CN107446844A - 一种野油菜黄单胞菌及其应用 - Google Patents

一种野油菜黄单胞菌及其应用 Download PDF

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朱林江
陆跃乐
范永仙
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Abstract

本发明公开了一种野油菜黄单胞菌及其应用，本发明菌株具备高活性糖基转移酶活性，能够同时对多种小分子化合物包括对苯二酚、L‑薄荷醇、丁香酚和异丁香酚进行有效糖基化。

Description

一种野油菜黄单胞菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种野油菜黄单胞菌及其应用。
(二)背景技术
天然活性小分子化合物具有重要的生理功能包括抗真菌、抗细菌、抗肿瘤、抗氧化等，在医药、食品、保健品以及化妆品行业具有重要的应用价值。这些小分子活性化合物包括维生素、抗生素、黄酮类物质、生物碱、固醇类化合物以及一些香味物质等等。这些物质往往是一类水溶性差或稳定性差的化合物，在实际应用中存在很大的局限性。在不影响生理功能的前题下，对这些小分子物质进行必要的修饰，增加其水溶性、稳定性和生理活性，是目前生物化工领域创新性研究的重要方面。
为了增加脂溶性小分子化合物的水溶性和稳定性，糖基化是一个重要手段，而且糖基化能够显著增加一些活性物质的生理活性。最典型的是黄酮类化合物，其往往以糖基化的形式存在植物中，即黄酮糖苷类化合物，通过糖基化修饰，可以改变黄酮的水溶性、稳定性等，产生更多新的生物活性。抗坏血酸是一个典型的不稳定的维生素物质，通过糖基化后，显著增加其稳定性，延长其作用时间和存储时间，拓展应用范围如化妆品领域和组织细胞培养领域。对苯二酚是色素沉着治疗中应用最为广泛的治疗药物，其对皮肤细胞具有一定的美白功能，但同时产物刺激感和急性炎症的副作用，通过糖基化后，能够维持其美白功能的同时，消除副作用产生，即糖基化生产熊果苷。L-薄荷醇给人们带来清凉清新的感觉，但是极易挥发，在食品应用中存在较大的局限性，通过糖基化，可显著提高其稳定性。所以，糖基化修饰活性小分子化合物具有非常广泛的应用价值。
小分子化合物的糖基化方式主要分为两种，即化学法和生物法。化学法糖基化，往往需要多个步骤的反应，包括合适的糖基供体、添加小分子物质的保护基团、糖基化反应、去保护基团等，容易形成生物活性低的β-糖苷键或产生消旋体化合物，也会产生大量的三废物质等。生物法糖基化存在明显的优势，首先小分子化合物往往是天然产物，应用于医药、食品、化妆品等领域，生物法修饰，容易被人们接受；再者，许多生物法糖基化，产生高活性的α-糖苷键产物和光学纯物质；此外，生物法相对简单，选择合适的酶，可通过一步酶法催化实现区域选择性的糖基化修饰。所以，采用生物催化法，选择合适的微生物或者糖基转移酶，对活性小分子化合物进行糖基化修饰，具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种野油菜黄单胞菌及其在糖基化反应中的应用，具备高活性糖基转移酶活性，可用于生物催化转化高效生产α-熊果苷、L-薄荷醇-α-糖苷以及丁香酚-α-糖苷。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IFE008，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13990，保藏日期2017年4月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明还提供一种所述野油菜黄单胞菌在糖基化反应中的应用。
进一步，所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源，以麦芽糖为助剂，加入底物，以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质，在30-40℃下反应完全，获得糖基化底物；所述底物为对苯二酚、L-薄荷醇、丁香酚或异丁香酚中的一种。
进一步，所述酶源用量以缓冲液体积计为5～20g/L(优选10g/L)，所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为200～1000g/L(优选800g/L)，所述底物用量以缓冲液体积计为5～50g/L。
进一步，所述酶源按如下方法制备：以体积浓度1％接种量取野油菜黄单胞菌IFE008的-80℃甘油贮存液，接种于新鲜MPY液体培养基，30℃摇床培养24小时，转速180rpm，接着以体积浓度2％接种量转接到新鲜MPY液体培养基，30℃、180rpm摇床培养18-20h，离心收集湿菌体，冷冻干燥，获得冻干粉；所述MPY培养基组成：麦芽糖50.0g/L，酵母粉2.0g/L，蛋白胨10.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
本发明所述底物为对苯二酚时，所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源，以麦芽糖为助剂，加入对苯二酚，以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质，在40℃下反应完全，获得α-熊果苷；所述酶源用量以缓冲液体积计为10g/L，所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为800g/L，所述底物用量以缓冲液体积计为50mM。
本发明所述底物为L-薄荷醇时，所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源，以麦芽糖为助剂，加入L-薄荷醇，以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质，在40℃下反应完全，获得L-薄荷醇-α-糖苷；所述酶源用量以缓冲液体积计为10g/L，所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为800g/L，所述底物用量以缓冲液体积计为50mM。
本发明所述底物为丁香酚或异丁香酚时，所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源，以麦芽糖为助剂，加入丁香酚或异丁香酚，以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质，在40℃下反应完全，获得丁香酚-α-糖苷和异丁香酚-α-糖苷；所述酶源用量以缓冲液体积计为10g/L，所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为800g/L，所述底物用量以缓冲液体积计为50mM。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明菌株具备高活性糖基转移酶活性，能够同时对多种小分子化合物包括对苯二酚、L-薄荷醇、丁香酚和异丁香酚进行有效糖基化。
(四)附图说明
图1BOX-PCR和M13-PCR扩增指纹图谱，A：BOX-PCR扩增指纹，B：M13-PCR扩增指纹。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1野油菜黄单胞菌的筛选
取染病的和腐烂的野油菜菜叶10g，直接加入到50mL生理盐水中，摇床放置30min，将悬浊液用生理盐水梯度稀释，涂布于半选择性的NSCA培养基(淀粉15g/L，营养琼脂粉23g/L，放线菌酮100mg/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然)平板，28℃好氧培养48h。挑取浅黄色凸粘液单菌落反复进行NSCA平板划线分离，重复三次得到纯化的菌株IFE008，供下一步鉴定用。
形态观察：
1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在2～4mm之间，表面光滑，浅黄色凸粘液等符合野油菜黄单胞菌菌落形态特征。2)划线到YDC培养基平板(酵母粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，碳酸钙粉20.0g/L，琼脂15.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然)，菌落呈深黄色，光滑凸起，粘液状。3)细胞形态观察：用光学显微镜观察，革兰氏阴性菌，细胞直杆状。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。
16S rDNA测序鉴定：以体积浓度1～2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于NGA培养基(牛肉膏3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂粉15.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然)中，28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。用细菌通用引物27F/1541R(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1541R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)扩增16s rDNA，反应条件为：94℃预变性3min后进入以下循环：94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将PCR扩增产物直接寄送上海生工基因测序，分别用27F和1541R测序，拼接序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定菌株IFE008为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IFE008，已于2017年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13990，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990的M13-PCR和BOX-PCR的指纹扩增
BOX-PCR指纹扩增：以体积浓度1～2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于NGA培养基中，28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。采用BOX引物(CTACGGCAAGGCGACGCTGACG)进行PCR扩增。反应体系为：Mg2+的浓度为3.0mmol/L，引物浓度为1.0μmol/L，DNA模板浓度为4.8ng/μL-0.48ng/μL，每种核苷酸的浓度为200μmol/L，TaqDNA聚合酶添加量为2.5U/25μL。PCR反应程序为：94℃3min，53℃2min，72℃ 3min后进入以下循环：94℃变性40s，53℃30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。取15μL的PCR产物用于118％的琼脂糖凝胶电泳(15cm×15cm)分离，在6.5V/cm稳压条件下电泳4h。用GoldView DNA染料染色，在紫外光下成像，即得M13-PCR指纹，如图1中A。
M13-PCR指纹扩增：以体积浓度1～2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于NGA培养基中，28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。采用M13引物(GAGGGTGGCGGTTCT)进行PCR扩增。反应体系为：Mg2+的浓度为3.5mmol/L，引物浓度为2.0μmol/L，DNA模板浓度为4.8ng/μL-0.48ng/μL，每种核苷酸的浓度为200μmol/L，Taq DNA聚合酶添加量为2.5U/25μL。PCR反应程序为：94℃3min，42℃2min，72℃ 3min后进入以下循环：94℃变性40s，42℃20s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。取15μL的PCR产物用于118％的琼脂糖凝胶电泳(15cm×15cm)分离，在6.5V/cm稳压条件下电泳4h。用GoldViewDNA染料染色，在紫外光下成像，即得M13-PCR指纹，如图1中B。
实施例3野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990细胞催化对苯二酚生产α-熊果苷
该实验所用的培养基为MPY培养基：麦芽糖50.0g/L，酵母粉2.0g/L，蛋白胨10.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
以体积浓度1％接种量取-80℃甘油贮存液，直接接种于新鲜MPY液体培养基，30℃摇床培养24小时，转速180rpm。接着以体积浓度2％接种量转接到新鲜MPY液体培养基，30℃、180rpm摇床培养18-20h，离心收集湿菌体细胞，用于对苯二酚的糖基化反应。
取500mL离心收集的野油菜黄单孢菌IFE008细胞，用液氮冻干；取5g冻干的细胞溶解在500ml的硼酸缓冲液(pH8.0)中；直接加入400g的麦芽糖和2.75g的对苯二酚；将反应液倒入1L的烧杯中，放置于40℃水浴锅中，搅拌1h；转化反应的产物用于HPLC分析，测得产物α-熊果苷浓度约为20mM，转化率为40％。
HPLC分析条件。样品前处理：100μL反应液，加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：Cl8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：CH3OH(甲醇)：H2O：C2HF3O2(三氟乙酸)＝90:10:0.01(体积比)；流速：0.8mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：287nm；进样量：10μL。底物对苯二酚的出峰时间一般为5-5.5min，产物α-熊果苷的出峰时间为6.5-7.5min。
实施例4野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990细胞催化L-薄荷醇生产L-薄荷醇-α-糖苷
以体积浓度1％接种量取-80℃甘油贮存液，接种于新鲜MPY液体培养基，30℃摇床培养24小时，转速180rpm。接着以体积浓度2％接种量转接到新鲜MPY液体培养基，30℃、180rpm培养18-20h，离心收集湿菌体细胞，用于对苯二酚的糖基化反应。
取500mL离心收集的野油菜黄单孢菌IFE008细胞，用液氮冻干；5g冻干的细胞溶解在500ml的硼酸缓冲液(pH8.0)中；直接加入400g的麦芽糖和2.0g的L-薄荷醇；将反应液倒入1L的烧杯中，放置于40℃水浴锅中，搅拌24h；转化反应的产物用于HPLC分析，测得产物L-薄荷醇-α-糖苷的浓度约为1g/L，转化率为20％。
HPLC分析条件。取反应液0.5ml的反应液，加入到1.2ml的甲醇中，12000rpm离心5min；用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中。色谱柱：Cl8柱，250×4.6mm；柱温：30℃；流动相：CH3OH(甲醇)：H2O：C2HF3O2(三氟乙酸)＝70:30:0.01(体积比)；流速：1.0mL·min-1；检测器：视差折光检测器；进样量：10μL。底物L-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min，产物L-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。
实施例5野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990细胞催化丁香酚或异丁香酚生产丁香酚-α-糖苷或已丁香酚-α-糖苷
以体积浓度1％接种量取-80℃甘油贮存液，接种于新鲜MPY液体培养基，30℃摇床培养24小时，转速180rpm。接着以体积浓度2％接种量转接到新鲜MPY液体培养基，30℃、180rpm培养18-20h，离心收集细胞，用于对苯二酚的糖基化反应。
取500mL离心收集的野油菜黄单孢菌IFE008细胞，用液氮冻干；5g冻干的细胞溶解在500ml的硼酸缓冲液(pH8.0)中；直接加入400g的麦芽糖和终浓度50mM(以缓冲液体积计)的丁香酚或异丁香酚；将反应液倒入1L的烧杯中，放置于40℃水浴锅中，搅拌0.5h；转化反应的产物用于HPLC分析，测得产物丁香酚-α-糖苷或已丁香酚-α-糖苷的浓度约为6mM，转化率为20％。
HPLC分析条件。样品前处理：400μL反应液，加入到600μL的甲醇中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：Cl8柱，250×4.6mm；柱温：40℃；流动相：CH3OH(甲醇)：H2O：C2HF3O2(三氟乙酸)＝60:40:0.01(体积比)；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：280nm；进样量：10μL。底物丁香酚的出峰时间一般为6.0min，产物丁香酚-α-糖苷的出峰时间为12.0min。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种野油菜黄单胞菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1364
<212> DNA
<213> Xanthomonas campestris
<400> 1
gtaagagctt gctcttatgg gtggcgagtg gcggacgggt gaggaataca tcggaatcta 60
ctctttcgtg ggggataacg tagggaaact tacgctaata ccgcatacga cctacgggtg 120
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gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt tgttgcacca gaag 1364

Claims (5)

1.野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IFE008，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13990，保藏日期2017年4月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.一种权利要求1所述野油菜黄单胞菌IFE008在糖基化反应中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源，以麦芽糖为助剂，加入底物，以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质，在30-40℃下反应完全，获得糖基化底物；所述底物为对苯二酚、L-薄荷醇、丁香酚或异丁香酚中的一种。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源用量以缓冲液体积计为5～20g/L，所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为200～1000g/L，所述底物用量以缓冲液体积计为5～50g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：以体积浓度1％接种量取野油菜黄单胞菌IFE008的-80℃甘油贮存液，接种于新鲜MPY液体培养基，30℃摇床培养24小时，转速180rpm，接着以体积浓度2％接种量转接到新鲜MPY液体培养基，30℃、180rpm摇床培养18-20h，离心收集湿菌体，冷冻干燥，获得冻干粉；所述MPY培养基组成：麦芽糖50.0g/L，酵母粉2.0g/L，蛋白胨10.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0。
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