CN102899261B - 长双歧杆菌长亚种br022菌株的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是有关于一种长双歧杆菌长亚种BR022菌株的用途。该菌株分离自新生儿粪便检体，利用菌种特性与16S rDNA部分序列进行比对及Biolog鉴定***鉴定，确认该分离株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)，其寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 910500。本发明利用人类周边淋巴血球细胞免疫激活反应分析，该分离株可刺激细胞产生较高的免疫激活反应。
Description
技术领域
本发明涉及一株可产生高细胞免疫激活反应的分离株，其于2011年8月5日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 910500。针对菌种特性与利用16S rDNA部分序列进行比对及Biolog鉴定***鉴定为长双歧杆菌长亚种长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)，其可刺激细胞产生高的免疫激活反应。
背景技术
随着感染性疾病的控制与工业化程度的提高，过敏性疾病发生率逐年上升，已经成为世界的趋势。近二十年来，过敏疾病发生率平均升高5～10倍，成为不容忽视的健康问题。世界过敏组织(WAO)在2005公布了30个国家12亿总人口中，有22％(约2亿5千万人)患有IgE介导(IgE mediated)的过敏性疾病，包括过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、食物过敏、湿疹、药物过敏及严重过敏反应等。过敏性疾病罹病率的迅速增高，已达流行病的程度。这些疾病的罹病率增加，与长期持续的环境因素和生活方式改变有关。工业化、都市化越高的国家，过敏性疾病的罹病率就越高，像是澳洲、英国、美国、西欧等国家，都是过敏性疾病最严重的地区。过敏疾病是一种免疫疾病，是人体内的免疫功能失调，出现不平衡的状况。
人体的免疫***中可以区分成第一型T细胞反应(Th1)与第二型T细胞反应(Th2)，由于人体内有抗原(过敏原)进入，身体就会产生免疫保护作用，当人体再次接触抗原时，就会诱发身体免疫***产生反应，T细胞会释放γ干扰素(IFN-γ)、细胞间白素2(IL-2)，使免疫反应趋向第一型T细胞反应，B细胞因此分泌更多的免疫球蛋白G(IgG)。过敏疾病的致病机转是多因子，免疫球蛋白E抗体，嗜伊红白血球(Eosinophil)，过敏原特异性T淋巴球和细胞间白素4、5、9、13都占有很重要的免疫致病机转，但要如何启动这些致病机转，进一步引发过敏症状的发生，则与遗传因素和环境因素脱不了关系。然而，有过敏体质的人，当过敏原进入体内，则会诱发身体免疫***朝第二型T细胞免疫反应，T细胞会释放细胞间白素4、5、9、13，让免疫B细胞制造免疫球蛋白E(IgE)增加，黏附在肥大细胞(Mast cells)上，再遇过敏原时，过敏原会黏附在免疫球蛋白E上，共同作用后，肥大细胞会释放发炎介质如组织胺(Histamine)、白三稀素(Leukotriene)、***素(Prostaglandin)、和血小板活化因子等，这些发炎介质会进一步影响呼吸道产生发炎反应，导致过敏症状发生。
根据学者针对内在肠道的原生菌丛研究指出，益生菌与坏菌的多寡与过敏性疾病发生率息息相关。研究学者于瑞典和爱沙尼亚2岁幼童的粪便中，发现乳酸菌数和坏菌的菌数有截然的不同表现，依据瑞典都市化、西方化的生活型态和饮食习惯的改变，使得儿童肠道中厌氧菌(clostridia)菌数愈增加，患过敏疾病的比率也愈增加；相反的，爱沙尼亚幼儿粪便中益生菌(包括乳酸菌、比菲德氏菌以及肠球菌等)菌数较多，过敏性疾病的罹病比例偏低。另一个实验结果发现，如果婴儿出生后第一年肠道中大肠菌菌数愈高，日后罹患异位性皮肤炎的机率也会提高；如果绿脓杆菌(Clostridium difficile)多，日后罹患气喘等过敏性疾病的机率也偏高。
进一步的研究又发现，幼儿生活型态中，愈不常接触细菌、使用较多抗生素和超清洁的饮食，反而使过敏的可能性增加。根据这些调查显示，人类所接触的细菌种类、数量，和时机，正足以影响免疫***发育的走向。随着疫苗的提早普遍接种和公共卫生学的进步，外在感染的形态正逐年改变，并非我们所能控制，因此许多研究学者希望能借着调整肠胃道中乳酸菌菌数而进一步控制过敏的发生。
“乳酸菌”是指能够代谢糖类、产生50％以上乳酸的细菌，具有这些功能的细菌包括了：乳酸杆菌(Lactobacillus)、键球菌(Streptococcus)、念球菌(Leuconostoc)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等，但乳酸菌为习惯用语，并不是分类学上正式用语。
科学家最早发现某些乳酸菌菌种与人类单核球或细胞株培养可以增加第一型T细胞细胞素包括珈玛干扰素(IFN-γ)，细胞间白素-12(IL-12)，和细胞间白素-18(IL-18)的分泌，主要的机转在增加细胞内STAT1和STAT3转译分子的磷酸化，增加干扰素的释放。进一步的研究也指出乳酸菌和肠道内皮细胞上的TOLL接受器，尤其是TOLL-2接受器的结合，能活化细胞内的转译蛋白NF-κB移至核内而释放大量细胞素，属于先天免疫(InnateImmunity)的一环。因此某些乳酸菌菌种借由其细胞壁成份(Peptidoglycan)，经由先天免疫***，确实能活化T细胞的发育。
在动物实验方面，早期科学家即发现，若实验动物肠中处于无菌状态，就不可能诱发免疫耐受性，因此证明肠胃中菌丛的改变，可以影响免疫反应。日本科学家进一步发现乳酸菌代田乳酸菌(Lactobacillus casei shirota)可以抑制抗原特异性IgE抗体的产生，并可以预防过敏反应和食物过敏，主要机转是此乳酸菌细胞壁可以诱发T细胞产生大量的间白素-12。在使用卵蛋白基因转殖鼠的动物实验中，也证明服用乳酸菌确实能抑制与过敏相关的IgG和IgE抗体，且能产生大量的干扰素和IgA抗体，可治疗食物过敏。因此从动物实验的结果，几乎能确定乳酸菌确实能降低第二型T细胞所造成的过敏免疫发炎反应。
最早使用乳酸菌的目的都放在病毒性或细菌性肠炎的治疗，尤其是旅行者腹泻和轮状病毒所引起的腹泻症状的改善，最常用的菌种是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GG)(LGG，ATCC 53103)，大部分的双盲临床试验结果皆证实有部份疗效。临床医师又进一步将乳酸菌用于治疗食物过敏，尤其是对牛奶过敏所引起的症状能有神奇的改善效果，进一步的发现更证明服用一百亿菌落数的LGG乳酸菌可在血清中增加足够的细胞间白素-10，能明显抑制过敏症状，尤其是异位性皮肤炎的症壮。在预防方面，芬兰的学者证明在怀孕妈妈若一等亲人中有过敏病者，在产前服用乳酸菌LGG一百亿连续14天，小孩则在出生后服用6个月，则2年的追踪显示小孩过敏病的发生率与对照组比至少降低50％以上，统计上有显著的意义。从以上研究报告显示口服乳酸菌能对过敏免疫疾病产生调节治疗作用。
学者也将嗜酸乳杆菌L.acidophilus引用在气喘的治疗，双盲试验证明不论是家尘螨或是花粉所引起的过敏症状，都能有效降低，但不能明显降低IgE和气道过度收缩反应。其它学者则证明若连续服用优格(Yogurt)，每天至少200公克1年，则不只能改善过敏症状，也能降低IgE抗体。
乳酸菌为人体使用超过300年，其作用是多方位的，除了上述免疫作用，包括促进干扰素，细胞间白素-12，和细胞间白素-18的产生，产生IgA抗体，在口服耐受性的研究中，乳酸菌也能促进免疫抑制细胞素细胞间白素-10和细胞转形成长因子(TGF-β)的产生，因此乳酸菌也被使用于调节自体免疫反应。乳酸菌的其它作用包括能产生乳酸菌和抑菌素(bacteriocin)，可以抑制其他病原菌，改善肠道中的生态，帮助肠道优势好菌的建立，另外乳酸菌也能黏附M细胞，促进肠细胞分泌生长素，增加肠细胞的再生生长，而其产生的丁酸(Butyric acid)更可中和食物的致癌物质。
日本科学家发现乳酸菌中比菲德氏菌能够减轻西洋杉花粉症的症状，在花粉季的早期连续使用长双歧杆菌长亚种能够减轻鼻塞、流鼻水、打喷嚏、眼睛痒、流泪等症状，同时在使用四周后血清中INF-γ、IL-10浓度下降的情形会减缓，而代表第二型T细胞反应的细胞趋化素TARC浓度也较安慰剂组低，使用八周后嗜伊红性球的比率也下降。TARC是在发炎的后期由抗原呈现细胞(APC)、脾脏细胞、上皮细胞等细胞所分泌的趋化素(chemokines)，它会吸引嗜伊红性球等过敏免疫细胞聚集。长双歧杆菌长亚种能够调节TARC的分泌，减少第二型T细胞的免疫反应。长双歧杆菌长亚种改善花粉症的机转除了减少第二型T细胞免疫反应外，科学家发现在花粉症期间，病人肠道的菌丛会产生变化，Faecalibacteriumprausnitzii、Bacteroides fragilis会明显增加，补充长双歧杆菌长亚种则能帮助维持正常的菌丛。
另一项动物实验发现长双歧杆菌长亚种能够诱导调节型T细胞增加，出生小鼠喂食长双歧杆菌长亚种后血中循环的调节型T细胞数目会增加，在肠道淋巴组织中Toll likereceptor讯息传导、抗原呈现、细胞激素等基因的表现都会增加。同时，口服长双歧杆菌长亚种能够阻断抗原诱导的IgE合成。也有研究指出口服长双歧杆菌长亚种能够阻止组织胺的讯息传递，它能让血球中histamine H1 receptor(H1R)以及histidine decarboxylase(HDC)的基因表现下降，减少组织胺的合成，并缓解组织胺所引起的病理反应，进而缓解过敏性疾病的症状。此外，还有研究也指出口服比菲德氏菌能够提升免疫力，如增加NK细胞的活性、脾脏淋巴细胞的增生以及血中溶血素(hemolysin)的浓度等。
乳酸菌是非致病性的革兰氏阳性杆菌，是肠道的益生菌，在肠道黏膜表面的正常菌丛中大多数是乳酸菌与比菲德氏菌，其临床作用有：调节肠道的通透性、改变肠道微生物的状态与增加肠道IgA的反应性。早期的研究发现乳酸菌可刺激老鼠的脾脏细胞株分泌干扰素-γ，同时在人类的研究上也发现血液中的淋巴球细胞也可被乳酸菌刺激而分泌干扰素-γ，而干扰素-γ可调节免疫反应产生与否。
过敏免疫反应之一产生干扰素γ是免疫细胞活化后所产生的，可以增加抗原呈献细胞的功能，使巨噬细胞能有效的辨识并吞噬侵入的病原体，所以干扰素-γ也被称为巨噬细胞的活化因子之一。因此乳酸菌能刺激产生干扰素-γ也代表其可调节免疫反应。
发明内容
有鉴于此，关键的影响过敏免疫反应之一为干扰素γ，免疫细胞活化到某程度后所产生的干扰素-γ，可以增加抗原呈献细胞的功能，使巨噬细胞能有效的辨识并吞噬侵入的病原体或过敏原，干扰素-γ产生越高细胞免疫激活反应越强。
本发明的目的在于，提供一种新的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株及包含该长双歧杆菌长亚种分离株的可刺激免疫激活的组合物，所要解决的技术问题是使其可刺激细胞产生高的免疫激活反应，非常适于实用。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其特征在于其寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC910500。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株为可产生高细胞免疫激活反应的分离株。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株是经鉴定为长双歧杆菌长亚种。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株是筛选自婴儿粪便检体。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株是经革兰氏染色镜检观察结果为革兰氏阳性杆菌。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株不具有触酶。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株不具有氧化酶。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株不具有运动性。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株是于厌氧环境下生长，好氧环境下不会生长。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株不产生内生孢子。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株是经16S rDNA部分序列进行比对及Biolog鉴定***鉴定为长双歧杆菌长亚种。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株其具有长双歧杆菌长亚种的所有被鉴知的特性。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的分离株可产生较其他乳酸菌种高的细胞免疫激活反应。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的其他乳酸菌种为副干酪乳杆菌及嗜酸乳杆菌所组成的群组。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的细胞免疫激活反应为利用ELISPOT assay进行干扰素-γ分析。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，具有刺激人类周边血液单核球细胞产生干扰素-γ的能力。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，刺激人类周边血液单核球细胞产生干扰素-γ的免疫激活强度高于其他乳酸菌种3倍以上。
前述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株，其中所述的其他乳酸菌为副干酪乳杆菌及嗜酸乳杆菌所组成的群组。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种可刺激免疫激活的组合物，其包括：上述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其中所述的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株为菌粉。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其中所述的菌粉为冷冻干燥而得。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其适应症为病毒感染索引发的疾病、过敏性疾病、自体免疫疾病及癌症抑制或预防所组成的群组。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其中所述的病毒感染索引发的疾病包含反复感冒、季节流感、肠胃炎及泌尿道感染组成的群组。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其中所述的过敏性疾病包含食物过敏、荨麻疹及过敏性鼻炎组成的群组。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其中所述的自体免疫疾病包含类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎及红斑性狼疮组成的群组。
前述的可刺激免疫激活的组合物，其中所述的癌症是指大肠癌、胃癌及肝癌组成的群组。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上可知，为达到上述目的，本发明提供了一种产生高细胞免疫激活反的分离株BR022，筛选自新生儿粪便检体的菌种并寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 910500。
本发明将分离出来的菌株利用革兰氏染色镜检观察为革兰氏阳性杆菌，其化学与物理特性为不具有触酶、氧化酶及运动性，不会产生内生孢子，于厌氧环境下会生长，好氧环境下不会生长。
另外本发明利用16S rDNA部分序列进行比对及Biolog鉴定***与标准菌株B.lonum subsp.longum BCRC 11847、B.lonum subsp.infantis BCRC 15416、B.lonumsubsp.suis BCRC 14671进行比对，加以鉴定确认该分离株BR022为Bifidobacteriumlongum subsp.Longum。利用引子RP4进行BR022与市售乳酸菌(B.longum BB536)基因组DNA的RAPD比对，结果显示BR022 RPAD Pattern为600bp、450bp，B.longum BB536 RPADPattern为600bp、450bp、～340bp、300～200bp间有3条Band，此一结果证实BR022与B.longum BB536为两株不同的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)属。
另一方面，本发明利用其他乳酸菌种L.paracasei及L.acidophilus作为对照组进行免疫激活反应差异分析。将三株菌种L.paracasei、L.acidophilus、BR022与PBMC进行免疫激活反应后，利用ELISPOT assay进行干扰素-γ分析。ELISPOT assay利用呈色反应，在细胞分泌细胞激素的对应位置上显现可辨的斑点，以ELISPOT辨识***对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，计算出分泌该细胞激素的细胞数量。且ELISPOT assay利用细胞平台进行检测，具有高灵敏度、高亲和力、高特异性，能于2.0～3.0×105细胞/毫升中即可检出1颗可分泌细胞激素的细胞，且在刺激细胞时，不会影响细胞分泌细胞激素的反应。其检测原理是利用96孔盘底部PVDF材质薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含sodium azide、内毒素endotoxin)的单株抗体。当血液检体经过分离后的取得的PBMC(人类周边血球细胞)细胞被加至96孔盘上，利用抗原刺激后将微孔盘放置于适当温度下培养16～24小时后，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素(Biotin)标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的链霉亲和素(StreptAvidin)与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点，将检体分析结果视为免疫激活反应强度，并将三株菌种的免疫激活反应进行排序。
本发明通过综合鉴定结果显示此分离株(BR022)为一长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)，并可产生较强的免疫激活反应。
借由上述技术方案，本发明可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株及可刺激免疫激活的组合物至少具有下列优点及有益效果：本发明的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种可刺激细胞产生高的免疫激活反应。
综上所述，本发明是有关于一种可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株BR022，该菌株分离自新生儿粪便检体，利用菌种特性与16S rDNA部分序列进行比对及Biolog鉴定***鉴定，确认该分离株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longumsubsp.longum)，其寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 910500。本发明利用人类周边淋巴血球细胞免疫激活反应分析，该分离株可刺激细胞产生较高的免疫激活反应。本发明在技术上有显著的进步，并具有明显的积极效果，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
附图说明
图1是BR022革兰氏染色镜检观察结果图。
图2是BR022与B.longum BB536基因组DNA的RAPD比对电泳图，其中A为B.longumBB536基因组DNA的RAPD，B为DNA marker，C为BR022基因组DNA的RAPD。
图3是ELISPOT assay分析免疫激活反应差异性分析图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的可产生高免疫激活反应的长双歧杆菌长亚种分离株其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
1.BR022乳酸菌分离鉴定
本发明BR022是由光晟生物科技公司筛选自新生儿粪便检体的菌种，寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存编号BCRC910500。利用革兰氏染色镜检观察为革兰氏阳性杆菌，结果如图1所示，不具有触酶、氧化酶及运动性，不会产生内生孢子，于厌氧环境下会生长，好氧环境下不会生长；根据2002P.S.M.Yeung et.al.等人研究指出，利用特殊引子对：Primer PAF[5′AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG 3′]与Primer 536R[5′GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3′]，进行乳酸菌16S rDNAgene PCR放大，即可进行乳酸菌属的鉴定。利用16S rDNA部分序列进行比对，加以鉴定确认该分离株BR022为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)，如表1所示，可得知BR022 16S rDNA gene片段与Bifidobacterium longum高达99％的相似度，证实BR022为Bifidobacterium longum菌属。另利用Biolog鉴定***，依据微生物95种不同炭原利用的生化代谢特性，比对分析来鉴别微生物，其结果显示BR022与标准菌株Bifidobacterium longum subsp.longum BCRC11847于95种炭原代谢特性中有93项具有相同反应，证实BR022为Bifidobacterium longum菌属。结果如表2、表3所示。
表1. 16S rDNA部分序列(507bp)
表2. Sequencing Alignent BR022 16S rDNA基因片段序列经美国国家生物技术资讯中心〔NCBI〕提供的核酸基因库序列比对工具〔Nuclotide BLAST〕比对结果
表3.Biolog鉴定***分析结果
2. BR022与市售乳酸菌(B.longum BB536)的差异比对分析：
2.1.基因组DNA的RAPD比对：
运用随机引子对扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。该RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引子，对所研究基因组DNA(本实验乃指乳酸菌基因组DNA)进行PCR扩增，检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引子DNA序列各不相同，但对于任一特异的引子，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。这些特异的结合位元点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引子在模板的两条链上有互补位置，且引子3′端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNA片段。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段***、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位元点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引子数很大，虽然对每一个引子而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引子则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。
本发明利用引子RP4进行BR022与市售乳酸菌(B.longum BB536)基因组DNA的RAPD比对，其DNA电泳图结果显示如图2所示，BR022 RPAD Pattern为600bp、450bp，B.longumBB536 RPAD Pattern为600bp、450bp、～340bp、300～200bp间有3条Band，此一结果证实BR022与B.longum BB536为两株不同的Bifidobacterium longum菌属。
2.2. DNA序列比对分析：
根据2002 P.S.M.Yeung et.al.等人研究指出，利用特殊引子对：Primer PAF[5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3′]与Primer 536R[5′GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3′]，进行乳酸菌16S rDNA gene PCR放大即可进行孔酸菌属的鉴定。BR022与市售乳酸菌(B.longum BB536)16S rDNA基因片段定序后利用Vector NTI 7.0软件进行比对，结果如表4所示，两序列差异为：
a)B.longum BB536于序列起始处多出3个核甘酸(TAA)；
b)BR022第496个位置是核甘酸(G)，B.longum BB536相对应是核甘酸(C)；
c)BR022第510个位置是核甘酸(T)，B.longum BB536相对应是核甘酸(A)；
d)BR022于序列终点处缺少1个核甘酸(A)。
表4 BR022与B.longum BB536的16S rDNA基因片段定序，利用Vector NTI 7.0软件进行比对
3. BR022乳酸菌制备
将该菌种活化放大后，利用冷冻干燥方式进行冻干。冻干菌粉末检测菌数须大于1.0×1011CFU/克。进行细胞实验时，取1克菌粉溶于10毫升无菌水中，充分均匀混合后，以系列稀释方式，将菌粉混合液稀释至1.0×106～1.0×108CFU/毫升，置于摄氏95度水浴槽中加热处理5分钟后，置于摄氏4度备用。
3.人类周边血球细胞(PBMC)制备
3.1.病人血液样本收集
血液检体来自中国台湾某诊所，共计73名过敏病人。
3.2.人类周边血球细胞分离
抽取病人血液约10毫升，将病人血液沿管壁缓慢加入含有Ficoll-Hypaque(BDPharmacia，Cat.No.17-1400-02)的离心管中，以冷冻离心机进行梯度离心(每分钟3000转，10分钟)来进行全血的血球分离，分界面处为周边血球细胞(PBMC)，沉淀物为红血球。将取出的PBMC置于新的15毫升离心管，并加入10毫升1×PBS至离心管中，以离心机进行离心(每分钟1500转，5分钟)，除去上清液，留下血球细胞pellet。取10毫升RPMI-1640培养基(含1％Penicillin-Streptomycin及10％Calf serum)至离心管中，来回吸冲20次并避免气泡产生，使血球细胞均匀分布。取血球细胞悬浮液与台盼蓝(trypan blue)染剂等体积混合，以血球计数盘进行细胞计数。并以RPMI-1640培养基调整血球细胞悬浮液浓度为1.0×106～1.0×108细胞/毫升。
四、利用ELISPOT assay(免疫酵素联结斑点法)进行乳酸菌刺激PBMC产生干扰素γ(IFN-γ)的分析
ELISPOT assay其反应步骤如下：
1.于无菌操作台中，将已预先涂有单株抗体1-D1套组平板(mAB1-D1K)自摄氏4度回温至室温后，以无菌1×PBS洗涤4次(200微升/well)；
2.加入200微升/well的培养基RPMI-1640(含10％FBS)于室温下进行阻断(blocking)30分钟；
3.去除培养基，以100微升1×PBS洗涤一次，于吸水纸上轻拍；
4.加入PBMC(细胞浓度调整为1.0×106～1.0×108细胞/毫升)及BR022菌液(1.0×106～1.0×108CFU/毫升)，最后体积约计150微升/well，此时正对照组为mAb CD3-2同时加入，试验浓度为100ng/毫升；
5.将平板(plate)置于摄氏37度5％二氧化碳(CO2)培养箱中反应12～48小时。
6.去除细胞悬浮液，加入200微升/well 1×PBS洗涤五次；
7.稀释侦测抗体7-b6-1-biotin至浓度1微克/毫升于1×PBS-0.5％FBS(1×PBS含0.5％胎牛血清)，加入100微升/well稀释的抗体，于室温下反应2小时；
8.去除上清液，加入200微升/well 1×PBS洗涤五次；
稀释卵白素(Streptavidin)-ALP(1∶1000)于1×PBS-0.5％FBS(1×PBS含0.5％胎牛血清)，加入100微升/well于室温下反应1小时；
9.去除上清液，加入200微升/well 1×PBS洗涤五次；
将呈色剂BCIT/NBT以0.45微米(μm)滤膜进行过滤并加入100微升/well，置于室温下直到斑点呈现为止；
10.完全显色后，将上清液加入相应的盘中，以蒸馏水充分洗涤膜的两边。敷吸水纸轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，利用显微镜或判读***即可读取斑点数。将平板(plate)置于室温下避光保存。
4.依据三株乳酸菌免疫激活反应强度进行差异分析
将三株菌种(L.paracasei，L.acidophilus & BR022)与PBMC进行免疫激活反应后，利用ELISPOT assay进行干扰素-γ分析，将检体分析结果视为免疫激活反应强度，并将三株菌种的免疫激活反应进行排序，依据73位病人检体进行分析，共有15位以L.paracasei的免疫激活反应最强，28位以L.acidophilus的免疫激活反应最强，30位以BR022的免疫激活反应最强。
再依据反应最强的菌株斑点数，将斑点数结果分类，并视为对该菌株的免疫激活反应强度，分为：1～300为对该菌株免疫激活反应“弱”；斑点数300～500为对该菌株免疫激活反应“中”；斑点数＞500为对该菌株免疫激活反应“强”。并以L.paracasei免疫激活反应作为正对照组进行Dunnet’s Test检定，以进行免疫激活反应差异性分析。
由ELISPOT assay分析免疫激活反应中观察，结果如表5与图3所示。于15位病人检体中，对L.paracasei(LP)的免疫激活反应较强，但以免疫激活反应观察多属于反应强度“弱”(53.3％)；28位以L.acidophilus(LA)的免疫激活反应，依据免疫激活反应多属于反应强度“中”(50.0％)；30位以BR022的免疫激活反应，其免疫激活反应多属于反应强度“强”(60.0％)，显示虽然不同检体对于不同菌株与细胞进行免疫激活反应时具有差异，但仍以BR022的激活反应较高，且与L.paracasei菌株的反应比较，具有统计上显著差异(P＝0.003)，图中黑色区块代表斑点数大于500，白色区块代表斑点数介于300到500之间，显示该分离株BR022可刺激细胞产生较强的免疫激活反应。
表5.ELISPOT assay分析免疫激活反应差异性分析
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种长双歧杆菌长亚种BR022菌株的用途，用以制备刺激人类周边血液单核球细胞产生干扰素-γ的药物，该长双歧杆菌长亚种BR022菌株寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No.5118，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC910500。
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