CN112679591B - 抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了调控OaGS3基因的物质在调控四倍体野生稻产量/籽粒长度中的应用。本发明的具体实施例证明通过编辑基因OaGS3，可实现籽粒长度的增加，从而选育产量较高的四倍体野生稻，推进四倍体野生稻的驯化与利用。

Description

抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中 的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。水稻高产、稳产对于保障世界粮食安全具有重要意义。然而，城镇化进程加剧导致耕地面积锐减，极端天气频发增加了粮食稳产风险，传统育种技术带来的作物产量提升缓慢。粮食安全问题日益凸显，已逐渐成为人们面临的新挑战。

高秆四倍体野生稻O.alta为多年生异源四倍体水稻，主要分布于南美洲地区。与二倍体栽培稻相比，四倍体高秆四倍体野生稻表现出生物量大，多年生，再生能力强，胁迫适应性强等诸多优点。但未经人工驯化，籽粒小，千粒重仅为8.79克。通过基因组编辑的技术增加高秆四倍体野生稻的籽粒长度从而增加粒重，同时结合高秆四倍体野生稻诸多的优势，达到增加产量的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何使四倍体野生稻的产量增加。

为了解决以上技术问题，本发明提供了抑制OaGS3基因表达的物质在增加四倍体野生稻产量或籽粒长度中的应用，所示OaGS3基因编码OaGS3蛋白，所述OaGS3蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是序列表中序列5和序列6中任一种所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、将序列表中序列5和序列6中任一种所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述应用中，序列表中的序列5由221个氨基酸残基组成，序列表中的序列6由211个氨基酸残基组成。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述应用中，所述OaGS3基因具体可为如下E1或E2所示的基因：

E1、编码链的编码序列(ORF)是序列表中序列3或序列4所示的DNA分子；

E2、核苷酸序列是序列表中序列1或序列2所示的DNA分子。

上述应用中，所述抑制OaGS3基因表达可通过对四倍体野生稻中OaGS3基因进行化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组实现的。

上述应用中，所述基因组定点编辑可采用锌指核酸酶技术(Zinc fingernuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(Transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关***技术(Clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9***)，以及其它能实现基因组定点编辑的技术实现的。

上述应用中，所述基因组定点编辑具体可借助CRISPR/Cas9***实现。所述CRISPR/Cas9***，其的靶序列为位于OaGS3基因中任一包括XXXNGG的核苷酸序列上的XXX序列；其中，XXX为所述的DNA分子序列中任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。

具体的靶序列可为序列表中序列1第392位-第411位所示的序列或序列2中第579位-第598位所示的序列。

上述应用中，所述物质可为CRISPR/Cas9***；

所述CRISPR/Cas9***包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

在本发明的具体的实施方式中，CRISPR/Cas9***的重组载体包括重组载体VK005-OaGS3gRNA；重组载体VK005-OaGS3gRNA含有sgRNA表达盒和Cas9编码基因，能表达sgRNA和Cas9。

本发明还提供选育产量较高的四倍体野生稻(O.alta)的方法，包括如下步骤：抑制受体四倍体野生稻中所述OaGS3基因的表达，得到产量高于所述受体四倍体野生稻的目的四倍体野生稻。

本发明还提供选育籽粒长度较长的四倍体野生稻(O.alta)的方法，包括如下步骤：抑制受体四倍体野生稻中所述OaGS3基因的表达，得到籽粒长度长于所述受体四倍体野生稻的目的四倍体野生稻。

上述方法中，所述目的四倍体野生稻为满足如下条件的四倍体野生稻：CC亚基因组和DD亚基因组在sgRNA的靶点区域均发生突变。

上述方法中，所述目的四倍体野生稻理解为不仅包含第一代到第二代转基因四倍体野生稻，也包括其子代。对于转基因四倍体野生稻，可以在该物种中遗传该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种。所述转基因四倍体野生稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了增加四倍体野生稻产量或籽粒长度的试剂，所述试剂的活性成分为抑制编码所述OaGS3蛋白的基因的表达、降低所述OaGS3蛋白的丰度、和/或敲除编码所述OaGS3蛋白的基因的物质。

上述试剂中，所述物质为CRISPR/Cas9***；

所述CRISPR/Cas9***包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

上述试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据四倍体野生稻增产效果或籽粒长度增加效果确定。

本发明还保护CRISPR/Cas9***，所述CRISPR/Cas9***包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供如下Y1-Y5的任一应用：

Y1、上述的应用在四倍体野生稻驯化育种中的应用；

Y2、上述的方法在四倍体野生稻驯化育种中的应用；

Y3、上述的试剂在四倍体野生稻驯化育种中的应用；

Y4、上述的CRISPR/Cas9***在四倍体野生稻驯化育种中的应用；

Y5、上述调控OaGS3基因的物质在水稻育种中的应用。

本发明提供了调控OaGS3基因的物质在调控四倍体野生稻产量/籽粒长度中的应用。本发明的具体实施例证明通过编辑基因OaGS3，可实现籽粒长度的增加，从而选育产量较高的四倍体野生稻，推进四倍体野生稻的驯化与利用。

附图说明

图1为本发明实施例1中O.alta中OaGS3基因靶位点图。

图2为本发明实施例1中VK005-OaGS3gRNA的构建图。

图3为本发明实施例2中部分T0扩增OaGS3-CC和OaGS3-DD的结果条带。

图4为本发明实施例2中部分基因组编辑T0材料突变测序结果图。其中，O.alta为野生型，T0-1和T0-2均为基因组编辑T0材料植株。

图5为本发明实施例2中部分基因组编辑材料和野生型籽粒长度表型照片。其中，O.alta为野生型，T0-1和T0-2均为基因组编辑材料株系。

图6为本发明实施例2中部分基因组编辑材料和野生型籽粒长度数据统计结果图。其中，O.alta为野生型，T0-1和T0-2均为基因组编辑材料株系。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为20，**代表显著性分析结果为P<0.01。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

双元载体VK005-01为北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(货号：VK005-01)中的Cas9/gRNA Vector。

下述实施例中的四倍体野生稻为四倍体野生稻Oryza alta 2007-24，即为文献1中第906页左栏1.1中的高秆四倍体野生稻种质材料(O.alta Swallen，染色体组为CCDD，编号为YD-7900)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所或国家种质南宁四倍体野生稻圃获得。文献1：梁云涛等，高秆四倍体野生稻愈伤组织诱导分化研究，西南农业学报，2014,27(3)，905-909。

下述实施例中所用转录本为T01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3’末端核苷酸。

实施例1、四倍体OaGS3靶位点的选择及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

一、靶序列的选择

四倍体高秆四倍体野生稻Oryza alta为异源四倍体，大部分基因在CC和DD亚基因组上都有拷贝。通过比对分析，Oryza alta中存在两个OaGS3的同源基因，位于CC亚基因组3号染色体上的基因命名为OaGS3-CC，另一位于DD亚基因组3号染色体上的基因命名为OaGS3-DD(核苷酸序列如序列2所示)。

OaGS3-CC由5926个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列1所示。其CDS序列如序列3所示，编码的蛋白序列如序列5所示。

OaGS3-DD由6193个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列2所示。其CDS序列如序列4所示，编码的蛋白序列如序列6所示。

如图1所示，在OaGS3-CC和OaGS3-DD第一个外显子保守区域上选择靶序列，具体序列如下:

靶序列：5’-CCGGCAGCGCCCGACCCCTG-3’(如序列1第392位-第411位所示或如序列2第579位-第598位所示)；

根据靶序列设计sgRNA记为OaGS3-sgRNA。

二、重组质粒的构建

合成下述带有接头序列(下划线部分)的单链引物:

VK005-OaGS3-F：

(波浪线指示的序列为靶序列，下划线指示的序列为接头序列)；

VK005-OaGS3-R：

(波浪线指示的序列与Target site 1反向互补，下划线指示的序列为接头序列)。

VK005-OaGS3-F和VK005-OaGS3-R进行引物退火，形成Oligo二聚体。将双元载体VK005-01进行BspQI单酶切，胶纯化回收约17kb左右的载体片段，在T4连接酶作用下与上述Oligo二聚体进行酶连，得到重组载体以如下测序引物进行测序：

VK005 primer:5’-GCCATGAATAGGTCTATGACC-3’。

经测序验证后的阳性质粒结构如图2所示，即在BspQI的酶切位点处正确***sgRNA表达盒，将阳性质粒命名为VK005-OaGS3gRNA。VK005-OaGS3gRNA含有sgRNA表达盒和Cas9编码基因，能表达sgRNA和Cas9。

实施例2、转化四倍体水稻愈伤及表型鉴定

1、培育OaGS3基因敲除的四倍体野生稻O.alta植株

将实施例1得到的质粒VK005-OaGS3gRNA通过电激方法转化农杆菌EHA105，利用农杆菌侵染四倍体野生稻O.alta的愈伤组织，培育上述愈伤组织得转化苗。提取转化苗的基因组DNA，以特异引物扩增OaGS3-CC和OaGS3-DD。

用于扩增OaGS3-CC的引物对由OaGS3-CC-F和OaGS3-CC-R构成：

OaGS3-CC-F:5’-CCTCCGCCATTTATAATCCA-3’；

OaGS3-CC-R:5’-TATGCATTCGTGGTTTCAGC-3’。

用于扩增OaGS3-DD的引物对由OaGS3-DD-F和OaGS3-DD-R构成：

OaGS3-DD-F:5’-GCTGCCTTTCCATCATCATT-3’；

OaGS3-DD-R:5’-ATGTTGGGCCATGCATATTT-3’。

扩增产物电泳图见图3，选择基因组编辑材料，进行测序确定突变类型。部分结果见图4，OaGS3-CC和OaGS3-DD发生移码突变，导致蛋白序列改变，蛋白功能被破坏。含有基因编辑突变的转化苗即为T0代转基因四倍体野生稻(编号为T0-1、T0-2)。

2、OaGS3基因敲除的四倍体野生稻O.alta的表型

在中国科学院遗传与发育生物学研究所海南实验基地大田分别播种T0代T0-1株系、T0-2株系，正常农艺管理至成熟期收获籽粒，去掉顶端的芒后充分脱水，然后进行籽粒长度统计，保证至少3次生物学重复。

各株系的籽粒长度照片见图6，发现基因编辑株系T0-1株系、T0-2株系株系、籽粒长度均显著长于野生型。

因此，在四倍体野生稻Oryza alta中，可以通过编辑基因OaGS3，实现籽粒的快速驯化，使四倍体野生稻Oryza alta的籽粒变长，提升高秆四倍体野生稻增产潜力。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 抑制OaGS3基因表达的物质在调控四倍体野生稻籽粒长度中的应用

<130> GNCSY210457

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5926

<212> DNA

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 1

gcccactctc tcccctccat cattacttgc ccaaaaacgg caatcgatcc ccttggcctg 60

cttccatcca tccatgtgct cctcctccgc catttataat ccaccttact ccttatctcc 120

cagctccgtc ttccccgctg ctagctccaa ctgatcaaaa cagctagcta gctgctgcag 180

cgccggcccc tacctaccct accctactgc tcctactcat cgtcatcgtc ccggccccta 240

tatatagctg cacctctctc tctctctcca tatatactcc tctcgtttta gagtagcagt 300

agtagtagag ctcatcactt catctccatc ggagtgaata agtgatatgg caatggcggc 360

ggcggcggcg gcgccccggc ccaagtcgcc gccggcagcg cccgacccct gcggccgcca 420

ccgcctccag ctcgccgtcg acgcgctcca ccgcgagatc ggattcctcg aggtacaaat 480

atctatgtag tatatcagta ccattcatag ttcttgctac aaaaacaaaa caaaacaaaa 540

caaaaacatc tttcgtacaa atatctgtcg aatcatttgc ttctgcatgc atcactctca 600

ccttaagttt tccccagctt aaaaccactc cttttatctt catttttcct tttcttgaac 660

cgaactcatt tcatcttcat atactactct tagcatgcac cattttcttc tttcagtccc 720

ccaatactga tcctctcttc ccagccaaat cattaacacg aataagctta atcaaacaag 780

ttgatcaact gatgatcgaa tgaaacaaaa caaaaccgat cgaataggag tcaatgatac 840

cacctatagc tgaaaccacg aatgcatagc ttacctctac tcgatctgtt gactgttcaa 900

cactgcacta agacaccagt taataagccg attaattaaa ccattaaatg agcttaaccg 960

gcggctagct tcctcttcct ctgggcccgt gcggatcgta ccatcggttt gcgcgttcct 1020

ccacccaaac tctctgcctt gttattccct ttgtctacat gcatttgcat catcatcaca 1080

tcaccactac gtttcaattg gattttggtg gtctccaacc atatcatatt gctttttttt 1140

cttctctact acaatctcta gcggttttgt ggagtactaa agaaaacaac taactagcca 1200

gggtttgacg tctaatcaat tggtgatttt gttaatttca cctactattt tagactttac 1260

aggtcttcga gctatactac gatttatcga tgccatgcat caatcgatgc tggtccacgc 1320

tagtttctga gttatgacta gctcttttaa ttgggcttca cctacttaat taattaacca 1380

gtggctgcgt catttattga ccaacattgt catgttaccc caactgattt tttttataaa 1440

aaaactacca ccggatatat tattagttcg tgtatgtatc tgctcaagca gcgcatgcat 1500

atagtttttc gtgacacaaa atatgtactg tatgctcaaa agatctgttg ggattgtcat 1560

attcgccatt ataattaaaa tggtgatgcc cagctttttt tttctccaat aatttattgg 1620

cttaatttcc tgtgctgtta ggagtaaagc tattaattag caccattttt aaagcttcta 1680

aaatctaaat aaagtacgac actgcaacct tactgtatat gctgtgtttg ttcattagca 1740

gtggcagtac ttgctgtcta gctttaaatg ttttgggtgt taaaatatcc cccagacatc 1800

acctgaaaag ttgacaggct aaacacatgc tcatttccca cgtttactta aattaactcg 1860

aataaacaat tactccttct gtttcggaat ataaagaatt ttagataaat gtaacatatc 1920

ctactattac aaatctgaaa aaaaaacctg ttcaaattcg taatactagg atatcatatt 1980

tattcaaaat tcgttatatt ttgagatgta gggagtaata tttcttgcag ggtgaaataa 2040

attcaatcga agggatccac gctgcctcca gatgctgcag agagtaagat agccctgctg 2100

tttctttttg tacttcgatt tcttctcgtc tttagtaccc ttcccatgca ttcgcaaaat 2160

atacttacct cagtttttgg tcatggatag atgaccttcg accgttatct ttgtaagcat 2220

cttcaataaa aatagcttta aatgcagggt attaggtata tactttcaat tgcaaatgta 2280

atgtacagca tattgattct aaaaccttga caaatcaaag taaaaaaacc gaacatttga 2340

tttctggacg ttgggagttt ttttttcttt catcttttac aaatgagtac gttgtggaat 2400

catattgtgc aagcttttga gtctaattag gtatgagata ctatctacta gttgcttgag 2460

gtaaaacaaa atgtaattag gttacattta ctaaactgaa catttagtaa tgttttgtta 2520

aataacggta atttcaatgc atgcatgtcc tcccgtaaaa acagtgcaca gactgttcaa 2580

aaagtcattg cacaataact attcacatgg aactgtgaaa agtatatata ttggaacttt 2640

ctagatcctt ttgggaacat gggaaaagcc aagtcacgcg tggaatccct attccctgtg 2700

ttccttttga aaggatccag ttaagctaga actgaaaatt gtactactac tgagatgaaa 2760

ttactgcagg agcagaaagg ggggaaacct gtaaattaaa caagcctcaa aattcaacat 2820

cagcaaccga ctcatctagt gttcctgtgt tatgaaccag ccggcaacta tgcctctatg 2880

tagtgcattg aagcacctta acaatctatg gcggtcggtt ggaaacctca tataaatacc 2940

aaatttttta accggcatct cattagcaac actgatggag agaactaaag ttgtcggctt 3000

agaaaccaga caccttttag gtttcaaaaa taaaaaaaaa tactgactcg atgcatcgtc 3060

ttgaatctag ccgatgcttc gagcagcccc atcgccccga gaggacgact cccattctaa 3120

tatcatggac atggtaatac ataaatttac gaccagcaca tatgaaataa ccgaattaat 3180

tagttcagag tacttccact ttcgaatctt gtagaacttc tttcctttcg gaaacaaaag 3240

gggggaagaa ggaggtaaca acaaagggaa ccgagaacaa aataaatatg ccgatgtaca 3300

cgagcatgaa aatttaaaaa tctcacagga aaggagatca taaataaaga accaagaacc 3360

agctcactcg gtccagattc atgctcgtta gctagcttcc atgtagcaag aaggcacgca 3420

gccatcgcac atagtgtttg caatttcggc agccactaaa atttccgtgg ttgccgaaat 3480

tttgaaaaat tcatgaacgg tgttttctga ccttttttgt ttgaaatctt aacatatttt 3540

gactgaattt aaacaaattt cgaccaaatt cacaaatatt tgaaaaaaac caataatttc 3600

aggggggtgt ttgatcttgc cggtaggatc cgaaatttca aaccatgatc gcacgcttca 3660

ccgcttgtct gcatcgacgc agctactggc catgggaagc ctccccatgc aaccaagctt 3720

cactgagagg ccgcacccct accgaccgag gagaggtggc cgccgcggag aggagggccg 3780

tcgccatcgc gtcgccagtt agaggcaagc cgtcaccttg gcgtggccgc gtagaggagg 3840

gccgctgctg tcgtgtcgcg atcgtcatcg tcggcttggc ttggagaggt ggagagatgg 3900

aggaggagat aaggtgagag agatgagaga aaatattctg acggcttgtt tggcaacttg 3960

agggaagagg attgggagtt tagacgggaa aattgatggt gagatctgtc gatgggttat 4020

acctgcaaac cgtattcgga agatatcggg gtacgctggt actagggcct acacaatatc 4080

gtatcaagca ctcagagaca aatgtttata cgagttcaag ccctactcca gtttatatgg 4140

attatggatg gaacaccaca aggattacaa taggaaaaca taacaaccta tctaatttgc 4200

cgactaggat ccaccaagaa tggcccaacg agatctaatc gacgaatacg actgcggctt 4260

cctccgggtt gcttctcgct gtggttggtg gttaactccc tagggggcct tgtatttata 4320

ttgatcgctg cctttctctt caagtagaac tcaacaagac atatttggat acgagcctga 4380

ggagacctta tcttctttga ataggacttt aacaccttct gttccgagaa gataatttcc 4440

ttttatcctt gccgtatttt cttaattaaa ggtaccttcc cctatatttt taggtatatg 4500

gtattcgtat actccatgaa tctatgtatg gagatatgtt ttatccttta ccctgaaaag 4560

attaatctga gaatttgatt tttagtctca atctcttatt tgatagagat ggtgagaatt 4620

gatagagagt ttagttgaac attagatttt aaatgaaaat agaaggttga gatttgttta 4680

gacaaagtaa aggaggaatt ctctcttaat taccaccctc ttcccaggta ttagaaagaa 4740

gagagttcct cctgaatttc ctatccccat cccactacaa ctcccatatc tttcaaccaa 4800

acagaacatt taatagcctc atccctttaa acttttaatc cctttcaaaa actccctcca 4860

accaaacgga ccgcgaggag ataagagatg gatggtggag ataaggtcgc gctggtaagc 4920

ggggtccacg gtgatttttt tctccacccg tgttgctgct gcaattctat gtcggctaat 4980

aaaaaaatca gcatctatag tttctttatt tgtcccattg ttttaaaaaa ccgtacttat 5040

aataaatggt gtttttaata aaccagtacc tataaaatgt tataggtgtc ggtttttgat 5100

tttagattca tgtgaggagt cgagtaggcc agaaatagct tcatatttca tatatgcctg 5160

ttcaaggcat atatgaaggt gtccgttatt aggggttttg tagtaatgtt tgttggaatt 5220

aatcacttgt atattatgaa accgatggct ggcgaaactt tgtcaattgt gggcggtaag 5280

ctcacctaaa gcaaattgtt caaaacaagg ttaaagatga attttattaa tggattttgg 5340

tttggaaaaa ttttgtaggg ttgacgaatt catcggaaga actcccgaac cattcataac 5400

gatgtatgaa ttttcaggtc gagaatttgt ctttaacttg gcacaactgt tactttttct 5460

tattaattct ctgtttacaa gcagttcatc cgagaagcga agtcatgatc attctcacca 5520

cttttggaag aagtttcggt acttacttga ttcccggatc ttaatgtacg tatgcatctg 5580

cactgcgcta attattattt acaaaactga actatttaat aaacactaca aaatatttaa 5640

cttgcaaagt acatatttaa tcagggattt agtaaaccca ttccaatcta atgtcaccat 5700

atctgcatgc acggtccaca tggatgctgg tgtattaatt tctttttgtg ctagaatgga 5760

cgttttattt tcaattgtcg ttagtataca cctttacgca tcatctctct cctgcgcatt 5820

tgagaaaact tcttcctttg atgatagacg tggtcttatt cttcagtttg atttagtttc 5880

agatagaata aatattgttt attacttagt ttctctcctt cagtaa 5926

<210> 2

<211> 6193

<212> DNA

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 2

acggctctga tccccgcggc gcagcggatc tagtccggat gggcagacga gacgagacga 60

gatgagatag atactagatc cgtccccgac aatctttcaa gccccgtggc cgtccctcct 120

ctgctcgatg tgccacgcct ctcagccttg ctgcctttcc atcatcatta ttcattcacg 180

cccaaagccc aaagcaattc acctctctct ctcgcacgaa tcgatagata cctgtaattt 240

cccccccgga aaagaaaaga gcggccattt ttctctcccc tccatcatta cttgcccaaa 300

aacggcaatc cctcctcccc catcgcctgc ttccatccat gtgcctccac cacctccgtc 360

ttccctccga ctgatcaaag cagctgctat cgctgctgca gcgccggcca tgcccgccct 420

ctagccccta cctaccctac cctaccctac tcggctactc ctactcctat atataccgtc 480

ctctctctct ctctctctct tgcgatatat ttcaagactc cagcgcgctc tccatcggag 540

tgatggcaat ggcggcggcg ccccggccca agtcgccgcc ggcagcgccc gacccctgcg 600

gccgccaccg cctccagctc gccgtcgacg cgctccaccg cgagatcgga ttcctcgagg 660

tacaacaata tccaatgtct tatcattccc tactccttct cttgcttcaa aaaaacatgt 720

cgtccatacc tcatattcat acacgtacgc tttttgctat cgctctctcc atgttttccc 780

aaccttaaaa accatcatgc atcatttgct tcttccgttc gacaaatcat ttgattagag 840

aagtttaaaa cattggaaca acaaatatgc atggcccaac attgctcctc tcgatctctt 900

ccctcagcca aattaacacg aacaaactta accaaacaag ttcaaccaac gatcggatag 960

gagtcaacca gcgctagcta gctgatgaac tagctagcaa gtccgttgac tgttcaacac 1020

taattaaggc accagttaat aagccgatta attaaacaat tatatgagct taacgggcgg 1080

ctagcttcgt cctctgggtc cgtgcggatc gtaccatcgg tttgcgcgtt cctccaccaa 1140

aactctctgc cttgttattc cctttgccta ggagcacata catttgcatg catcatcatc 1200

acatcaccag ttttaattgg attttaattt ggcggtctcc aaccatatca tattggtttt 1260

gttctctata ctagagtact ataatctcta gcggttttgt ggaactaaga aattataatt 1320

agccagggtt tgttaaccaa ttggtggttt agtttgttaa ttttagctag tactaggatt 1380

ttagacttag aggtcttcga gctactacta cgatatattg atgccatgca tcaatcgatg 1440

ctggtccatg ctagtttctg actagccctc ttaattgggc ttgacctact taattaatta 1500

accagtggct gcgtcactca ttgaccaaca ttgtcatgtt acccggactg atattttttt 1560

tataaaaaaa actaccaccg gtcgatatat tattagttag tgtatatatc tgctcaagca 1620

gcgcatgcac atggattttc gtcaaacaaa atatgtactg tatgctcaat gcatctgtgg 1680

gacgattgtc atattcgcct ttataattaa aatggtggtg cccagttgtt ttttttctcc 1740

aataatttat tgacttaaat ttcctgttct gttaggagta aaactattaa ttagcaccat 1800

tttaaaagtt tctaaaatct taataaagta tatgacactg caaccttact gtatatatat 1860

gttgtgtttg ttcattagca gtggcagtac ttgctgtcta actttaaatg ttttgggcgt 1920

taaaatatcc cccagacatc acctgaaaag ttgacaggct aaacacatgc ccatctccct 1980

cgtttactta aattaattcg aacaaacaac tatttcttgc agggtgaaat aaattcaatc 2040

gaagggatcc acgctgcctc cagatgctgc agagagtaag ttagccctgc tgtttctttt 2100

tgtacttcca tttcttctcg tctttaaact atccgcgacg ctacttactc taaattccta 2160

ctctaaagga atattccatg cctggtcagt gagattcctt actctatatc aaatcttccg 2220

cgctcgtgtt tactctatat cttcctctat aattttttaa ctatattttg aaaagtctat 2280

tttacctcct ccatcccccc aataaaaccc cgcactccta ctgcatcagc ggctcccccc 2340

cccgtcggtt gctccgccac cgccgatccc cctcccccgt gcccgaatcc ccccgccgca 2400

gccgtcgccg aatcccccct cccccagccg catcgcccct ccgccagccg catcggctcc 2460

tcccccgccg cccccgtcgc ccggcgtccc tctccctgcc gcggcttcgt cccgcatcag 2520

ctcctccccc ccgcctgtcg gccttcaccg cgccaacccg catcggctcg gaggcgcgga 2580

ggcggaggag ccgatggggc ggcgcgccgg ggcatcggcg gaggaagggc gtcgtggcgg 2640

atccgccgag ggagagcgct ctccgccgcg ccctccgccg agctctccgc ctcgctcgcc 2700

ctctccgcct cgcttgccct tccgctgtcg ctcgccgctg ctcctgcttc gttcccctcc 2760

tccccttctt ccgtccgtgc gcgggaggga cggacagttg gccgtcgccc gcgcgcgcgg 2820

cctatacagg ctgctacagt gctccgctac ggatagcgga gcactgtagc ccctggacga 2880

tacaggcgcc tttagcggat ggcgctgcag ccgcgccgtc cgctaccgcg gatagatcgc 2940

ggacggcgct gcggatagtc ttagtactct taccatgcat tcacaaaata tacttacctc 3000

ggttgatcat ggatagataa actttgaccg ttatcttttt aagcaacttc aataaaaata 3060

ggtttaaatg cagggtatta ggtatatatt ttcaattgca aatgtaacat acagcattga 3120

ttctaaaaca ttggcaaatc aaagtaaaaa actgaacatt tgatttaatt ctgaacgttg 3180

ggagtatttt ttttcatcat ttacaaatga gtacgttgtg gaattatatt gtgcaagctt 3240

ttgagactaa ttaggttata tgagatacta tctaccaagg ttgtcagtgt cttatgatac 3300

caggatccta ttaaagcgaa acgatattaa tcccatctag tatctaatta tcatagtatc 3360

tcatcttact atttatttcc atatgatcct acgaaatctt aggtagtatc ccgattctac 3420

gatccctctg atcctataaa atattattta aaataaggtg gattgaaaat aatatgaata 3480

aatatactca agtttacata aaaccaatta aatttatcaa aatcaatatt atatgcttta 3540

atttgtacaa catattatat attttatata aaaatgtata ctttctaaaa tctgttagta 3600

ttccgatcct atgatactac caataaaaaa cgattctacc tggtatctcc atatgctatc 3660

tattagttgc ttgaggtaaa acaaaatgta gttaggttac atttactaaa ctgaacattt 3720

agtaatgttt tgttaaataa cggtaatttc aatgcatgca tgtcctcccg taaaaacagt 3780

gcagagactg ttcaaaaagt cattgcacaa taactattca catggaactg tgaaaagtat 3840

atattggaac ttactagatc cttttgggaa catgggaaaa gccaaagtca cgtgtggaat 3900

ccctattccc tgtgttcttt ttgaaaggat ccagttatgg cccgtttagt tcgcgaaatt 3960

tttttcaaaa acatcacatc aaacgtttga ccgaatgtcg ggaggggttt tcggacacga 4020

atgaaaaaac taatttcacg gttagcctgt aaaccacgag acgaattttt ttgagcctaa 4080

ttaagccgtc aacatgtagg ttactgtagc acttacggct aattatggcg taattatgac 4140

aaaattaggc tcaaaagatt cgtctcgtcg tttacaatcc aactgtgcaa ttagtttctt 4200

tttttatcta tatttaatgc ttcatgcatg agtccaaaag tttgatgtga tgtttttggg 4260

gttttcgttt tgggaactaa acaaggcctt agctagaaga gtggaaattg tactactact 4320

gagatgaaat tacagcagga gcagaaaggg ggacaaactg aaaattaaac aagcctcaaa 4380

attcaacatc agcaaccgac tcatctagtg ttcctgtgtt atgaaccagc cggcaactat 4440

gcctctatgt agcgcattga agcaccttaa ctaagggcta tcaaggctgt gttaaactgt 4500

taatggtaca tatgcctttc agtttctgtc tgtactttag gttgctatac atcctatgaa 4560

catgttttct tgtctttctt cttacctcgg ttgaaaaacc catacaaata tcatttttta 4620

actgactact cactaaataa aaagaatcaa atgtgccgat ttaagaactg atgcctttaa 4680

aattttaata ataagaagaa aaataccagt tcgatgcatc gtctcgaatc gaccgaatcg 4740

aaccgatgct tcaaccggcc cccatccctc gagaggacga ctcccattct agaaacatgg 4800

acatggtaac acagaaattt tcgaccagca catatgaaat aaccgaatca attagttcag 4860

aatccttcca ctttcgaatc ttgtagaact tctatccttt cggaaacaag agggggaagg 4920

aggaggcaac aacaaagtat gggaactgag aacaaaataa atatgccgat gtacacaagc 4980

atgaaaagtt aaagatctca aaggaaagga gatcataaat caagaaccaa gaaccagctc 5040

actcggtcca gttcatgctc gttagctagc ttccatgtag caagaaggca cgcagccatc 5100

gcacatagtg tttgtaattt cggtagccac cgaaatttcg gtggttaccg aaattttgaa 5160

aaaaatcatg aatttcggtg ttttctgact gatttttttt tcaattttaa ctgagtttga 5220

acaaatttgg atcaaattca caaatatttg aaaaaatcca aaaaatttgg ggagatttga 5280

tcgtgccgat agggtccgaa atttcaaacc atgatcgcac acttcaccgc ttgtctgcat 5340

cgacgctggc cgtgggaagc ttccccgtgc aaccaagctt caccgagcgg ccgcacccct 5400

gccgatcgaa ggagaggtgg ccgccgtgga gaggagggcc gctgccgtcg cgtcgccggg 5460

tagaggcaag ccttcacctt ggcgtggccg cagacaggag ggccgctgct gtcgcgtaac 5520

ggccgtcgtc gccggcttgg cttggagagg tggagagaga tggaggagga gatgaggtta 5580

gagagagaga ggagaaagag gtaagaaaat atccagagga gataagagat gcatggtgga 5640

gataacgtcg cgctgggcaa gcgtggtcca cactgatttt ttccccgccc gtgtcgctgc 5700

tgcaattctg tgctggctaa taaaaaaaat cagataccta taaaatgtta tagatgtcgg 5760

tttttaattt taaactcatg tgagtagtcg ggtggataaa aaatggtctc gtctgccagt 5820

tgaatatgca tatataaaga cgtccactat tagggtttta tagtagttag ttagaattaa 5880

ttagttgcat attaaccaga aggctggcga aactttgtca attgtgggcg ctaatctcac 5940

ctgaagcaaa ttgttcaaaa caaggttaaa gatgattttt attaatgaat tttggcttgg 6000

aaaaattttg tagggttgac gaattcatcg gaagaactcc cgatccattc ataacgatgt 6060

atggattttc aggtcgagaa tttgtctttt aacttggcac aaccgtactt tttcttatta 6120

attctctgtt tacaagcagt tcatcggaga agcgaagtca tgatcattct caccacttat 6180

tgaagaagtt tcg 6193

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 3

atggcaatgg cggcggcggc ggcggcgccc cggcccaagt cgccgccggc agcgcccgac 60

ccctgcggcc gccaccgcct ccagctcgcc gtcgacgcgc tccaccgcga gatcggattc 120

ctcgagggtg aaataaattc aatcgaaggg atccacgctg cctccagatg ctgcagagag 180

gttgacgaat tcatcggaag aactcccgaa ccattcataa cgatttcatc cgagaagcga 240

agtcatgatc attctcacca cttttggaag aagtttcggt acttacttga ttcccggatc 300

ttaatgtacg tatgcatctg cactgcgcta attattattt acaaaactga actatttaat 360

aaacactaca aaatatttaa cttgcaaagt acatatttaa tcagggattt agtaaaccca 420

ttccaatcta atgtcaccat atctgcatgc acggtccaca tggatgctgg tgtattaatt 480

tctttttgtg ctagaatgga cgttttattt tcaattgtcg ttagtataca cctttacgca 540

tcatctctct cctgcgcatt tgagaaaact tcttcctttg atgatagacg tggtcttatt 600

cttcagtttg atttagtttc agatagaata aatattgttt attacttagt ttctctcctt 660

cagtaa 666

<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 4

atggcggcgg cgccccggcc caagtcgccg ccggcagcgc ccgacccctg cggccgccac 60

cgcctccagc tcgccgtcga cgcgctccac cgcgagatcg gattcctcga gggtgaaata 120

aattcaatcg aagggatcca cgctgcctcc agatgctgca gagaggttga cgaattcatc 180

ggaagaactc ccgatccatt cataacgatt tcatcggaga agcgaagtca tgatcattct 240

caccacttat tgaagaagtt tcggtactta cttgattccc ggatcttaat gtacatatgc 300

atctgcactg tgctaattgg tgtgcattat atggtcgtaa gtcctagtta cttattattt 360

acaaaactga actaataaac actacaaaat atttaacttg caaagtatcc aatctaatgt 420

cactatatct gcatgcatgg tccacatgga cgctggtgta ttattttttt tgtgctagta 480

tggacgtttt attttcaatt gtcgcttagt atacaccgtt acgcatcata tctctcctgc 540

gcatttgaga aaacttcttc ctttgatgat agacgtgggc ttattcttca gtttgattta 600

gtttcagata gaataaatat tgtttaatac ttagtttctc tccttcagta a 651

<210> 5

<211> 221

<212> PRT

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 5

Met Ala Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ala Ala Pro Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp

20 25 30

Ala Leu His Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile

35 40 45

Glu Gly Ile His Ala Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe

50 55 60

Ile Gly Arg Thr Pro Glu Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg

65 70 75 80

Ser His Asp His Ser His His Phe Trp Lys Lys Phe Arg Tyr Leu Leu

85 90 95

Asp Ser Arg Ile Leu Met Tyr Val Cys Ile Cys Thr Ala Leu Ile Ile

100 105 110

Ile Tyr Lys Thr Glu Leu Phe Asn Lys His Tyr Lys Ile Phe Asn Leu

115 120 125

Gln Ser Thr Tyr Leu Ile Arg Asp Leu Val Asn Pro Phe Gln Ser Asn

130 135 140

Val Thr Ile Ser Ala Cys Thr Val His Met Asp Ala Gly Val Leu Ile

145 150 155 160

Ser Phe Cys Ala Arg Met Asp Val Leu Phe Ser Ile Val Val Ser Ile

165 170 175

His Leu Tyr Ala Ser Ser Leu Ser Cys Ala Phe Glu Lys Thr Ser Ser

180 185 190

Phe Asp Asp Arg Arg Gly Leu Ile Leu Gln Phe Asp Leu Val Ser Asp

195 200 205

Arg Ile Asn Ile Val Tyr Tyr Leu Val Ser Leu Leu Gln

210 215 220

<210> 6

<211> 211

<212> PRT

<213> 野生稻(Oryza alta)

<400> 6

Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Ala Pro Asp Pro

1 5 10 15

Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His Arg Glu

20 25 30

Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile His Ala

35 40 45

Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe Ile Gly Arg Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg Ser His Asp His Ser

65 70 75 80

His His Leu Leu Lys Lys Phe Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Arg Ile Leu

85 90 95

Met Tyr Ile Cys Ile Cys Thr Val Leu Ile Gly Val His Tyr Met Val

100 105 110

Val Ser Pro Ser Tyr Leu Leu Phe Thr Lys Leu Asn Thr Leu Gln Asn

115 120 125

Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Ile Cys His Tyr Ile Cys Met His Gly Pro

130 135 140

His Gly Arg Trp Cys Ile Ile Phe Phe Val Leu Val Trp Thr Phe Tyr

145 150 155 160

Phe Gln Leu Ser Leu Ser Ile His Arg Tyr Ala Ser Tyr Leu Ser Cys

165 170 175

Ala Phe Glu Lys Thr Ser Ser Phe Asp Asp Arg Arg Gly Leu Ile Leu

180 185 190

Gln Phe Asp Leu Val Ser Asp Arg Ile Asn Ile Val Tyr Leu Val Ser

195 200 205

Leu Leu Gln

210

Claims (7)

1.OaGS3基因在增加四倍体野生稻籽粒长度中的应用，其特征在于，所述OaGS3基因编码OaGS3蛋白，所述OaGS3蛋白是如下A1或A2的蛋白质：

A1、氨基酸序列是序列表中序列5和序列6所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、在A1）的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OaGS3基因具体为如下E1或E2所示的基因：

E1、编码链的编码序列是序列表中序列3和序列4所示的DNA分子；

E2、核苷酸序列是序列表中序列1和序列2所示的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用通过对四倍体野生稻中OaGS3基因进行基因组定点编辑实现，所述基因组定点编辑通过CRISPR/Cas9***实现，所述CRISPR/Cas9***，其的靶序列为位于OaGS3基因中任一包括XXXNGG的核苷酸序列上的XXX序列；其中，XXX为所述的DNA分子序列中任意19-20 bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的靶序列为序列表中序列1第392位-第411位所示的序列。

5.根据权利要求3-4任一所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9***包括如下1）或2）：

1）sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；

2）表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

6.选育籽粒长度增长的四倍体野生稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：抑制受体四倍体野生稻中权利要求1所述OaGS3基因的表达，得到籽粒长度长于所述受体四倍体野生稻的目的四倍体野生稻。

7.CRISPR/Cas9***，其特征在于，所述CRISPR/Cas9***包括如下1）或2）：

1）sgRNA，所述sgRNA靶点为序列1第392位-第411位或序列2中第579位-第598位所示的序列；

2）表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

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