CN102898527B - 融合蛋白、药物组合物及预防或治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含(a)包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质的融合蛋白、包含所述融合蛋白的药物组合物、以及通过施用所述药物组合物治疗或预防癌症的方法。

Description

融合蛋白、药物组合物及预防或治疗癌症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年7月25日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2011-0073635的权益，其公开内容通过引用全部引入本文中。
电子提交材料的通过引用的引入
在本文中通过引用全部引入的是与此同时提交且鉴别如下的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：2011年8月9日创建的名为“708782SequenceListing.TXT”的一份63,762字节的ASCII(文本)文件。
背景技术
目前，用于治疗的抗体的开发正在积极进行。这为用现有的合成药物难以治疗的疾病提供了解决方案，并且正在取代合成药物。目前，16种用于治疗的抗体是可商购的，且约7000或更多种抗体在被全球约300家或更多的公司开发。这些抗体产品正使医药市场持续增长。
血管发生对于所有癌组织中的细胞分化是必不可少的，且即使抑制血管发生的靶是已知的，由于其效率低，还没有单独的治疗剂是可用的。此外，尚未开发出可广泛用于各种癌症的治疗剂。
二十年前，被称为脂皮质蛋白、依钙蛋白、内附蛋白等的蛋白质被赋予标准名膜联蛋白(Annexin)，其已在过去的十年中使用。
膜联蛋白结合钙和磷脂，并具有独特的保守域，其中称为内附蛋白折叠的包括“GXGTDE”(SEQ ID NO：118)基序的约70个氨基酸序列重复4次(有时重复8次)。常规已知的膜联蛋白包括保守域。蛋白质取决于序列保守与否而被鉴定为膜联蛋白。已知膜联蛋白存在于从哺乳动物到霉菌的多种活生物体中，且已报道膜联蛋白I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、XIII等存在于人类中。已知膜联蛋白涉及骨的结构形成和多种生物现象例如膜运输、跨膜通道活性、磷脂酶A2的抑制、凝血抑制、有丝***信号的转导和细胞-基质相互作用的介导。
虽然相关技术公开了通过使用结合膜联蛋白A1的抗体递送物质的方法，但是没有关于通过使用抗体治疗癌症的公开内容。虽然另一相关技术公开了通过将针对癌症的多重标记的抑制剂组合治疗癌症的方法，但是没有公开使用膜联蛋白A1作为标记。
发明内容
本发明提供包含(a)包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质的融合蛋白，以及包含所述融合蛋白和可药用载体的药物组合物和使用所述创造性的药物组合物治疗或预防癌症的方法。
额外的方面将在随后的说明中部分阐述，和部分将从该说明中明晰，或者可通过所呈现的实施方式的实践而获知。
附图说明
图1是说明融合蛋白的示意图，所述融合蛋白包含：包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和包括诱导作用于癌细胞的细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质。
图2是NdeI-XhoI片段的示意图，所述NdeI-XhoI片段***到用于根据实施方式的由以下构成的融合蛋白表达的载体中：包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质。(GGGGS)接头对应于SEQID NO：120。
图3是说明融合蛋白的纯化结果的照片，所述融合蛋白包含：包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和包括抗CD3的第二蛋白质。根据实施方式，在各道中的L、FT、W和数字分别表示加载、流过、洗涤和咪唑摩尔浓度(mM)。
图4是AA1BPxCD3-活化的T细胞对分离的膜联蛋白A1-阳性/-阴性细胞的效果的图。细胞毒性T细胞克隆(由PMBC产生)与靶细胞(Ramos、SNU-1、SNU-2)混合并以10:1的效应物对靶(E:T)之比在AA1BPxCD3的指示浓度下温育3小时。显示来自特异性靶溶解的重复三次测定的平均值，以百分比计。
具体实施方式
现在将详细介绍实施方式，其实例在附图中说明，其中相同的附图标记始终是指相同的要素。在这方面，本发明的实施方式可具有不同的形式，且不应解释为限于本文所阐述的说明。因此，以下仅通过参考附图描述实施方式以解释本说明的各方面。
发明人发现，包含(a)包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质的融合蛋白可用于靶向在细胞表面表达膜联蛋白A1的癌细胞。
因此，本发明提供包含如下、基本上由如下组成或由如下组成的融合蛋白：(a)包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质。
本发明还提供含有融合蛋白及可药用载体的药物组合物，所述融合蛋白包含(a)包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质。
如本文中使用的术语“融合蛋白”是指包括两种或更多种(例如三种、四种、五种或更多种)蛋白质的蛋白复合物，其通过两种或更多种蛋白质自身的化学结合或者是通过接头的结合形成。
已知膜联蛋白(所述融合蛋白特异性结合的靶之一)存在于在从哺乳动物到霉菌的多种活生物体中，并且具有独特的保守域，其中称作内附蛋白折叠的包括“GXGTDE”(SEQID NO：118)基序的约70个氨基酸序列重复4次(有时重复8次)。已知膜联蛋白A1涉及多种生物现象例如膜运输、跨膜通道活性、磷脂酶A2的抑制、凝血抑制、有丝***信号的转导和细胞-基质相互作用的介导。膜联蛋白A1(膜联蛋白的亚家族)也称作脂皮质蛋白I。例如，膜联蛋白A1可由ANXA1基因编码。膜联蛋白A1属于膜联蛋白家族的Ca2+-依赖性的磷脂结合蛋白且可位于质膜的胞质面上。膜联蛋白A1蛋白质可具有约40kDa的分子量，具有磷脂酶A2抑制活性。另外，因为膜联蛋白A1具有位于正常细胞内部且由于癌症的产生而迁移到细胞的外膜的特性，因此其可用作癌症标记。因此，融合蛋白中的包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质可通过所述多肽特异性结合到癌细胞表面上的膜联蛋白A1。
如本文中使用的术语“特异性结合”与本领域技术人员已知的含义相同，且是指通过在两种或更多种多肽或蛋白质之间的共价键或非共价键的在分子间的特异性相互作用。例如，可包括抗原与抗体特异性相互作用以引起免疫反应的概念。
如本文中使用的术语“多肽”是指由彼此通过肽键相互结合的氨基酸残基形成的线性分子。特异性结合膜联蛋白A1的多肽可具有例如4-200、4-100或4-50个氨基酸残基。具有小于4个氨基酸残基的多肽可具有低的对膜联蛋白A1的结合亲和性。具有超过200个氨基酸残基的多肽可特异性结合到膜联蛋白A1。多肽可以通过本领域已知的各种方法制备，例如，基因克隆方法和固相合成技术。此外，多肽可以通过可商购的多肽文库(例如多肽文库，噬菌体M13-多肽文库等)经验地获得。
根据实施方式，第一蛋白质可为全长抗体或其抗原结合片段。全长抗体具有拥有两个全长轻链和两个全长重链的结构，并且各轻链通过二硫键(SS键)连接到各重链。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区，和重链恒定区具有γ、μ、α、δ和ε型以及γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2亚类。轻链恒定区具有κ和λ型。
抗体包括，但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、非人抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键Fv(sdFV)、抗独特型(抗-Id)抗体、及其表位结合片段。
抗体可为人源化抗体或人抗体。非人抗体例如小鼠的人源化抗体可为包括得自如下的最小序列的嵌合免疫球蛋白：小鼠免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段，例如Fv、Fab、Fab’、F(ab')2或抗体的其他抗原结合亚序列。
将非人抗体人源化的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有从非人类供给源引入的一个或多个氨基酸残基。人源化可通过使用对应于人抗体的序列基本上取代啮齿动物的互补决定区(CDR)或CDR序列的部分进行。因此，比基本上完整的人抗体的可变区小的区域可被来自非人物种的相应序列取代。例如，人源化抗体可为其中通过来自啮齿动物抗体中相似位点的残基取代一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基的那些。
人抗体是指其中重链和轻链的可变和恒定区序列得自人类的抗体，并可通过使用各种技术例如基因重组技术和基因工程产生。
人抗体的效应部分可与人体免疫***的其他部分相互作用。此外，人类免疫***不将人抗体识别为外源物质，因此，针对引入活的人体的抗体的免疫反应可显著地比针对全部外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体的免疫反应不严重。此外，引入到活的人体的人抗体具有与天然存在的人抗体基本上相同的半衰期，因此施用的剂量和频率可降低。如本文中使用的术语“嵌合”是指包括得自两种不同物种的序列的抗体或抗原结合位点。
如本文中使用的术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白的整体结构的抗原可结合的片段。例如，抗原结合片段可为F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段、或scFv片段，但不限于此。在抗原结合片段中，Fab片段含有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区、和重链的第一恒定区(CH1)。Fab片段具有一个抗原结合位点。Fab’片段与Fab片段的不同在于Fab’片段具有在重链CH1域的C末端有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab’)2抗体以在铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键产生。Fv片段是最小的抗体片段，其仅包含重链可变位点和轻链可变位点，且产生Fv片段的重组技术是本领域公知的。双链Fv片段可具有其中重链和轻链可变区通过非共价键连接的结构，和单链Fv(scFv)片段可具有其中重链和轻链可变区经由肽接头共价结合、或在C-末端直接彼此连接的二聚体结构。可通过使用蛋白酶获得抗原结合片段(例如，整个抗体可通过木瓜蛋白酶消化以获得Fab片段或通过胃蛋白酶消化以获得F(ab’)2片段)，且可通过基因重组技术制备抗原结合片段。
根据具体实施方式，融合蛋白的第一蛋白质可为具有由X1-Trp-Gly-His-X2-X3-Trp(SEQ ID NO：119)表示的氨基酸序列的多肽，其中X1和X2独立地为选自Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val、Asn、Cys、Gln、Gly、Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Arg、His和Lys的氨基酸，和X3是选自Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val、Asn、Cys、Gln、Gly、Ser、Thr和Tyr的氨基酸。具有由X1-Trp-Gly-His-X2-X3-Trp(SEQ ID NO:119)表示的氨基酸序列的多肽可选自SEQ ID NO：1-8的氨基酸序列。
根据实施方式，第一蛋白质可选自具有SEQ ID NO：9-42的氨基酸序列的多肽。这些可为特异性结合到膜联蛋白A1的多肽的氨基酸序列。这些可不为具有由表示X 1 -Trp- Gly-His-X 2 -X 3 -Trp的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)的多肽。
根据实施方式，第二蛋白质可特异性结合细胞毒性淋巴细胞的表面标记。例如，表面标记可选自，但不局限于，CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、D16、CD28、CD56、CD57、和TCR。
根据实施方式，第二蛋白质可为具有SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：117的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：116是包含小鼠抗-CD3的VH和VL的氨基酸序列，和SEQ ID NO：117是包含人抗-CD3的VH和VL的氨基酸序列。
根据实施方式，第二蛋白质可为全长抗体或其抗原结合片段。全长抗体或其抗原结合片段是如上所述的。
抗体或其抗原结合片段可包括保留特异性识别膜联蛋白A1或细胞毒性淋巴细胞的表面标记的能力的变体。例如，可对抗体的氨基酸序列进行修饰以改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。所述修饰包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、***、和/或取代。该氨基酸修饰基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，如疏水性、亲水性、电荷、大小等的性质。例如，精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)都是带正电的残基，丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)都是类似大小的，以及苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)都具有大体相似的形状。因此，基于这些考虑，Arg、Lys和His；Ala、Gly和Ser；以及Phe、Trp和Tyr可为生物功能等同物。
在蛋白质中通常不改变这样的分子活性的氨基酸取代在本领域是已知的。最通常发生的交换是：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。考虑到具有生物等同活性的修饰，可理解，特异性结合细胞毒性淋巴细胞或膜联蛋白A1的表面标记的抗体或其抗原结合片段，可还包括展现出与序列表中描述的序列相当同一性的序列。相当同一性可为当对任何其他序列进行比对以最大地对应序列表中的氨基酸序列并通过使用本领域典型使用的算法分析经比对的序列时显示至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、或至少90％同一性(例如至少95％同一性或至少99％的同一性)的序列。用于序列比较的比对方法在本领域是已知的。例如，序列分析程序如blastp、blastx、tblastn和tblastx可通过NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)在互联网上使用。
根据实施方式，融合蛋白任选地可包括将第一蛋白质和第二蛋白质连接的接头。用于本发明的合适的接头在本领域是已知的且包括肽接头(例如，由多个氨基酸残基组成的)。只要融合蛋白的生物活性不受影响，融合蛋白可不包括接头或包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或更多个)任意合适长度的接头。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但肽接头可通过将包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和包括诱导细胞毒性淋巴细胞的活性的多肽的第二蛋白质以足够的距离分开而允许融合蛋白的各蛋白质折叠为合适的二级和三级结构。例如，肽接头可包括Gly、Asn和Ser残基，和中性氨基酸如Thr和Ala。适于肽接头的氨基酸序列是本领域已知的，并可为例如Gly4-Ser(SEQ ID NO：120)、(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：121)或Gly4-Ser-Gly5-Ser(SEQ ID NO：122)。
肽接头可连接到特异性结合膜联蛋白A1的多肽的N-和/或C-末端区。特别地，当肽接头连接到多肽的N-末端和C-末端时，肽接头可包括各半胱氨酸，且在各半胱氨酸之间可出现二硫键以容许所述多肽存在于两个半胱氨酸之间。
本发明还提供治疗或预防受试者的癌症的方法，包括将药物组合物向受试者施用使得受试者中的癌症得到治疗或预防，所述药物组合物包括融合蛋白和可药用载体，所述融合蛋白包含如下、基本上由如下组成或由如下组成：(a)包括特异性结合药物有效量的膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质。
可由包括所述融合蛋白的组合物治疗或预防的癌症可选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑色素瘤、直肠癌、***附近的癌症、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子***、卵巢癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、以及头颈癌，但不限于此。
所述组合物通过结合癌细胞表面上的膜联蛋白和结合细胞毒性淋巴细胞表面上的表面标记(例如CD3)而治疗或预防癌症。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但据信，所述组合物通过将细胞毒性淋巴细胞定位在癌细胞附近来治疗或预防癌症，该癌细胞随后被细胞毒性淋巴细胞分泌的细胞毒性颗粒破坏。
如图1所示，融合蛋白140包含包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和包括诱导作用于癌细胞120的细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质。融合蛋白140特异性结合癌细胞120表面上的膜联蛋白130和细胞毒性淋巴细胞100表面上的表面标记110两者。通过将细胞毒性淋巴细胞100定位于癌细胞120周围，可通过细胞毒性淋巴细胞100分泌的细胞毒性颗粒特异性杀死癌细胞120，而不影响正常细胞。因此，创造性的融合蛋白(例如，在药物组合物中)特异性靶向癌细胞以进行破坏，而不影响正常(非癌)细胞。
所述组合物中包括的可药用载体是在制剂中通常使用的，并可包括，但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、及矿物油。除了所述组分之外，所述药物组合物可额外地包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、增味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
预防或治疗癌症的组合物可口服或肠胃外施用。肠胃外施用可包括静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠施用。由于口服施用导致蛋白质或肽的消化，可将活性剂包覆或配制在药物组合物中以保护所述组合物免于在胃中分解。此外，所述组合物可通过任意具有朝向特定细胞的靶向能力的装置施用。
预防或治疗癌症的组合物的合适剂量可取决于许多因素，如配制方法、施用方法、病人的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、***速度、和反应敏感性。对于成年人，所述组合物的剂量可在约0.001-约100mg/kg的范围内。如本文使用的术语“治疗有效量”是指用于预防或治疗癌症的足够量。
可通过本领域技术人员已知的任意方法，将所述组合物与可药用载体和/或赋形剂配制为单位剂型或多重剂型。制剂可为溶液、悬浮液、糖浆、或在油或水性介质中的乳液、提取物、粉剂、粉末、颗粒、片剂、或胶囊，且可额外地包括分散剂或稳定剂。此外，所述组合物可以作为单独的治疗剂施用，或与其他治疗剂组合施用，并可与常规治疗剂顺序或同时施用。
所述组合物可包含抗体或其抗原结合片段，因此可配制为免疫脂质体。可使用本领域公知的任意方法制备含有抗体的脂质体。免疫脂质体是包括磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰基乙醇胺的脂质组合物，并可例如通过反相蒸发法制备。例如，抗体的F(ab′)2片段可通过二硫键交换反应附接于脂质体。
可将预防或治疗癌症的药物组合物施用的受试者包括所有的动物。例如，所述受试者可为人或例如狗、猫、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠)的动物，以及除人以外的灵长类动物。
根据本发明的另一方面，用于制备融合蛋白的方法包括：培养包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的细胞，所述融合蛋白包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质(例如，其中第二蛋白质可连接到第一蛋白质的末端)；和获得由在细胞培养中产生的培养物表达的蛋白质。
可通过本领域已知的各种方法进行转化细胞的培养。例如，体内或体外分泌的蛋白质可通过如下获得：将转化细胞接种入YT液相培养基中以进行培养，在当细胞密度达到一定水平的时间点处向培养基中加入IPTG以诱导通过lacZ启动子的蛋白质表达，和培养所述蛋白质。
可通过本领域已知的各种纯化方法以纯化形式得到体内或体外分泌的蛋白质。例如，可通过纯化方法例如通过硫酸铵的溶解度分级、以及大小分级和过滤与各种色谱分离方法(对于根据大小、疏水性或亲水性的分离制造的)，以纯化形式得到蛋白质。例如，当融合蛋白融合到GST和6x His时，可通过分别使用结合了谷胱甘肽的树脂柱和Ni2+-NTA His-结合树脂柱容易地获得所需的蛋白质。
实施例
下面的实施例进一步说明本发明，但是当然不应该以任何方式解释为限制其范围。
实施例1：特异性结合膜联蛋白A1的多肽的筛选
(1)生物淘选
编码膜联蛋白A1的多核苷酸是由Genotech，Inc.化学合成的，并用于表达膜联蛋白A1以进行分离和纯化。将膜联蛋白A1固定到板上，向其加入噬菌体展示多肽文库(DyaxCorp.)以进行结合，并通过各种结合时间和洗涤条件选择以高亲和力结合的多肽表达噬菌体。
使用珠淘选方法作为所述淘选。具体地，将表面上固定有抗生蛋白链菌素的磁珠与生物素缀合的膜联蛋白A1混合，并在4°C搅拌混合物18小时以将蛋白质固定在磁珠表面上。在室温下用脱脂乳将其上固定蛋白质的磁珠封闭2小时，然后添加在所述珠的表面上展示多肽的噬菌体溶液。将得到的产物搅拌2小时进行反应，并用PBS溶液(1.06mM KH2PO4，155.17mM NaCl，和2.97mM Na2HPO4-7H2O)和含0.1％Tween20的PBS溶液洗涤。仅分离出结合抗原的噬菌体。根据在淘选后获得的噬菌体数进行淘选过程两次或三次。
(2)特异性结合于噬菌体ELISA和膜联蛋白D1的多肽序列的鉴定
将在淘选过程中得到的噬菌体克隆各自用大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue感染，并在约37°C培养14小时以获得噬菌体溶液。将膜联蛋白A1添加到96孔微量滴定板(Nunc，Inc.)，并容许在约4℃放置18小时以将蛋白质固定在板表面上。在室温下用脱脂乳将其上固定蛋白质的板封闭1小时，然后加入100μL噬菌体溶液。在室温下使噬菌体与蛋白质反应2小时，并用含0.1％Tween20的PBS溶液洗涤混合物。随后，在室温下向反应混合物中加入与噬菌体特异性反应的HRP缀合的抗-M13抗体(GE Healthcare)以反应1小时，然后用含0.1％Tween20的PBS溶液洗涤两次。最后，向板的各孔加入100μL三甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma)以诱导显色反应。随后加入50μL5N H2SO4溶液以停止反应，然后用板阅读器(MolecularDevices)测量OD450值。
结果，总共鉴定出42个与膜联蛋白A1具有高反应性的噬菌体克隆。使用引物组(SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115)进行菌落PCR以从噬菌体的单克隆中鉴定编码特异性结合膜联蛋白A1的多肽的核苷酸序列。通过使用GeneAmp PCR System9700(AppliedBiosystem)进行PCR，PCR条件如下：在94℃5分钟；在94℃1分钟、在60℃1分钟和在72℃1.5分钟的连续反应重复30次；在72℃10分钟；和在4℃冷却。随后，进行由溶液获得的多核苷酸片段的洗涤和序列分析(Solgent)，并鉴定特异性结合膜联蛋白A1的多肽序列(表1)。表1鉴定了展示在噬菌体上展示的多肽部分(不包括肽接头)，即特异性结合膜联蛋白A1的多肽的氨基酸序列和相应的核酸序列。
[表1]
序号 氨基酸序列 核酸序列
1 QWGHTLW(SEQ ID NO:1) cagtggggccataccctgtgg(SEQ ID NO:43)
2 KWGHEVW(SEQ ID NO:2) aaatggggccatgaagtgtgg(SEQ ID NO:44)
3 WWGHEQW(SEQ ID NO:3) tggtggggccatgaacagtgg(SEQ ID NO:45)
4 PWGHEIW(SEQ ID NO:4) ccgtggggccatgaaatttgg(SEQ ID NO:46)
5 LWGHHIW(SEQ ID NO:5) ctgtggggccatcatatttgg(SEQ ID NO:47)
6 LWGHQIW(SEQ ID NO:6) ctgtggggccatcagatttgg(SEQ ID NO:48)
7 LWGHGMW(SEQ ID NO:7) ctgtggggccatggcatgtgg(SEQ ID NO:49)
8 AWGHPFW(SEQ ID NO:8) gcgtggggccatccgttttgg(SEQ ID NO:50)
9 MNRV(SEQ ID NO:9) atgaaccgcgtg(SEQ ID NO:51)
10 SLNSIL(SEQ ID NO:10) agcctgaacagcattctg(SEQ ID NO:52)
11 NLNAWF(SEQ ID NO:11) aacctgaacgcgtggttt(SEQ ID NO:53)
12 VEWPWW(SEQ ID NO:12) gtggaatggccgtggtgg(SEQ ID NO:54)
13 WLWPRL(SEQ ID NO:13) tggctgtggccgcgcctg(SEQ ID NO:55)
14 IDYGLF(SEQ ID NO:14) attgattatggcctgttt(SEQ ID NO:56)
15 VEGQQWW(SEQ ID NO:15) gtggaaggccagcagtggtgg(SEQ ID NO:57)
16 WMGHSAW(SEQ ID NO:16) tggatgggccatagcgcgtgg(SEQ ID NO:58)
17 GIHHPIW(SEQ ID NO:17) ggcattcatcatccgatttgg(SEQ ID NO:59)
18 WGGHPIW(SEQ ID NO:18) tggggcggccatccgatttgg(SEQ ID NO:60)
19 PWAKIFW(SEQ ID NO:19) ccgtgggcgaaaattttttgg(SEQ ID NO:61)
20 MGSKMWG(SEQ ID NO:20) atgggcagcaaaatgtggggc(SEQ ID NO:62)
21 MLWEDQD(SEQ ID NO:21) atgctgtgggaagatcaggat(SEQ ID NO:63)
序号 氨基酸序列 核酸序列
22 ELFDGYD(SEQ ID NO:22) gaactgtttgatggctatgat(SEQ ID NO:64)
23 WPWEANH(SEQ ID NO:23) tggccgtgggaagcgaaccat(SEQ ID NO:65)
24 EQYGFPF(SEQ ID NO:24) gaacagtatggctttccgttt(SEQ ID NO:66)
25 SGFGHMIW(SEQ ID NO:25) agcggctttggccatatgatttgg(SEQ ID NO:67)
26 ETRFHAIW(SEQ ID NO:26) gaaacccgctttcatgcgatttgg(SEQ ID NO:68)
27 MLHHHQRE(SEQ ID NO:27) atgctgcatcatcatcagcgcgaa(SEQ ID NO:69)
28 ALHNEPHT(SEQ ID NO:28) gcgctgcataacgaaccgcatacc(SEQ ID NO:70)
29 AFHNDPAE(SEQ ID NO:29) gcgtttcataacgatccggcggaa(SEQ ID NO:71)
30 LLFSDIGN(SEQ ID NO:30) ctgctgtttagcgatattggcaac(SEQ ID NO:72)
31 LVLKGKWH(SEQ ID NO:31) ctggtgctgaaaggcaaatggcat(SEQ ID NO:73)
32 SGNGKPFWM(SEQ ID NO:32) agcggcaacggcaaaccgttttggatg(SEQ ID NO:74)
33 IQRGGVDWS(SEQ ID NO:33) attcagcgcggcggcgtggattggagc(SEQ ID NO:75)
34 RDSQSWSWS(SEQ ID NO:34) cgcgatagccagagctggagctggagc(SEQ ID NO:76)
35 LLESQNPQD(SEQ ID NO:35) ctgctggaaagccagaacccgcaggat(SEQ ID NO:77)
36 IINGWNPIW(SEQ ID NO:36) attattaacggctggaacccgatttgg(SEQ ID NO:78)
37 DWTTAYGPS(SEQ ID NO:37) gattggaccaccgcgtatggcccgagc(SEQ ID NO:79)
38 IYDGNWSYWH(SEQ ID NO:38) atttatgatggcaactggagctattggcat(SEQ ID NO:80)
39 STDSNWFFNA(SEQ ID NO:39) agcaccgatagcaactggttttttaacgcg(SEQ ID NO:81)
40 MPENWISWYR(SEQ ID NO:40) atgccggaaaactggattagctggtatcgc(SEQ ID NO:82)
41 VRTDWYSMLM(SEQ ID NO:41) gtgcgcaccgattggtatagcatgctgatg(SEQ ID NO:83)
42 MIQTSSANRD(SEQ ID NO:42) atgattcagaccagcagcgcgaaccgcgat(SEQ ID NO:84)
实施例2：由抗-CD3和膜联蛋白A1结合多肽组成的融合蛋白的表达载体的制备
在本实施例中，制备用于制造包括(a)可特异结合CD3的抗-CD3多肽(诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽)和(b)实施例1中制备的膜联蛋白A1结合多肽的融合蛋白的表达载体。包括如图2所示结构的NheI-XhoI片段由Genotech，Inc.化学合成，且合成的NheI-XhoI片段用NheI和XhoI消化并***到用相同的限制酶消化的pET21b(Promega)中以完成表达载体。通过将2种类型(小鼠或人)的编码抗-CD3的多核苷酸和8种类型的编码膜联蛋白A1结合多肽(分别是SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)的多核苷酸组合，将NheI-XhoI片段总共制备出16种类型。NheI-XhoI片段各自由SEQ ID NO：85-100表示。由NheI-XhoI片段表达的融合蛋白分别命名为M1，M2，M3，M4，M5，M6，M7，M8，H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7和H8。
此外，为了改善所表达的融合蛋白的溶解度，通过使用表达载体制造用于泛素附接于融合蛋白的蛋白质的表达的载体。容许泛素定位于图2中所示的NheI-XhoI片段中的pelB和FLAG之间。制造用于泛素附接的融合蛋白的表达的载体的方法如下。
首先，使用所述表达载体作为模板进行PCR，正向引物(5`-cgccatatgaaatacctgctgccgaccgctg-3`(pelB:NdeI-F;SEQ ID NO：101))设计为包括NdeI限制位点和包括pelB的5’区，且反向引物(5`-cccggatccggccatggccggctggg-3`(pelB-NcoI：BamHI-R；SEQ ID NO：102))设计为包括BamHI限制位点和包括pelB的3’区。获得的PCR产物用NdeI和BamHI消化，并纯化以获得NdeI-BamHI片段。
随后，将在pET21b载体的Bam HI和EcoRI限制位点间包括编码泛素的多核苷酸(SEQ ID NO：103)的载体用NdeI和BamHI消化并纯化，和使NdeI-BamHI片段进行连接。将连接产物测序和鉴定。
随后，使用16种类型表达载体的每一种作为模板以及如下的正向和反向引物通过PCR获得包括编码FLAG-VH-接头-VL-(GGGGS)接头(SEQ ID NO：120)-膜联蛋白A1结合多肽的多核苷酸的DNA片段。正向引物通过如下设计：包括EcoRI限制位点和FLAG标签，和各自不同地使用对应于小鼠抗-CD3抗体的VH的部分和对应于人抗-CD3抗体的VH的部分。反向引物设计为包括XhoI限制位点和包括编码膜联蛋白A1结合多肽的多核苷酸的一些。所用的引物如下：
正向引物：
5`-ccggaattcgactacaaagatgatgacgataaggatatcaaac-3`(Flag-小鼠a-CD3:EcoRI-F)(SEQ ID NO:104)
5`-ccggaattcgactacaaagatgatgacgataaggagctg-3`(Flag-人_a-CD3:EcoRI-F)(SEQ ID NO:105)
反向引物：
5`-ccgctcgaggcaccaaaacggatgg-3`(pep1:XhoI-R)(SEQ ID NO:106)
5`-ccgctcgaggcaccaaatatgatggcc-3`(pep2:XhoI-R)(SEQ ID NO:107)
5`-ccgctcgaggcaatcctgatcttcccac-3`(pep3:XhoI-R)(SEQ ID NO:108)
5`-ccgctcgaggcaccaaaaaattttcgc-3`(pep4:XhoI-R)(SEQ ID NO:109)
5`-ccgctcgaggcaccaaatttcatgacc-3`(pep5:XhoI-R)(SEQ ID NO:110)
5`-ccgctcgaggcaccacagggtatgacc-3`(pep6:XhoI-R)(SEQ ID NO:111)
5`-ccgctcgaggcaccaccactgctgg-3`(pep7:XhoI-R)(SEQ ID NO:112)
5`-ccgctcgaggcaccacgcggaatg-3`(pep8:XhoI-R)(SEQ ID NO:113)
随后，将获得的PCR产物用EcoRI和XhoI消化并纯化，且连接产物也用EcoRI和XhoI消化并纯化。将纯化产物相互连接、测序并鉴定。泛素附接于融合蛋白的蛋白分别命名为Ub-M1，Ub-M2，Ub-M3，Ub-M4，Ub-M5，Ub-M6，Ub-M7，Ub-M8，Ub-H1，Ub-H2，Ub-H3，Ub-H4，Ub-H5，Ub-H6，Ub-H7和Ub-H8。
实施例3：融合蛋白的表达和纯化
为了使用实施例2中制造的载体过表达融合蛋白，在用所述载体(编码泛素附接的融合蛋白的载体)转化的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中表达融合蛋白。然后，使用YT培养基作为培养基，当在600nm的光密度(O.D.)值为0.5时向其加入0.1mM的IPTG，并将细胞在18°C再温育16个小时。将由所述培养物获得的细胞在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中声波处理，然后在13,000rpm下离心以获得上清液。将上清液施加到用缓冲液平衡的Ni2+-NTAsuperflow柱(Qiagen)并用对应于5倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，1MNaCl)洗涤，并用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，250mM咪唑)洗脱蛋白质。收集包括融合蛋白的级分，并施加到用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，250mM咪唑)平衡的Q柱(Amersham Biosciences)和用对应于5倍柱体积的清洗缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4)洗涤，并用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，500mM NaCl)洗脱蛋白质。收集包括融合蛋白的级分并进行透析以除去盐。使用Amicon(Millipore)浓缩蛋白质。通过使用BSA作为标准物测量纯化的蛋白质的浓度。使用SDS-PAGE，鉴定融合蛋白(Ub-H2)为约30kDa并纯化(见图3)。
根据实施方式的包括融合蛋白和可药用载体的药物组合物可有效地预防或治疗癌症，所述融合蛋白由包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质和连接到第一蛋白质末端的包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质组成。
实施例4：细胞培养物、细胞系和T-细胞分离
从American Type Culture Collection购买人伯基特(Burkitt)淋巴瘤细胞Ramos(ATCC CRL-1596)。从American Type Culture Collection购买胃癌细胞系SNU1、SNU5(ATCC CRL-5971，ATCC CRL-5973)。如由供应商推荐的那样培养细胞。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从由当地血库获得的血液分离外周血单核细胞(PBMC)。通过在RBC溶解缓冲液(155mM NH4Cl，10mMKHCO3，和0.1mM EDTA)中在室温下温育15分钟除去红细胞(RBC)。通过离心使细胞沉淀(在600g5分钟)。丢弃上清液，并将细胞再悬浮在PBS中。在通过在110g的离心步骤15分钟除去大部分血小板后，将PBMC再悬浮在培养基中且典型地使用在没有刺激的情况下制备之后4天。使用Human CD8Subset Column试剂盒(R&D Systems，Wiesbaden，Germany)分离CD8+T细胞。
实施例5：细胞毒性测定
钙黄绿素AM释放测定用于确定与CD3融合的膜联蛋白A1结合肽(AA1BPxCD3)的细胞毒性活性。在3小时后确定细胞毒性。将Ramos或SNU-5或SNU-1细胞(1.5x107)用10mM钙黄绿素AM(Molecular Probes)在细胞培养基中在37℃标记30分钟。在细胞培养基中3次洗涤后，调节细胞密度至在RPMI1640/10%FCS中3x105个细胞/ml，且每次测定反应使用100μl的3x104个细胞的等分试样。在96孔圆底板中，在指示的AA1BPxCD3浓度下一式三份地共培养CD8+T细胞和靶细胞。对于10:1的E:T之比，靶细胞数量保持恒定在3x104个细胞/孔。AA1BPxCD3稀释在RPMI1640/10%FCS中至所需浓度。在200μl的总反应容积中，将反应温育3小时。使用荧光读取器(2104Multilabel Reader，USA)测量从溶解细胞释放的荧光钙黄绿素。通过在不存在AA1BPxCD3下温育效应物和靶细胞确定对照荧光钙黄绿素。为确定总细胞溶解，通过添加20μl的1%皂苷溶解不具有AA1BPxCD3的效应物和经标记的靶细胞的混合物10分钟。根据下式计算特异性细胞毒性：
%特异性溶解=[(样品的荧光-对照的荧光)/(总溶解的荧光-对照的荧光)]x100
应理解，本文中描述的示例性实施方式应仅在描述意义上考虑而不用于限制的目的。在各实施方式中的特征或方面的描述应典型地被视为可用于其他实施方式中其他类似的特征或方面。

Claims (10)

1.融合蛋白，包含：
(a)包括特异性结合膜联蛋白A1的多肽的第一蛋白质，和
(b)包括诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的多肽的第二蛋白质，
其中所述第一蛋白质包括选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列；或
其中所述第一蛋白质包括选自SEQ ID NO:9-42的氨基酸序列。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包括连接所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的接头。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述第一蛋白质是全长抗体或其抗原结合片段。
4.权利要求1的融合蛋白，其中所述第二蛋白质特异性结合细胞毒性淋巴细胞的表面标记。
5.权利要求4的融合蛋白，其中所述表面标记选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD28、CD56、CD57和TCR。
6.权利要求4的融合蛋白，其中所述第二蛋白质包括SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117的氨基酸序列。
7.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二蛋白质是全长抗体或其抗原结合片段。
8.药物组合物，包括权利要求1的融合蛋白和可药用载体。
9.权利要求8的药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述癌症选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑色素瘤、直肠癌、***附近的癌症、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子***、卵巢癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、及头颈癌。
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