长cDNA,与玉米泛素基因启动子Pubi连接后克隆到植物转化双元载体pCAMBIA1305.1改造的载体。把此载体以农杆菌转化方法转化由MSL12/msl12 杂合体产生的种子（有1/4比例是msl12/msl12纯合体）诱导的愈伤组织。从获得的T₀转化体用分子标记625051（表1）筛选出2个msl12/msl12纯合体，它们的花药发育正常并产生可育花粉（图3D）。此结果证明OsABCG15是具有育性功能的目标基因，突变基因osabcg15（SEQ ID No.1）的功能缺失导致小孢子早期不能正常发育而退化，产生无花粉型败育。

实施例2 从水稻分离化学诱导型基因启动子

本发明用0.05%丙环唑和0.05%腈菌唑混合水溶液施加到水稻叶片，24h后取处理和对照的减数***期至小孢子期的花药，提取RNA。利用水稻全基因组表达芯片（OsAffx）杂交（由博奥生物有限公司完成）筛查，发现1个基因探针（OsAffx.13615.1.S1_at）代表的基因在非处理样品的表达水平很低，而在处理样品的表达水平大大高于非处理对照。进一步用定量RT-PCR验证，证实其本底表达较低，而丙环唑或腈菌唑可提高其表达水平，这2种诱导剂共用的表达水平更高（图4）。

实施例3 水稻雄性育性可控系的构建

以特异引物5’-CTTGAGGCCGGCCTAAATTATTATTTTTCCAATATTTA-3’ (下划线为FseI切点)和TCAGGTACCGATCGGTGATCCCTCCTCAA-3’ (下划线为Kpn I切点)从水稻基因组PCR扩增所述的启动子序列；用5’-GATCGGTACCTGATTAAAAGGAGAGA AG-3’ (下划线为Kpn I切点)和5’-GGAGGATCCAGACCTCGCGCA-3’ (下划线为BamH I切点) PCR扩增野生型 OsABCG15 近全长cDNA编码序列；以5’-CTCT GGATCCTCCTCGCCATGGC-3’ (下划线为BamH I切点)和5’-CCTACTCGAG CTCCCTGCAGGTGAGGA-3’(下划线为Xho I切点) PCR扩增OsABCG15 的小部分cDNA编码序列和3’终止子序列。将这3个片段用所示的限制性内切酶切出粘性末端，连接成重组基因表达盒结构（图5），其DNA序列如SEQ ID No.6所示。将此表达盒序列克隆到基于可转化人工染色体载体（Lin等 2003，PNAS, 100, 5962-5967）的改造载体。将含有此重组基因表达盒的载体以农杆菌介导方法（Hiei 等, 1994 Plant J. 6, 271-282) 转化导入所述的雄性不育突变系，获得转化体。将转化体与1个籼稻品系TB杂交，并以TB为轮回亲本回交3代，选育出偏籼型的雄性育性可控系HNLS-1。每次回交时以引物组5’-CCTGTTCCATCGAGGAGT-3’ /5’-CTCAACAATGGCCATCTCCA-3’以及5’-CTCGGCCTCCTCTGGTGGAAGT-3’/ 5’-CGGCTGCCGCAGTTGTAGGT-3’筛选含有转基因和内源突变基因osabcg15 的个体作为回交的母本。

实施例4 水稻雄性育性可控系的繁殖

    在雄性育性可控系的花药减数***期至单核小孢子期，以0.05%丙环唑或0.05%腈菌唑或0.05%丙环唑+0.05%腈菌唑混合水溶液喷施到叶片，3天后重施一次。结果表明，单独使用丙环唑或腈菌唑的自交结实率约为60%，将2种诱导剂混用的自交结实率约为86%（图6）。

实施例5 用水稻雄性育性可控系进行杂交制种

将本发明育成的水稻雄性育性可控系与1个籼稻品系HNLR-1按12:2的比例种植，在抽穗杨花时辅以人工赶花粉以提高杂交率，获得F1杂交种子(结实率约55%)。F1杂种植株的花粉正常可育，自交结实率达到约90%（图7）。

<110>  华南农业大学

<120>  一种水稻雄性育性可控系的构建方法及育种方法

<160>  6    

<210>  1

<211>  5579

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa)

<400>  1

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<210>  2

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<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa)

<400>  2

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<210>  3

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<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa)

<400>  3

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       841 cacatgttcg acaagctgct gctcgtcgcc gagggccacg ccatctacca cggcggcgcc

       901 cgcggctgca tgcgccactt cgccgccctc ggcttctccc ccggcatcgc catgaacccc

       961 gccgagttcc tcctcgacct cgccaccggc aacctcgacg gcatctcctc ccccgcctcc

      1021 ctcctcctcc cctccgccgc cgccgcctcg ccggactccc ccgagttcag gtcccacgtc

      1081 atcaagtact tgcaggcgag gcacagggcg gccggcgagg aggaggcggc ggccgcggcg

      1141 gcgagggagg gcggcggcgg aggtggcgcg gggagggatg aggcggcgaa gcagctgaga

      1201 atggcggtga ggatgaggaa ggataggcgg ggcggcatcg gctggctgga gcagttcacc

      1261 gtgctgtcgc ggcgcacgtt ccgggagcgc gccgccgact acctcgacaa gatgcgcctc

      1321 gcccagtccg tcggcgtcgc cctcctcctc ggcctcctct ggtggaagtc ccagacctcc

      1381 aacgaggccc agctccgtga ccaagtgggg ttgatattct acatctgcat attctggacg

      1441 tcgtcgtcgc tgttcgggtc ggtgtacgtg ttcccgttcg agaagctgta cctggtgaag

      1501 gagaggaagg cggacatgta caggctgagc gcctactacg cgagcagcac ggtgtgcgac

      1561 gcggtgccgc acgtcgtgta cccggtgctc ttcacggcca tcctctactt catggccgac

      1621 ctgcgccgca ccgtgccctg cttctgcctc accctcctcg ccaccctcct catcgtcctc

      1681 accagccagg gcaccggcga gctgctcggc gccgccatcc tcagcgtcaa gcgcgccggc

      1741 gtcatggcct cgctcgtcct catgctcttc ctcctcaccg gcggctacta cgtccagcat

      1801 ataccgaagt tcataaggtg gctcaagtac gtgtcgttca tgcactacgg gttcaacctg

      1861 ctgctgaagg cgcagtacca cggccacctg acctacaact gcggcagccg cggcggctgc

      1921 cagcggctgc agtcctcgcc gtcgttcggc accgtcgacc tcgacggcgg catgcgcgag

      1981 gtctggatcc tcctcgccat ggccgtcgcc taccgcctcc tcgcctacct ctgcctccgc

      2041 aagcggatca gcctcatgcc cttgtag

 

 

<210>  4

<211>  688

<212>  PRT

<213>  水稻(Oryza sativa)

<400>  4

1 MMEISSNEEM MEMAIVEQLP PSSHHLNGGS VEVDMEEDHV WPTKDGPLPI FLKFENVEYK

        61 VKLTPKNPLT AARVAFASHK STEDQGSCKH ILKGIGGSVD PGEILALMGP SGSGKTTLLK

       121 ILGGRLSGGV KGQITYNDTP YSPCLKRRIG FVTQDDVLFP QLTVEETLVF AAFLRLPARM

       181 SKQQKRDRVD AIITELNLER CRHTKIGGAF VRGVSGGERK RTSIGYEILV DPSLLLLDEP

       241 TSGLDSTSAA KLLVVLRRLA RSAARRTVIT TIHQPSSRMF HMFDKLLLVA EGHAIYHGGA

       301 RGCMRHFAAL GFSPGIAMNP AEFLLDLATG NLDGISSPAS LLLPSAAAAS PDSPEFRSHV

       361 IKYLQARHRA AGEEEAAAAA AREGGGGGGA GRDEAAKQLR MAVRMRKDRR GGIGWLEQFT

       421 VLSRRTFRER AADYLDKMRL AQSVGVALLL GLLWWKSQTS NEAQLRDQVG LIFYICIFWT

       481 SSSLFGSVYV FPFEKLYLVK ERKADMYRLS AYYASSTVCD AVPHVVYPVL FTAILYFMAD

       541 LRRTVPCFCL TLLATLLIVL TSQGTGELLG AAILSVKRAG VMASLVLMLF LLTGGYYVQH

       601 IPKFIRWLKY VSFMHYGFNL LLKAQYHGHL TYNCGSRGGC QRLQSSPSFG TVDLDGGMRE

661 VWILLAMAVA YRLLAYLCLR KRISLMPL

 

<210>  5

<211>  2805

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa)

<400>  5

1 taaattattt ttccaatatt tattttttta aaattttaaa tttcgaatta taaatttatt

        61 tctatatgga cttctatttt ttttcaattt caaattttaa ttagttctaa attatataat

       121 ggtgtggact ctaatacttt cttttaatat ttattattat taattctgaa tttcagctat

       181 ttaaaattgt atttctatat ggactctatt attctttttt aatccaagtt tttgatattt

       241 ctaaatttta tttcaacata gactcttctt aaaattttct tcatttttat tccaaatttt

       301 agatatatat taaattatat ttatatttat aaatagtttt attttcatct aggtagttga

       361 agagaattct ttattctgaa tttcagatat attgaaatat atttccattt gaactctatt

       421 tttttctaat taatatggaa atttgtagaa agtggaagca aatatggtgg cctttttata

       481 ttagactaag atatactatt atagacatat aaatgcgtag agtgtgcagg tatgaccgta

       541 tgaacatgcc attagagatt tgatttgttg caacggggag aatagatcga gataagcaat

       601 gaaaccaata cctcttacgg acatgagcac ttgtgatttg tattatacac ggttactgta

       661 gcccagctta ggtttttttc ccttggaaaa ggcttccaag ctactaatca ttctatgcag

       721 ctgtccgatc ggacacattt ttttttctaa aaaaagtcct tatatacaaa aaattttcct

       781 tatatatttt ttattctgct tatttctata tggactctaa tctctacttt tagttttctt

       841 atcttcttaa attctgaatt ctcattagtt ctattgtcta ccggtatgga ctctagtatt

       901 atattcctat attctatatt tttaatccga atttcagcta tttttaaatt gtatattcct

       961 atatggactc tgttttttct ttttctctga ttaatatgag aatttctagg ctataagagc

      1021 aaacgtggag gcttcttttt ctattccttt aataagttaa ctagcatagt gacccgcgca

      1081 gattgcgcgg ctagcatcat tatagtttct ctcatataat agcatatata tatttctcat

      1141 tatattaaaa tgaaaatata atttgaaatt ttgcaataac tttacgaaac aactaatgtg

      1201 tagtattcat attgtatttt atatatgtgt tagttattaa ttatttttaa tatcaaattt

      1261 aagttatttg taaattatat atattcctat atggactcta gactcgtctt ttaatattta

      1321 tttttttaat tatgaatttt tattatttct gattgtattt ctacgtggac actaaactca

      1381 tctttcaata ttctttaatt ttttatttca aatttcagtt agtattccta tattgacttt

      1441 gcttcttccc atttttttta attttaaatt ttagttattt gtaaattata tttttatacg

      1501 gactctgaat actactttta attttattat gtttattccc aattttagtt agttttaaat

      1561 tcttatatgg actctatact ctacttctaa tattcctttt tttaattcca aatttctatt

      1621 tttttcgtaa ttgtatttat atgtggactc tatactctac ttctaatatt ccatattttt

      1681 aattccgaat ttctattatt tcctaattgt attttctata tggactctgt actctacttc

      1741 taaaagcacg aacaaacaaa atacattgga ttgtctttgc tatatgaagc atataacttc

      1801 gagtttcttt cattctacac accattcata tttttgcgag tacattttta ttatatatgt

      1861 agcctgtaat aacttttcca ttattgctaa taaaatacgt ttattagcaa taatagtttt

      1921 cagaatttat taaaaaagag ggactctaaa cattcaatta aaactggaaa acaccatatc

      1981 tttaatttat acttaattta taagacatat cttttaaaca aactaagtca aactcctctc

      2041 aagataataa taaaaaaaat aaatcttata gtaataaatt aaatattata tagtttaaag

      2101 ctaataaata ttttgcaaaa tttcaaataa tgtcgatgaa caaaatttga agagaaataa

      2161 tacttttgaa gcatataggc cgggtcattc ggttgatatt ttatccttat aaatttctca

      2221 aacatatcgt acaatacatg cccgcgtgaa tgcacgggct aatttcctag ttatatgaaa

      2281 acaaataaaa ttagttatag atgacgggag acaataaaag aaatctacga tatataggat

      2341 tattttatgg acttgctgaa ggaaggtggg cccaaatatg ggtcatgtag caaatgattg

      2401 ttggagcaag gcccagccca aggtagcgta catccagacg aattccctag cttgcggata

      2461 ctgacgctcc gaaatgcgct ggtgctggaa gctgtggaag gaaggctctc gagtctggaa

      2521 gccgcatcgc gctttctccg ctccacctcc acgatccaac agatgggctg caaccccaaa

      2581 agagcgggaa atgttgagaa gcctctggaa cacctgcgat ccgtccatcg tcttcctgtt

      2641 ccatcgagga gtatatatat atatctgtcc gtccgtccta cttgtcaaat ccaatcgatc

      2701 catctctgca cagctgcact tgcatttcag ccagcgacaa gaaagcacca aatctctttg

      2761 cattcaagca gcaggcaaca ttgttgagga gggatcaccg atcgg

 

<210>  6

<211>  6035

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa)

<400>  6

1 ggccggccta aattattttt ccaatattta tttttttaaa attttaaatt tcgaattata

        61 aatttatttc tatatggact tctatttttt ttcaatttca aattttaatt agttctaaat

       121 tatataatgg tgtggactct aatactttct tttaatattt attattatta attctgaatt

       181 tcagctattt aaaattgtat ttctatatgg actctattat tcttttttaa tccaagtttt

       241 tgatatttct aaattttatt tcaacataga ctcttcttaa aattttcttc atttttattc

       301 caaattttag atatatatta aattatattt atatttataa atagttttat tttcatctag

       361 gtagttgaag agaattcttt attctgaatt tcagatatat tgaaatatat ttccatttga

       421 actctatttt tttctaatta atatggaaat ttgtagaaag tggaagcaaa tatggtggcc

       481 tttttatatt agactaagat atactattat agacatataa atgcgtagag tgtgcaggta

       541 tgaccgtatg aacatgccat tagagatttg atttgttgca acggggagaa tagatcgaga

       601 taagcaatga aaccaatacc tcttacggac atgagcactt gtgatttgta ttatacacgg

       661 ttactgtagc ccagcttagg tttttttccc ttggaaaagg cttccaagct actaatcatt

       721 ctatgcagct gtccgatcgg acacattttt ttttctaaaa aaagtcctta tatacaaaaa

       781 attttcctta tatatttttt attctgctta tttctatatg gactctaatc tctactttta

       841 gttttcttat cttcttaaat tctgaattct cattagttct attgtctacc ggtatggact

       901 ctagtattat attcctatat tctatatttt taatccgaat ttcagctatt tttaaattgt

       961 atattcctat atggactctg ttttttcttt ttctctgatt aatatgagaa tttctaggct

      1021 ataagagcaa acgtggaggc ttctttttct attcctttaa taagttaact agcatagtga

      1081 cccgcgcaga ttgcgcggct agcatcatta tagtttctct catataatag catatatata

      1141 tttctcatta tattaaaatg aaaatataat ttgaaatttt gcaataactt tacgaaacaa

      1201 ctaatgtgta gtattcatat tgtattttat atatgtgtta gttattaatt atttttaata

      1261 tcaaatttaa gttatttgta aattatatat attcctatat ggactctaga ctcgtctttt

      1321 aatatttatt tttttaatta tgaattttta ttatttctga ttgtatttct acgtggacac

      1381 taaactcatc tttcaatatt ctttaatttt ttatttcaaa tttcagttag tattcctata

      1441 ttgactttgc ttcttcccat tttttttaat tttaaatttt agttatttgt aaattatatt

      1501 tttatacgga ctctgaatac tacttttaat tttattatgt ttattcccaa ttttagttag

      1561 ttttaaattc ttatatggac tctatactct acttctaata ttcctttttt taattccaaa

      1621 tttctatttt tttcgtaatt gtatttatat gtggactcta tactctactt ctaatattcc

      1681 atatttttaa ttccgaattt ctattatttc ctaattgtat tttctatatg gactctgtac

      1741 tctacttcta aaagcacgaa caaacaaaat acattggatt gtctttgcta tatgaagcat

      1801 ataacttcga gtttctttca ttctacacac cattcatatt tttgcgagta catttttatt

      1861 atatatgtag cctgtaataa cttttccatt attgctaata aaatacgttt attagcaata

      1921 atagttttca gaatttatta aaaaagaggg actctaaaca ttcaattaaa actggaaaac

      1981 accatatctt taatttatac ttaatttata agacatatct tttaaacaaa ctaagtcaaa

      2041 ctcctctcaa gataataata aaaaaaataa atcttatagt aataaattaa atattatata

      2101 gtttaaagct aataaatatt ttgcaaaatt tcaaataatg tcgatgaaca aaatttgaag

      2161 agaaataata cttttgaagc atataggccg ggtcattcgg ttgatatttt atccttataa

      2221 atttctcaaa catatcgtac aatacatgcc cgcgtgaatg cacgggctaa tttcctagtt

      2281 atatgaaaac aaataaaatt agttatagat gacgggagac aataaaagaa atctacgata

      2341 tataggatta ttttatggac ttgctgaagg aaggtgggcc caaatatggg tcatgtagca

      2401 aatgattgtt ggagcaaggc ccagcccaag gtagcgtaca tccagacgaa ttccctagct

      2461 tgcggatact gacgctccga aatgcgctgg tgctggaagc tgtggaagga aggctctcga

      2521 gtctggaagc cgcatcgcgc tttctccgct ccacctccac gatccaacag atgggctgca

      2581 accccaaaag agcgggaaat gttgagaagc ctctggaaca cctgcgatcc gtccatcgtc

      2641 ttcctgttcc atcgaggagt atatatatat atctgtccgt ccgtcctact tgtcaaatcc

      2701 aatcgatcca tctctgcaca gctgcacttg catttcagcc agcgacaaga aagcaccaaa

      2761 tctctttgca ttcaagcagc aggcaacatt gttgaggagg gatcaccgat cggtacctga

      2821 ttaaaaggag agaagggcag tctgcttggc gctctctctc tgaacctgtc actctttttt

      2881 tctgtgtctc ttggaggaga tgatggagat cagcagcaat gaggagatga tggagatggc

      2941 cattgttgag cagctgcctc cttcctctca tcatctcaat ggtggcagtg ttgaggttga

      3001 catggaggag gatcatgtgt ggccaaccaa agatggccct ctccctatat tccttaagtt

      3061 tgagaatgtg gagtacaagg tgaagctgac tccaaagaac ccactaacag ctgcaagggt

      3121 ggcatttgca tctcacaaga gcactgagga tcagggcagc tgcaagcaca tcctcaaggg

      3181 gataggaggc agtgttgacc ctggtgagat cctggcactg atgggcccat ctggcagtgg

      3241 caagaccacg ctgctcaaga tacttggagg caggctcagt ggtggtgtca agggccagat

      3301 cacctacaat gacaccccct acagtccctg cctcaaaaga aggattggat ttgtgacaca

      3361 ggacgacgtc cttttccctc agttgacagt ggaggagacc cttgtgttcg ctgccttctt

      3421 gagactcccc gctcgcatgt caaagcagca gaagcgcgac agagttgacg ccatcataac

      3481 tgagctaaat ctagagaggt gccggcacac caagatcggc ggcgcgttcg tgcgcggcgt

      3541 gtcgggcggc gagaggaagc ggacgagcat cgggtacgag atcctcgtcg acccgtcgct

      3601 gctgctcctc gacgagccca cctcgggcct cgactccacg tcggcggcga agctcctcgt

      3661 cgtgctccgc cgcctcgcca ggtcggcggc ccgccggacg gtgatcacca ccatccacca

      3721 gccctccagc cggatgttcc acatgttcga caagctgctg ctcgtcgccg agggccacgc

      3781 catctaccac ggcggcgccc gcggctgcat gcgccacttc gccgccctcg gcttctcccc

      3841 cggcatcgcc atgaaccccg ccgagttcct cctcgacctc gccaccggca acctcgacgg

      3901 catctcctcc cccgcctccc tcctcctccc ctccgccgcc gccgcctcgc cggactcccc

      3961 cgagttcagg tcccacgtca tcaagtactt gcaggcgagg cacagggcgg ccggcgagga

      4021 ggaggcggcg gccgcggcgg cgagggaggg cggcggcgga ggtggcgcgg ggagggatga

      4081 ggcggcgaag cagctgagaa tggcggtgag gatgaggaag gataggcggg gcggcatcgg

      4141 ctggctggag cagttcaccg tgctgtcgcg gcgcacgttc cgggagcgcg ccgccgacta

      4201 cctcgacaag atgcgcctcg cccagtccgt cggcgtcgcc ctcctcctcg gcctcctctg

      4261 gtggaagtcc cagacctcca acgaggccca gctccgtgac caagtggggt tgatattcta

      4321 catctgcata ttctggacgt cgtcgtcgct gttcgggtcg gtgtacgtgt tcccgttcga

      4381 gaagctgtac ctggtgaagg agaggaaggc ggacatgtac aggctgagcg cctactacgc

      4441 gagcagcacg gtgtgcgacg cggtgccgca cgtcgtgtac ccggtgctct tcacggccat

      4501 cctctacttc atggccgacc tgcgccgcac cgtgccctgc ttctgcctca ccctcctcgc

      4561 caccctcctc atcgtcctca ccagccaggg caccggcgag ctgctcggcg ccgccatcct

      4621 cagcgtcaag cgcgccggcg tcatggcctc gctcgtcctc atgctcttcc tcctcaccgg

      4681 cggctactac gtccagcata taccgaagtt cataaggtgg ctcaagtacg tgtcgttcat

      4741 gcactacggg ttcaacctgc tgctgaaggc gcagtaccac ggccacctga cctacaactg

      4801 cggcagccgc ggcggctgcc agcggctgca gtcctcgccg tcgttcggca ccgtcgacct

      4861 cgacggcggc atgcgcgagg tctggatcct cctcgccatg gccgtcgcct accgcctcct

      4921 cgcctacctc tgcctccgca agcggatcag cctcatgccc ttgtagtcca tcgatctgtc

      4981 agatcaggat cagttggttc ggggaagaag acgactgatg tggtagtgaa ttgcaattgc

      5041 gattgatgat ggtgaatggg ccattgttgg tttgggtgct gtgaattgtt tcaaacttga

      5101 gttcttttct ttatttgaga agtatttgag gcttgtctgc ttagcaagtt gggaaataat

      5161 caaccccatc attttagcat tcagcttgta agcataagcg aagatttatt taaaacttat

      5221 ttttaaagtt aattttaggt atcttttcgt agtttatttt ctagcattta ctttttaatt

      5281 tgctgagcat gtatattaaa gttttacgta taattttttt taaaattatt aataagttgt

      5341 ttgtataagc gattagtctg tctcgtcgtc gtgacaaaaa gaaaaaccga tgagatggtt

      5401 gggagccgat taaggttatt gttttcctcg aaaagagaag gtggagggga tggggtgaat

      5461 ttaaatctcc ctgcaaaacc atttttggct ttgagctcaa aatttctcat tttccgtttg

      5521 taatggacat agtagtatgt tctcctcagg gcctttgccc tattaggccc aaatctcctg

      5581 cccgcaaaaa atgggctgac aacgtcacga accacgaacc gcgccgtaaa tgggccaaaa

      5641 ataccaaggc ccaaatccta cagagcccaa agtagagggc cataatatgg gcctagaaat

      5701 tcaacggccc gctccaatga gaagtggact cggagcggga ttcccccacc aaatccgttt

      5761 cgacctcaga aaatacgcct ccgatcaggc gtttacgcac actactaata ttgacgagaa

      5821 agccacctcc tctctctcgc tcgctccgct cttcttgaca aggaagcaaa agccgccgcc

      5881 gccgacgccg acgagagagg agagagagat cgccgccgac gtcgcaggag ggggaggggg

      5941 agatggcggc ggagggggag gacgcggcgg ccgcgcgacg ccgcgcggcg gccaccgact

      6001 acaggaagaa gctcctcacc tgcagggagc tcgag

 

Claims (15)

1. 一种水稻雄性育性可控系的构建方法，包括：

（a）获得水稻雄性育性基因的不育突变系和相应的雄性育性基因；

（b）构建由诱导型启动子控制的雄性育性基因表达盒转化载体；

（c）以所述表达盒转化载体转化所述不育突变系，获得水稻雄性育性可控系。

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其中所述水稻雄性不育突变系为自然突变或人工诱变产生的隐性不育突变系。

3. 根据权利要求1所述的构建方法，其中所述水稻雄性不育突变系为孢子体型雄性不育突变系。

4. 根据权利要求1所述的构建方法，其中所述雄性育性基因为可恢复所述雄性不育系的花粉育性的基因，该基因是所述雄性不育系的突变育性基因的功能型等位基因。

5. 根据权利要求1所述的构建方法，所述诱导型启动子是化学诱导启动子。

6. 根据权利要求1所述的构建方法，其中所述雄性不育突变系为保藏编号为CCTCC P201207的雄性不育突变系，其功能缺失突变型育性基因的基因组DNA序列如SEQ ID No.1所示。

7. 根据权利要求1所述的构建方法，其中所述雄性育性基因的基因组DNA序列如SEQ ID No.2所示，或所述雄性育性基因的cDNA序列如SEQ ID No.3所示。

8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述雄性育性基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

9. 根据权利要求5所述的方法，其中所述化学诱导启动子的DNA序列如SEQ ID No.5所示。

10. 一种育种方法，其包括：

（a）向权利要求1所述的水稻雄性育性可控系施加诱导剂，使得功能型雄性育性基因表达，以恢复花粉育性，进行自交繁殖；或

（b）在自然条件下将权利要求1所述的水稻雄性育性可控系与正常可育的父本品系按适当比例种植，从而与父本进行杂交获得杂交种子。

11. 根据权利要求10所述的育种方法，其中所述诱导剂含有作为有效成分的丙环唑或腈菌唑或两者的组合。

12. 根据权利要求10所述的育种方法，其中在步骤（a）中，在花药发育期向所述水稻雄性育性可控系施加诱导剂。

13. 根据权利要求12所述的育种方法，其中花药发育期为减数***期至小孢子发育期。

14. 一种重组基因表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

15. 一种转化载体，其包含权利要求14所述的重组基因表达盒。

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