CN102858990B - 针对β-NGF的适体及其在治疗β-NGF介导的疾病和失调中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开大体上涉及核酸的领域，更具体而言涉及能够结合β-NGF的适体；包含这种β-NGF适体的药物组合物；和制造并使用所述适体的方法。

Description

针对β-NGF的适体及其在治疗β-NGF介导的疾病和失调中的用途
相关申请
本申请要求美国临时申请序列号61/323145(2010年4月12日提交)的权益，其通过引用全部并入本文。
于2011年4月1日创建的题为“Sequence_listing_ST25.txt”126千字节大小的序列表通过引用全部并入本文。
发明领域
本公开大体涉及核酸和更具体地涉及适体的领域，所述适体能够结合神经生长因子，更具体而言神经生长因子的β亚基(“β-NGF”)，并用作针对预防、治疗或改善搔痒症、搔痒性病症和/或其他β-NGF已牵连其中的疾病或病症的治疗。本公开还涉及用于施用能够结合β-NGF的适体的材料和方法。
背景技术
以下描述提供与本公开有关的信息概述，并且不是承认本文引用的任何所提供的信息或出版物对本公开是现有技术。
严重的瘙痒每天负面地影响数以百万计人的生活质量。严重的瘙痒可能与多种健康状态有联系，包括瘙痒性皮肤病，例如疥疮、湿疹、干皮症、牛皮癣、荨麻疹，以及***性病症，包括慢性肝脏或肾脏疾病和淋巴瘤。类似地，疼痛是常见的现象，其为看医生的主要原因之一。疼痛可能与多种类型的损害或病症有联系，并且治疗急性疼痛失败可能导致慢性疼痛的问题以及免疫和代谢失调。除降低患有瘙痒症和/或疼痛的个体的生活质量，在特别是与搔痒性皮肤病以及慢性疼痛失调有关的医疗预算上也有显著的影响。目前处理或治疗搔痒和/或疼痛的努力被广泛地认为是不能胜任的。
神经生理学研究已确认痒途径与疼痛途径相比的区别。痒的感觉是由专门的C神经元感知和传递，其区别于加工疼痛感觉的伤害性感受器(Schmelz,Neurosci.Biobehav.Rev.doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004,2009)。专门的C神经元然后传递所述痒刺激至一类特化的背角神经元并投身至丘脑(StanderandSchmelz,Eur.J.Pain10:473,2006)。相信在周围神经末梢上没有特异的痒受体而痒感C神经元的特异性是基于其与痒途径在脊髓的连接。在脑活动模式中观察到痒与疼痛的差异，例如缺少可检测的来自痒感觉的丘脑和顶叶体感皮层的活动(Yosipovitch等人,Lancet361:690,2003)。
一般将疼痛分类为急性的或慢性的。急性疼痛通常是组织损伤的反应，其特征是短暂并随着最初损伤痊愈而解决。慢性疼痛是持续的并可能与创伤性事件没有明显的联系。在疼痛的机械起源的基础上可以进一步将疼痛分类并包括伤害性的和非伤害性的。伤害性疼痛是由通过特异性刺激(损伤、炎症、化学制品等)所激活的特异性的受体(伤害性受体)所介导的。伤害性疼痛可以进一步划分类为躯体的或内脏的。躯体疼痛发生在组织中，例如皮肤、肌肉、关节、骨骼或韧带。躯体疼痛是一般尖锐的和局部的。目前的治疗包括使用的阿片类和非甾体类抗炎症药物(NSAIDS)。内脏疼痛发生在内部器官中。它经常地是定位不明的疼痛并且通常使用阿片类治疗。
非伤害性疼痛可以进一步分解成神经性的或交感神经性的。神经性疼痛可能在周围或中枢神经***中出现。神经性疼痛可能与退行性病症、炎症或感染性疾病有联系。这类型的疼痛导致过敏感(痛觉过敏)并经常被描述为刺痛或灼痛。治疗可选方案包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗心律不齐药、抗惊厥药或抗抑郁药。神经性疼痛经常对常规的止痛药是耐受的。交感神经疼痛出现在交感神经***以及周围和中枢神经***并且通常与某种类型的损伤有联系。损伤的位置可能表现出增长的过敏感和异常的温度。治疗通常涉及包括交感神经阻断、血管舒张、抗惊厥药、抗心律不齐药和抗抑郁药的多药物方案。
不推荐用阿片类止痛药的常规和长期的治疗，因为考虑到潜在的成瘾性、副作用、耐受性和对阿片类的依赖性。阿片类的副作用包括恶心、呕吐、便秘、呼吸抑制等。对许多目前以帮助进行适当的疼痛控制的治疗，存在缺乏效力、严重的副作用和给药方法不力。这些问题支持需要更好的疼痛控制疗法。
虽然痒和疼痛是明显地有区别的感觉，但在痒和疼痛之间有重要的相互作用。众所周知可以通过刮擦引起的疼痛的感觉减少痒。然而，通过作用以降低疼痛的感觉的止痛药(如阿片类)实际上可以增强痒的感觉。因此，一些针对疼痛的治疗可以加剧痒的症状，这进一步支持对更好的有治疗痒和疼痛的潜力的治疗的需要。
神经生长因子(NGF)是神经营养性细胞因子或神经营养因子家族中的一员。神经营养因子通过控制细胞的存活、分化和凋亡在周围和中枢神经***的发育和维持中发挥关键作用。除了这些神经***的功能，NGF也已显示出增加组胺的释放、肥大细胞的产生和B淋巴细胞的生长和分化。NGF也已显示出调节某些脂质介质的嗜碱性生产。嗜中性粒细胞的凋亡也可以被NGF所抑制。所有这些因素暗示NGF在免疫***中以及神经***中的作用。
NGFβ链(β-NGF)单独地负责NGF的神经生长刺激活性。在细胞中，β-NGF以二聚体存在并与神经元和非神经元细胞中的两类细胞表面受体结合。该蛋白质的三级结构基于三个胱氨酸二硫化物和两个反向平行的β-链。人、小鼠和大鼠该蛋白的氨基酸的同源性是大约90%。像所有的神经营养因子，β-NGF以nM的亲和力来结合p75细胞受体。β-NGF也以nM的亲和力来结合一种酪氨酸激酶受体(Trk)，具体来说结合TrkA。与p75受体的反应可以诱导细胞死亡而与TrkA结合促进细胞存活。ββ-NGF结合TrkA导致该受体和细胞内部的蛋白质的磷酸化。β-NGF通过受体介导的内吞被内化。在广泛的非神经组织中发现Trk受体。
从皮肤中的角质形成细胞所释放的神经生长因子(NGF)是主要递质之一，所述递质通过(也包括其他)促进神经纤维发芽来增加皮肤的神经密度并影响形态(Schmelz,Neurosci.Biobehav.Rev.doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004,2009)。已发现有慢性瘙痒的患者表现出增加的皮内神经纤维密度。另外，已发现NGF通过(在其他事项中)触发NGF受体酪氨酸激酶TrkA来增加周围神经元的灵敏度(StanderandSchmelz,Eur.J.Pain10:473,2006)。
可能由瘙痒和疼痛引起症状的异位性病症中所测量的高浓度的NGF中表现出NGF在在介导瘙痒以及疼痛中的重要性。有异位性皮炎的患者具有极大地提高的NGF的血清水平，其与所述病症的严重性正相关。有接触性皮炎的患者具有更高的局部NGF浓度而有结节性痒疹的患者也表现出更高的NGF水平和TrkA活动水平(Schmelz,Neurosci.Biobehav.Rev.doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004,2009)。
通过腹腔内注射***性施用抗NGF抗体在针对异位性皮炎的小鼠模型的症状上的效果已有研究，并且结果“暗示抗NGF抗体阻断NGF对周围神经***上的作用并抑制表皮神经支配、皮炎和抓挠行为”(Takano等人，J.PharmacolSci99:277:284,2005)。然而，该研究发现抗-NGF抗体没有改变血清NGF水平，没有减少所测试的皮肤区域中的NGF浓度，并且没有完全地抑制抓挠行为。因此，仍然存在更完全地减少或消除与异位性皮炎有关联的瘙痒的需要。
不断增长的证据表明NGF作为某些疼痛状态的递质起作用。已显示抗NGF抗体可以产生持续的热和化学止痛效果，以及阻断由角叉菜胶(carrageenan)诱导的炎症所发展的痛觉过敏(McMahon等人,Nat.Med.1:774,1995)。针对阻断NGF生物活性的小分子NGF受体拮抗剂的研究已表明在神经性和炎症性疼痛上的止痛效果(Owolabi等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.289:1271,1999)。在Owolabi等人的研究中，小分子NGF活性抑制剂的止痛效果可能小于***的效果，其取决于施用的途径。由于阿片类(例如***)具有很多不需要的副作用，仍然有需要提供在由NGF介导的多种疼痛状态中的止痛，其允许在有效施用中的灵活性。
概述
本公开提供与神经生长因子的β亚基结合的多种适体(在本文中单独地称为“β-NGF适体”)和使用这种β-NGF适体来治疗β-NGF介导的疾病和失调(包括疼痛和瘙痒和搔痒性病症的治疗)的方法。包括药物组合物或制剂，其包含β-NGF适体或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体。
可以任何适合的药学上可接受的剂量形式制备本公开的组合物。本文所描述的制剂和剂量，旨在在治疗各种病症(例如疼痛和瘙痒和搔痒病症)中最大化临床的效力，而同时减少或最小化不良副作用。
本公开还提供用于预防、治疗或改善由β-NGF所介导的疾病或病症的方法，所述方法包括给脊椎动物，具体地哺乳动物，更具体地人类施用β-NGF适体或所述β-NGF适体的药物组合物。具体而言，本公开提供用于治疗、预防或改善疼痛和瘙痒和搔痒性病症的方法。在某些方面，所述β-NGF介导的疾病或病症是这样的疾病或病症，其中在疾病某个阶段，β-NGF活性可能直接或间接地导致瘙痒。在一些实施方案中，所要治疗、防止或改善的疾病或病症是皮炎或湿疹。在其它实施方案中，所要治疗、防止或改善的疾病或病症是异位性皮炎。
在一个实施方案中，通过施用β-NGF适体使所述适体暴露至β-NGF并能够结合β-NGF(不论用于被治疗的患者的递送所述适体的方式)可以实现治疗效果(例如治疗、预防或改善疼痛和瘙痒和搔痒性病症)。在一个相关的实施方案中，通过施用所述β-NGF适体使其暴露于β-NGF并结合β-NGF，从而阻止或减少β-NGF与一或多种其不同细胞受体的结合可以实现治疗效果。在一个实施方案中，所述细胞受体是p75。在另一实施方案中，所述细胞受体是Trk受体。在又一实施方案中，所述细胞受体是TrkA。在又一实施方案中，所述β-NGF适体阻止或减少所述β-NGF受体和其它内部的细胞蛋白质的磷酸化水平。
所提供的方法包括与一或多种次级活性剂联合施用β-NGF适体。这种施用可以是连续的或以组合组合物。
在另一方面，本公开提供体外诊断方法，其包括将β-NGF适体与疑似包含β-NGF的样品接触。在另一方面，本公开提供体内诊断方法，其包括提供适当地标记的β-NGF适体，注射所述适体至疑似具有β-NGF介导的疾病或病症的个体中，并出于诊断或评估所述个体的健康状况的目的而检测所述标记的适体。将会按照所要使用的成像方式选择所使用的标记。
附图简述
图1展示针对适体2426-66(■)(SEQIDNO:1)与随机文库(○)相比的结合曲线。
图2A和2B表示对适体2426-66(SEQIDNO:1)使用454测序鉴定的适体共有序列。
图3展示针对β-NGF适体的二聚化策略＃1。
图4展示针对β-NGF适体的二聚化策略＃2。
图5图形化地展示多种适体抑制人β-NGF诱导的PC12细胞分化的能力，在实施例4中所描述的神经突生长测定中测试。
图6图形化地展示β-NGF介导的神经突生长的抑制，其作为适体2426-66(■)(SEQIDNO:1)与其截短变体2426-66-50(○)(SEQIDNO:2)的适体浓度的函数，如实施例4所描述测量。
图7图形化地展示通过适体2426-66(SEQIDNO:1)和截短变体2426-66-50(SEQIDNO:2)和2426-66-53(SEQIDNO:43)的对人β-NGF、小鼠β-NGF和大鼠β-NGF介导的神经突生长的抑制。所有三种适体与对人β-NGF几乎一样有效地抑制了小鼠β-NGF，并以更小的程度抑制了大鼠β-NGF。
图8图形化地展示使用适体2426-66(SEQIDNO:1)和截短变体2426-66-50(SEQIDNO:2)和2426-66-3(SEQIDNO:5)的TrkA磷酸化测定的结果。
图9图形化地展示使用小鼠和大鼠(rate)β-NGF针对适体2426-66-50(SEQIDNO:2)的TrkA磷酸化测定。
图10表示用于制备本文所描述的适体的C-5嘧啶修饰。
图11图形化地展示在用适体2426-66-50(SEQIDNO:2)(●)治疗的患病小鼠中四个星期内抓挠频率的减少，但在未处理小鼠(■)或用亲水性软膏(HO)处理的小鼠(▲)中没有减少，如实施例5中所描述的。在适体治疗与未治疗(*)之间或适体治疗与HO治疗(＃)之间观察到统计上显著的差异(p<0.05)，其由t检验确定。
图12图形化地展示在用适体2426-66-50(SEQIDNO:2)(●)治疗的患病小鼠中四个星期内临床皮肤病症的减少，但在未处理小鼠(■)或用亲水性软膏(HO)处理的小鼠(▲)中没有减少，如实施例5中所描述的。在适体治疗与未治疗(*)之间或适体治疗与HO治疗(＃)之间观察到统计上显着的差异(p<0.05)，其由t检验确定。
发明详述
现在将会详细描述本发明的代表性实施方案。虽然会结合所列举的实施方案来描述本发明，但会理解本发明并非旨在限于这些实施方案。相反地，本发明旨在涵盖如权利要求所限定的可以包括在本发明的范围内的所有替代物、修改和等同物。
本领域技术人员会承认许多类似或等同于本文所描述的方法和材料，其可以在本发明的实施中使用并且在本发明的领域内。本发明不以任何方式限于所描述的方法和材料。
除非另有定义，本文中所用的技术和科学术语具有由本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在本发明的实施或测试中可以使用类似或等同于本文中所描述的任何方法、设备和材料，现在描述优选的方法、设备和材料。
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如本文中所用的，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“含有(contains)”，“含有(containing)”及其任何变体旨在涵盖非独占性的包含物，例如包含、包括或含有一种元素或一列表的元素的过程、方法、加工产品或物质的组合物不仅包括那些元素还可能包括没有明确地列出的或该过程、方法、加工产品或物质的组合物的固有的其它元素。
如本文中所用的，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其修饰的形式及其类似物。核苷酸包括种类，其包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和它们的衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和它们的衍生物和类似物)。
如本文中所用的，互换地使用“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”来指核苷酸的聚合物，并包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体和这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰，其中包括在所述核苷酸单位的任何位置上附加各种实体或部分。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更宽的术语，因此术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括是适体的核苷酸的聚合物但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适体。
如本文中所用的，当指寡核苷酸时使用术语“修饰”、“修饰的”、“修饰”意为所述寡核苷酸的四种组成核苷酸碱基(即A、G、T/U和C)的至少一种是天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸赋予寡核苷酸核酸酶抗性。具有在C-5位的取代的嘧啶是修饰的核苷酸的实例。修饰可以包括主链修饰、甲基化、罕有的碱基配对的组合，例如异碱基异胞苷和异胍等。修饰也可以包括3'和5'的修饰，如加帽。其他修饰可以包括用类似物取代一或多种天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰，例如具有不带电荷的键(例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、磷酸胺盐(phosphoamidates)、氨基甲酸盐等)的核苷酸间修饰和具有带电荷的键(例如硫代磷酸盐、二硫代磷酸盐等)的核苷酸间修饰，有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)的核苷酸间修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的核苷酸间修饰，含有烷化剂的核苷酸间修饰和有修饰的键(例如阿尔法异头核酸等)的核苷酸间修饰。另外，通常存在于核苷酸的糖上的任何羟基可以由膦酸基或磷酸基来取代；由标准的保护基团来保护；或被活化来制备额外的与其它核苷酸或固体支持物的连接。可以用胺、大约1至大约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一个实施方案中的大约10至大约80kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一实施方案中的大约20至大约60kDa的PEG聚合物、或者其它的亲水性或疏水性的生物的或合成的聚合物来磷酸化或取代所述5'和3'末端的OH基。在一个实施方案中，修饰是嘧啶的C-5位的修饰。通过直接在C-5位的酰胺键或其他类型的键可以产生这些修饰。
多核苷酸还可以含有本领域通常所知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括2'-O-甲基-、'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖如***糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚醛糖，无环类似物和脱碱基核苷类似物如甲基核糖苷。如上所述，通过可选的连接基团可以替代一或多个磷酸二酯键。这些可选的连接基团包括其中磷酸被P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR2(“酰胺”)、P(O)R、P(O)(O)OR'、CO或CH2(“formacetal”)替换的实施方案，其中每个R或R'独立地是H或任选地含有醚(-O-)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代的或未取代的烷基(1-20C)。并非所有的多核苷酸中的键都需要是相同的。糖、嘌呤和嘧啶的类似物形式的取代在设计终产物中可以是有利的，例如像多酰胺主链的可选主链结构也可以是有利的。
如本文中所用的，术语“C-5修饰的嘧啶”是指有C-5位上的修饰的嘧啶，所述修饰包括但不限于图10中所示的那些部分。C-5修饰的嘧啶的实例包括美国专利号5719273和5945527以及美国临时申请序列号61/264545(2009年11月25日提交，题为“核酸酶抗性寡核苷酸”)中所描述的那些。C-5修饰的实例包括C-5位上的脱氧尿嘧啶由取代基所取代，所述取代基独立地选自：苯甲基甲酰胺(或者苯甲基氨基羰基)(Bn)、萘基甲基甲酰胺(或者萘基甲基氨基羰基)(NAP)、色氨基甲酰胺(或者色氨基羰基)(Trp)和异丁基甲酰胺(或者异丁基氨基羰基)(IBU)，如紧接着下面所示。
C-5修饰的嘧啶的化学修饰也可以与2'-位糖的修饰、在环外胺上的修饰和4-硫尿嘧啶的取代等单独地或以任何组合地结合。
代表性C-5修饰的嘧啶包括：5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(BndU)、5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(iBudU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(TrpdU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2'-氯化脱氧尿嘧啶、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶或5-(N-[1-(2,3-二羟基丙基)]甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶。
如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后给予对所述核苷酸结构的修饰。可用通过非核苷酸的组分中断核苷酸的序列。可以在多聚化后进一步修饰多核苷酸，例如通过用标记组分缀合。
如本文中所用的，当术语“至少一种嘧啶”是指核酸的修饰时，是指所述核酸中的一个、几个或全部嘧啶，表明核酸中的任意或所有出现的任意或所有的C、T或U可以修饰或不修饰。
如本文中所用的，互换地使用“核酸配体”、“适体”和“克隆”来指具有所需的对靶分子的作用的非天然存在的核酸。所需的作用包括但不限于与所述靶结合、催化改变所述靶、以修饰或改变所述靶或所述靶的功能性活性的方式与靶反应、共价地连接所述靶(如在***抑制剂中)和促进所述靶与其他分子间的反应。在一个实施方案中，所述作用是针对靶分子的特异性结合亲和力，这样的靶分子是三维化学结构而不是多核苷酸，其通过不依赖于Watson/Crick碱基配对或三重螺旋形成的机制来结合所述核酸配位体，其中所述适体不是具有被所述靶分子结合的已知生理功能的核酸。对给定靶的适体包括从核酸的候选物混合物中鉴定的核酸，其中所述适体是所述靶的配体，所述鉴定的方法包括：(a)使所述候选物混合物与所述靶接触，其中相对于所述候选物混合物中其他核酸具有增加的对所述靶的亲和力的核酸可以从所述候选物混合物的剩余物中区分出；(b)从所述候选物混合物的剩余物中区分所述增加亲和力的核酸；和(c)扩增所述增加亲和力的核酸以获得配体富集的核酸混合物，从而鉴定所述靶分子的适体。人们认识到亲和相互作用是程度的问题，然而在本上下文中，适体针对其靶的“特异性结合亲和力”是指所述适体通常以比其结合至混合物或样品中其他的非靶组分高得多的程度的亲和力来结合至其靶。“适体(aptamer)”或“核酸配体”是具有特定核苷酸序列的一种或一类核酸分子的一组拷贝。适体可以包括任何适合数目的核苷酸。“适体(aptamers)”是指多于一组这样的分子。不同的适体可以具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA并可以是单链的、双链的或含有双链或三链区域。
如本文中所用的，“蛋白质”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义地使用。“纯化的”多肽、蛋白质、肽或肽片段基本上没有来自从中获得所述氨基酸序列的细胞、组织或无细胞来源的细胞材料或其它污染蛋白质，或当进行化学合成时基本上没有化学前体或其他化学品。
如本文中所用的，“调节”是指改变(通过增加或减少)肽或多肽的水平，或改变(通过增加或减少)肽或多肽的稳定性或活性。术语“抑制”是指降低肽或多肽的水平或降低肽或多肽的稳定性或活性。如本文所述，所调节或抑制的蛋白是β-NGF。
如本文中所用的，术语“生物活性”表示对一或多种细胞或细胞外的过程的作用(例如通过结合、信号传递等)，其可以影响生理或病生理过程。
如本文中所用的，术语“神经生长因子”、“NGF”和“β-NGF”是指神经生长因子的β亚基及其保留至少部分NGF活性的变体。如本文中所用，NGF包括所有哺乳动物物种的NGF天然序列，所述哺乳动物物种包括人、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、马科动物、灵长目动物和牛科动物。
如本文中所用的，“NGF受体”是指由NGF结合和活化的多肽。NGF受体包括任何哺乳动物物种的TrkA受体和p75受体，所述哺乳动物物种包括但不限于人、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、灵长目动物、马科动物和牛科动物。
“β-NGF适体”是能够结合β-NGF并修饰β-NGF活性的适体。如本文中所用，“β-NGF适体”是指能够结合β-NGF和/或抑制β-NGF的生物活性和/或由NGF信号介导的下游通路的适体。
如本文中所用的，“由β-NGF介导的疾病或医学病症”是指在疾病过程中某个阶段上β-NGF活性可能直接或间接地导致疼痛或瘙痒的疾病或医学病症，其包括表7中所列的任何的疾病或医学病症。因此，使用β-NGF适体的治疗抑制由于在疾病或医学病症中的β-NGF活性而存在的疼痛或瘙痒。针对β-NGF的适体还可以阻断β-NGF结合其一或多种受体。
如本文中所用，“疼痛”是指急性疼痛、慢性疼痛、伤害性疼痛、内脏疼痛、躯体疼痛、非伤害性疼痛、神经性疼痛、交感神经性疼痛或与β-NGF介导的炎症过程有关的疼痛。
术语“瘙痒”是指痒，其范围可以从对痒痛的温和的感觉至强烈的感觉。瘙痒可能伴随原发性皮肤疾病也可能是***性疾病的症状—有时是唯一的症状。其中瘙痒可以是最严重的皮肤疾病包括疥疮、虱病、昆虫叮咬、皮肤干燥症、荨麻疹、异位性皮炎、接触性皮炎、扁平苔藓、痱子和疱疹样皮炎。瘙痒的***性原因包括慢性肝脏、肾脏疾病和淋巴瘤。
术语“皮肤失调”和“皮肤疾病”是指影响或涉及皮肤的任何疾病或病症，其包括皮肤病症，例如异位性皮炎、鱼鳞癣、皮肤干燥症、脂溢性皮炎、过敏性接触性皮炎、秃头症、天疱疮、疱疹样皮炎、牛皮癣、念珠菌病、痤疮，脚癣、尿布疹、胎腻、湿疹、钩虫和皮肤损伤(来自例如创伤、烧伤和便与尿失禁)。
如本文中所用的，术语“药学上可接受的”是指被联邦或州政府或美国药典或其他普遍公认的药典中所列的管理机构批准在动物中和更具体而言在人中使用。术语“载体”是指用来施用所述治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体(vehicle)，并包括但不限于无菌液体如水和油。
β-NGF适体的“药学上可接受的盐”或“盐”是公开的化合物，其含有离子键并通常通过将所述公开的化合物与酸或碱反应来产生，适合于给个体施用。药学上可接受的盐可包括但并不限于酸加成盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氢硫酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、芳基烷基磺酸盐、醋酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐；碱金属阳离子如Li、Na、K，碱土金属盐如Mg或Ca，或有机胺盐。
“药物组合物”是包含适于给个体施用的形式的β-NGF适体的制剂。通常将药物组合物配制为与其拟定的施用途径兼容。施用途径的实例包括但不限于口服和肠道外使用，例如静脉内、皮内、皮下、吸入、局部、经皮、经粘膜和直肠施用。
如本文中所用的，术语“治疗有效量”通常是指改善本文中所描述的所要预防、减少或治疗的失调或病症的至少一种症状所必要的量。当短语“治疗有效量”涉及本公开的β-NGF适体时，是指提供特定药理学反应的所述适体的剂量，为此在显著数目的需要这种治疗的个体中施用所述适体。强调的是在特定实例中施用至特定个体的适体的治疗有效量在治疗本文所描述的病症/疾病中不会总是有效，即使本领域技术人员认为该剂量是治疗有效量。
SELEX方法
在本文中术语“SELEX”和“SELEX方法”通常可互换地使用来指以下的组合：(1)选择以期望的方式与靶分子相互作用的核酸(例如以高亲和力与蛋白质结合)和(2)扩增所选择的核酸。可以使用SELEX方法鉴定对特定靶分子或生物标志物具有高亲和力的适体。
SELEX通常包括制备核酸的候选物混合物、使所述候选物混合物结合至所期望的靶分子以形成亲和复合物、将未结合的候选核酸和所述亲和复合物分开、从所述亲和复合物分开和分离所述核酸、纯化所述核酸和鉴定特定的适体序列。该过程可以包括多轮以进一步精炼所选择的适体的亲和力。所述方法可以包括在方法中的一或多个点上的扩增步骤。参见，例如美国专利号5475096，题为“核酸配体”。可以使用所述SELEX方法来产生共价地结合其靶的适体以及非共价地结合其靶的适体。参见，例如美国专利号5705337，题为“通过指数富集的核酸配体的***性进化：CHEMI-SELEX”。
可以使用所述SELEX方法来鉴定含有修饰的核苷酸的高亲和力的适体，其在所述适体上赋予提高的特性，例如提高的体内稳定性或提高的输送特性。这样修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。含有修饰的核苷酸的SELEX方法鉴定的适体在美国专利号5660985，题为“含有修饰的核苷酸的高亲和力核酸配体”中有所描述，其描述含有在嘧啶的5'-和2'-位上被化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。同上，美国专利号5580737描述含有一或多种用2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸的高度特异性的适体。另见，美国专利申请公开号20090098549，题为“SELEX和PHOTOSELEX”，其描述具有扩大的物理和化学特性的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的使用。
美国临时申请序列号61/264545(2009年11月25日提交)，题为“核酸酶抗性寡核苷酸”，描述用于生产有提高的核酸酶抗性的寡核苷酸的方法。所述核酸酶抗性寡核苷酸包括至少一个选自图10中所提及的在C-5位修饰的嘧啶。在各种实施方案中，所述修饰包括C-5位上的脱氧尿嘧啶的取代，其取代基独立地选自：如以上所示的苯甲基甲酰胺(Bn)、萘基甲基甲酰胺(Nap)、色氨基甲酰胺(Trp)和异丁基甲酰胺。
也可以使用SELEX来鉴定具有理想的解离速率(off-rate)特性的适体。见美国专利公开号20090004667，题为“用于产生有提高解离速率的适体的方法”，其描述用于产生可以结合至靶分子的适体的改进的SELEX方法。已描述产生具有更低的从其各自靶分子解离的速率的适体和光适体的方法。该方法涉及将所述候选物混合物与靶分子接触，使得核酸-靶复合物的形成发生，并进行缓慢解离速率的富集过程，其中具有快的解离速率的核酸-靶复合物解离并且不重新形成而具有慢的解离速率的复合物保持完整。此外，该方法包括在候选核酸混合物的生产中使用修饰的核苷酸以产生有增强的解离速率表现的适体(见美国专利公开号20090098549，题为“SELEX和PhotoSELEX”)。
“靶”或“靶分子”或“靶”在本文中是指核酸可以期望的方式作用的任何化合物。靶分子可以是蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅助因子、抑制剂、药物、染料、养料、生长因子、细胞、组织、任何上述的任何部分或片段等，没有限制。实际上，任何化学或生物效应物可以是适合的靶。任何大小的分子可以作为靶。也可以特定的方式修饰靶来增强所述靶和核酸间相互作用的可能性或强度。靶也可以包括特定化合物或分子的任何小的改变，例如在蛋白质的情况下，例如在氨基酸序列、硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰(例如用标记组分缀合)中的小的改变，其基本上不改变所述分子的性质。“靶分子(targetmolecule)”或“靶(target)”是能够结合适体的一种或一类分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子(targetmolecules)”或“靶(targets)”是指多于一组这样的分子。其中所述靶是肽的SELEX方法的实施方案在美国专利号6376190，题为“不用纯化蛋白质的修改的SELEX方法”中有所描述。在本文的情况中，所述靶是β-NGF。
适体
使用用于鉴定具有如实施例1中所述的慢解离速率的适体的改进的SELEX方法鉴定本公开的适体，其描述用于选择和产生针对β-NGF的DNA适体的代表性方法。在所述选择方法中使用的β-NGF形式是重组人蛋白并分离为具有13.2kD分子量的蛋白单体形式。在溶液中所述单体形成二聚体。使用该方法，鉴定了定名为适体2426-66(SEQIDNO:1)的针对β-NGF的DNA适体。
使用适体2426-66(SEQIDNO:1)进行研究以鉴定保持针对β-NGF的强亲和力所需的最小序列长度，如实施例2中所描述。最小化序列长度允许化学方法中更加可重复的适体合成并潜在地有助于通过皮肤的吸收以及有助于并入药剂中。该截短研究导致鉴定具有许多对β-NGF也是强烈(avid)的结合物的截短序列(Kd值高达约30nM)的适体。这些序列包括SEQIDNO:1、2、9-44和149(表3和表4)。在特定的适体2426-66-50(SEQIDNO:2，表4)中，鉴定了具有1.4nM的Kd的针对β-NGF的28-聚体。
对从中选择出2426-66(SEQIDNO:1)的序列池进行额外的测序研究。所用的测序方法是454测序。这是使用平行焦磷酸测序的大规模、高通量的方法。该方法提供无偏差的样品制备和非常准确的序列分析。在该方法中，在链霉亲和素珠上捕获生物素化的DNA片段然后通过PCR扩增。从所述珠释放非生物素化的链并用其作为单链模板DNA文库。然后通过PCR扩增该文库。然后，每个珠含有所述DNA片段的扩增的克隆拷贝。然后在酶测序方法中使用该珠的文库。使用该测序数据来鉴定针对β-NGF适体的共有序列。另外，实施例3中所描述的核苷酸取代研究导致发现在所述共有序列中九个BndU位置的七个对β-NGF结合是需要的，但两个BndU位置可以用dT替代而不损失结合活性。图2A中显示所述共有序列，以及在相对于所述2426-66(SEQIDNO:1)适体的各个位置上的核苷酸频率的图示。如图2A中所示，所述共有序列是：
BAZGRGGRSZWGGGGZZWADCCGZZRZG(SEQIDNO:45)
其中
B选自除A以外的任何核苷酸；
R独立地选自A或G；
S选自C或G；
W独立地选自Z或T；
D选自除C以外的任何核苷酸；和
Z独立地选自修饰的核苷酸，特别是修饰的嘧啶。
一个方面，B选自C、G或Z；D选自A、G或Z而R、S、W和Z如上所定义。
另一方面，所述共有序列是：
BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG(SEQIDNO:3)
其中B、R、S、D和Z如上所定义。
在一些实施方案中，Z是修饰的尿嘧啶。在其他实施方案中，Z是如上所定义的C-5修饰的嘧啶。在另外的其他实施方案中，Z是C-5修饰的嘧啶，其独立地选自5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(BndU)、5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(iBudU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(TrpdU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2'-氯化脱氧尿嘧啶、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿嘧啶、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-氟尿嘧啶和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶。在其它实施方案中，Z是5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(BndU)。预期任何这些核苷酸修饰在促进对β-NGF的高亲和力并提供慢解离速率中是同样地有效。
如本文中所用，当对一系列相关的核酸使用“共有序列”时，是指反映在序列中各个位置上碱基最普遍的选择的核酸序列，其中对所述系列相关的核酸已进行精密的数学和/或序列分析。
本公开提供使用所述SELEX方法鉴定并列于表3和表4(SEQIDNO:1、2、9-44和149)中的β-NGF适体(SEQIDNO:1、2、9-44和149)。本公开也包括基本上与任何所列出的适体同源并具有与选自表3和4中所提及的适体(SEQIDNO:1、2、9-44和149)基本上类似的结合β-NGF能力的针对β-NGF的适体。另外，本公开也包括具有与本文所鉴定的适体基本上同样结构形式并具有与选自表3和4中所提及的适体(SEQIDNO:1、2、9-44和149)基本上类似的结合β-NGF能力的针对β-NGF的适体。
一方面，本公开提供特异性结合β-NGF的适体并包括一级核酸序列。在一个实施方案中，所述一级核酸序列选自SEQIDNO:1、2、9-44和149。在其它实施方案中，选择一级核酸序列使得其与选自SEQIDNO:1、2、9-44和149的一级核酸序列具有至少大约75%相同性、至少大约80%相同性、至少大约85%相同性、至少大约90%相同性或至少大约95%相同性。
当在两或多个核酸序利的上下文中使用时，互换地使用术语“序列相同性”、“序列相同性百分比”、“相同性百分比”、“%相同的”、“%相同性”及其变体来指当针对最大一致进行比较和比对时，两或多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的同样的核苷酸，其使用序列比较算法或通过肉眼检查来测得。对于序列比较，通常一个序列作为参考序列而将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列的坐标(如果必要的话)并指定序列算法程序的参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数来计算所述测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。用于比较的最佳的序列比对可以例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.,2:482,1981)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.,48:443,1970)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索的方法(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444,1988)，通过这些算法的电脑化实现(WisconsinGeneticsSoftwarePackage(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过肉眼检查(通常见Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，pub.byGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987))进行。
适合于确定序列相同性百分比的算法的一个实例是在基本局部比对搜索工具(以下为“BLAST”)中使用的算法，见例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschul等人，NucleicAcidsRes.,15:3389-3402,1997。进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(以下为“NCBI”)公开地可获得的。在使用从NCBI可获得的软件(如针对核酸序列的BLASTN)来确定序列相同性所使用的默认参数在McGinnis等人NucleicAcidsRes.,32:W20-W25,2004中有所描述。
如本文中所用的，当描述核酸(如β-NGF适体)的相同性百分比，例如其序列与参考核苷酸序列具有至少大约95%相同性时，其旨在指所述核酸序列与所述参考序列是相同的，除了所述核酸序列可能在所述参考核酸序列的每100个核苷酸包括最高五个点突变。换而言之，为了获得序列与参考核酸序列具有至少大约95%相同性的所期望的核酸序列，所述参考序列中的高达5%的核苷酸可能被缺失或由另一核苷酸取代，或高达所述参考序列中核苷酸的总数的5%的一些数目的核苷酸可能被***至所述参考序列(本文称之为***)。用于产生所期望的序列的所述参考序列的这些突变可以出现在所述参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或所述末端位置之间的任何位置，单独地在所述参考序列中的核苷酸当中或以一或多个连续的组中散布于所述参考序列中。所述参考(查询)序列可以是SEQIDNO:1、2、9-44和149或任何这些序列的任何片段中所示的全部核苷酸序列的任何一种。
一方面，可以修饰SEQIDNO:45或SEQIDNO:3的各自的共有序列以包括至少一个***。在一个实施方案中，修饰SEQIDNO:45或SEQIDNO:3的共有序列使得在所述共有序列的碱基9和10之间***一个核苷酸(N)。在另一实施方案中，修饰SEQIDNO:45或SEQIDNO:3的共有序列使得在所述共有序列的碱基15和16之间***一个核苷酸(N)。在另一实施方案中，修饰SEQIDNO:45或SEQIDNO:3的共有序列使得在共有序列的碱基9和10之间***一个核苷酸(N)并且在所述共有序列的碱基15和16之间***一个额外的核苷酸(N)。这些实施方案如下所示：
BAZGRGGRSN(0-1)ZWGGGGN(0-1)ZZWADCCGZZRZG(SEQIDNO:154)
BAZGRGGRSN(0-1)ZZGGGGN(0-1)ZZZADCCGZZRZG(SEQIDNO:155)
其中B、R、S、D和Z如上所定义而N独立地选自任何天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸(A、C、G或T)。
另一方面，本公开提供β-NGF适体，其通过结合β-NGF来调节β-NGF的功能。在多种实施方案中，所述适体调节β-NGF的体内功能。在多种实施方案中，所述β-NGF适体包括连续核苷酸的序列，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的连续核苷酸的序列相同。在多种实施方案中，所述β-NGF适体中的连续核苷酸序列可以包括任意数目的核苷酸，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的连续核苷酸序列中同样数目的核苷酸相同。在多种实施方案中，所述β-NGF适体中的连续核苷酸序列包括大约4至大约30个连续核苷酸的序列，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的大约4至大约30个连续核苷酸的序列相同。在一个示例性实施方案中，所述β-NGF适体包括30个连续核苷酸的序列，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的30个连续核苷酸的序列相同。在另一示例性实施方案中，所述β-NGF适体包括20个连续核苷酸的序列，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的20个连续核苷酸的序列相同。在又一示例性实施方案中，所述β-NGF适体包括8个连续核苷酸的序列，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的8个连续核苷酸的序列相同。在又一示例性实施方案中，所述β-NGF适体包括4个连续核苷酸的序列，其与SEQIDNO:1、2、9-44和149中的任一个所包括的4个连续核苷酸的序列相同。
在一个实施方案中，所述β-NGF适体是SEQIDNO:1。在另一实施方案中，所述β-NGF适体是SEQIDNO:2。在又一实施方案中，所述β-NGF适体衍生自SEQIDNO:3的共有序列。在其它实施方案中，所述β-NGF适体是SEQIDNOS：9-44和149中的任一个。在一个实施方案中，所述β-NGF适体与SEQIDNOS：1、2、9-44和149中的任一个具有至少大约95%相同性、至少大约90%相同性、至少大约85%相同性、至少大约80%相同性或至少大约75%相同性。在另一实施方案中，所述β-NGF适体包括来自SEQIDNOS：1、2、9-44和149中任一个及这些中任一个的片段的序列。
除β-NGF结合区域之外，所述β-NGF适体可以含有任意数目的核苷酸。在多种实施方案中，所述β-NGF适体可以包括多达大约100个核苷酸、多达大约95个核苷酸、多达约90个碱基、多达大约85个核苷酸、多达大约80个核苷酸、多达大约75个核苷酸、多达大约70个碱基、多达大约65个碱基、多达大约60个核苷酸、多达大约55个核苷酸、多达大约50个核苷酸、多达大约45个核苷酸、多达大约40个核苷酸、多达大约35个核苷酸、多达大约30个核苷酸、多达大约25个核苷酸和多达大约20个核苷酸。
在又一实施方案中，所述β-NGF适体选自具有与选自SEQIDNO:1、2、9-44和149的适体类似的结合特性和治疗β-NGF关联的疼痛或瘙痒和搔痒病症的能力的适体。
可以选择所述β-NGF适体以具有任何适合的针对β-NGF的解离常数(Kd)。在一个示例性实施方案中，所述β-NGF适体对β-NGF具有大约10nM或更小的解离常数(Kd)。在另一示例性实施方案中，所述β-NGF适体对β-NGF具有大约15nM或更小的解离常数(Kd)。在又一示例性实施方案中，所述β-NGF适体对β-NGF具有大约20nM或更小的解离常数(Kd)。在又一示例性实施方案中，所述β-NGF适体对β-NGF具有大约25nM或更小的解离常数(Kd)。使用多点滴定并拟合如下面实施例1中所描述的方程y=(max–min)(Protein)/(Kd+Protein)+min可以确定适合的解离常数。应当理解解离常数的确定是高度地依赖于其所测量的条件，因此这些数目可能由于例如平衡时间等的因素而显著差异。在其他实施方案中，所述β-NGF适体是Kd小于或等于选自SEQIDNO:1、2、9-44和149的适体的Kd的适体。
适体2426-66(SEQIDNO:1)以1:1化学计量与β-NGF单体结合。由于β-NGF形成与其靶受体反应所需的紧密的同二聚体，可以通过使用适体2426-66的二聚体或其他多聚体形式实现对β-NGF活性更有效的抑制。因此，在另一实施方案中，所述β-NGF适体是上述序列的任意组合的多聚化。图3和图4展示二聚化所述适体2426-66的可能的方法。相同的策略可以用于具有适当的针对β-NGF的结合特性的任何适体序列。类似的方法也可以用于用如所期望的多拷贝的适体序列创造多聚化适体。在这种情况下使用所述适体截短的2426-66-50(SEQIDNO:2)序列，但也可以利用全长的2426-66序列。图3展示两个2426-66序列的从头至尾的构建体，其用一或多个六乙二醇(HEG)或脱碱基糖磷酸作为所述新适体序列两个部分之间的接头。图4表示通过使用分支的亚磷酰胺任选地包括六乙二醇(HEG)或脱碱基糖磷酸盐作为接头的所述2426-66序列的二聚化。
包括β-NGF适体的药物组合物
本公开包括药物组合物，其包括至少一种针对β-NGF的适体和至少一种药学上可接受的载体。适合的载体在“Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Twenty-firstEdition,"publishedbyLippincottWilliams&Wilkins中有所描述，其通过引用并入本文。包括至少一种针对β-NGF的适体和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物还可以包括一或多种不是β-NGF抑制剂的活性剂。
本文所描述的适体可以任何药学上可接受的剂量形式使用，包括但不限于以可注射剂量形式、液体分散体、凝胶、喷雾、软膏、霜剂、冻干制剂、干粉、片剂、胶囊、控制释放制剂、速熔制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉动释放制剂、混合的立即释放和控制释放制剂等。具体地，本文所描述的适体可以配制为：(a)通过选自口腔、肺、静脉内、动脉内、鞘内、内关节、直肠、眼、结肠、胃肠外、脑池内、***内、腹腔内、局部、颊、鼻和局部施用中的任一项来施用；(b)选自液体分散体、凝胶、喷雾、软膏、霜剂、片剂、香囊和胶囊中任一项的剂量形式；(c)选自冻干制剂、干粉、速熔制剂、控制释放制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉动释放制剂和混合的立即释放和控制释放制剂中任一项的剂量形式；或(d)它们的任意组合。
用于肠胃外、皮内或皮下的施用的溶液或悬浮液可以包含一或多种的以下组分：(1)无菌稀释剂，例如用于注射的水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；(2)抗菌剂，例如苯甲醇或对羟苯甲酯；(3)抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸钠；(4)螯合试剂，例如乙二胺四乙酸；(5)缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和(5)用于调节张力(tonicity)的物质，例如氯化钠或葡萄糖。用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)可以调整pH。肠胃外的制剂可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物可以包括无菌的水性溶液(其中是水溶的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物应该是无菌的并且其流动程度应该为易于注射。在制造和储存的条件下所述药物组合物应该是稳定的并应当被保护以防微生物如细菌和真菌的污染作用。如本文中所用的术语“稳定的”意为保持在适合于给患者施用的状态或条件。
所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。例如通过使用如卵磷脂的包衣，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。通过各种抗菌和抗真菌的试剂，例如，对羟基苯甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸，硫柳汞等可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在所述组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)和无机盐(如氯化钠)。通过在所述组合物中包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以带来可注射组合物的延长的吸收。
可以通过在适当的溶剂中用以上所列举的成分的一种或组合(如需要的)以需要的量并入活性剂(例如，β-NGF适体)接着过滤灭菌来制备无菌的可注射溶液。通常，通过向含有基本分散介质和任何其他所需成分的无菌载体并入至少一种β-NGF适体来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的示例性方法包括真空干燥和冷冻干燥，这两者会获得所述β-NGF适体的粉末以及来自之前其无菌过滤溶液的任何额外的所需的成分。
口服组合物通常包括惰性的稀释剂或可食用的载体。例如，可以将它们装入明胶胶囊或压成片剂。针对口服治疗施用的目的，所述β-NGF适体可以并入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。还可以使用流体载体来制备口服组合物以用作漱口水，其中在口腔中使用所述流体载体中的化合物并涮洗，并吐出或吞咽。可以包括药物相容的结合剂和/或佐剂材料作为所述组合物的一部分。
对于通过吸入的施用，以来自含有适合的推进物(例如气体(如二氧化碳)、雾化的液体或来自适合的装置的干粉末)的加压容器或分配器的气溶胶喷雾的形式来递送所述化合物。对于经粘膜或经皮的施用，在制剂中使用对要渗透的屏障是适当的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，并包括例如，用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂可以实现经粘膜的施用。对于经皮的施用，所述活性剂配制成如本领域所熟知的的软膏、油膏、凝胶或霜剂。也可以栓剂(例如用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂的形式来制备所述试剂。
在一个实施方案中，β-NGF适体配制为用于局部施用。如本文所用，“局部施用”是指通过将(直接地或其他方式)包含所述β-NGF适体的制剂与动物的全部或部分皮肤(表皮)接触来递送β-NGF至所述动物。该术语包括了几种施用途径，包括但不限于局部施用和经皮施用。针对这些施用模式的普遍需求是有效递送至靶组织或层。一方面，使用局部施用作为渗透所述表皮和真皮的方式并最终实现β-NGF适体的全身性递送。另一方面，使用局部施用作为选择性地递送β-NGF适体至动物的表皮或真皮或其特定的层的方式。
对于局部施用，所述β-NGF适体可以配制成药学上可接受的软膏剂、霜剂、洗剂、眼用软膏剂、滴眼剂、滴耳剂、浸渍敷料、和气雾剂、含药粉末、含药粘合剂、泡沫，并且可以含有适当的常规添加剂或赋形剂，包括，例如防腐剂或帮助药物渗透的溶剂和软膏剂、凝胶和霜剂中的软化剂。这种局部制剂也可以含有兼容的常规载体，例如用于乳液的乙醇或油醇。这样的载体可能构成所述制剂的大约1%至大约98%的重量，更通常地，这样的载体会构成所述制剂的高达大约80%的重量。针对适体的局部递送的具体制剂在美国专利号6841539和美国公开号20050096287中有所描述。设计以局部制剂递送的剂量以适应持续的递送模式。
在一个实施方案中，用会防止从身体迅速除去的载体制备β-NGF适体。例如，可以使用控制释放制剂，包括植入和微囊化的递送***。可以使用可生物降解的、生物兼容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这种制剂的制备方法对本领域技术人员会是显而易见的。所述材料也可以从AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc商购获得。
脂质体悬浮液(包括以被感染的细胞为靶的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如在美国专利号4522811中所描述的。
此外，可以制备所述β-NGF适体的悬浮液作为适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。非脂的聚阳离子氨基酸聚合物也可以用于递送。任选地，所述悬浮液还可以包括适合的稳定剂或试剂以增加所述化合物的溶解度并允许用于制备高浓缩的溶液。
在某些情况下，以剂量单位来配制口服或胃肠外的组合物对便于施用和剂量均一可能是特别有利的。如本文中所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，适合作为用于要治疗的对象的单一剂量；每单位含有经计算能产生期望的治疗效果的预定量的β-NGF适体以及所需的药物载体。本文所描述的β-NGF适体的剂量单位形式的说明决定于并直接依赖于特定β-NGF适体的独特的特性和所要实现的特定的治疗效果和配制此类用于治疗个体的活性剂的技术的固有限制。
包含至少一种β-NGF适体的药物组合物可以包括一或多种药物赋形剂。这样的赋形剂的实施例包括但不限于，结合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。这样的赋形剂在本领域中是已知的。示例性赋形剂包括：(1)结合剂，包括各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素(如AvicelPH101和AvicelPH102)、硅化微晶纤维素(ProSolvSMCCTM)、黄蓍胶和明胶；(2)填充剂，例如各种淀粉、乳糖，乳糖单水合物、无水乳糖；(3)崩解剂如藻酸、Primogel、玉米淀粉、轻度交联的聚乙烯基吡咯烷、马铃薯淀粉、玉米淀粉和修饰的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、乙醇酸淀粉钠及它们的混合物；(4)润滑剂，包括作用于所要压缩的粉末的流动性的试剂，包括硬脂酸镁、胶状二氧化硅(如Aerosil200、滑石)、硬脂酸、硬脂酸钙和硅胶；(5)助流剂，如胶状二氧化硅；(6)防腐剂，如山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、其他对羟基苯甲酸的酯(如对羟基苯甲酸丁酯)、醇(如乙醇或苯甲醇)、酚类化合物(如苯酚)或季铵化合物(如氯化苯甲烃胺)；(7)稀释剂，如药学上可接受的惰性填料，如微晶纤维素、乳糖、磷酸氢钙、糖类和/或任何以上的混合物；稀释剂的实施例包括微晶纤维素，如AvicelPH101和AvicelPH102；乳糖如乳糖单水合物、无水乳糖和PharmatoseDCL21；磷酸氢钙如Emcompress甘露醇、淀粉、山梨醇、蔗糖和葡萄糖；(8)甜味剂，包括任何天然或人造的甜味剂，如蔗糖、糖精蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜和安赛蜜；(9)调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂、Magnasweet(商标MAFCO)、泡泡糖香料、水果香料等；和(10)泡腾剂，包括泡腾剂对(effervescentcouple)，如有机酸和碳酸盐或重碳酸盐。适合的有机酸包括，例如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、己二酸、琥珀酸和藻酸和酐和酸式盐。适合的碳酸盐和重碳酸盐包括，例如碳酸钠、重碳酸钠、碳酸钾、重碳酸钾、碳酸镁、甘氨酸钠碳酸盐、L-赖氨酸碳酸盐和精氨酸碳酸盐。可选地，只有所述泡腾剂对的重碳酸钠成分可以存在。
在多种实施方案中，本文所描述的制剂基本上是纯的。如本文中所用的，“基本上纯的”是指活性成分(β-NGF适体)是最主要存在的种类(species)(即，基于摩尔数，其比所述组合物中其他任何的单个种类更丰富)。在一个实施方案中，基本上纯化的比例是组合物中的活性成分包括所有存在的大分子种类的至少大约50%(基于摩尔数)。通常地，基本上纯的组合物会包括存在于所述组合物中的超过大约80%的所有的大分子种类。在多种实施方案中，基本上纯的组合物会包括存在于所述组合物中的至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%或至少大约99%的所有大分子种类。在各种实施方案中，纯化所述活性成分至必要的同质性(通过常规的检测方法在所述组合物中不能检测到污染物种类)，其中所述组合物基本上由单一的大分子种类组成。
包含B-NGF适体组合物的试剂盒
本公开提供包含本文所描述的任何β-NGF适体的试剂盒。这种试剂盒可以包含，例如(1)至少一种β-NGF适体，和(2)至少一种药学上可接受的载体，例如溶剂或溶液。额外的试剂盒组分可以任选地包括，例如：(1)任何本文所鉴定的药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂、缓冲剂等；(2)至少一种容器，用于容纳和/或混合所述试剂盒组分的小瓶或类似的装置；和(3)递送装置。
治疗方法
本公开提供通过使用β-NGF适体的预防或治疗(例如，减轻一或多种症状)医学病症的方法。该方法包括施用治疗有效量的β-NGF适体至需要所述适体的患者。所描述的适体也可以用于预防性的治疗。在一些实施例中局部地施用所述β-NGF适体。
在治疗方法中所使用的β-NGF适体可以是：(1)通过本文所描述的方法制备新型的β-NGF适体，或其药学上可接受的盐，或其前药。
所述个体或患者可以是任何动物(驯养的、家畜或野生的)，其包括但不限于猫、狗、马、猪和牛，并优选人类患者。如本文中所用，术语患者、个体和对象可以互换地使用。
如本文中所用的，“治疗”描述患者的管理和护理，其目的为治疗疾病、病症或失调并包括施用β-NGF适体以预防所述患者的症状或疾病并发症、病症或失调的发生；或为了缓和症状或疾病并发症、病症或失调；或以消除疾病、病症或失调。更具体地，“治疗”包括逆转、减弱、缓和、最小化、抑制或停止至少一种有害的症状或疾病(失调)状态、疾病进展、疾病的病原体(如细菌或病毒)的作用，或其它异常病症。只要症状和/或病理改善，通常继续治疗。
在各种实施方案中，所公开的组合物(包括局部制剂)和方法用于治疗皮炎，其特征往往在于表面的炎症或特征为发红、水肿、渗出、结痂、脱屑和有时为囊泡的皮肤疹。瘙痒(痒)在皮炎中是普遍的。湿疹是与皮炎经常互换地使用的术语。皮炎或湿疹的实施例包括，例如，异位性皮炎(也称为婴儿或屈侧湿疹)、接触性皮炎(包括过敏性和刺激性)、干燥湿疹(也称为干性湿疹、craquele或craquelatum、冬季痒或冻瘙痒)、剥脱性皮炎、手和脚的皮炎、神经性皮炎(例如，慢性单纯性苔藓)、脂溢性皮炎(婴儿中的胎腻、头皮屑)、盘状湿疹(也称为钱币状湿疹、渗出性湿疹、微生物湿疹)、出汗障碍、静脉湿疹(引力性湿疹、淤滞性皮炎、静脉曲张性湿疹淤滞性皮炎、疱疹样皮炎(杜林病)、自体湿疹化(也称为id反应、自体敏感性)、尾蚴性皮炎(例如，游泳者的痒或鸭痒)、漆酚诱导的接触性皮炎，其也称为漆树皮炎和盐肤木皮炎(例如，有毒橡树、有毒腾、漆树)、日光性皮炎和主妇湿疹。
在一个实施方案中，可以与其它改善或根除痒的治疗组合施用所公开的化合物或其药学上可接受的盐或前药。包括所公开的β-NGF适体的组合物可以含有，例如，多于一种适体，如IgE、IL-6和/或PAR2适体和β-NGF适体。在一些实施例中，含有一或多种适体的β-NGF适体组合物与其他有用的抗瘙痒组合物(例如，抗组胺、止痛药、抗胆碱药、非固醇类抗炎症药物、类固醇、抗氧化试剂、维生素、白细胞三烯修饰剂、白细胞介素拮抗剂、肥大细胞抑制剂、抗IgE抗体、选择性血清素再摄取抑制剂、5-羟色胺受体拮抗剂、抗生素、钙调磷酸酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、加巴喷丁或纳洛酮，其中活性成分以游离形式或以药学上可接受的盐的形式存在)和任选地至少一种药学上可接受的载体组合来施用，用于同时地、分开地或顺序地(等)***性或局部使用或施用。通常，针对在这样组合中使用的已知治疗试剂的目前可获得的剂量形式会是适合的。
“组合疗法”(或“共疗法”)包括使用一种β-NGF适体组合物和至少另一种试剂作为旨在从这些治疗试剂的共同作用中提供有益效果的特定治疗方案。所述组合的有益效果包括但并不限于，从所述治疗试剂的组合所导致的药物代谢动力学上和药效(pharmacodynamic)上的共同作用。在限定的时间段(取决于所选择的组合通常为分钟、小时、天或数周)内进行这些治疗试剂的组合施用。
“组合疗法”可以，但通常不是，旨在包括施用两或多种这些治疗性试剂作为作为单独的单治疗方案的部分，其偶然地并任意地导致在本公开的组合。“组合疗法”旨在包括以顺序的方式施用这些治疗性试剂，即，其中在不同时间下施用每种治疗性试剂，以及以基本上同时的方式施用这些治疗性试剂或至少两个所述治疗性试剂。例如，通过给所述对象施用具有固定比率的每种治疗性试剂的单剂或以多个针对每种治疗性试剂的单剂可以完成基本上同时的施用。
按照多种因素选择利用所述β-NGF适体的剂量方案，所述因素包括例如，所述患者的类型、种类、年龄、体重、性别和医疗病症，；所要治疗的病症的严重性；施用途径；所述患者的肾与肝的功能；和所使用的特定的β-NGF适体或其盐。普通熟练的医生或兽医可以容易地确定并指定预防、对抗或抑制所述病症进展所需要的组合物的有效量。
通常，所述剂量(即，治疗有效量的)为每天大约1μg/kg所治疗对象体重至约100mg/kg所治疗对象体重。
效力
实施例4展示各种β-NGF适体和其截短变体抑制人β-NGF介导的神经突生长(图5-7)和抑制由β-NGF的TrkA磷酸化(图8和9)的能力。
实施例5展示β-NGF适体在通过对患病小鼠施用适体2426-66-50(SEQIDNO:2)减少抓挠频率和改善临床皮肤病症中的效力。参照图11，可以看出抓挠频率在用适体2426-66-50(●)治疗的小鼠中从14-28天稳定地下降，相反在未治疗的小鼠(■)或用亲水性软膏(HO)(▲)治疗的小鼠中没有观察到改变。同样地，参照图12，可以看出在用适体2426-66-50(SEQIDNO:2)(●)治疗的患病小鼠中临床皮肤病症在4周内改善，而如抓挠频率，在未治疗的小鼠(■)或用HO(▲)治疗的小鼠中没有改善。
实施例
提供以下的实施例中仅用于展示的目的而不是旨在限制由附加权利要求所限定的本发明的范围。使用标准技术进行本文所描述的所有实施例，所述技术对本领域技术人员是熟知的和常规的。可以如在标准的实验室手册中所描述的进行以下实施例中所描述的常规分子生物学技术，例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rd.ed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,(2001)。
实施例1.适体选择和序列
A.候选物混合物的制备
通过聚合酶延伸退火至生物素化的ssDNA模板(如表1中所示)的DNA引物来制备部分随机化的ssDNA寡核苷酸的候选物混合物。所述候选物混合物含有40个核苷酸的含有dATP、dGTP、dCTP和BndUTP(5-(N-苯甲基甲酰胺-2'-脱氧尿嘧啶三磷酸)的随机盒。
将4.8nmol的在5'末端带有独特发色团硝基叠氮苯胺(ANA，命名为所述序列中的X)的引物1(SEQIDNO:165)和4nmol的带有两个生物素残基(命名为所述序列中的B')和40个随机位置(A、C、G或T)(命名为所述序列中的N)的模板1(SEQIDNO:46)合并于100μL1XKODDNA聚合酶缓冲液(Novagen)中，加热至95℃下8分钟，并在冰上冷却。所述100μL引物：模板混合物添加至含有1XKODDNA聚合酶缓冲液、0.125U/μLKODXLDNA聚合酶和0.5mM各个dATP、dCTP、dGTP和BndUTP的400μL延伸反应，并在70℃下孵育30分钟。通过加入1mL链霉亲和素包被的磁珠(MagnaBindStreptavidin，Pierce，5mg/mL在含有0.05%TWEEN-20的3MNaCl中)通过所述模板链生物素捕获双链产物并在25℃下孵育10分钟。用0.75mLSB17T缓冲液(40mMHEPES,pH7.5,125mMNaCl,5mMKCl,5mMMgCl2,0.05%TWEEN-20)洗珠三次。用1.2mL20mMNaOH从所述珠上洗脱所述适体链，用0.3mL80mMHCl中和，并用with15μL1MHEPES，pH7.5缓冲。用Centricon-30浓缩所述候选物混合物至大约0.2mL，并通过UV吸收光谱定量。
表1:SELEX模板和引物的序列
B.制备靶蛋白
通过NHS-PEO4-生物素(Pierce)共价偶联至赖氨酸残基来生物素化未标记的人β-NGF(R＆DSystems)。用SephadexG-25微旋转柱交换蛋白质(300pmol在50μL中)进入SB17T。添加NHS-PEO4-生物素至1.5mM并在4℃下孵育该反应16小时。用SephadexG-25微旋转柱去除未反应的NHS-PEO4-生物素。
C.固定靶蛋白
为第1轮SELEX固定靶蛋白在MyOne-SA顺磁性珠(MyOneSA，Invitrogen，或下文中称为SA珠)。β在0.5mLSB17T中稀释β-NGF至0.2mg/mL并添加至0.5mLSA珠(预先用20mMNaOH洗两次和用SB17T洗一次)。在25℃下旋转该混合物30分钟并在4℃下储存直至使用。
D.用慢解离速率富集方法和光交联选择适体
进行对所述候选物混合物的选择，比较有靶蛋白质的样本(信号S)和无靶蛋白质的样品(背景B)间的结合。进行前三轮针对亲和力(无光交联)的选择，第二和第三轮包括慢解离速率的富集方法。第四至九轮包括慢解离速率富集方法和光交联。
对每个样品，在有10-20pmol候选物混合物(在第一轮中的56pmol)和56pmol反向引物的SB17T中制备90μLDNA混合物。加热样品至95℃3分钟并以0.1°C/秒的速率冷却至37°C。将样品与10μL蛋白至竞争物混合物(0.1%HSA，10μM酪蛋白和10μM凝血酶原，在SB17T中)组合，添加至0.5mgSA珠并在37℃下孵育5分钟。通过磁分离去除珠。
通过添加10μL靶蛋白(0.5μM，在SB17T中)或SB17T至40μLDNA混合物并在37℃下孵育30分钟进行结合反应。以三种不同的方式使用所述慢解离速率富集方法。在第二和第三轮中，通过添加950μLSB17T(预热至37℃)稀释样品20倍，并在捕获复合物前在37℃下孵育15分钟前。在第四和第五轮中，通过添加950μLSB17T(预热至37℃)稀释样品20倍，并在交联前在37℃下孵育30分钟前。在第六和第七轮中，通过添加950μLSB17T(预热至37℃)稀释样品20倍。通过转移至含有10mM硫酸葡聚糖(5kDa)的950μLSB17T(预热至37℃)再次稀释50μL的每个稀释样品以给出整体的400倍的稀释，并在交联前在37℃下孵育30分钟前。在第八和第九轮中，通过添加950μLSB17T(预热至37℃)稀释样品20倍，并通过转移至950μLSB17T(预热至37℃)再次稀释50μL的每个稀释样品以给出整体的400倍的稀释。最后，通过转移至含有10mM硫酸葡聚糖(5kDa)的950μLSB17T(预热至37℃)再次稀释50μL的每个400倍稀释的样品以给出整体8000倍的稀释，并在交联前在37℃下孵育30分钟前。当使用光交联时，在复合物捕获之前用470nmLED的阵列从上方照射所述慢解离速率富集方法后的1mL结合反应物60秒。
通过加入0.25mgMyOne-SA珠(Invitrogen)并在25℃下混合地孵育15分钟由蛋白质生物素捕获SA珠上的复合体。通过用SB17T洗所述珠五次去除游离DNA。除非另有说明，通过在100μL洗涤溶液中重悬浮，在25℃下混合30秒，用磁铁分离所述珠并去除所述洗涤溶液进行所有的洗涤。通过添加85μL20mMNaOH并在37℃下混合地孵育1分钟来从所述珠上洗脱所述适体链。磁分离后，转移80μL适体洗脱液至新管，用20μL80mMHCl中和，并用1μL0.5MTris-HCl(pH7.5)缓冲。
当使用光选择时，如上地捕获复合物，而通过用含有0.05%TWEEN-20的4M盐酸胍在50℃下洗一次所述珠10分钟、用SB17T洗两次和用16mMNaCl洗一次来去除非交联的DNA。针对扩增步骤不会从珠表面去除交联的DNA。
E.适体的扩增和纯化
扩增所选择的适体DNA并通过QPCR定量。添加48μLDNA溶液至12μLQPCRMix(5XKODDNA聚合酶缓冲液、25mMMgCl2、10μM正向PCR引物(引物2，SEQIDNO:47)、10μM生物素化的反向PCR引物(引物3，SEQIDNO:48)、5XSYBRGreenI、0.125U/μLKODXLDNA聚合酶和1mM每种dATP、dCTP、dCTP和dTTP)并在Bio-RadMyiQTMQPCR仪器中用以下方案热循环：1个循环的99.9℃15sec、55℃10sec、68℃30min，30个循环的99.9℃15sec、72℃1min。用所述仪器软件进行定量并与和不与靶蛋白质比较所选择的DNA的拷贝数以确定信号/背景的比例。
当进行光选择时，通过在所述珠表面的引物延伸制备所选择的DNA的cDNA拷贝。在20μLcDNA延伸混合物(含有5μM非生物素化的反向PCR引物(引物4，SEQIDNO:169)、0.5mM各种dATP、dCTP、dCTP和dTTP和0.125U/μLKODXLDNA聚合酶的引物延伸缓冲液)重悬浮洗过的小珠并在68℃下混合地孵育30分钟。用SB17T洗所述珠三次，并通过添加85μL20mMNaOH并在37℃下混合地孵育1分钟来从所述珠上洗脱所述适体链。磁分离后，转移80μL适体洗脱液至新管，用20μL80mMHCl中和，并用1μL0.5MTris-HCl(pH7.5)缓冲。扩增所述cDNA并通过有30个循环的99.9℃15秒，72℃1分钟的如上的QPCR定量。
扩增之后，通过生物素化的反义链捕获SA珠上的PCR产物。用0.5mL20mMNaOH洗1.25mLSA珠(10mg/mL)两次，用SB17T洗一次，在1.25mL3MNaCl+0.05%Tween中重悬浮，并在4℃下储存。添加25μLSA珠(10mg/mL在3MNaCl中)至50μL双链QPCR产物中并在25℃下混合地孵育5分钟。用SB17T洗所述珠一次，并通过添加85μL20mMNaOH并在37下混合地孵育1分钟来从所述珠上洗脱所述“有义”链。丢弃所述洗脱的链并用SB17T洗珠三次和用16mMNaCl洗一次。
通过从固定的反义链的引物延伸用ANA发色团制备适体有义链。在20μL引物延伸反应混合物(1X引物延伸缓冲液、1.5mMMgCl2、5μM有5'ANA发色团的正向引物(引物1，SEQIDNO:165)、0.5mM各种dATP、dCTP、dCTP和dTTP和0.125U/μLKODXLDNA聚合酶)中重悬浮所述珠并在68℃下混合地孵育30分钟。用SB17T洗所述珠三次，并通过添加85μL20mMNaOH并在37℃下混合地孵育1分钟来从所述珠上洗脱所述适体链。磁分离后，转移80μL适体洗脱液至新管，用20μL80mMHCl中和，并用1μL0.5MHEPES(pH7.5)缓冲。
F.选择的严格性和反馈
响应如下的S/B比例，每一轮降低所述选择步骤的相对靶蛋白质浓度，其中在D节中定义信号S和背景B：
如果S/B<10，[P](i+1)=[P]i
如果10<S/B<100，[P](i+1)=[P]i/3.2
如果S/B>100，[P](i+1)=[P]i/10
其中[P]＝蛋白质浓度而i＝当前轮数。
每个选择轮次后，确定所述富集的DNA混合物的会聚状态。用含有1XSYBRGreenI的4mMMgCl2稀释10μL双链QPCR产物至200μL。用75μL的硅油覆盖样品并用C0t分析针对收敛性分析，其测量针对双链寡核苷酸的复合体混合物的杂交时间。用以下方案热循环样品：3个循环的98℃1分钟、85℃1分钟，1个循环的93℃1分钟、85℃15分钟。在85℃下的15分钟期间，以5秒的间隔测量荧光图像。对荧光强度作图为对数(时间)的函数，并观察到随着每个SELEX的杂交率的增加，表明序列的收敛。
G.克隆筛选方法及适体鉴定
克隆并测序9轮SELEX后的收敛池。用非生物素化的SELEX引物PCR扩增所选择的DNA来创造AGCTDNA，用QIAquick96PCR纯化试剂盒(Cat＃28181)纯化，并用StratagenePCR-Script克隆试剂盒(Cat＃211189)按照制造商的方案克隆纯化的***子。发送所述连接的SELEX池至测序供应商(Cogenics,Houston,Texas)进行转化、阵列入96孔板中、DNA制备和测序。获得了针对个克隆的序列并使用确定序列计数/拷贝数并使用局部比对算法鉴定普遍收敛模式的用户软件来针对收敛性分析。选择在所述池中有最高代表性/拷贝数的序列收敛至普遍结合基序的序列用于下游的筛选。选择六条序列用于进一步的分析并使用从Cogenics获得的质粒DNA作为针对PCR扩增的模板来酶学地制备所述序列。
H.测量平衡结合常数(Kd)
在亲和力测定中测量所述六条选择的序列的平衡结合常数。在95℃下在SB17T-0.002(有降低至0.002%的TWEEN-20的SB17T)中加热放射性标记的DNA3分钟并缓慢冷却至37℃。通过混合低浓度的放射性标记的DNA()与在SB17T-0.002中的浓度范围内的靶蛋白质(1×10-7M至1×10-12M)形成复合体，并在37℃下孵育30分钟。转移每个反应的部分至尼龙膜上并干燥以确定每个反应中的总计数。在ZORBAX树脂(Agilent)上捕获复合体，在真空下通过MultiScreenHV板(Millipore)中，并用200μLSB17T-0.002缓冲液洗以从未结合的DNA分离蛋白质结合的复合体。磷屏成像(phosphorimaged)所述尼龙膜和MultiScreenHV板并使用FUJIFLA-3000定量每个样品中的放射性的量。将所捕获DNA的比例作图为蛋白质浓度(Pt)的函数并使用y=(max–min)(Pt)/(Kd+Pt)+min确定平衡结合常数(Kd)。选择有Kd=5×10-9M的76聚体的克隆2426-66(SEQIDNO:1，列于表3中)作为lead克隆用于进一步特征化，见图1。
I.SELEX池的深度测序
为了更完全地评估所述2426-66适体家族的序列，使用454焦磷酸测序技术测序所述富集池。如上所述的用454引物扩增所述DNA池并纯化所述PCR产物并使用Sequal归一化板(Invitrogen，Cat#A10510-01)归一化。在凝胶上运行所述洗脱液以确认每个扩增子的大小和纯度。在位于AuroraCO的科罗拉多大学健康科学中心的454焦磷酸测序设备上测序所述纯化的PCR产物。
用CLUSTAL分析用2426-66比对所述454序列。从总数为1165个多拷贝序列中，165个序列具有与2426-66类似的模式。基于这些序列中5'序列的共性，他们被比对为三组。序列的中间区域在所有三组中是是保守的。对于所有的序列，计算在每个位置上与2426-66的相同性百分比，如图2B中所列。表2列出所述2426-66适体家族序列的一些序列代表，其中Z'代表BndU。
表2:所述适体2426-66的代表性序列*
*只显示40N区域
基于此，如上所述，确定结合β-NGF的共有序列为以下序列：
BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG(SEQIDNO:3)
其中B、Z、R、S如上所定义。虽然所述共有序列长为28个核苷酸，表2中列出的一些序列在这个共有序列中具有单碱基***。图2B表示大约91%的所述序列具有在12位的缺失，但大约7%的所述序列具有在该位置的G或Z，而且大约95%具有在19位的缺失，但大约3%具有在该位置的G。这一观察暗示在所述β-NGF共有序列(SEQIDNO:3)中的***在某些位置上是可容忍的而这些***不会失活所述β-NGF适体。
实施例2序列截短研究
ββ-NGF适体2426-66(SEQIDNO:1)长为76个核苷酸，Kd=5×10-9M。对最有效的化学合成，鉴定最小的高亲和力适体序列和截短所述适体至最小的可能的大小是重要的。其他优点是增加的组织渗透和体内对核酸酶活性的稳定性。
为了鉴定保留结合亲和力的适体2426-66(SEQIDNO:1)的最小区域，合成了一系列截短的变体代表2426-66中存在的所有可能的连续的50个核苷酸长的序列。所述变体的序列列于表3中，其中Z'代表BndU而T代表dT。在如上所述的亲和力结合测定中针对β-NGF的亲和力测试所述变体。
表3:适体2426-66和截短变体的序列
除变体2426-66-2(SEQIDNO:4)、2426-66-3(SEQIDNO:5)、2426-66-4(SEQIDNO:6)、2426-66-5(SEQIDNO:7)和2426-66-6(SEQIDNO:8)之外，所有变体保留β-NGF结合活性，暗示2426-66的5'末端的26个核苷酸(位置1-26)和3'末端的21个核苷酸(位置56-76)不是结合β-NGF所需要的，而保留的29个核苷酸元素的全部或部分(位置27-55)可能是足够的。通过合成和测量2426-66(SEQIDNO:1)的第二系列变体的结合亲和力来检验这个假说。所述变体的序列列于表4中，其中Z'代表BndU而T代表DT。除变体2426-66-56(SEQIDNO:150)、2426-66-57(SEQIDNO:151)、2426-66-58(SEQIDNO:152)和426-66-59(SEQIDNO:153)之外，所有变体保留β-NGF结合活性。25聚体的变体2426-66-55(SEQIDNO:149)是β-NGF结合亲和力等于所述全长适体2426-66(SEQIDNO:1)的最短的序列。26聚体的变体2426-66-54(SEQIDNO:44)具有比所述全长适体2426-66(SEQIDNO:1)稍好的针对β-NGF的亲和力并被选择用于进一步的优化。
表4:适体2426-66的截短变体的序列
实施例3.理想的BndU位置的确定
26聚体的BndU至dT的单取代
适体2426-66-54(SEQIDNO:44)26个核苷酸的9个是BndU。为了确定哪些BndU位置参与结合，合成了2426-66-54的九个变体，每个含有在九个BndU位置中一个的单个的dT取代并测量β-NGF亲和力。所述变体的序列列于表5中，其中Z'代表BndU而T代表dT。
表5:适体2426-66-54的变体的序列
适体名称 取代位置 序列(5′→3') SEQ ID NO:
2426-66-54 无 Z'GAGGACZ'Z'GGGGZ'Z'Z'AGCCGZ'Z'GZ'G 44
2426-66-66 1 TGAGGACZ'Z'GGGGZ'Z'Z'AGCCGZ'Z'GZ'G 156
2426-66-67 8 Z'GAGGACTZ'GGGGZ'Z'Z'AGCCGZ'Z'GZ'G 157
2426-66-68 9 Z'GAGGACZ'TGGGGZ'Z'Z'AGCCGZ'Z'GZ'G 158
2426-66-69 14 Z'GAGGACZ'Z'GGGGTZ'Z'AGCCGZ'Z'GZ'G 159
2426-66-70 15 Z'GAGGACZ'Z'GGGGZ'TZ'AGCCGZ'Z'GZ'G 16027 -->
2426-66-71 16 Z'GAGGACZ'Z'GGGGZ'Z'TAGCCGZ'Z'GZ'G 161
2426-66-72 22 Z'GAGGACZ'Z'GGGGZ'Z'Z'AGCCGTZ'GZ'G 162
2426-66-73 23 Z'GAGGACZ'Z'GGGGZ'Z'Z'AGCCGZ'TGZ'G 163
2426-66-74 25 Z'GAGGACZ'Z'GGGGZ'Z'Z'AGCCGZ'Z'GTG 164
在第9位和第16位(变体2426-66-71，SEQIDNO:161)上的用dT取代BndU(变体2426-66-68，SEQIDNO:158)显示与所述未取代的(所有BndU)适体2426-66-54(SEQIDNO:44)相比，没有针对β-NGF的亲和力的损失。在第1位(变体2426-66-66，SEQIDNO:156)、第8位(变体2426-66-67，SEQIDNO:157)和第14位(2426-66-69，序列IDNO：159)上的用dT取代BndU显示亲和力的部分损失，而在第15位(2426-66-70，SEQIDNO:160)、第22位(2426-66-72，SEQIDNO:162)、第23位(2426位-66-73，SEQIDNO:163)和第25位(2426-66-74，SEQIDNO:164)上的取代显示亲和力的完全丧失。这些结果表明在第1、8、14、15、22、23和25位修饰尿嘧啶残基对最大化β-NGF的结合亲和力是理想的。
合成用dT替代第9和16位BndU残基的2426-66(SEQIDNO:1)的截短变体并测试对β-NGF的亲和力。序列列于表6中，其中Z'代表BndU而T代表dT。任何的三种变体与未取代的对照相比，在两个位置上用dT取代BdU显示没有亲和力的损失。
表6:适体2426-66的截短和取代变体的序列
基于这些结果(总结在图2A中)，如下修饰所述用于结合β-NGF的共有序列(SEQIDNO:3)以反映在两个位置用dT取代BndU的能力：
BAZGRGGRSZWGGGGZZWADCCGZZRZG(SEQIDNO:45)
其中Z、R、S、Z和W如上所定义。
实施例4.细胞测定
针对在两个体外细胞测定中的β-NGF活性的抑制筛选β-NGF适体2426-66(SEQIDNO:1)和2426-66的截短变体。PC12细胞(来自ATCC的CRL-1721)，其为来自大鼠嗜铬细胞瘤的癌症细胞系和针对神经元分化的模型，通过诱导的神经元的表型对β-NGF响应。该反应的两种表现是膜结合TrkA的磷酸化和神经突的延伸。对适体测试其抑制PC12细胞的β-NGF刺激的TrkA磷酸化和神经突生长的能力。
神经突生长测定
在60mm培养皿中稀疏地放置PC12细胞并允许过夜附着至所述板。附着之后，用低血清培养基(LSM)替代正常生长培养基，因为PC12细胞在正常高血清生长培养基中不分化。β在LSM中预混合β-NGF(100ng/mL)和适体(100nM)并允许平衡一小时，然后添加至板中达到10ng/mLβ-NGF(0.38nM)和10nM适体的最终浓度。允许所述细胞孵育三天，并在第三天如之前更换所述培养基、β-NGF和适体。在第5天，用相差显微镜捕获所述细胞的图像并使用针对ImageJ(NIH计划)的NeuronJ插件测量神经突的长度。计算神经突长度/细胞并对无适体的对照样品归一化至100的数值(相对于神经突的生长)。
在神经突生长测定中测试适体抑制人β-NGF诱导的PC12细胞分化的能力。用在3'末端的倒置的dTamidite(3'-IDT)合成适体以提供对存在于所述培养基中的3'-5'核酸外切酶的抗性(见图5)。
适体2426-66(SEQIDNO:1)和截短变体2426-66-50(SEQIDNO:2)有效地抑制由β-NGF诱导的神经突生长。变体2426-66-53(SEQIDNO:43)、2426-66-54(SEQIDNO:44)和2426-66-55(SEQIDNO:149)在抑制β-NGF介导的神经突生长上没有2426-66-50有效，表明28个核苷酸的最小适体长度是为最大的抑制所需要的。变体2426-66-75(SEQIDNO:166)(在2426-66-50的第11和18位上的BndU残基由dT残基替代)在阻断β-NGF介导的神经突生长中也不有效。有差的对β-NGF的亲和力的50聚体的变体2426-66-3(SEQIDNO:5)显示对β-NGF介导的神经突生长几乎没有抑制。
通过在适体浓度在0.5nM至8.0nM范围内下测量相对神经突生长和使用非线性曲线拟合(有可变斜率的S形剂量反应)计算最大抑制浓度(IC50)来确定适体对β-NGF介导的神经突生长抑制的有效性(见图6)。在该测定中，适体2426-66(SEQIDNO:1)显示出IC50=2×10-9M，而截短变体2426-66-50(SEQIDNO:2)显示出IC50=1×10-9M。
在神经突生长测定中针对小鼠β-NGF和大鼠β-NGF的抑制来测试适体2426-66(SEQIDNO:1)和截短变体2426-66-50(SEQIDNO:2)与2426-66-53(SEQIDNO:43)。所有三个与对人β-NGF几乎一样有效地抑制了小鼠β-NGF，并以更小的程度抑制了大鼠β-NGF(见图7)。
TrkA磷酸化测定
ββ-NGF结合至所述PC12细胞表面的TrkA受体，诱导所述受体的二聚化和自身磷酸化。TrkA磷酸化测定在用已拿适体预平衡的β-NGF处理10分钟后检测TrkA的磷酸化状态。虽然神经突生长测定是末端测定，看β-NGF刺激的结束点，所述TrkA磷酸化测定是β-NGF刺激之后紧接的信号事件的快照。
接种PC12细胞在100mm板上并允许过夜附着。附着后，更换所述培养基至LSM。细胞留在LSM中过夜，然后只用β-NGF(10ng/mL最终浓度，或0.38nM)、用有TrkA磷酸化抑制剂K252a的β-NGF(0.2μM)和用10nM最终浓度的适体预平衡的β-NGF处理10分钟。收集细胞，裂解细胞，用总Trk抗体(TrkA是在PC12细胞中表达的唯一Trk受体)从澄清的裂解物中免疫沉淀TrkA。在SDS-PAGE凝胶上跑所述免疫沉淀物，电印迹到PVDF膜上，并用磷酸化酪氨酸抗体探测probe以定量磷酸化TrkA的量。剥去所述印迹并用TrkA抗体探测以定量总TrkA的量。对每个样品计算TrkA磷酸化的百分比(磷酸化的TrkA/总TrkA的比例)并对无适体对照归一化至100的数值。所述结果在图8中说明。
针对由人β-NGF的TrkA磷酸化的抑制测试适体2424-66(SEQIDNO:1)和截短变体2426-66-50(SEQIDNO:2)与2426-66-3(SEQIDNO:5)。适体2426-66和截短变体2426-66-50有效地抑制由β-NGF诱导的TrkA受体的磷酸化。有差的对β-NGF的亲和力的50聚体的变体2426-66-3显示几乎没有对由β-NGF的TrkA磷酸化的抑制。
在TrkA磷酸化测定中针对小鼠β-NGF和大鼠β-NGF的抑制测试变体2426-66-50(SEQIDNO:2)。所述结果在图9中说明。变体2426-66-50有效地抑制小鼠β-NGF和大鼠β-NGF诱导的TrkA磷酸化。
实施例5.在小鼠模型***中的异位性皮炎的适体治疗
在非无菌的(常规的)环境中养殖的自交系NC/NgaTnd小鼠的自发地发展类似于人的异位性皮炎损伤的皮肤损伤，所述自交系小鼠是针对调查异位性皮炎的治疗而建立的模型(Matsuda等人，Int.Immunol.9:461,1997)。设计以下研究以评估NGF中和适体在体内减少或消除这种小鼠模型中异位性皮炎的临床表现的能力。
NC/NgaTnd小鼠保持在20-26°C下有12小时日/夜循环的空气未控制的常规环境中，并可随意获得标准的食物和水。在该研究中使用表现出轻度的皮肤损伤(疾病表型)的年龄为8-10周的小鼠。使用保持在无特定病原(SPF)条件下并未表现出异位性皮炎的临床信号或症状(无疾病表型)的NC/NgaTnd小鼠作为对照。
根据日本药典制备亲水性软膏(HO)(25%白色凡士林、20%硬脂醇、12%丙二醇、4%聚氧乙烯氢化蓖麻油60、1%甘油单硬脂酸酯、0.1%对羟基苯甲酸甲酯、0.1%羟基苯甲酸丙酯)。通过在85℃下的水浴中熔化20g的HO，在水中添加20g的2%适体并在冰冷水浴中混合直至冷却来在HO中制备适体。
小鼠分为四组。组1含有7只患有皮炎的未治疗的小鼠。组2含有7只患有皮炎的用HO治疗的小鼠。组3含有7只患有皮炎的用有3'-idT(1%w/v在HO中)的适体2426-66-50(SEQIDNO:2)治疗的小鼠。组1含有7只正常SPF的未治疗的小鼠。通过应用100mg样品至所影响的背侧区域在四周内每天一次地治疗组2和3中的小鼠。在四周内每周一次(0、7、14、21、28天)地定量所述小鼠的抓挠行为和临床皮肤病症得分。
使用SCLABA-Real***(ScratchCountingforLABoratoryAnimals,NoveltecInc.,Kobe,Japan)定量自发的抓挠行为(Hattori等人，J.Immunol.184:2729,2010)。在测量前将小鼠放入所述SCLABA仪器30分钟以使得它们可以适应新的环境，并在观察室中记数抓挠数目一个小时。一系列的抓挠行为，开始于拉伸后爪至头、面或背而并结束于收回爪子，计数为一次抓挠。
根据Matsuda等人(Int.Immunol.9:461,1997)所描述的标准确定临床皮肤病症得分。观察项为1)瘙痒/痒，2)红斑/出血，3)水肿，4)表皮脱落/侵蚀，和5)脱屑/干燥。将各观测项的得分分级为0(无)、1(轻度)、2(中度)和3(重度)。所述临床皮肤病症得分是5个观察项得分的总和。
图11展示针对每个治疗组的在抓挠频率中的改变，以带标准误差线的平均值作图。对组3抓挠频率从14-28天稳定地降低(适体治疗)，对组1(未治疗)和2(HO治疗)在28天内频率上没有显示出变化。组4(正常SPF小鼠)的抓挠频率是非常低的(数据未显示)。图12展示针对每个治疗组的在临床皮肤病症得分中的改变，以带标准误差线的平均值作图。对组3皮肤病症得分从14-28天稳定地降低(适体治疗)，对组1(未治疗)和2(HO治疗)在28天内没有显示出变化。组4(正常SPF小鼠)的皮肤病症得分是非常低的(数据未显示)。
以上实施方案和实施例仅仅旨在作为例子。无特定的实施方案、实施例或特定实施方案或实施例的元素会，被解释为任一权利要求的关键的、必需的或必要的元素或特征。另外，针对附加权利要求的实践不需要本文所描述的元素，除非明确地描述为“必要的”或“关键的”。可以对所公开的实施方案做各种改变、修改、替换和其他变化而不脱离本发明的领域，其由所附的权利要求限定。本说明书，包括附图和实施例，是被视为以展示性的方式而不是限制性的方式，并且所有这样的修改和替换旨在包括在本发明领域的范围之内。因此，应当由所附权利要求及其合法等同物而不是由以上所给出的实施例来确定本发明的领域。例如，可以以任何可行的顺序执行任何方法或方法权利要求中所叙述的步骤，而不受任何实施方案、实施例或权利要求中所展示的顺序限制。

Claims (7)

1.包含序列BAZGRGGRSN(0-1)ZWGGGGN(0-1)ZZWADCCGZZRZG(SEQIDNO:154)的适体，
其中
B选自C、G或Z；
R独立地选自A或G；
S选自C或G；
W独立地选自Z或T；
D选自A、G或Z；
N独立地选自任何天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸；和
Z是修饰的嘧啶，
其中所述适体结合β-NGF。
2.权利要求1的适体，其中所述适体具有以下序列：BAZGRGGRSZWGGGGZZWADCCGZZRZG(SEQIDNO:45)，其中所述适体结合β-NGF。
3.包含序列BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG(SEQIDNO:3)的适体，
其中
B选自C、G或Z；
R独立地选自A或G；
S选自C或G；
D选自A、G或Z；和
Z是修饰的嘧啶，
其中所述适体结合β-NGF。
4.权利要求1-3任一项的适体，其中所述适体抑制β-NGF的功能。
5.权利要求1或3的适体，其中所述修饰的嘧啶是C-5修饰的嘧啶并且所述适体包括至少一个核苷酸***(N)并具有以下序列：
BAZGRGGRSN(0-1)ZZGGGGN(0-1)ZZZADCCGZZRZG(SEQIDNO:155)
其中N独立地选自任何天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸。
6.权利要求5的适体，其中所述的C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(BndU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(iBudU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(TrpdU)和5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(NapdU)。
7.权利要求5的适体，其中所述C-5修饰的嘧啶是5-(N-苯甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿嘧啶(BndU)。
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