CN113728911A - 一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系 - Google Patents

一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系 Download PDF

Info

Publication number
CN113728911A
CN113728911A CN202110271745.1A CN202110271745A CN113728911A CN 113728911 A CN113728911 A CN 113728911A CN 202110271745 A CN202110271745 A CN 202110271745A CN 113728911 A CN113728911 A CN 113728911A
Authority
CN
China
Prior art keywords
line
temperature
rice
indica
htrms1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110271745.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113728911B (zh
Inventor
陈乐天
刘耀光
李构思
张雅玲
谢勇尧
张嘉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202110271745.1A priority Critical patent/CN113728911B/zh
Publication of CN113728911A publication Critical patent/CN113728911A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113728911B publication Critical patent/CN113728911B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型高温可逆不育水稻材料和高温可逆不育系的培育方法，以及基于此不育系创建的新型两系杂交稻制种体系及其应用。方案包括：(1)利用粳稻品种台中65(T65)与携带第1染色体籼型片段的导入系E4杂交，在其杂交后代选出籼粳重组体，其中携带籼粳重组型复合遗传位点htrms1的新种质T65rS表现为反向高温敏感雄性不育；(2)以T65rS为htrms1供体，与其它优良水稻品种(系)杂交和回交，选育新的高温可逆不育系；(3)选育携带籼型恢复位点HTRMS1的恢复系；(4)高温可逆不育系在高温条件下(孕穗期日平均温度32～35℃)可自交繁种；在中低温条件下(日平均温度25～31℃)，高温可逆不育系表现雄性不育，可与恢复系杂交制种产生杂种F1。所得杂种F1可用于生产。本发明丰富了两系杂交育种材料，降低制种风险，扩大两系杂交稻应用范围。

Description

一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，涉及一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系。更具体地，涉及一种新型水稻高温可逆不育系的选育方法，以及基于此不育系创制的新型两系杂交稻制种体系及其应用。
背景技术
杂交育种是杂种优势利用和提高作物单产量的重要途径。杂交稻的创制是杂交育种的成功范例之一，目前其生产面积占我国水稻总生产面积的57％，产量占全国总产量的65％，单位面积产量比常规稻增加10％～30％(Yuan,2014；Bai et al.,2018)。杂交稻生产主要通过三系(细胞质雄性不育系，保持系，恢复系)和两系(温敏不育系，恢复系)杂交***。其中两系杂交稻具有生产流程简单、配组自由等优势，目前的产量比三系杂交稻高5～10％，故其应用范围逐步扩大，现已超过杂交稻种植面积的1/3(Huang et al.,2014；Kimand Zhang,2018)。
目前生产上利用的两系杂交育种主要基于温敏雄性不育系。通常，温敏雄性不育系在孕穗期(花药减数***期为温度最敏感期)高温时，呈现雄性不育，可与对应恢复系杂交制种；在低温时，其育性恢复并自交结实，实现一系两用的目的。育性转换临界温度(日平均温度)是温敏雄性不育系选育的关键技术指标。目前使用的温敏雄性不育系的育性转换临界温度为23～24℃(袁隆平，1992；牟同敏，2016)，主要由隐性突变遗传位点tms5控制，不育基因来源单一，遗传脆性风险高。现有的两系制种体系，杂交制种主要在南方稻区的夏季。在生产实践中孕穗期若遇到多日阴雨、气温下降，会导致不育系育性部分恢复，杂交制种纯度下降而失败(Chen et al.,2011；Huang et al.,2014；Xie et al.,2019)。
目前为止也报道了少数水稻反向温敏不育材料如“雁农S”(原名go543S)，表现为低温条件下花粉不育，而高温条件下花粉可育，但它们的育性转换温度都在27-28℃左右，即孕穗期日平均温度等于和低于27℃时雄性不育，高于27℃转为可育(阳花秋，1996；罗越华等，2008；高扬，2017)。由于在水稻种植区的生长季节(双季稻区的早季和晚季、单季稻区的中季)的孕穗期日平均温度都包含27℃左右的范围，即杂交制种的不育系难以避免处于28～29℃的可育温度而自交结实，杂交制种的风险极高，因而没有生产应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有两系杂交稻生产局限性和遗传脆性风险的缺陷和不足，提供一种基于反向高温敏感雄性不育材料创制新型的高温可逆不育系及其两系杂交稻制种体系的方法和应用。所述高温可逆不育系与常规温敏不育系的温敏育性特性相反，表现为高温可育，中低温不育，其育性转换温度比现有反温敏雄性不育水稻的转育温度高4～5℃。因此制种安全性高，也扩宽了适合地域，从而突破现有两系制种技术瓶颈，与常规温敏不育系互补应用，丰富两系杂交育种种质并扩大其应用范围。
本发明的目的之一是提供一种具有反向高温敏感雄性不育特性的水稻新种质T65rS的选育方法。
本发明另一目的是提供一种新型水稻高温可逆不育系的选育方法。
本发明再一目的是提供基于上述高温可逆不育系构建的新型两系杂交稻制种体系。
本发明再一目的是提供所述两系杂交稻制种体系在杂交水稻育种方面的应用。
本发明再一目的是提供一种基于所述两系杂交稻制种体系的杂交水稻育种方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明是在进行籼稻和粳稻的杂种育性研究中，发现了一个粳稻品系T65背景材料T65rS表现反向高温敏感雄性不育特性，以此培育出高温可逆不育系，并鉴定出其隐性遗传座位，命名为htrms1(high temperature reversible male sterility1)。T65rS具有较高的转育温度(31～32℃)，即孕穗期的日平均温度低于31℃(25～31℃)时表现为雄性不育，而在日平均温度为32～35℃时恢复花粉育性。利用T65rS转移htrms1可培育新的高温可逆不育系。而携带显性的籼型HTRMS1位点的品系可作为恢复系。利用此高温可逆不育系和恢复系，在华南和华中双季稻区晚季，或高海拔稻区(如云南贵州地区)，或高纬度稻区(如东北稻区)的单季稻(中季)，或海南冬春季等条件可以进行杂交制种。根据历史天气资料，所述地区季节的水稻孕穗期的日平均温度均低于31℃，能达到安全制种的目的。而在华南和华中稻区的中稻季节，其孕穗期(8月份)处于较高温度条件(日平均温度高于32℃)，高温可逆不育系的花粉育性恢复，可自交繁殖。
本发明技术方案(高温可逆不育系的选育方法及基于所述不育系的新型两系杂交稻制种体系)涉及：(1)高温可逆不育系的选育；(2)恢复系的选育；(3)高温可逆不育系的繁种；(4)高温可逆不育系和恢复系的杂交制种。
具体地，基于研究结果，本发明要求保护如下技术方案：
首先提供一种具有反向高温敏感雄性不育特性的水稻新种质T65rS的选育方法：利用粳稻品种台中65(粳稻T65)和其携带第1染色体籼型片段的导入系(近等基因系)E4(T65背景)杂交，构建杂交分离群体，在该群体中筛选籼粳重组体，筛选得到具有反向高温敏感雄性不育特性的重组体T65rS，其表现为孕穗期处于32℃或以上温度时花粉可育或部分可育结实，但在31℃或以下温度时花粉完全败育、不结实。
所得T65rS具有SEQ ID NO.1所示的籼粳重组型遗传位点htrms1，其表现为在孕穗期的日平均温度为25～31℃时(优选地26～30℃)，其花粉完全败育，不结实；在孕穗期的日平均温度为32～35℃(优选地33～35℃)，其花粉育性恢复，能自交结实。
所述htrms1是籼粳重组型复合位点，具有SEQ ID NO.1所示基因组序列，其含有3个相邻的具有籼粳遗传分化的基因，即由基因号为LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680的籼型等位基因和LOC_Os01g39690的粳型等位基因构成，其中粳型LOC_Os01g39690对反向高温敏感雄性不育起关键作用，其编码蛋白如SEQ ID NO.3所示。
另外提供一种新型水稻高温可逆不育系的选育方法，以上述水稻新种质T65rS或其衍生高温可逆不育系为供体亲本，经过杂交、回交及筛选将htrms1位点导入符合育种目标的水稻品种(系)，育成新型高温可逆不育系；优选地，在回交过程中利用htrms1区间的分子标记组合辅助选育高温可逆不育系。
优选地，作为一种优选方案，所述新型水稻高温可逆不育系的选育方法如下：
将T65rS与符合育种目标的水稻品种(系)(可以是现有三系杂交稻的保持系，如籼型三系杂交稻的保持系协青早B(XieB))杂交和多代回交，获得高世代回交系，每一代获得的杂种及其自交后代中使用分子标记(表1所示，优选使用M1、M5、M8组合)筛选携带htrms1位点的个体，最终获得的高世代自交htrms1位点纯合个体即为候选高温可逆不育材料。将以上获得的候选高温可逆不育材料在不同温度环境下种植，调查其花粉育性和结实率，挑选具备稳定的反向高温敏感雄性不育特性的株系作为新型高温可逆不育系；所述衍生高温可逆不育系又可作为htrms1供体亲本以杂交和回交培育其它高温可逆不育系。
更具体优选地，所述新型水稻高温可逆不育系的选育方法包括如下步骤：
(1)以籼型三系杂交稻的保持系协青早B(XieB；吴让祥，1986)作为轮回父本，与T65rS进行杂交和回交，每一代获得的杂种使用分子标记筛选携带htrms1位点的个体，再与轮回父本进行多代回交获得BC5F1；
(2)选择农艺性状与XieB一致的BC5F1植株经过自交获得BC5F2，使用分子标记筛选携带纯合htrms1位点的BC5F2植株，在日平均气温33～35℃条件下种植(如在广州中季(夏季)种植，即8月中旬水稻处于减数***期，此时期日平均气温33～35℃，花粉可育)，获得BC5F3种子；
(3)将BC5F3分别种植于广州中季(夏季)、广州晚季(9月中下旬减数***期，此时期日平均气温低于30℃)和海南陵水的冬春季(2月下旬减数***期，此时期日平均气温约25～28℃)；
选择在中低温季节(广州晚季、海南陵水冬春季)时花粉稳定不育，而在高温季节(广州中季)时花粉育性及结实率均明显恢复的株系，作为新的高温可逆不育系XieS。
所得高温可逆不育系的自交繁种方法：在孕穗期处于高温(日平均温度32～35℃，优选33～35℃)条件下种植，高温可逆不育系育性恢复，自交繁殖得种子。
另外基于上述高温可逆不育系提供了一种新型两系杂交稻制种体系，包括所述水稻高温可逆不育系和恢复系。
所述恢复系的选育方法：利用分子标记筛选含有SEQ ID NO.2所示的特异恢复位点HTRMS1的籼稻品种(系)作为恢复系；或以携带HTRMS1的籼稻品种(系)作为供体亲本，通过杂交、回交及筛选将HTRMS1导入不携带该恢复位点的水稻品种(系)育成新恢复系。
优选地，所述恢复系的选育方法：在符合育种目标的水稻品种(系)(可以是现有三系杂交稻或两系杂交稻的恢复系，如航恢1173(R1173))中以htrms1区间的分子标记(表1所示，优选使用fM2、fM4、fM7组合)或基因组测序筛选含有SEQ ID NO.2所示的特异恢复位点HTRMS1的品种(系)作为恢复系；或以携带HTRMS1的品种(系)作为供体亲本，通过杂交、连续回交并利用所述分子标记进行筛选将该位点导入符合育种目标的水稻品种(系)育成新恢复系。
所述特异恢复位点HTRMS1是来源于籼稻的复合位点，具有SEQ ID NO.2所示基因组序列，由LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680和LOC_Os01g39690的籼型等位基因构成；其中籼型LOC_Os01g39690在htrms1/HTRMS1杂种中具有恢复花粉育性的功能，其编码蛋白如SEQID NO.4所示。
所述符合育种目标的水稻品种可选自三系杂交稻的保持系和恢复系、两系杂交稻的恢复系、常规水稻品种或其他来源的育性正常水稻品种，应具备异交率高、配合力好、抗逆性强、株形理想等一种以上优良性状。
上述两系杂交稻制种体系在杂交水稻育种方面的应用，也应在本发明保护范围之内。
最后提供了一种利用上述两系杂交稻制种体系进行杂交水稻育种的方法：在孕穗期处于中低温(日平均温度25～30℃，优选26～30℃)条件下将高温可逆不育系与恢复系进行杂交制种，生产得到杂种F1种子。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种利用水稻新种质T65rS选育高温可逆不育系的方法，还创建了基于所述高温可逆不育系的新型两系杂交稻制种体系。本发明提供的高温可逆不育系与常规温敏不育系的温敏育性特性相反，表现为高温可育，中低温不育，其育性转换温度为31～32℃(日平均温度)，比报道的反温敏雄性不育水稻的转育温度(27℃)高4～5℃。因此制种安全性高，适合在双季节稻区的晚季，或云南贵州地区单季中稻，或海南地区冬春季稻(孕穗期在2月下旬至3月上旬)，或高纬度稻区(东北稻区)的单季中稻。根据历史气象资料，所述地区水稻季的孕穗期的日均温度均低于31℃，可开展安全杂交制种；而在大部分稻区的夏季中季稻的孕穗期(8月份)的日平均气温高于32℃，可进行自交繁种。从而突破现有两系制种技术瓶颈，与常规温敏不育系互补应用，丰富两系杂交育种种质并扩大其应用范围。
综上，本发明发掘了与常规温敏雄性不育系育性的转换特征相反，而又与其它反向温敏不育材料相比具有高转育温度的反向高温敏感雄性不育新材料，用于培育实用型高温可逆不育系、建立新型两系杂交稻制种体系，将有助于扩大两系杂交稻应用范围，提高杂交制种的安全性，为保障粮食安全提供新的种质资源与技术支撑。
附图说明
图1为反向高温敏感雄性不育新种质T65rS的表型观察；其中图1A～1B是粳稻亲本T65和T65rS在高温(日平均温度32～35℃)下的株型和花粉；图1C～1D是T65和T65rS在中低温(日平均温度<31℃)下的株型和花粉；图1A，1C中标尺为25cm，图1B，1D中标尺为50μm。
图2为T65rS的育性转换条件测定；其中图2A是在日照长度固定时(11.5～12.5h)，以人工气候室不同温度梯度处理后的T65rS的花粉育性；图2B是在温度为30℃时，不同日照长度(11.5h，14h)处理后T65rS的花粉育性；花粉图中标尺为50μm。
图3为T65rS的基因型构成鉴定；其中图3A是亲本E4、T65，E4与T65杂交后代选出的重组体T65rS、T65r-1～3，以及T65rS与E4或T65r-1杂交的杂种一代(F1)等材料，在孕穗期经历中低温(25～31℃)和高温(32～35℃)的育性表型。双横线表示此区间染色体的籼、粳基因型，虚竖线表示分子标记的位置，其中fM2，fM4，fM7为在籼型和粳型基因编码区的功能型单核苷酸多态(导致编码蛋白的功能性氨基酸变异)标记(表1)；M1，M5，M6和M8为长度多态分子标记(表1)。这些重组体的基因型和表型遗传分析表明，T65rS的htrms1为2个籼型等位基因(LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680)和1个粳型等位基因(LOC_Os01g39690)构成的重组型复合位点(单倍型，如SEQ ID NO.1所示)，遗传表现为隐性的反向高温敏感雄性不育特性；其它的重组体不具备T65rS的htrms1那样的基因型组合(单倍型)，因而不表现反向高温敏感雄性不育。E4和T65r-1携带此3基因都为籼型的HTRMS1(SEQ ID NO.2)，它们与T56S杂交的F1中能在中低温下恢复花粉育性。图3B是用分子标记M1，M5，M8对E4、T65、T65rS及T65rS×E4的杂种F1的分子标记鉴定结果。
图4为LOC_Os01g39690基因结构及其功能验证示意图。图4A的剪刀图形表示CRISPR/Cas9基因编辑位点，星号表示E4和T65间等位基因的差异碱基位点，其中2个产生所示的氨基酸变异；图4B是基因编辑产生的功能敲除突变纯合体的测序结果，灰色背景处显示***了1个A碱基；图4C是T65rS、其LOC_Os01g39690敲除体和向T65rS导入籼型LOC_Os01g39690(克隆自E4)的纯合转化体，在孕穗期处于不同温度下的花粉育性；其中敲除体在不同温度下均表现花粉不育，籼型基因转化体在不同温度下花粉育性正常。图中标尺为50μm。
图5为利用T65rS新种质选育新的高温可逆不育系并创建新型两系杂交稻制种体系；其中图5A是新的高温可逆不育系协S(XieS)和恢复系的选育策略：将T65rS与籼稻品种协青早B(XieB)为轮回亲本杂交和回交，每一代的杂种F1使用分子标记M1、M5、M8筛选携带htrms1位点的植株与XieB进行下一轮回交获得高世代回交系；在高温中季使其自交，纯合后代即为高温可逆不育系XieS。从现有籼稻品种(系)中使用功能型分子标记fM2、fM4、fM7筛选出携带HTRMS1位点的籼稻品系R1173作为配套的恢复系。XieS和R1173杂交配组获得杂交种。图5B是T65rS、XieB及XieS的植株形态，图中标尺为25cm；图5C～5D是XieS在孕穗期处于不同温度的自然条件下的小穗和花粉，图5C、5D中标尺分别为4cm、50μm；图5E～5G是XieS与恢复系R1173杂交F1个体与双亲的植株形态、小穗及种子，标尺分别为25cm、4cm和1cm；图5H～5K是杂交F1与双亲在田间同一环境中种植，在灌浆期对分蘖数进行调查，待种子黄熟后对结实率、株粒数和千粒重进行调查。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。若无特殊说明，下述实施例中所用试剂和材料均为市购，使用的水稻品种均为育种领域中的常规品种，使用的实验方法均为本技术领域已有的常规技术。
实施例1水稻反向高温敏感雄性不育新种质T65rS的构建及关联基因的鉴定和功能分析
1、具有反向高温敏感雄性不育特性的新种质T65rS的构建
本发明利用粳稻T65和其携带第1染色体籼型片段的导入系(近等基因系)E4(T65背景)构建了杂交分离群体。在该群体中获得了一个具有反向高温敏感雄性不育特性的重组体T65rS，表现为孕穗期处于高温下花粉可育或部分可育结实(图1A～1B)，但在中低温下T65rS的花粉完全败育，不结实(图1C～1D)。
本发明利用人工气候箱设定单一环境变量，从试验田中挑选同一孕穗发育时期(小孢子母细胞期)、长势相当的T65rS植株进行温度梯度/光照时间处理10天(花药经历完整的减数***和小孢子发育过程)。对处理后的植株进行花粉育性观察，发现T65rS的育性转换敏感期在减数***期，且其育性转换主要受到温度影响，当日平均温度等于或低于31℃时花粉败育，温度在32℃或以上时，花粉育性被恢复，即育性转换温度在31～32℃(图2)。
2、新种质T65rS关联基因的鉴定及功能分析
利用分子标记进行遗传定位检测，发现了多个关键重组体。结果表明：T65rS具有位于第1染色体的重组型隐性遗传位点htrms1，由3个相邻基因即基因号为LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680和LOC_Os01g39690构成，且这些基因之间发生籼粳等位交换重组：LOC_Os01g39670和LOC_Os01g39680为E4型(籼型)基因型，而LOC_Os01g39690则为T65型(粳型)基因型(SEQ ID NO.1)；E4具有所述3个基因都为籼型基因型的位点HTRMS1(SEQID NO.2)，且此位点在与T65rS的杂种F1中能恢复花粉育性(图3A)，表现为显性遗传。
为了验证htrms1和HTRMS1位点中的LOC_Os01g39690粳型和籼型等位基因的功能，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了T65rS的LOC_Os01g39690基因，敲除体在孕穗期处于不同温度下均表现花粉不育(图4)。进一步以农杆菌介导转化法向T65rS导入籼型LOC_Os01g39690(克隆自E4)，获得的纯合转化体在孕穗期处于不同温度下表现花粉育性正常(图4C)。这些结果验证了LOC_Os01g39690粳型和籼型等位基因在htrms1和HTRMS1位点中的功能是产生或恢复反向高温敏感雄性不育的关键基因。
实施例2高温可逆不育系和恢复系的选育及新型两系制种体系的创制
本实施例的目标为选育新的高温可逆不育系和恢复系，创制新型两系杂交稻制种体系。
以T65rS为htrms1供体亲本，以籼型三系杂交稻的保持系协青早B(XieB；吴让祥，1986)为受体亲本，以高抗稻瘟病籼型恢复系(含有HTRMS1)航恢1173(R1173，孙大元等，2014)为恢复系。
(1)选育高温可逆不育系XieS：
利用XieB作为轮回父本与T65rS进行杂交和回交。每一代获得的杂种使用分子标记(M1，M5，M8；图3A，表1)筛选携带htrms1位点的个体与轮回父本进行多代回交获得BC5F1(图5A)。
选择农艺性状与XieB一致的BC5F1植株经过自交获得BC5F2，使用分子标记筛选携带纯合htrms1位点的BC5F2植株，在广州中季(夏季)种植(8月中旬减数***期，此时期日平均气温约33～35℃，花粉可育)，获得BC5F3种子(图5A，5B)。
将BC5F3分别种植于广州中季(夏季)、广州晚季(9月中下旬减数***期，此时期日平均气温低于30℃)和海南陵水的冬春季(2月下旬减数***期，此时期日平均气温约25～28℃)。选择在中低温季节时花粉稳定不育，而在高温季节时花粉育性及结实率均明显恢复的株系，作为新的高温可逆不育系XieS(图5B～5D)。
(2)筛选恢复系R1173：
使用分子标记(表1，图3)对多个籼稻品种(系)进行筛选，挑选了携带特异恢复位点HTRMS1的R1173作为恢复系父本。
(3)创制新型两系杂交稻制种体系：
以(1)选育的高温可逆不育系母本XieS与(2)筛选的恢复系父本R1173杂交制种，获得的杂种F1在中低温季节下结实率高(图5F，5H)，说明R1173的恢复力强。调查杂交F1代群体和双亲的关键农艺性状，发现杂交F1个体株高适中(图5E)，聚合了双亲分蘖旺盛(图5E，5I)、大穗(图5F，5J)、谷粒饱满(图5G，5K)等多个优良性状，体现出明显的杂种优势。
表1 htrms1/HTRMS1位点相关分子标记信息
Figure BDA0002974877660000091
Figure BDA0002974877660000101
注：InDel为***缺失型标记；SNP为单碱基多态标记；SSR为微卫星标记。
综上结果，本发明在研究中从1个籼粳杂交遗传位点分离群体中获得了一个携带籼粳重组型位点htrms1的反向高温敏感雄性不育材料T65rS。本发明对T65rS进行了多个世代种植并调查了其育性转换特性，发现其孕穗期(花药减数***期)在中低温(日平均温度25～31℃)条件下导致花粉发育异常而彻底败育，在高温(日平均温度32～35℃)下育性恢复正常。
本发明通过遗传定位确定了htrms1位于第1染色体的特定区间，是一个籼粳重组型复合位点，具有SEQ ID NO.1所示基因组序列，其含有3个相邻的籼粳遗传分化基因，即由2个基因号为LOC_Os01g39670和LOC_Os01g39680的籼型等位基因和1个基因号为LOC_Os01g39690的粳型等位基因构成的单倍型。并开发了此区间的多个共分离分子标记组成的标记组合，用于辅助鉴定在杂交及多代回交中将供体亲本T65rS或其衍生高温可逆不育系的htrms1位点导入到优良水稻品系，从而选育出新的高温可逆不育系；进一步通过此分子标记的辅助鉴定或基因组测序，在优良水稻品系中筛选出含有显性的籼型恢复位点HTRMS1的品种(系)作为恢复系。HTRMS1是由所述3个基因(LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680，LOC_Os01g39690)的籼型等位基因构成的单倍型，具有SEQ ID NO.2所示基因组序列。本发明还利用所述的高温可逆不育系与恢复系进行杂交配组，建立了新型两系杂交稻制种体系。
由于htrms1和HTRMS1具有相同的LOC_Os01g39670和LOC_Os01g39680籼型等位基因，而分别具有LOC_Os01g39690粳型和籼型等位基因，提示htrms1的反向高温敏感雄性不育特性是在LOC_Os01g39670和LOC_Os01g39680籼型等位基因的基础上，由粳型LOC_Os01g39690等位基因与前2个籼型基因遗传互作发挥特异作用，而非由新的基因突变产生此育性表型。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在T65rS中敲除LOC_Os01g39690粳型等位基因的功能，其突变体在中低温和高温条件下都表现为雄性不育，丧失了高温下育性恢复的作用，确认了该粳型基因是htrms1介导的反向高温敏感雄性不育的必需基因。本发明进一步利用农杆菌介导的转化将LOC_Os01g39690籼型等位基因导入T65rS，转化体在中低温条件下表现为雄性可育，即此转基因发挥了育性恢复功能。这些实验证明了htrms1和HTRMS1复合座位的功能，以及LOC_Os01g39690的籼、粳等位基因与LOC_Os01g39670和LOC_Os01g39680籼型等位基因遗传互作的特异作用。
LOC_Os01g39690粳型和籼型等位基因的编码蛋白分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示，其编码携带F-box蛋白底物结合结构域FBA_1的类F-box蛋白，它们之间存在2个氨基酸差异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
本文中涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1(htrms1座位)
15352bp，Genomic DNA，稻属水稻(Oryza sativa L.)
籼型LOC_Os01g39670 CDS区(112bp-1847bp)：1736bp
籼型LOC_Os01g39680 CDS区(3730bp-7149bp)：3420bp
粳型LOC_Os01g39690 CDS区(9777bp-11117bp)：1341bp
Figure BDA0002974877660000111
Figure BDA0002974877660000121
Figure BDA0002974877660000131
Figure BDA0002974877660000141
Figure BDA0002974877660000151
Figure BDA0002974877660000161
Figure BDA0002974877660000171
Figure BDA0002974877660000181
Figure BDA0002974877660000191
Figure BDA0002974877660000201
注：灰色背景标记处为三个基因的起始密码子和终止密码子；方框表示籼粳型LOC_Os01g39690差异碱基；下划线指示表1中分子标记的引物序列。
SEQ ID NO.2(HTRMS1座位)
15452bp，Genomic DNA，稻属水稻(Oryza sativa L.)
籼型LOC_Os01g39670 CDS区(112bp-1847bp)：1736bp
籼型LOC_Os01g39680 CDS区(3730bp-7149bp)：3420bp
籼型LOC_Os01g39690CDS区(9777bp-11117bp)：1341bp
Figure BDA0002974877660000202
Figure BDA0002974877660000211
Figure BDA0002974877660000221
Figure BDA0002974877660000231
Figure BDA0002974877660000241
Figure BDA0002974877660000251
Figure BDA0002974877660000261
Figure BDA0002974877660000271
Figure BDA0002974877660000281
Figure BDA0002974877660000291
注：灰色背景标记处为三个基因的起始密码子和终止密码子；方框表示籼粳型LOC_Os01g39690差异碱基；下划线指示表1中分子标记的引物序列。
SEQ ID NO.3(粳型LOC_Os01g39690编码氨基酸序列)
446aa，Protein，稻属水稻(Oryza sativa L.)
Figure BDA0002974877660000292
注：方框表示籼粳型LOC_Os01g39690差异氨基酸。
SEQ ID NO.4(籼型LOC_Os01g39690编码氨基酸序列)
446aa，Protein，稻属水稻(Oryza sativa L.)
Figure BDA0002974877660000293
注：方框表示籼粳型LOC_Os01g39690差异氨基酸。

Claims (10)

1.一种具有反向高温敏感雄性不育特性的水稻新种质T65rS的选育方法，其特征在于，利用粳稻品种台中65(粳稻T65)和其携带第1染色体籼型片段的导入系(近等基因系)E4(T65背景)杂交，构建杂交分离群体，在该群体中筛选籼粳重组体，筛选得到具有反向高温敏感雄性不育特性的重组体T65rS，其表现为孕穗期处于32℃或以上温度时花粉可育、可结实，但在31℃或以下温度时花粉败育、不结实。
2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所得T65rS具有SEQ ID NO.1所示的籼粳重组型遗传位点htrms1，其表现为在孕穗期的日平均温度为25～31℃时(优选地26～30℃)，其花粉败育，不结实；在孕穗期的日平均温度为32～35℃(优选地33～35℃)，其花粉育性恢复，能自交结实。
3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述htrms1是籼粳重组型复合位点，具有SEQ ID NO.1所示基因组序列，其含有3个相邻的具有籼粳遗传分化的基因，即由基因号为LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680的籼型等位基因和LOC_Os01g39690的粳型等位基因构成，其中粳型LOC_Os01g39690对反向高温敏感雄性不育起关键作用，其编码蛋白如SEQID NO.3所示。
4.一种新型水稻高温可逆不育系的选育方法，其特征在于，以权利要求1-3任一中所述的水稻新种质T65rS或其衍生高温可逆不育系为供体亲本，经过杂交、回交及筛选将htrms1位点导入符合育种目标的水稻品种(系)，育成新型高温可逆不育系；优选地，在回交过程中利用htrms1区间的分子标记组合辅助选育高温可逆不育系。
5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，所得高温可逆不育系的自交繁种方法：在孕穗期处于日平均温度32～35℃(优选33～35℃)条件下种植，高温可逆不育系育性恢复，自交繁殖得种子。
6.一种新型两系杂交稻制种体系，其特征在于，包括权利要求4或5方法获得的水稻高温可逆不育系，以及恢复系。
7.根据权利要求6所述新型两系杂交稻制种体系，其特征在于，所述恢复系的选育方法：利用分子标记筛选含有SEQ ID NO.2所示的特异恢复位点HTRMS1的籼稻品种(系)作为恢复系；或以携带HTRMS1的籼稻品种(系)作为供体亲本，通过杂交、回交及筛选将HTRMS1导入不携带该恢复位点的水稻品种(系)育成新恢复系；优选地，利用htrms1区间的分子标记组合辅助选育恢复系。
8.根据权利要求7所述新型两系杂交稻制种体系，其特征在于，所述htrms1是籼粳重组型复合位点，具有SEQ ID NO.1所示基因组序列，其含有3个相邻的具有籼粳遗传分化的基因，即由基因号为LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680的籼型等位基因和LOC_Os01g39690的粳型等位基因构成，其中粳型LOC_Os01g39690对反向高温敏感雄性不育起关键作用，其编码蛋白如SEQ ID NO.3所示；
所述特异恢复位点HTRMS1是来源于籼稻的复合位点，具有SEQ ID NO.2所示基因组序列，由LOC_Os01g39670，LOC_Os01g39680和LOC_Os01g39690的籼型等位基因构成；其中籼型LOC_Os01g39690在htrms1/HTRMS1杂种中具有恢复花粉育性的功能，其编码蛋白如SEQ IDNO.4所示。
9.权利要求6或7所述两系杂交稻制种体系在杂交水稻育种方面的应用。
10.一种杂交水稻育种方法，其特征在于，利用权利要求6或7所述两系杂交稻制种体系进行杂交制种，具体是：在孕穗期处于中低温(日平均温度25～30℃，优选26～30℃)条件下将高温可逆不育系与恢复系进行杂交制种，生产得到杂种F1种子。
CN202110271745.1A 2021-03-12 2021-03-12 一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系 Active CN113728911B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110271745.1A CN113728911B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110271745.1A CN113728911B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113728911A true CN113728911A (zh) 2021-12-03
CN113728911B CN113728911B (zh) 2022-05-31

Family

ID=78728256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110271745.1A Active CN113728911B (zh) 2021-03-12 2021-03-12 一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113728911B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115669402A (zh) * 2022-09-16 2023-02-03 北京林业大学 高温恢复百合远缘杂种育性的方法与设备

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101492682A (zh) * 2008-01-23 2009-07-29 华南农业大学 水稻杂种花粉育性基因及其应用
CN102925478A (zh) * 2012-09-14 2013-02-13 华南农业大学 一种水稻雄性育性可控系的构建方法及育种方法
CN104737898A (zh) * 2015-04-02 2015-07-01 福建金山都发展有限公司 一种水稻长粒粳型亲籼两系不育系种质的快速创制方法
CN106967726A (zh) * 2017-04-05 2017-07-21 华南农业大学 一种创建亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种亲和系的方法和应用
CN107164390A (zh) * 2017-06-21 2017-09-15 华南农业大学 水稻杂种花粉育性基因座Sc的等位基因Sc‑j和Sc‑i的分离克隆和在育种中的应用
CN107466842A (zh) * 2017-09-06 2017-12-15 浙江农科种业有限公司 水稻籼粳中间型光温敏核不育系的选育方法
CN110800608A (zh) * 2019-12-10 2020-02-18 安徽省农业科学院水稻研究所 一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101492682A (zh) * 2008-01-23 2009-07-29 华南农业大学 水稻杂种花粉育性基因及其应用
CN102925478A (zh) * 2012-09-14 2013-02-13 华南农业大学 一种水稻雄性育性可控系的构建方法及育种方法
CN104737898A (zh) * 2015-04-02 2015-07-01 福建金山都发展有限公司 一种水稻长粒粳型亲籼两系不育系种质的快速创制方法
CN106967726A (zh) * 2017-04-05 2017-07-21 华南农业大学 一种创建亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种亲和系的方法和应用
CN107164390A (zh) * 2017-06-21 2017-09-15 华南农业大学 水稻杂种花粉育性基因座Sc的等位基因Sc‑j和Sc‑i的分离克隆和在育种中的应用
CN107466842A (zh) * 2017-09-06 2017-12-15 浙江农科种业有限公司 水稻籼粳中间型光温敏核不育系的选育方法
CN110800608A (zh) * 2019-12-10 2020-02-18 安徽省农业科学院水稻研究所 一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨存义等: "几个水稻株系的亲和性测定及微卫星标记分析", 《西北植物学报》, no. 11, 30 November 2003 (2003-11-30), pages 66 - 71 *
王建林等: "中国北方杂交粳稻发展现状与前景", 《沈阳农业大学学报》, no. 02, 25 June 2002 (2002-06-25), pages 66 - 70 *
谢留杰等: "水稻粳型不育系研究进展与选育策略", 《浙江农业科学》, no. 05, 11 May 2015 (2015-05-11), pages 58 - 61 *
陈乐天等: "水稻野败型细胞质雄性不育的发现利用与分子机理", 《科学通报》, no. 35, 20 December 2016 (2016-12-20), pages 82 - 90 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115669402A (zh) * 2022-09-16 2023-02-03 北京林业大学 高温恢复百合远缘杂种育性的方法与设备
CN115669402B (zh) * 2022-09-16 2023-06-20 北京林业大学 高温恢复百合远缘杂种育性的方法与设备

Also Published As

Publication number Publication date
CN113728911B (zh) 2022-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5639893B2 (ja) コンパクトな成長習性をもつ新しいキュウリ植物
CN110800608B (zh) 一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用
Dhaliwal et al. Induction and exploitation of nuclear and cytoplasmic male sterility in pepper (Capsicum spp.): a review
US20150106970A1 (en) Breeding method for two lines hybrid rice based on the rice osms4 gene mutant
CN106434708A (zh) 一种水稻msp1基因突变体及其分子鉴定方法和应用
WO2021237924A1 (zh) 利用水稻籼粳亚种间杂交/加倍的四倍体重组自交系进行育种的方法
US8878012B2 (en) Methods for improving the yield of cucumber plants
CN113728911B (zh) 一种新型水稻高温可逆不育系及两系杂交稻制种体系
CN110951753B (zh) 一种水稻光温敏核雄性不育基因tms2759及其分子标记和应用
CN111676229B (zh) 一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用
Flaschenriem et al. S allele discrimination in styles of Petunia hybrida bearing stylar-conditioned pseudo-self-compatibility
CN111088258B (zh) 一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用
CN113430209B (zh) 大麦雄性不育基因bms-1及其应用
CN111100869B (zh) 一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用
CN107969104B (zh) 黄瓜中镰孢属抗性的qtl
CN110184377B (zh) 与番茄雄性不育突变位点ms-32共分离的分子标记、特异性引物及其应用
CN114231662A (zh) 用于油菜雌不育种质资源突变体鉴定的Indel分子标记及应用
CN108570515B (zh) 水稻孕穗期耐冷基因qCT6.7DOD的分子标记及应用
CN111820124A (zh) 一种利用植物雄性不育材料进行回交育种的方法及应用
CN115976055B (zh) 一种玉米矮秆基因及其分子标记
CN112521472B (zh) 一种与水稻育性及花器官数目相关的分子标记及其应用
CN110951906A (zh) 高代回交分子轮回选择（mrsab）育种方法i--一种显性早穗不降产材料的培育及利用方法
CN114921471B (zh) 一种控制油菜特异花序特征的基因、分子标记及应用
CN108315474B (zh) 水稻孕穗期耐冷基因qCT3.12FAZ的分子标记及应用
CN113994886B (zh) 一种赏食两用杂交水稻不育系的选育方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant