KR20150029457A - 아넥신 a1에 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

아넥신 a1에 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

아넥신 A1(Annexin A1)에 특이적으로 결합하여 기능을 저해하는 폴리펩타이드 및 이의 용도가 제공되며, 구체적으로, 아넥신 A1에 결합하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1에 대한 길항제, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 길항체 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방, 치료 및/또는 진단용 약학 조성물이 제공된다.

Description

아넥신 A1에 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도{Polypeptide binding to Annexin A1 and use thereof}
아넥신 A1(Annexin A1)에 특이적으로 결합하여 기능을 저해하는 폴리펩타이드 및 이의 용도가 제공되며, 구체적으로, 아넥신 A1에 결합하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1에 대한 길항제, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 길항체 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방, 치료 및/또는 진단용 약학 조성물이 제공된다.
항체는 항원과 결합함으로써 이들의 생물학적 활성을 개시한다. 항원과 결합하는 항체는 일반적으로 하나의 항원에 특이적이고 상기 결합은 대개 친화도가 높다. 항체는 B-림프구에 의해 생성된다. 혈액은 많은 상이한 항체들을 포함하고 있고, 각 항체는 B-세포의 클론으로부터 유래되며 항원에 대해 독특한 구조 및 특이성을 가진다.
한편, 아넥신(Annexin)은 20여년 전부터 리포코르틴, 칼팍틴, 엔도넥신 등으로 불리던 단백질을 10여년 전부터 통일시켜 부르기 시작한 단백질의 이름이다. 아넥신은 칼슘과 포스포리피드 (phospholipid)에 결합하며, 엔도넥신-폴드(endonexin-fold)라고 불리는 'GXGTDE' 모티프를 포함하는 약 70개 아미노산 서열이 4번 반복(8번 반복이 되는 경우도 존재)되는 독특한 보존된 도메인을 갖는다. 종래에 발표된 아넥신 계열 단백질들은 상기 보존된 도메인을 포함하고 있으며, 상기 서열의 보존 여부로 아넥신 계열 단백질 여부가 결정된다.
아넥신 단백질은 포유류에서 사상균에 이르기까지 다양한 생명체에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 인간에서는 아넥신 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ 및 XIII 등이 보고되고 있다. 아넥신 단백질은 뼈의 구조 형성에 관여할 뿐만 아니라 막 트래피킹, 막투과 채널 활성, 포스포리파아제 A2의 억제, 응고 억제, 미토겐 시그널의 전달, 세포-매트릭스 상호작용 조정 등 다양한 생물학적 현상에 관여하는 것으로 여겨지고 있다. 아넥신 단백질들 중, 아넥신 Ⅰ 그룹에 속하는 아넥신 A1(아넥신 A1)은 암 조직에서도 발견되는 것으로 알려져 있다.
암세포에서 과발현되는 단백질을 이용한 항암제를 개발을 위한 많은 연구들이 진행되고 있는 상황에서, 아넥신 A1의 표적으로서의 중요성이 커져가고 있으며, 보다 효과적이고 강력한 아넥신 A1 표적 약물의 개발이 요구되고 있다.
일 예는 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1 길항제를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는, 아넥신 A1에 특이적으로 결합하는 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 예는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 아넥신 A1 길항제를 유효성분으로 포함하는 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 아넥신 A1 길항제를 포함하는 아넥신 A1 검출용 조성물 및 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 아넥신 A1에 결합하는 신규 폴리펩타이드 및 이의 활용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아넥신 A1 단백질 또는 아넥신 A1의 일부 절편(fragment)에 결합하는 신규 폴리펩타이드 및 이의 용도를 포함한다.
일반적으로 아넥신 A1은 세포간의 신호 전달에 관여하며 칼슘(Ca) 농도에 따라 기능이 조절되는 것으로 알려져 있다. 또한 아넥신 A1은 암 세포의 성장 및 전이에 영향을 미치는 인자로 여겨지며, 다양한 암에서의 아넥신 A1의 과발현이 보고되고 있다. 이에, 본 발명자들은 phage library screening 방법을 통해 아넥신 A1에 결합하는 신규 폴리펩타이드를 발굴하여, 이를 질병 진단 및 치료에 활용하고자 한다.
본 발명의 일 예는 신규한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 아넥신 A1에 결합하는 기능을 가지며, 일 예에서는 전장 아넥신 A1 또는 아넥신 A1의 세포 외 노출 부위 (예컨대 20 내지 40 아미노산 길이, 또는 25 내지 35 아미노산 길이의 N 말단 부위)에 특이적으로 결합하여 아넥신 A1의 기능을 저해하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 폴리펩타이드는
서열번호 2 및 서열번호 147 (일반식 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 48, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 70, 서열번호 73, 및 서열번호 148 (일반식 2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 149 (일반식 3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
서열번호 135 및 서열번호 150(일반식 4)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다:
일반식 1
X1-Y-X2-M-S (서열번호 147)
상기 일반식 1 중, X1은 Asn(N), Gly(G), Asp(D), 또는 Ser(S)이고,
X2는 Ala(A), Ser(S), 또는 Tyr(Y)이며,
일반식 2
X3-X4-X5-X6-X7-F-D-Y (서열번호 148)
상기 일반식 2 중, X3은 Arg(R) 또는 Lys(K)이고,
X4는 Arg(R), Gly(G), Ala(A), Met(M), Lys(K), Ser(S), 또는 Asn(N)이며,
X5는 Ala(A), Ser(S), Leu(L), Ile(I), Thr(T), Val(V), Gly(G), Asn(N), Pro(P), 또는 Lys(K)이고,
X6은 Ile(I), Pro(P), Gly(G), His(H), Thr(T), Ser(S), Ala(A), Asn(N), Trp(W), Lys(K), 또는 Gln(Q)이며,
X7은 Arg(R), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Gly(G), Ser(S), Thr(T), 또는 Val(V)이고,
일반식 3
X8-G-X9-S-X10-N-I-G-X11-N-X12-V-X13 (서열번호 149)
상기 일반식 3 중, X8은 Ser(S) 또는 Thr(T)이고,
X9는 Ser(S) 또는 Thr(T)이며,
X10은 Ser(S) 또는 Phe(F)이고,
X11은 Ser(S), Asn(N), 또는 Ile(I)이고,
X12는 Asp(D), Ser(S), Asn(N), Ala(A), Thr(T), 또는 Tyr(Y)이며,
X13은 Thr(T), Asn(N), 또는 Ser(S)이고,
일반식 4
X14-X15-W-D-X16-S-L-X17-X18 (서열번호 150)
상기 일반식 4 중, X14는 Gly(G) 또는 Ala(A)이며,
X15는 Thr(T), Ser(S), 또는 Ala(A)이고,
X16은 Asp(D), Tyr(Y), Ser(S), 또는 Ala(A)이며,
X17은 Asn(N) 또는 Ser(S)이고,
X18은 Gly(G) 또는 Ala(A)이다.
보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드는
서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 43 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 75 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
서열번호 113 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 12 내지 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 43 내지 서열번호 57로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 75 내지 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 95 내지 서열번호 100으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
서열번호 113 내지 서열번호 122로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 폴리펩타이드는 아넥신 A1의 N 말단 (20 내지 40 아미노산 길이, 또는 25 내지 35 아미노산 길이의 N 말단 부위; 예컨대, 서열번호 151)에 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는,
서열번호 7 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 27 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 58 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 86 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
서열번호 101 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
서열번호 123 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 폴리펩타이드는 전장 아넥신 A1 (예컨대, Accession No. NP_000691.1, 서열번호 152)에 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 150의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 아넥신 A1 (전장 또는 세포 노출 부위 (예컨대 N 말단))와 특이적으로 결합하고, 이의 기능을 저해하는 기능을 가지며, 이러한 기능에 의하여 항 아넥신 A1 항체의 상보성 결정 부위로서 작용할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 항 아넥신 A1 항체의 상보성 결정 부위로서의 기능을 아래의 표 1에 정리하였다:
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TGSSSNIGNNDVS(서열번호89) SDNQ(서열번호104) GAWDSSLNA(서열번호126)
SGSSSNIGSNDVS(서열번호93) YDSN(서열번호109) GTWDSSLSG(서열번호134)
TGSSSNIGINDVS(서열번호94) ADNN(서열번호112) AACDDNLND(서열번호135)
TGSSSNIGNNDVS(서열번호89) YNSQ(서열번호101) GSWDDSLSA(서열번호136)
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 137 내지 서열번호 146으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 137 내지 서열번호 140으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 폴리펩타이드는 아넥신 A1의 N 말단 부위 (20 내지 40 아미노산 길이, 또는 25 내지 35 아미노산 길이의 N 말단 부위; 예컨대, 서열번호 151) 또는 상기 N 말단 부위 내의 인접하는 2 내지 30, 5 내지 25, 또는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 것일 수 있다. 상기 아넥신 A1의 N 말단 부위는 아넥신 A1이 세포 표면에 노출되는 환경(예컨대, 칼슘 존재)에서 세포와의 결합 부위가 아닌 세포 외 노출 부위이며, 상기 폴리펩타이드는 상기 노출된 아넥신 A1의 N 말단 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 141 내지 서열번호 146으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 폴리펩타이드는 전장 아넥신 A1 (예컨대, Accession No. NP_000691.1) 또는 상기 전장 단백질 중의 1차, 2차 또는 3차 구조 상의 인접하는 2 내지 30, 5 내지 25, 또는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 결합하는 전장 아넥신 A1의 부위는 아넥신 A1이 세포 표면에 노출되는 환경(예컨대, 칼슘 존재)에서 아넥신 A1의 세포와의 결합 부위가 아닌 세포 외 노출 부위일 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 폴리펩타이드는 아넥신 A1 (전장 또는 일부분)와 특이적으로 결합하고, 이의 기능을 저해하는 기능을 가지므로, 아넥신 A1에 대한 길항제, 예컨대, 항 아넥신 A1 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 항 아넥신 A1 항체 유사체 (항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 구조체; 예컨대, 펩티바디, 나노바디, 등)의 전구체 또는 구성 부분으로서 역할을 할 수 있다.
따라서, 다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1에 대한 길항제를 제공한다. 상기 길항제는 아넥신 A1의 기능을 저해하는 역할을 하는 것으로, 항 아넥신 A1 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 항 아넥신 A1 항체 유사체 (예컨대, 펩티바디, 나노바디, 이중 결합 항체, 다중 결합 항체 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, 아넥신 A1)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, 아넥신 A1)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 길항제는 상기 표적과 상호작용하는 물질에 결합하여 그 물질의 활성을 감소시키거나, 상기 물질에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시키거나, 또는 사멸시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 길항제는 표적과 다른 물질과의 상호 작용을 완전히 단절시키거나, 표적과 경쟁적으로 상기 물질과 상호작용하거나, 상기 물질의 3차 구조의 변화 또는 하향 조절(down regulation)에 의해 상기 상호 작용을 실질적으로 감소시키는 것일 수 있다.
용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 상기 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용하여, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다.
용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.
용어 "이중 결합 항체" 또는 "다중 결합 항체"는 2개(이중 결합 항체) 또는 그 이상(다중 결합 항체)의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 이중 결합 항체 또는 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 상기 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아넥신 A1을 특이적으로 인식하거나 아넥신 A1에 특이적으로 결합한다. 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 2 및 서열번호 147 (일반식 1)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 48, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 70, 서열번호 73, 및 서열번호 148 (일반식 2)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 149 (일반식 3)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 135 및 서열번호 150(일반식 4)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 기재된 일반식 1 내지 일반식 4의 정의는 앞서 설명한 바와 같다.
보다 구체적으로, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 43 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 75 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L12, 및 서열번호 113 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 내지 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 43 내지 서열번호 57로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 75 내지 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 95 내지 서열번호 100으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 및 서열번호 113 내지 서열번호 122로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아넥신 A1의 N 말단 부위 (20 내지 40 아미노산 길이, 또는 25 내지 35 아미노산 길이의 N 말단 부위; 예컨대, 서열번호 151), 또는 상기 N 말단 부위 내의 인접하는 2 내지 30, 5 내지 25, 또는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하는 부위를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 7 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 27 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 58 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 86 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 101 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 123 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 아넥신 A1 단백질 (예컨대, Accession No. NP_000691.1) 또는 상기 전장 단백질 내의 1차, 2차 또는 3차 구조 상의 인접하는 2 내지 30, 5 내지 25, 또는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하는 부위를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 137 내지 서열번호 146으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 scFv일 수 있다. 예컨대, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 137 내지 서열번호 140으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 scFv일 수 있으며, 이 경우, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아넥신 A1의 N 말단 (20 내지 40 아미노산 길이, 또는 25 내지 35 아미노산 길이의 N 말단 부위 (예컨대, 서열번호 151) 또는 상기 N 말단 부위 내의 인접하는 2 내지 30, 5 내지 25, 또는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하는 부위를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 기능을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 141 내지 서열번호 146으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 scFv일 수 있으며, 이 경우, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 아넥신 A1 (예컨대, Accession No. NP_000691.1) 또는 상기 전장 단백질 내의 1차, 2차 또는 3차 구조 상의 인접하는 2 내지 30, 5 내지 25, 또는 10 내지 20개의 아미노산을 포함하는 부위를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 기능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함한다. 　한편, "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위를 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.
아넥신 A1(Annexin I)은 인 칼슘이온 의존적 인지질 결합 단백질 (Ca2 +-dependent phospholipid-binding proteins)의 아넥신 계열 단백질에 속한다. 상기 아넥신 A1은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래의 Human 아넥신 A1 (예컨대, NCBI Accession No. NP_000691.1 등), 원숭이 유래의 원숭이 아넥신 A1 (예컨대, NCBI Accession No. AFH29166.1 등), 마우스 유래의 Mouse 아넥신 A1 (NCBI Accession No. NP_034860.2 등), 래트 유래의 래트 아넥신 A1 (예컨대, NCBI Accession No. 001164623.1 등) 등일 수 있다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이 때, 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
항 아넥신 A1　항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 아넥신 A1와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 아넥신 A1에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.
본 발명에서 제공되는 아넥신 A1에 대한 길항제, 및/또는 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 표적인 아넥신 A1은 암 또는 염증 등의 면역 질환에서 과발현되고, 암의 성장 및/또는 전이에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로, 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암, 면역질환 등의 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 진단, 예방, 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 다른 예는 상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 예에서, 상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 혈관신생 저해를 위한 용도 또는 혈관신생 저해제를 제조하는데 사용하기 위한 용도가 제공된다. 또 다른 예에서, 상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 상기 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 용도가 제공된다.
상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 소망하는 효과, 즉 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 약학 조성물의 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
상기 아넥신 A1에 대한 길항제, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히, 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.
한편, 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아넥신 A1 (전장 또는 세포 노출 부위 (예컨대, N 말단 부위))에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 아넥신 A1를 검출하거나, 아넥신 A1의 활성화 및/또는 과발현 여부를 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 아넥신 A1 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 생물 시료에 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응(결합) 여부를 확인하는 단계를 포함하는 아넥신 A1 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에 있어서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 생물 시료에 아넥신 A1이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 또 다른 예는 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아넥신 A1 검출을 위한 용도를 제공한다. 상기 생물 시료는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등의 포유류로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 아넥신 A1의 검출은 아넥신 A1의 존재 여부, 발현 여부, 또는 아넥신 A1의 존재 또는 발현 정도 등을 확인하는 것을 의미한다.
또 다른 예는 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현 및/또는 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 아넥신 A1의 활성화 및/또는 과발현, 또는 아넥신 A1의 활성화 및/또는 과발현 관련 질병의 진단(판단)에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 상기 생물 시료에서의 항원-항체 반응의 정도가 정상 시료에서의 항원-항체 반응의 정도보다 높은 경우, 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 얻어진 상기 환자를 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현 증상이 존재하거나, 아넥신 A1의 활성화 및/또는 과발현 관련 질병을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 정상 시료에 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기 아넥신 A1에 대한 길항제 및/또는 상기 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현 및/또는 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 진단을 위한 용도를 제공한다.
상기 생물 시료는 진단 대상 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 정상 시료는 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현 및/또는 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병을 갖지 않는 환자로부터 얻어진(분리된) 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아넥신 A1 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병은 암, 암전이, 염증, 및 면역질환 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 면역질환은 TNF 시그널링 관련 면역 질환, 자가면역 질환 등일 수 있으며, 예컨대, 천식, 아토피피부염, 류마티스관절염, 알러지, 건선(psoriasis), 백반증 (vitiligo), 그레이브스병(Graves' disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 당뇨병 (예컨대, 인슐린 의존성 당뇨병(type 1 diabetes mellitus)), 다발성경화증(multiple sclerosis), 갑상선염(thyroiditis), 빈혈(예컨대, pernicious anemia), 전신홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 패혈증(Sepsis) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 아넥신 A1를 과발현하는 것일 수 있고, 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 예는 상기한 바와 같은 서열번호 1 내지 서열번호 150으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 137 내지 서열번호 146의 폴리펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다. 또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV ㅍ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 폴리펩타이드는 아넥신 A1의 세포 노출 부위에 결합하므로, 상기 아넥신 A1에 대한 결합 폴리펩타이드를 아넥신 A1의 정량, 이미징 분석 등을 통하여 아넥신 A1과 관련된 질병의 진단 시스템에 사용 가능하며, 상기 아넥신 A1에 대한 결합 폴리펩타이드를 기반으로 아넥신 A1를 표적으로 하는 치료제의 개발이 가능하다.　
도 1은 3-round의 바이오 패닝 과정을 통해 얻어진 Annexin A1 N말단 부분에 결합 scFv 풀에 대한 ELISA 분석 결과이다.
도 2는 4-round의 바이오 패닝 과정을 통해 얻어진 Annexin A1 전장 단백질에 결합 scFv 풀에 대한 ELISA 분석 결과이다.
도 3은 도 1 (Annexin A1의 N 말단 결합 scFv)의 신호 세기를 수치화하여 나타낸 것이다.
도 4는 도 2 (Annexin A1의 전장 단백질 결합 scFv)의 신호 세기를 수치화하여 나타낸 것이다.
도 5는 Annexin A1 N 말단 결합 scFv와 Annexin A1 전장 단백질 결합 scFv로서 대표적으로 선정된 10종의 아미노산 서열 alignment(CLUSTAL W (1.8) multiple sequence alignment) 결과를 보여준다.
도 6은 일 실시예에 따른 정제된 Annexin A1 결합 scFv의 단백질 크기 및 양을 SDS-PAGE 전기 영동 결과로서 보여준다.
도 7은 암세포 SNU1을 이용한 일 실시예에 따라 선별된 Annexin A1 결합 scFv에 대한 cell-based ELISA 결과를 보여준다.
도 8은 암세포 MDA-MB-231을 이용한 일 실시예에 따라 선별된 Annexin A1 결합 scFv에 대한 cell-based ELISA 결과를 보여준다.
도 9은 암세포 SNU1과 MDA-MB-453(Annexin A1 megative cell)에서의 일 실시예에 따라 선별된 Annexin A1 결합 scFv의 결합 정도를 형광세기 분석을 통하여 측정한 결과를 보여준다.
도 10는 암세포 SNU1과 MDA-MB-453에서의 일 실시예에 따라 선별된 Annexin A1 결합 scFv의 처리 농도에 따른 결합 정도를 형광세기 분석을 통하여 측정한 결과를 보여준다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. Annexin A1에 결합 폴리펩타이드 라이브러리 분석
Annexin A1에 결합하는 scFv 형태의 항체를 선별하고자 항체 파지 라이브러리(phage library)를 이용한 바이오 패닝(biopanning) 과정을 수행하였다. 이를 위해 Annexin A1 N말단 30개 아미노산 (MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKG; 서열번호 151)으로 이루어진 펩타이드를 biotin 결합된 형태로 합성하였고, Annexin A1 전장 단백질(총 346개 아미노산; Accession No. NP_000691.1; 서열번호 152)의 경우, 상기 단백질의 코딩 DNA 단편을 pET21b 벡터 (Novagen)에 NdeI과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 이용하여 삽입하고 대장균 BL21(Invitrogen)에서 발현시킨 후, his tag을 이용하여 정제하고 biotinylation kit(Pierce)를 이용해 biotin 부착된 형태로 만들었다.
Annexin A1 전장 서열(346a.a.; 서열번호 152)
mamvseflkq awfieneeqe yvqtvksskg gpgsavspyp tfnpssdvaa
lhkaimvkgv deatiidilt krnnaqrqqi kaaylqetgk pldetlkkal
tghleevvla llktpaqfda delraamkgl gtdedtliei lasrtnkeir
dinrvyreel krdlakdits dtsgdfrnal lslakgdrse dfgvnedlad
sdaralyeag errkgtdvnv fntilttrsy pqlrrvfqky tkyskhdmnk
vldlelkgdi ekcltaivkc atskpaffae klhqamkgvg trhkalirim
vsrseidmnd ikafyqkmyg islcqailde tkgdyekilv alcggn
Biotin이 부착된 Annexin A1 N 말단 펩타이드와 Annexin A1 전장 단백질을 각각 스트렙타비딘이 고정된 자성 비드(Invitrogen)에 부착 시킨 후, scFv가 디스플레이된 1012 pfu파지 라이브러리를(phage library; 'Construction of a large synthetic human scFv library with six diversified CDRs and high functional diversity. Moll. Cells 27, 225-235, Feb. 28, 2009'을 참조하여 제조)와 섞어 주어 4℃에서 30분 동안 결합 시켰다. 이후 결합하지 않은 scFv는 HBSS(+)(Gibco)로 세척하여 제거하고, Annexin A1에 결합하는 scFv만을 회수하는 바이오 패닝(biopanning; Ehrlich GK, Berthold W, and Bailon P. Phage display technology. Affinity selection by biopanning . Methods in molecular biology. 2000. 147:195-208) 과정을 반복적으로 각각 3, 4-round까지 수행하였다. 이러한 과정을 통해 Annexin A1 N 말단 부분과 전장 단백질에 특이적으로 결합하는 scFv 풀(pool)을 확보하였다.
Annexin A1 N 말단 펩타이드와 전장에 특이적 결합을 하는 각각의 scFv 풀 분석을 위해 개별 파지 클론(phage clone)이 감염 된 ER2537(New England Biolabs Inc)를 배양한 후, 20%(w/v) 수크로오스 용액을 이용하여 세포질 분획을 분리하고, 파지 표면에 디스플레이 된 scFv를 획득하였다.
전장 Annexin A1에 대한 결합을 확인하기 위하여 96-well immunoplate(Nunc)에 Annexin A1 전장 단백질을 4ug(microgram) 코팅 한 후, scFv가 포함되어 있는 세포질 분획을 결합시켰다. Annexin A1 N말단 (서열번호 151) 에 대한 결합을 확인하기 위하여, streptavidin coating 96-well plate(NUNC)에 biotinylated된 N말단 펩타이드(서열번호 151; 펩트론)를 1nmol씩 코팅한 후, 상기 scFv가 포함되어 있는 세포질 분획을 결합시켰다.
scFv 말단에 tagging 되어 있는 HA tag를 검출 할 수 있는 항 HA-HRP 항체(Santa Cruz)를 상온에서 1시간 동안 반응시켜 결합 시키고, 항 HA에 항체에 conjugation 되어 있는 HRP를 이용해 Super AquaBlue ELISA 기질 용액(eBioScience)을 넣어 10분동안 상온에서 반응 시킨 후, 405nm에서의 흡광도 값을 얻어 scFv와 Annexin A1 결합여부를 판별하였다. 이와 함께 mock 단백질이 코팅 된 negative control immunoplate에 같은 세포질 분획을 결합시켜 두 immunoplate간의 차이를 분석을 통해 Annexin A1에 특이적으로 결합하는 scFv만을 선별하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다.
도 1은 30개의 아미노산(MAMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKG; 서열번호 151)으로 이루어진 펩타이드 형태의 N 말단 부분에 결합하는 scFv 풀 분석 결과를 보여주는 것으로, 3-round의 바이오 패닝 과정을 통해 얻어진 Annexin A1 N말단 부분에 결합 scFv 풀에 대한 ELISA 분석 결과이다. negative control로 사용된 mock 단백질이 코팅 된 immunoplate 대비 Annexin A1의 N 말단이 코팅 된 immunoplate에서 더 강한 세기를 나타내는 개별 파지 클론(phage clone)을 확인할 수 있다.
도 2는 Annexin A1의 전장 단백질(총 346개의 아미노산, Accession No. NP_000691.1; 서열번호 152)에 결합하는 scFv 풀 분석 결과를 보여주는 것으로, 4-round의 바이오 패닝 과정을 통해 얻어진 Annexin A1의 전장 단백질에 결합하는 scFv 풀의 ELISA 분석 결과이다. negative control로 사용된 mock 단백질이 코팅 된 immunoplate 대비 Annexin A1가 코팅 된 immunoplate에서 더 강한 세기를 나타내는 개별 파지 클론(phage clone)을 확인할 수 있다.
도 3과 도 4는 각각 도 1 (Annexin A1의 N 말단 결합 scFv; 도 3)과 도 2 (Annexin A1의 전장 단백질 결합 scFv; 도 4)의 신호 세기를 수치화하여 나타낸 것이다.
실시예 2. Annexin A1에 결합 폴리펩타이드의 서열 분석
ELISA를 통해 선별된 scFv의 서열 분석을 위해 각 scFv의 대장균 stock을 이용해 하기와 같은 PCR용 프라이머(Genotech)를 제작하여 PCR을 수행하였다. 확보된 PCR 결과물들을 공시된 방법으로 서열 분석용 프라이머(Genotech)를 합성한 후 DNA 염기서열 분석(sequencing)을 수행하였다.
PCR primer
PC3X Foward primer: 5' -GCACGACAGGTTTCCCGAC-3' (서열번호 153)
PC3X Reverse primer: 5'-AACCATCGATAGCAGCACCG-3' (서열번호 154)
Sequencing primer
5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3' (서열번호 155)
그 결과 표 3 내지 6에 나타난 CDR의 아미노산 서열들을 확보할 수 있었다.
Annexin A1의 N 말단 결합 scFv의 중쇄 상보성 결정 영역
항체명 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3
N31 NYAMS(서열번호1) AISPGDSNT(서열번호12) RMTKRFDY(서열번호43)
N32 NYAMS(서열번호1) GIYPNSGSNT(서열번호13) RRPTLFDY(서열번호44)
N33 DYSMG(서열번호2) GIYPSGGNT(서열번호14) RKPTIFDY(서열번호45)
N34 NYAMS(서열번호1) AIYPGGGSI(서열번호15) RRLQIFDY(서열번호46)
N35 GYSMS(서열번호3) GIYSGDSSK(서열번호16) RSLSIFDY(서열번호47)
N36 NYAMS(서열번호1) GISSDDGSKY(서열번호17) ARTLTIFDY(서열번호48)
N37 DYAMS(서열번호4) GIYPSSSSK(서열번호18) KRLALFDY(서열번호49)
N38 NYAMS(서열번호1) GISSDNSSKY(서열번호19) RRISLFDY(서열번호50)
N39 GYSMS(서열번호3) GIYYGDGST(서열번호20) RRATLFDY(서열번호51)
N311 NYAMS(서열번호1) AIYPGNGSK(서열번호21) KGLSLFDY(서열번호52)
N314 GYAMS(서열번호5) GIYPGGGST(서열번호22) RRLTIFDY(서열번호53)
N43 DYSMG(서열번호2) GIYPSGGNT(서열번호14) KRPSRFDY(서열번호54)
N44 GYSMS(서열번호3) GIYPGGSST(서열번호23) KRPTLFDY(서열번호55)
N45 DYAMS(서열번호4) AIYPDGGST(서열번호24) KRITLFDY(서열번호56)
N46 SYAMS(서열번호6) GIYPSDGNI(서열번호25) KNKAPFDY(서열번호57)
N48 DYAMS(서열번호4) GIYPSSSSK(서열번호18) KRLALFDY(서열번호49)
N49 NYAMS(서열번호1) AIYPSNGSK(서열번호26) KGLSLFDY(서열번호52)
Annexin A1의 N 말단 결합 scFv의 경쇄 상보성 결정 영역
항체명 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
N31 SGSSSNIGSNDVT(서열번호75) DNSK(서열번호95) GTWDDSLNG(서열번호113)
N32 TGSSSNIGSNSVN(서열번호76) SDSH(서열번호96) ATWDDSLNG(서열번호114)
N33 SGSSSNIGNNDVN(서열번호77) SNSH(서열번호97) GTWDDSLNG(서열번호113)
N34 TGSSSNIGSNNVT(서열번호78) SDSH(서열번호96) GSWDYSLSA(서열번호115)
N35 SGSSSNIGSNAVT(서열번호79) SNSQ(서열번호98) GTWDYSLSG(서열번호116)
N36 SGSSSNIGSNNVT(서열번호80) SDSH(서열번호96) GTWDYSLSG(서열번호116)
N37 SGSSSNIGNNAVN(서열번호81) SNSH(서열번호97) GAWDYSLSG(서열번호117)
N38 TGSSSNIGSNNVT(서열번호78) SDSH(서열번호96) GSWDYSLSA(서열번호115)
N39 TGSSSNIGSNSVS(서열번호82) SDNH(서열번호99) GTWDYSLSG(서열번호116)
N311 TGSSSNIGSNNVT(서열번호78) SDSH(서열번호96) GAWDYSLNA(서열번호118)
N314 SGSSSNIGNNDVT(서열번호83) SDSH(서열번호96) GTWDDSLSG(서열번호119)
N43 TGSSSNIGNNDVN(서열번호84) SNSH(서열번호97) GTWDDSLNG(서열번호113)
N44 TGSSSNIGSNNVT(서열번호78) ADSN(서열번호100) GTWDDSLSA(서열번호120)
N45 TGSSSNIGSNNVT(서열번호78) SDSH(서열번호96) GTWDYSLSG(서열번호116)
N46 TGSSSNIGNNTVS(서열번호85) SDSH(서열번호96) ATWDDSLNA(서열번호121)
N48 SGSSSNIGNNAVN(서열번호81) SNSH(서열번호97) GAWDYSLSG(서열번호117)
N49 TGSSSNIGSNNVT(서열번호78) SDSH(서열번호96) GAWDYSLNG(서열번호122)
Annexin A1 의 전장 단백질 결합 scFv의 중쇄 상보성 결정 영역
항체명 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3
F2 NYSMS(서열번호7) GISSDGGNK(서열번호27) RRAIPFDY(서열번호58)
F4 GYYMS(서열번호8) SISPSGSSI(서열번호28) KGSPGFDY(서열번호59)
F5 DYAMS(서열번호4) GISYGGGNT(서열번호29) KRLGSFDY(서열번호60)
F6 NYAMS(서열번호1) SISSNSGNK(서열번호30) KATLGMDHIHAYSAYGMDV(서열번호61)
F8 SYSMS(서열번호9) GISPGSGSI(서열번호31) RRIHPFDY(서열번호62)
F10 DYSMS(서열번호10) VISPDSSNT(서열번호32) KVTGTCGPRSCYYYDAMDV(서열번호63)
31 DYSMS(서열번호10) SISPDGGNK(서열번호33) KRTTLFDY(서열번호64)
32 NYSMS(서열번호7) GISPDGGSI(서열번호34) RRSSLFDY(서열번호65)
34 GYYMS(서열번호8) SISPSGSSI(서열번호28) KGSPGFDY(서열번호59)
35 NYSMS(서열번호7) GISPDDGSI(서열번호35) RRVGLFDY(서열번호66)
36 SYYMS(서열번호11) LISPGSGSI(서열번호36) RSISGRQYANPSYDDAMDV(서열번호67)
A1 SYSMS(서열번호9) GISPNGGSI(서열번호37) KRAALFDY(서열번호68)
A4 NYSMS(서열번호7) AISSSGGST(서열번호38) RRGNLFDY(서열번호69)
A5 SYYMS(서열번호11) LISPGSGSI(서열번호36) KGGPARRASTFDY(서열번호70)
A6 NYSMS(서열번호7) SISPSSGSI(서열번호39) KRNWTFDY(서열번호71)
A8 NYSMS(서열번호7) LISPDSSSI(서열번호40) KRATVFDY(서열번호72)
A10 NYAMS(서열번호1) SISYGNSNK(서열번호41) RAPGPFNY(서열번호73)
A11 NYSMS(서열번호7) AISSDGGST(서열번호42) RRGALFDY(서열번호74)
Annexin A1 의 전장 단백질 결합 scFv의 경쇄 상보성 결정 영역
항체명 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
F2 TGSSSNIGSNAVS(서열번호86) YNSQ(서열번호101) GAWDDSLNA(서열번호123)
F4 SGSSFNIGSNDVS(서열번호87) SDSH(서열번호96) GSWDYSLSA(서열번호115)
F5 TGTSSNIGSNYVS(서열번호88) AGNH(서열번호102) GSWDSSLSA(서열번호124)
F6 TGSSSNIGSNSVS(서열번호82) ANSN(서열번호103) AAWDDSLNA(서열번호125)
F8 TGSSSNIGNNDVS(서열번호89) SDNQ(서열번호104) GAWDSSLNA(서열번호126)
F10 SGSSSNIGSNAVS(서열번호90) YNSH(서열번호105) ATWDSSLNG(서열번호127)
31 TGSSSNIGSNDVS(서열번호91) DNSQ(서열번호106) AAWDASLSA(서열번호128)
32 TGSSSNIGNNSVT(서열번호92) DSQR(서열번호107) GSWDASLSA(서열번호129)
34 SGSSFNIGSNDVS(서열번호87) SDSH(서열번호96) GSWDYSLSA(서열번호115)
35 TGSSSNIGNNDVS(서열번호89) YDNQ(서열번호108) GAWDASLSA(서열번호130)
36 SGSSSNIGSNNVT(서열번호80) ANSN(서열번호103) GAWDDSLSG(서열번호131)
A1 SGSSSNIGSNDVT(서열번호75) YDSN(서열번호109) GAWDYSLNG(서열번호122)
A4 TGSSSNIGSNDVS(서열번호91) DDSN(서열번호110) GSWDASLNG(서열번호132)
A5 SGSSFNIGSNDVS(서열번호87) DNSK(서열번호111) GSWDDSLSG(서열번호133)
A6 TGSSSNIGNNDVS(서열번호89) SDNQ(서열번호104) GAWDSSLNA(서열번호126)
A8 SGSSSNIGSNDVS(서열번호93) YDSN(서열번호109) GTWDSSLSG(서열번호134)
A10 TGSSSNIGINDVS(서열번호94) ADNN(서열번호112) AACDDNLND(서열번호135)
A11 TGSSSNIGNNDVS(서열번호89) YNSQ(서열번호101) GSWDDSLSA(서열번호136)
상기 표 3 내지 6에 서열 분석된 Annexin A1 N 말단 결합 scFv와 Annexin A1 전장 단백질 결합 scFv 중 각각 4종 및 6종을 대표적으로 선택하여 전장 서열을 분석하였다. 상기 표 3 내지 6에 제시된 scFv의 CDR 이외의 framework는 상기 대표적으로 분석된 것들과 동일하다. 상기 전장 서열 분석 결과를 아래의 표 7, 표 8, 및 도 5에 나타내었다:
Annexin A1 N 말단 결합 scFv의 아미노산 서열
항체명 scFv의 아미노산 서열
N32 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSG IYPNSGSNTY YADSVKGRFT ISRDNSKNTL YLQMNSLRAE DTAVYYCARR PTLFDYWGQG TLVTVGSGGG GSGGGGSGGG GSQSVLTQPP SASGTPGQRV TISCTGSSSN IGSNSVNWYQ QLPGTAPKLL IYSDSHRPSG VPDRFSGSKS GTSASLAISG LQSEDEADYY CATWDDSLNG YVFGGGTKLT VLG (서열번호 137)
N34 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSA IYPGGGSIYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRL QIFDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTQPPS ASGTPGQRVT ISCTGSSSNI GSNNVTWYQQ LPGTAPKLLI YSDSHRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL QSEDEADYYC GSWDYSLSAY VFGGGTKLTV LG (서열번호 138)
N314 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFG GYAMSWVRQA PGKGLEWVSG IYPGGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRL TIFDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTQPPS ASGTPGQRVT ISCSGSSSNI GNNDVTWYQQ LPGTAPKLLI YSDSHRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC GTWDDSLSGY VFGGGTKLTV LG (서열번호 139)
N43 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYSMGWVRQA PGRGLEWVSG IYPSGGNTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKRP SRFDYWGQGT LVAVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTQPPS ASGTPGQRVT ISCTGSSSNI GNNDVNWYQQ LPGTAPKLLI YSNSHRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC GTWDDSLNGY VFGGGTKLTV LG (서열번호 140)
Annexin A1 전장 단백질 결합 scFv의 아미노산 서열
항체명 scFv의 아미노산 서열
F2 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYSMSWVRQA PGKGLEWVSG ISSDGGNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRA IPFDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTHPPS ASGTPGQRVT ISCTGSSSNI GSNAVSWYQQ LPGTAPKLLI YYNSQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC GAWDDSLNAY VFGGGTKLTV LG (서열번호 141)
F4 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYYMSWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGSSIYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGS PGFDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTQPPS ASGAPGQRVT ISCSGSSFNI GSNDVSWYQQ LPGTAPKLLI YSDSHRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL QSEDEADYYC GSWDYSLSAY VFGGGTKLTV LG (서열번호 142)
F5 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYAMSWVRQA PGKGLEWVSG ISYGGGNTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKRL GSFDYWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTQPPS ASGTPGRRVT ISCTGTSSNI GSNYVSWYRQ LPGTAPKLLI YAGNHRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC GSWDSSLSAY VFGGGTKLTV LG (서열번호 143)
F6 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSS ISSNSGNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAT LGMDHIHAYS AYGMDVWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSQSVLTQPP SASGTPGQRA TISCTGSSSN IGSNSVSWYQ QLPGTAPKLL IYANSNRPSG VPDRFSGSKS GTSASLAISG LRSEDEADYY CAAWDDSLNA YVFGGGTKLT VLG (서열번호 144)
F8 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYSMSWVRQA PGKGLEWVSG ISPGSGSIYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRI HPFDYWGQGT LVAVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSVLTQPPS ASGTPGQRVT ISCTGSSSNI GNNDVSWYQQ LPGTAPKLLI YSDNQRPSGV PGRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC GAWDSSLNAY VFGGGTKLTV LG (서열번호 145)
F10 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYSMSWVRQA PGKGLEWVSV ISPDSSNTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVT GTCGPRSCYY YDAMDVWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSQSVLTQPP SASGTPGQRV TISCSGSSSN IGSNAVSWYQ QLPGTAPKLL IYYNSHRPSG VPDRFSGPKS GTSASLAISG LRSEDEADYY CATWDSSLNG YVFGGGTKLT VLG (서열번호 146)
상기 표 7, 표 8, 및 도 5에 나타낸 항체명에 대응하는 도 3 및 도 4의 클론명을 아래의 표 9에 정리하였다:
도 3 및 도 4의 클론명 표 7, 표 8, 및 도 5의 항체명
C9 N32
C10 N33
C11 N34
D5 N36
E9 N38
G11 N314
B5 F5
C5 F6
E9 F7
G3 F8
실시예 3. Annexin A1에 결합하는 scFv 의 발현 및 정제
Annexin A1에 특이적으로 결합하는 scFv (N32, N43, N46, N48, N314, N36, F1 ~ F12)를 발현하는 대장균 (실시예 1 참조)을 SB 배지(조성: 30g bactotryptone, 20g yeast extract, 10g MOPS/1L, Sigma) 에서 OD600=0.6이 될 때까지 37℃에서 교반 배양한 후, 항체 발현을 위해 1mM이 되도록 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)를 첨가하여 밤새 30℃에서 교반 배양하였다. 상기 얻어진 세포 배양액을 8000rpm에서 원심분리하고 pellet을 취하여, 16ml의 1xTES 버퍼(50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 20%[w/v] sucrose, pH 8.0)에 현탁하고, 30분 후, 0.2 X TES 버퍼 24ml을 첨가하여 30분 동안 4℃에서 보관하였다. 여기에, 5mM이 되도록 MgCl2를 첨가하여 20000g에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상기 scFv 항체 발현시 함께 발현되는 his tag을 이용한 정제를 위하여, 원심 분리를 통해 얻어진 상등액을 Ni-NTA column(GE)에 흘려주어 column에 결합시켰다. 5mM imidazole(Sigma)가 포함된 PBS버퍼(Gibco)로 세척하여 결합하지 않은 단백질들을 제거하였다. 300mM 이미다졸이 포함된 PBS 버퍼를 이용해 Ni-NTA column에 결합한 scFv를 회수하였다. 이와 같이 분리 정제된 scFv를 SDS-PAGE 전기 영동법을 사용하여 단백질의 크기 및 양을 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 4. 암세포에서의 Annexin A1에 결합하는 scFv 와 Annexin A1 세포 표면 노출 부위와의 결합 확인
Annexin A1이 많이 발현되는 암세포 SNU1과MDA-MB-231을 이용한 cell-based ELISA를 통해 상기 선별된 Annexin A1 결합 scFv의 결합 특이성을 확인하였다.
구체적으로, 암세포 SNU1(ATCC)과MDA-MB-231(ATCC)를 37℃의 5% CO2 가 공급되는 조건에서 각각 RPMI-1640 또는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후, 96-well plate(NUNC)에 각 well 당 5x105cells의 양으로 넣었다. 선별한 scFv(N32, N33, N43, N46, N48, N314, N36, F1 ~ f12)의 정제된 단백질을 250ng, 125ng, 또는 25ng의 양으로 넣고 4℃에서 90분동안 반응시킨 후, HBSS(+) 버퍼(Gibco, 14025-092; Ca2+ 및 Mg2+ 함유 HBSS; Calcium Chloride(CaCl2) 12.6mM, Magnesium Chloride 4.9mM, 및 Magnesium Sulfate 4mM 포함)로 2회 세척하였다. 그 후, 상기 scFv 말단에 존재하는 HA tag에 결합하는 항 HA-HRP이차 항체(secondary antibody; Santa Cruz)를 1/200로 희석하여 50ul의 양으로 첨가하여 1시간 동안 결합시켰다. 이차 항체에 있는 HRP 이용해 Super AquaBlue ELISA 기질 용액(eBioScience)을 150ul씩 첨가한 후 10분 후, 405nm에서의 흡광도를 측정하여 암세포 표면의 Annexin A1에 scFv의 결합 유무를 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 7(SNU1) 및 도 8(MDA-MB-231)에 나타내었다. 도 7과 도 8의 Y축의 signal intensity는 405nm의 흡광도 측정을 통하여 얻어진 값이다. 도 7 및 도 8에서와 같이, biopannig을 통하여 선별된 scFv를 Annexin A1이 많이 발현되는 암세포 SNU1과 MDA-MB-231에 처리시 Annexin A1와의 결합 신호가 나타남을 알 수 있으며, scFv의 처리 농도가 높을수록 신호 강도가 높아짐을 확인할 수 있다. 이는 이들 scFv가 농도 의존적으로 실제 암세포 표면에 존재하는 Annexin A1에 특이적으로 결합함을 확인시켜주는 것이다.
또한, Annexin A1이 많이 발현되는 암세포 SNU1과 Annexin A1의 발현량이 낮은 암세포 MDA-MB-453을 이용한 FACS 분석을 통해 상기 선별된 scFv의 Annexin A1에 대한 결합 특이성 확인하였다.
구체적으로,　암세포 SNU1(ATCC)와 암세포 MDA-MB-453(negative control; ATCC)를 각각 37℃의 5% CO2 가 공급되는 조건에서 각각 RPMI-1640 또는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 여기에, 상기 선별된 scFv N43을 넣어 4℃에서 30분간 결합 시킨 후, 상기 scFv N43 말단에 존재하는 HA tag에 결합할 수 있는 형광을 나타내는 항 HA-FITC 결합 이차 항체(Santa Cruz)를 첨가하였다. 상기 이차항체의 FITC형광 세기를 이용하여 scFv의 암세포 표면에 존재하는 Annexin A1와 scFv의 결합 여부를FACScantoii(BD) 기기와 Flowjo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9의 Y축의 count는 세포수을 의미하는 것으로 형광에 세기에 따른 세포의 수를 의미한다. 도 8에서와 같이, Annexin A1의 발현량이 낮은 MDA-MB-453와 비교하여, Annexin A1이 많이 발현되는 SNU1 암세포에서 더 강한 형광 세기가 검출되었으며, 이는 Annexin A1 발현 유무에 따른 scFv N43 결합 정도 차이를 보여주는 것이다.
실시예 5. Annexin A1 결합 scFv 농도에 따른 암세표 표면 결합량 변화
Annexin A1이 많이 발현되는 암세포 SNU-1(ATCC)과 Annexin A1이 적게 발현되는 암세포 MDA-MB-453(ATCC)을 37℃의 5% CO2가 공급되는 조건에서 각각RPMI-1640 또는 DMEM 배지를 이용하여 각각 배양한 후, 상기 선별된 scFv N43를 0.31ug 및 1.25ug의 양으로 각각 넣어 주어 4℃에서 30분간 결합시켰다. scFc N43말단 HA tag에 결합할 수 있는 형광을 나타내는 이차 항체(Santa Cruz)를 처리하고, FITC형광 세기 분석을 통해 암세포 표면에 결합하고 있는 scFv N43의 양을 FACScantoii (BD)기기와 Flowjo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10의 Y축은 세포수를 의미하는 것으로 도 9에서와 같이, Annexin A1이 많이 존재하는 SNU-1 암세포의 경우, scFv N43의 처리 농도 의존적으로 결합 정도가 증가하는 반면, Annexin A1이 적게 발현되는 MDA-MB-453에서는 scFv N43의 처리 농도와 결합 정도와의 뚜렷한 상관 관계가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 상기 선별된 scFv N43가 암세포 표면에 비특이적인 결합이 아닌 농도에 따라 결합 정도 차이를 보이는 특이적인 결합을 형성함을 확인시켜주는 것이다.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Polypeptide binding to Annexin A1 and uses thereof <130> DPP20132765KR <160> 155 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <400> 1 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <400> 2 Asp Tyr Ser Met Gly 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <400> 3 Gly Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <400> 4 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <400> 5 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <400> 6 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of Anti-Annexin A1 antibody <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is Asn(N), Gly(G), Asp(D), or Ser(S) <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa is Ala(A), Ser(S), or Tyr(Y) <400> 147 Xaa Tyr Xaa Met Ser 1 5 <210> 148 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of Anti-Annexin A1 antibody <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is Arg(R) or Lys(K) <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa is Arg(R), Gly(G), Ala(A), Met(M), Lys(K), Ser(S), or Asn(N) <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa is Ala(A), Ser(S), Leu(L), Ile(I), Thr(T), Val(V), Gly(G), Asn(N), Pro(P), or Lys(K) <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa is Ile(I), Pro(P), Gly(G), His(H), Thr(T), Ser(S), Ala(A), Asn(N), Trp(W), Lys(K), or Gln(Q) <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa is Arg(R), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Gly(G), Ser(S), Thr(T), or Val(V) <400> 148 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr 1 5 <210> 149 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of Anti-Annexin A1 antibody <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is Ser(S) or Thr(T) <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa is Ser(S) or Thr(T) <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa is Ser(S) or Phe(F) <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa is Ser(S), Asn(N), or Ile(I) <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Xaa is Asp(D), Ser(S), Asn(N), Ala(A), Thr(T), or Tyr(Y) <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Xaa is Thr(T), Asn(N), or Ser(S) <400> 149 Xaa Gly Xaa Ser Xaa Asn Ile Gly Xaa Asn Xaa Val Xaa 1 5 10 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of Anti-Annexin A1 antibody <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is Gly(G) or Ala(A) <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa is Thr(T), Ser(S), or Ala(A) <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa is Asp(D), Tyr(Y), Ser(S), or Ala(A) <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Xaa is Asn(N) or Ser(S) <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa is Gly(G) or Ala(A) <400> 150 Xaa Xaa Trp Asp Xaa Ser Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 151 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of Annexin A1 <400> 151 Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly 20 25 30 <210> 152 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> full-length sequence of Annexin A1 <400> 152 Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val 35 40 45 Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr 50 55 60 Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys 115 120 125 Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg 130 135 140 Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu 145 150 155 160 Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe 165 170 175 Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe 180 185 190 Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu 195 200 205 Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile 210 215 220 Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr 225 230 235 240 Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu 245 250 255 Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr 260 265 270 Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly 275 280 285 Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser 290 295 300 Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu 325 330 335 Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly Asn 340 345 <210> 153 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC3X Foward primer <400> 153 gcacgacagg tttcccgac 19 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC3X Reverse primer <400> 154 aaccatcgat agcagcaccg 20 <210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer <400> 155 aagacagcta tcgcgattgc ag 22

Claims (15)

  1. 서열번호 2 및 서열번호 147로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 48, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 70, 서열번호 73, 및 서열번호 148로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 149로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
    서열번호 135 및 서열번호 150으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는,
    폴리펩타이드:
    X1-Y-X2-M-S (서열번호 147)
    X1은 Asn(N), Gly(G), Asp(D), 또는 Ser(S)이고,
    X2는 Ala(A), Ser(S), 또는 Tyr(Y)이며,
    X3-X4-X5-X6-X7-F-D-Y (서열번호 148)
    X3은 Arg(R) 또는 Lys(K)이고,
    X4는 Arg(R), Gly(G), Ala(A), Met(M), Lys(K), Ser(S), 또는 Asn(N)이며,
    X5는 Ala(A), Ser(S), Leu(L), Ile(I), Thr(T), Val(V), Gly(G), Asn(N), Pro(P), 또는 Lys(K)이고,
    X6은 Ile(I), Pro(P), Gly(G), His(H), Thr(T), Ser(S), Ala(A), Asn(N), Trp(W), Lys(K), 또는 Gln(Q)이며,
    X7은 Arg(R), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Gly(G), Ser(S), Thr(T), 또는 Val(V)이고,
    X8-G-X9-S-X10-N-I-G-X11-N-X12-V-X13 (서열번호 149)
    X8은 Ser(S) 또는 Thr(T)이고,
    X9는 Ser(S) 또는 Thr(T)이며,
    X10은 Ser(S) 또는 Phe(F)이고,
    X11은 Ser(S), Asn(N), 또는 Ile(I)이고,
    X12는 Asp(D), Ser(S), Asn(N), Ala(A), Thr(T), 또는 Tyr(Y)이며,
    X13은 Thr(T), Asn(N), 또는 Ser(S)이고,
    X14-X15-W-D-X16-S-L-X17-X18 (서열번호 150)
    X14는 Gly(G) 또는 Ala(A)이며,
    X15는 Thr(T), Ser(S), 또는 Ala(A)이고,
    X16은 Asp(D), Tyr(Y), Ser(S), 또는 Ala(A)이며,
    X17은 Asn(N) 또는 Ser(S)이고,
    X18은 Gly(G) 또는 Ala(A)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 43 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 75 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
    서열번호 113 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는,
    폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 137 내지 서열번호 146으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항의 폴리펩타이드를 포함하는 아넥신 A1에 대한 길항제.
  5. 서열번호 2 및 서열번호 147로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 48, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 67, 서열번호 70, 서열번호 73, 및 서열번호 148로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 149로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 135 및 서열번호 150으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는, 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    X1-Y-X2-M-S (서열번호 147)
    X1은 Asn(N), Gly(G), Asp(D), 또는 Ser(S)이고,
    X2는 Ala(A), Ser(S), 또는 Tyr(Y)이며,
    X3-X4-X5-X6-X7-F-D-Y (서열번호 148)
    X3은 Arg(R) 또는 Lys(K)이고,
    X4는 Arg(R), Gly(G), Ala(A), Met(M), Lys(K), Ser(S), 또는 Asn(N)이며,
    X5는 Ala(A), Ser(S), Leu(L), Ile(I), Thr(T), Val(V), Gly(G), Asn(N), Pro(P), 또는 Lys(K)이고,
    X6은 Ile(I), Pro(P), Gly(G), His(H), Thr(T), Ser(S), Ala(A), Asn(N), Trp(W), Lys(K), 또는 Gln(Q)이며,
    X7은 Arg(R), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Gly(G), Ser(S), Thr(T), 또는 Val(V)이고,
    X8-G-X9-S-X10-N-I-G-X11-N-X12-V-X13 (서열번호 149)
    X8은 Ser(S) 또는 Thr(T)이고,
    X9는 Ser(S) 또는 Thr(T)이며,
    X10은 Ser(S) 또는 Phe(F)이고,
    X11은 Ser(S), Asn(N), 또는 Ile(I)이고,
    X12는 Asp(D), Ser(S), Asn(N), Ala(A), Thr(T), 또는 Tyr(Y)이며,
    X13은 Thr(T), Asn(N), 또는 Ser(S)이고,
    X14-X15-W-D-X16-S-L-X17-X18 (서열번호 150)
    X14는 Gly(G) 또는 Ala(A)이며,
    X15는 Thr(T), Ser(S), 또는 Ala(A)이고,
    X16은 Asp(D), Tyr(Y), Ser(S), 또는 Ala(A)이며,
    X17은 Asn(N) 또는 Ser(S)이고,
    X18은 Gly(G) 또는 Ala(A)이다.
  6. 제5항에 있어서,
    서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 43 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 75 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 95 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L12, 및 서열번호 113 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는, 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제5항에 있어서,
    서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 12 내지 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 43 내지 서열번호 57로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 75 내지 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 95 내지 서열번호 100으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 및 서열번호 113 내지 서열번호 122로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하고, 아넥신 A1의 N 말단에 특이적으로 결합하는,
    항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제5항에 있어서,
    서열번호 7 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 27 내지 서열번호 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 58 내지 서열번호 74로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 86 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 101 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 123 내지 서열번호 136으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하고, 전장 아넥신 A1 단백질에 특이적으로 결합하는,
    항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제5항에 있어서, 서열번호 137 내지 서열번호 146으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제5항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제4항의 아넥신 A1 에 대한 길항제, 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병은 암, 암전이, 및 면역질환으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제4항의 아넥신 A1 에 대한 길항제, 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 아넥신 A1 검출용 조성물.
  14. 제4항의 아넥신 A1 에 대한 길항제, 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항 아넥신 A1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병은 암, 암전이, 및 면역질환으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 아넥신 A1 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물.
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