CN108025005A - 神经退行性疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

描述了用于预防和治疗神经退行性疾病，特别是运动神经元病如肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，以及用于所述方法中的组合物和组合制剂。所述方法包括在需要所述预防或治疗的对象的中枢神经***中抑制EGFR信号传导并抑制MyD88依赖性TLR/IL‑R1信号传导。所述组合物包含EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL‑R1信号传导抑制剂。

Description

神经退行性疾病的治疗

本发明涉及神经退行性疾病特别是运动神经元病(如肌萎缩侧索硬化症)的治疗，以及涉及用于所述方法中的组合物或组合制剂。

运动神经元病(MND)是一组进行性神经***疾病，该疾病破坏控制着必要的随意肌活动(如说话、行走、呼吸和吞咽)的运动神经元、细胞。通常，来自大脑中的神经细胞(上运动神经元)的信息被传递到脑干和脊髓中的神经细胞(下运动神经元)，并从它们传递到特定的肌肉。上运动神经元指导下运动神经元产生运动，例如步行或咀嚼。下运动神经元控制手臂、腿部、胸部、面部、喉咙和舌头的运动。

当最低运动神经元和肌肉之间的信号中断时，肌肉不能正常工作；肌肉逐渐弱化，并可能开始衰弱并发展出不可控制的抽搐(称为肌束震颤)。当上运动神经元和下运动神经元之间的信号发生中断时，肢体肌肉发展僵硬(称为痉挛)，运动变得缓慢且费力，肌腱反射如膝反射和踝反射等变得过度活跃。随着时间的推移，控制自主运动的能力可能会丧失。

根据MND是遗传性(家族性)还是散发性，以及退化是否影响上运动神经元、下运动神经元或同时影响上、下运动神经元来将MMD分类。在成人中，最常见的MND是肌萎缩侧索硬化症(ALS)，它同时影响上下运动神经元。它有遗传性和散发性形式，可能影响手臂、腿部或面部肌肉。原发性侧索硬化(PLS)是上运动神经元病，而进行性肌萎缩(PMA)仅影响脊髓中的下运动神经元。在进行性延髓麻痹(PBP)中，脑干的最低运动神经元受到最大影响，导致言语不清、难以咀嚼和吞咽。手臂和腿部几乎总是有轻度不正常的迹象。

表1.运动神经元病的分类

类型	上运动神经元(UMN)变性	下运动神经元(LMN)变性
			肌萎缩侧索硬化(ALS)	是	是
原发性侧索硬化症(PLS)	是	否
			进行性肌萎缩(PMA)	否	是
进行性延髓麻痹(PBP)	否	是，延髓区
			假性延髓麻痹	是，延髓区	否

ALS是一种渐进性的、最终致命的疾病，会扰乱所有随意肌的信号。术语“运动神经元病”和“ALS”经常互换使用。ALS最常侵袭40至60岁之间的人，但更年轻和更年长的人也会得该疾病。男性比女性更常受到该病影响。ALS的家族性形式占ALS病例的10％或更少，迄今为止确定了10多个基因。然而，发现的大部分基因突变仅解释了极少数病例。成人中最常见的家族性形式的ALS是由位于染色体21上的超氧化物歧化酶基因或SOD1的突变引起的。

尚不存在针对ALS或其他MND的治愈或标准治疗。利鲁唑是美国食品和药物管理局批准的用于治疗ALS的唯一处方药，其可以延长2-3个月的生命，但不能缓解症状，并具有不良副作用，例如恶心和疲劳。该药减少了将信号传递给运动神经元的、机体自然生成的神经递质谷氨酸。据信太多的谷氨酸可能会伤害运动神经元并抑制神经信号传导。

哺乳动物中枢神经***(CNS)被认为具有免疫优势，其具有相对较少的常驻型免疫细胞和高度特异性的血脑屏障(BBB)。然而，相当多的证据支持神经退行性疾病中存在免疫和炎症异常。神经炎症的特征在于小神经胶质细胞的活化和增殖(小神经胶质细胞增生症)、星形胶质细胞增生和免疫细胞浸润。它是许多神经退行性疾病的病理学特征，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)和ALS。神经炎症反应对运动神经元存活可能有益或有害。这些不同的作用是由小神经胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞的不同活化状态引起的，并且由浸润T细胞来调节(Zhao et al.,JNeuroimmune Pharmacol.2013；8(4):888-899)。

小神经胶质细胞作为CNS中免疫防御的第一道防线，通过它们的过程来调查周围环境。小神经胶质细胞对CNS中的病理变化敏感，并对来自受损组织的危险信号作出应答。在ALS中运动神经元损伤的早期阶段，据信来自运动神经元的修复信号诱导小神经胶质细胞活化为M2表型。M2小神经胶质细胞释放神经保护因子(如神经营养因子和抗炎因子)来修复运动神经元并防止进一步损伤。星形胶质细胞也通过分泌神经营养因子参与神经保护过程。随着疾病的发展，受损的运动神经元释放出危险信号，所述危险信号将小神经胶质细胞转化为具有细胞毒性的M1表型。M1小神经胶质细胞释放促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子α，即TNF-α，和白细胞介素1β，即IL-1β)，并通过释放活性氧物种来促进神经毒性。这些促炎细胞因子进一步激活小神经胶质细胞,导致过度的神经毒性。M1小神经胶质细胞也促进星形胶质细胞的活化。活化的星形胶质细胞获得有害的炎症表型，释放活性氧物种和促炎细胞因子，进而诱导小神经胶质细胞活化并增强运动神经元变性。活化的神经胶质细胞还募集外周单核细胞/巨噬细胞和T细胞进入CNS，其进一步加剧运动神经元变性。Zhao等人(同上)和Lewis等人(Neurology Research International,2012,Article ID803701)综述了ALS中的神经炎症反应。

在小神经胶质细胞上主要表达的模式识别受体(PRR)是对组织受损或损伤的最初应答者。PRR检测独特微生物结构，该结构称为病原体相关分子模式(PAMP)，例如微生物核酸，细菌分泌***，以及微生物细胞壁的成分。受损的宿主细胞还可以通过释放与危险相关的分子模式(DAMP)，如尿酸晶体、ATP、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和热休克蛋白hsp70和hsp90，来触发PRR。PRR可以在膜表面上，例如Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)，或在细胞质内，例如Nod样受体(NLR)、RIG-I样受体(RLR)和AIM2样受体(ALR)。许多遇到PAMP和DAMP的PRR触发信号级联反应，该级联反应通过核因子-kB(NF-kB)、活化蛋白1(AP1)和干扰素调节因子(IRF)促进基因转录。靶基因编码细胞因子、干扰素和其他促炎或抗菌蛋白。

Toll样受体/白细胞介素1受体(TLR/IL-1R)超家族是一组结构同源蛋白，其特征在于细胞外免疫球蛋白样结构域和细胞内Toll/白细胞介素1R(TIR)结构域。TLR/IL-1R超家族的成员在免疫应答中发挥基础作用。所述受体检测微生物成分并触发复杂信号传导通路，导致多种炎症基因表达增加。所述超家族包括Toll样受体(TLR)亚家族、白细胞介素1受体(IL-1R)亚家族和含TIR结构域的衔接蛋白(如MyD88)。

NLR和ALR的子集触发了独特的防御机制。所述蛋白组装的胞质蛋白复合物称为炎性体。一旦活化，炎性体通过其自身的胱天蛋白酶活化和募集域(CARD)、或通过在炎性体形成过程中与其结合的衔接蛋白ASC的CARD，与胱天蛋白酶1前体(胱天蛋白酶1的前体分子)结合。炎性体诱导胱天蛋白酶1前体分子的自催化切割形成胱天蛋白酶1，所述胱天蛋白酶1可以响应最初的炎症信号来进行多种过程，包括将白细胞介素(IL)-1β前体水解切割成IL-1β，该IL-1β为一种促炎细胞因子。

IL-1β通过I型IL-1受体/IL-1辅助蛋白(IL-1RAcP)复合物发出信号，造成神经胶质中的促炎细胞因子(肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6和干扰素)和嗜中性粒细胞募集趋化因子(CXCL1和CXCL2)的NFkB依赖性转录。IL-1β(通过激活NF-κB)诱导其自身基因表达，作为扩增IL-1应答的正反馈环。

RNA结合蛋白，特别是反式激活应答(TAR)DNA结合蛋白43(TDP43)，对于运动神经元病和相关的神经退行性疾病的发病机制至关重要。TDP43是蛋白包涵体的主要成分，所述蛋白包涵体是大多数ALS形式的特征。TDP43含有两个参与RNA和DNA结合的RNA识别模体(RRM)和一个富含甘氨酸的羧基末端结构域。TDP43主要是核定位。在病变的大脑和脊髓中发现病理性TDP-43异常聚集，其主要发生在细胞质中。几乎所有的散发性和TDP43突变家族性病例都有TDP43聚集(Lee et al.,Nat Rev Neurosci.2011Nov 30；13(1):38-50)。沉淀的TDP43蛋白质是多磷酸化的以及泛素化的。磷酸化与聚集紧密相关。TDP43的乙酰化也是聚集过程的一部分。乙酰化损害RNA结合并促进不溶性且高度磷酸化的TDP43物种的积累，所述TDP43物种与ALS中的病理包涵体很相似。乙酰化发生在TDP43的RRM中的赖氨酸残基上。细胞质组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)在体内与TDP43相互作用。尽管细胞质TDP43聚集体不能有效地脱乙酰化，但已显示HDAC6可使TDP43脱乙酰化(Cohen et al.,NatCommun.2015Jan 5；6:5845)。

ALS的SOD1^G93A小鼠模型是ALS中最广泛使用的动物模型(Gurney et al.,1994,Science 264:1772-1775)。在所述小鼠中，导致ALS的人SOD1基因(G93A)中的家族性突变在内源性小鼠SOD1启动子控制下在整个身体内转基因表达。该转基因***引起下运动神经元的退行性疾病，导致进行性瘫痪和最终死亡，其中转基因复制数量与疾病的严重程度相关。TDP43的细胞质错位发生在疾病的末期。

mSOD小鼠模型概括了在ALS患者中观察到的神经炎症反应的许多方面。在mSOD小鼠中，在疾病的症状发生前的早期阶段观察到，活化的小神经胶质细胞数量增加，并且随着疾病进展到末期，腰椎脊髓中的小神经胶质细胞数量进一步增加近2倍。几项研究表明，mSOD小鼠的炎症应答的调节改变疾病进展，导致如下启示：mSOD小鼠中的小神经胶质细胞促成运动神经元变性。然而，在mSOD小鼠中消除促炎细胞因子TNF-α或阻断小神经胶质细胞增殖的实验对疾病进展速度没有影响，表明小神经胶质细胞不加剧mSOD小鼠模型中的神经变性。

一些证据表明表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路可能在神经退行性疾病的病理中起作用。据报道，用EGFR抑制剂进行的治疗在大鼠青光眼模型(Liu et al.,2006,JNeurosci 26:7532–7540)和大鼠脊髓损伤模型(Erschbamer et al.,2007,J Neurosci27:6428–6435)中均具有神经保护作用。在该两项研究中，其作者都提出EGFR抑制靶向反应性星形胶质细胞。此外，发现EGFR mRNA表达在人ALS患者的脊髓以及SOD1^G93A小鼠模型的脊髓中上调超过10倍(Offen et al.,2009,J Mol Neurosci 38:85–93)，这表明EGFR信号传导的药理学抑制可能是减缓该疾病进展的可行策略)。

与对照相比，SOD1小鼠和ALS患者的脊髓中的EGFR水平增加了约10倍(Offen etal.,J Mol Neurosci.2009Jun；38(2):85-93)。作为脊髓损伤的后果，EGFR强烈牵涉到星形胶质细胞的活化(Li et al.,Neurochem Int.2011Jun；58(7):812-9；Li et al.,Journalof Neuroinflammation 2014,11:71)。活化的星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，抑制轴突和树突的形成，并释放多种炎性细胞因子，包括能诱导神经细胞凋亡的TNF、IL-1β和IL-6(Monje et al.,Science.2003Dec 5；302(5651):1760-5)。此外，已显示EGFR抑制剂促进神经元再生，而EGF本身可增加星形胶质细胞的发生(Kuhn et al.,JNeurosci.1997Aug 1；17(15):5820-9)。因此，EGFR可以在脊髓星形胶质细胞活化中发挥关键作用。

EGFR还参与小神经胶质细胞的活化和增殖(Qu et al.,JNeuroinflammation.2012Jul 23；9:178)，阻断EGFR可显著减少小神经胶质细胞对LPS的应答。类似地，体内阻断EGFR可减少小神经胶质细胞和星形胶质细胞的活化、瘢痕形成和增强的轴突生长(Qu et al.,2012,同上)。

这些观察结果表明，通过阻断EGFR可以显著改变ALS中神经胶质细胞向MN-毒性表型的转化。[Le Pichon et al.,2013(PLoS ONE,8(4):e62342；1-12]描述了一项研究，其测试市售用于治疗非小细胞肺癌的EGFR抑制剂厄洛替尼(Erlotinib)是否对ALS的SOD1^G93A小鼠模型具有有益作用。该作者报道，通过多次读取疾病发作和进展而进行的测量表明，厄洛替尼渗透到中枢神经***中，导致适度但统计学显著的症状延迟。然而，该治疗未能延长寿命，不能保护运动突触，并且与星形胶质细胞和小神经胶质细胞的标志物的调节不相关。作者得出结论，厄洛替尼在治疗ALS的SOD1小鼠模型中无效。鉴于厄洛替尼在该小鼠模型中的疗效不足及该药物的不良副作用(包括皮肤刺激和腹泻)，作者总结认为厄洛替尼似乎不是治疗ALS的良好临床候选药物。

因此，迫切需要改善ALS和其他神经退行性疾病的治疗。

我们已经认识到神经退行性疾病(如ALS)的有效治疗需要同时纠正多种功能失调的途径和过程。

根据本发明，提供了预防或治疗神经退行性疾病的方法，该方法包括：在需要所述预防或治疗的对象的中枢神经***(CNS)中，抑制EGFR信号传导；以及抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导。

根据本发明还提供了用于预防或治疗神经退行性疾病的EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂。

本发明还提供EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

在小神经胶质细胞、星形胶质细胞或神经元中，或在小神经胶质细胞和星形胶质细胞中，或在小神经胶质细胞和神经元中，或在星形胶质细胞和神经元中，或在小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中，在CNS内，EGFR信号传导和/或MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导可能受到抑制。

EGFR(也称为ErbB1或HER1)是ErbB受体家族的成员。所述家族的其他成员是ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。它们都是由以下各项组成的跨膜糖蛋白：(i)富含半胱氨酸、细胞外N末端配体结合结构域和二聚臂；(ii)疏水性跨膜结构域；以及(iii)具有数个磷酸化位点的细胞内高度保守的胞质C末端酪氨酸激酶结构域。EGFR的胞外域具有闭合的无活性构象和开放的活性构象，它们彼此保持平衡。在没有配体的情况下，闭合构象是有利的。配体的结合改变平衡并稳定开放构象，使二聚臂与另一受体分子的相同二聚臂相互作用以形成同型二聚体。EGFR还促进与HER家族其他成员(包括HER2、HER3和HER4)的异源二聚化。因此，EGFR可以通过其自身的同源二聚化或与其他HER家族成员的异源二聚化来启动细胞信号传导级联。

ErbB家族成员可被13种已知配体活化，所述配体包括EGF、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白(AR)、细胞素(BTC)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、上皮调节蛋白(EPR)、上皮细胞有丝***蛋白抗体(EPG)和神经调节蛋白1-6(NRG)。EGF、TGF-α、AR、BTC与EPR特异性结合EGFR。各种配体可诱导特异性异源二聚化，例如EGF可诱导EGFR与HER2、HER3或HER4异源二聚化。因此，EGF受体的同源和异源二聚化促进了复杂的信号级联(Seshacharyuluet al.,Expert Opin Ther Targets,2012(16(1):15-31)。

EGFR信号传导的激活(如图1所示)由配体诱导的受体二聚化触发，之后酪氨酸残基存在于一个受体的内在激酶结构域中，所述一个受体在配偶受体的C末端尾部交叉磷酸化特异性残基(包括Y992、Y1045、Y1068、Y1148、Y1173)。效应蛋白的募集通过效应蛋白上的Src同源性2(SH2)和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域，以及存在于受体的细胞内酪氨酸激酶结构域上的磷酸酪氨酸模体进行。在随后的解离中，活化的衔接蛋白和效应蛋白进一步刺激其相应的信号级联，包括KRAS-BRAF-MEK-ERK通路、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、磷脂酶Cγ蛋白通路、抗凋亡AKT激酶通路和STAT信号传导通路。这导致细胞增殖、血管生成、迁移、存活和粘附。

其中一种衔接蛋白GRB2在1068处与磷酸酪氨酸残基结合并将SOS募集到膜上。SOS激活GDP/GTP交换，从而将RAF募集到膜上。RAF使MEK磷酸化，然后活化细胞外信号调节激酶(ERK)。ERK活化多个转录调节因子以诱导细胞生长和增殖。GRB2(或其他衔接蛋白，如GAB)募集PI3K，该PI3K是EGFR信号传导的另一主要媒介。PI3K将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)。PIP3与AKT的PH结构域结合并将该结构域募集至质膜。PDK1使AKT磷酸化，该磷酸化的AKT反过来调节介导细胞存活的各种蛋白质的活性。

EGFR还活化磷脂酶C，其水解PIP2以产生肌醇三磷酸酯(IP3)和1,2-二酰甘油(DAG)。IP3诱导内质网释放Ca²⁺以激活钙调节通路。DAG激活蛋白激酶C通路。在EGFR通路中由PKC调节的信号传导模块之一是NFκB模块。SRC蛋白是激活各种通路如RAS、PLC和各种细胞中的STAT蛋白的关键参与者。其他由EGFR激活的信号模块包括FAK、JNK、p38MAPK和ERK5模块。EGFR通过激活G蛋白(例如RAC和CDC42)来诱导JNK途径，其招募JNK激酶以及调节肌动蛋白聚合。

EGFR也从质膜易位至包括细胞核在内的其他细胞区室，在所述细胞核中，EGFR与其他转录调节子(如STAT、PCNA和E2F蛋白家族)一起共同直接调节几种基因的表达。

在一些实施例中，可以通过抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，或者通过例如在EGFR酪氨酸激酶活性上游的EGFR信号传导通路的位点抑制配体与受体的结合，来抑制EGFR信号传导。

鉴于EGFR在各种细胞过程中的功能性参与，已经开发了几种靶向并干扰EGFR介导的效应的方法。目前用于在各种人类恶性肿瘤中靶向EGFR的两种不同的治疗方法是使用小分子酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体。酪氨酸激酶抑制剂靶向EGFR的细胞内酪氨酸激酶结构域，而抗EGFR抗体结合EGFR的细胞外结构域。这种EGFR信号传导抑制剂可以用在本发明的用于预防或治疗神经退行性疾病，特别是运动神经元病的方法中。

已知的EGFR信号传导的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是三磷酸腺苷(ATP)类似物。它们通过与受体酪氨酸激酶的细胞内催化激酶结构域上的ATP结合口袋竞争和结合来抑制EGFR信号传导，从而阻止几种下游信号传导通路的自体磷酸化和激活。I型和II型可逆抑制剂与识别激酶活性构象的ATP分子竞争。不可逆抑制剂通过与亲核半胱氨酸残基特异性反应而共价结合激酶活性位点。不可逆抑制剂具有延长临床效果和减少频繁给药需求的优点。

抑制EGFR信号传导的小分子酪氨酸激酶抑制剂的例子包括吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼、布里替尼(brigatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、阿法替尼(afatinib)和艾考替尼(icotinib)。

吉非替尼(ZD1839；商品名易瑞沙(Iressa))(N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺，在US 5,770,599中有描述)被批准用于铂类或多西他赛(docetaxel)化疗失败后的NSCLC患者的治疗。吉非替尼是苯胺喹唑啉衍生的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。它是一种具有选择性酪氨酸激酶活性的口服有效的低分子量的EGFR抑制剂。它不抑制丝氨酸-苏氨酸激酶活性。相对于其他ErbB家族成员，吉非替尼对EGFR的亲和力高200倍。吉非替尼的生物半衰期为28小时，吸收后的峰值血浆浓度为3-7小时。吉非替尼的临床研究表明，每日250或500mg的剂量对晚期肺癌有效。在I期试验中评估的最大耐受剂量为700mg/天。吉非替尼用于治疗神经退行性疾病例如ALS的合适剂量范围是每天100-750mg，例如每天250mg。

厄洛替尼(OSI-774；商品名特罗凯(Tarceva))是另一种FDA批准的类似于吉非替尼的低分子量分子，可以以EGFR酪氨酸激酶的口服有效和选择性可逆抑制剂的形式获得。像吉非替尼一样，厄洛替尼通过与受体酪氨酸激酶内的ATP结合口袋竞争而起到ATP类似物的作用。对人癌细胞的研究发现，它在纳摩尔浓度下抑制EGF依赖性细胞增殖并阻断G1期的细胞周期进展。厄洛替尼目前被批准用于复发性NSCLC患者以及用于晚期NSCLC患者的维持治疗，所述晚期NSCLC患者在四个铂类一线化疗周期后病情未有进展。

拉帕替尼(GW-572016)是口服有效的、可逆的、EGFR和HER2的特异性受体酪氨酸激酶抑制剂。由于其EGFR抑制的非选择性性质，它具有更广谱的抗肿瘤活性并具有改善的功效。该分子结合至重组EGFR和HER2蛋白激酶的ATP结合口袋。它分别在10.8和9.3nmol/L浓度下将重组EGFR和HER-2酪氨酸激酶抑制50％(IC₅₀)，从而防止自身磷酸化及随后下游信号传导的抑制。

卡奈替尼(canertinib，CI-1033)是3-氯-4-氟-4-苯胺基喹唑啉化合物。它是一种口服有效的低分子量的不可逆pan-EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂。它是新一代酪氨酸激酶抑制剂，旨在使特异于ErbB家族受体的半胱氨酸残基烷基化，导致这些受体及其下游促有丝***信号传导通路的不可逆抑制。卡奈替尼在碳6处与ATP结合口袋和丙烯酰胺侧链结合，并且分别与EGFR的半胱氨酸残基773和HER2和HER4的残基784和778密切相关，导致它们的永久性失活。由于EGFR家族成员的异源二聚化不存在配偶体受体，它也能有效抑制HER3依赖性信号传导。卡奈替尼还诱导受体的泛素化和胞吞作用。生长抑制和凋亡可以在1微摩尔或纳摩尔范围内实现，并且这种选择性解释了在多剂量动物研究中观察到的最小毒性。

应该理解，根据本发明，可以使用其他EGFR酪氨酸激酶活性抑制剂。

在其他实施例中，可以通过抑制配体与EGFR的细胞外结合结构域的结合来抑制EGFR信号传导。阻断配体与EGFR的细胞外配体结合结构域的结合的单克隆抗体阻止受体二聚化、自体磷酸化和下游信号传导。所述抗体还诱导受体内化、泛素化、降解和下调延长。结合EGFR细胞外结构域和阻断配体结合的单克隆抗体的例子包括西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)和马妥珠单抗(matuzumab)。

EGFR信号传导的抑制降低星形胶质细胞和小神经胶质细胞的活化，并抑制TLR/IL-1R对IL-1β和TLR配体的应答。

在本发明的一个实施例中，EGFR信号传导受到抑制，从而抑制通过EGFR进行的HDAC6磷酸化。这可以例如通过抑制EGFR的细胞内酪氨酸激酶或通过抑制配体与EGFR的结合来实现。已显示HDAC6使TDP43脱乙酰化(Cohen et al.,Nat Commun.2015Jan 5；6:5845)。EGFR介导的(在酪氨酸570处)HDAC6磷酸化抑制HDAC6脱乙酰酶活性(Deribe etal.,Sci Signal.2009Dec 22；2(102):ra84)，因此EGFR的阻断应该增加HDAC6活性并由此增加TDP43脱乙酰化，从而减少TDP43聚集。

图2显示了TLR/IL-1R信号传导通路(从文献[Loiarro et al.,Mediators ofInflammation,2010,Article ID 674363]取得)。在识别其同源配体后，TLR/IL-1R蛋白同源或异源二聚化(TLR1/2、TLR2/6、IL-1R/IL-1RacP)，并通过募集不同组合的含有TIR结构域的衔接蛋白(即MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM)至其TIR结构域来启动信号级联。除TLR3外，所述超家族的所有受体均使用MyD88来启动其信号传导通路。在某些情况下，MyD88与其他衔接蛋一致起作用，例如在由TLR4、TLR1/2和TLR2/6刺激引发的的应答中与MAL/TIRAP一致起作用。TLR3介导的信号传导仅需要衔接分子TRIF，该TRIF也由TLR4与其他衔接子TRAM联合募集。

TLR/IL-1R诱导的通路可以分成两类：MyD88依赖性和MyD88非依赖性应答。在MyD88依赖性通路中，MyD88与IRAK4、IRAK1和/或IRAK2相关联。IRAK4反过来使IRAK1和IRAK2磷酸化，并促进它们与TRAF6关联，所述TRAF6作为募集激酶TAK1的平台。一旦活化，TAK1激活由IKKα、IKKβ和NEMO(IKKγ)组成的IKK复合物，所述复合物催化IκB的磷酸化和随后的降解，使NF-κB(即p50/p65)自由地从细胞溶质易位到细胞核并激活NF-κB依赖性基因。TAK1还可以激活促***原活化蛋白激酶(MAPK)，如p38和JNK，造成转录因子AP-1的活化。NF-κB和AP-1的同时激活通过产生促炎细胞因子而诱导多效炎症反应。转录因子IRF7在TLR7、8和9的下游也被激活，导致其易位到细胞核中并激活IFNα和IFN可诱导基因。

TLR3和TLR4都通过衔接子TRIF在MyD88非依赖性通路中传递信号。TLR3只需要TRIF作为衔接子。TRAM的招募需要桥接TRIF与TLR4。因此，TLR4能够在涉及TLR4复合物内吞作用的连续过程中激活MyD88依赖性和TRIF依赖性信号传导通路。TLR4首先在质膜上诱导MAL/TIRAPMyD88信号传导。然后，在其内吞进入早期核内体后，TLR4激活TRAM-TRIF信号传导。TRIF与TRAF3相互作用以激活非经典IKK、TBK1和IKKε，导致IRF3的二聚化和活化，然后IRF3易位到细胞核中，活化IFNβ和IFN可诱导基因的转录(Loiarro et al.,Mediators ofInflammation,2010,Article ID 674363)。

申请人已经认识到重新平衡对IRF3的IL-R/TLR信号传导通路，将在神经退行性疾病例如MND(并且特别是ALS)中具有神经保护作用。据推测，运动神经元的损伤导致DAMP如HMGB1的释放，引起TLR4受体活化，增强了炎性体活化，并因此增加了小神经胶质细胞产生的IL-1β。IL-1β介导的TLR/IL-1信号传导通路的活化产生更多的NFkB，从而产生更多的IL-1β，因此产生可以诱导运动神经元坏死的IL-1β产生的自我维持周期(Brites and Vaz,Front Cell Neurosci.2014May 22；8:117)。在mSOD1小鼠的小神经胶质细胞和星形胶质细胞中，NFkB活性升高导致相关的运动神经元坏死(Frakes et al.,Neuron.2014Mar 5；81(5):1009-23)。在大脑中，NFkB活性降低与MCAO后神经元损伤减少有关(Vartanian etal.,J Neuroinflammation.2011Oct 14；8:140)。在运动神经元中，坏死性凋亡是通过Rip-1介导的，这增加了NFkB的产生，表明靶向NFkB可能是一种治疗选项。然而，这种转录因子的通用性和多功能性使得这一点变得困难。

申请人已经认识到SOD1小鼠的脊髓中IL-1β水平的增加，mSOD1增加IL-1β产生的能力，以及所述IL-1β加速ALS进展的事实(Meissner et al.,Proc Natl Acad SciUSA.2010Jul 20；107(29):13046-50)，表明了调节IL-1β和IL-1R信号传导通路对于预防和治疗神经退行性疾病如MND，尤其是ALS，是有益的。另外，活性EGFR在小神经胶质细胞中产生LPS反应的明显需要(Qu et al.,2012)表明阻断EGFR可减少TLR刺激的炎症。

已证明TBK1(TRIF通路的中心成分)中的“单倍体不足”足以导致fALS(Freischmidt et al.,Nat Neurosci.2015May；18(5):631-6)。TRIF通路是通向IRF3产生的IL-1R/TLR途径的一部分，并且IRF3通常是神经保护性的。实际上，通过预处理的神经保护驱使TLR/IL-1信号传导通路远离NFkB并朝向IRF3活化(Vartanian et al.,2011)。我们已经认识到，重新平衡通向IRF3的IL-R/TLR信号传导通路对神经退行性疾病如MND(例如ALS)将具有神经保护作用。具体而言，我们已经认识到，MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导的抑制将导致在IL-1/TLR刺激后优先产生IRF3。这将减少向NFkB的驱动，从而减少IL-1β产生、神经胶质活化和运动神经元死亡。

因此，根据本发明的某些实施例，MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导被抑制，从而抑制IL-1β和NFkB的产生。

MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导的抑制可通过抑制“Myddosome”(所述Myddosome是由衔接蛋白MyD88和IRAK4激酶组成的寡聚信号复合物)来实现，例如通过抑制Myddosome激酶IRAK1和/或IRAK4来实现。

申请人已经认识到，观察到的IRAK1与TDP43的关联(Li et al.,2014，同上)可以介导TDP43的启动磷酸化，引发该蛋白的聚集和细胞质积聚，导致功能异常。因此，预期抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导(特别是通过抑制IRAK1激酶活性，或通过抑制IRAK1作用下的TDP43磷酸化的上游的MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导)也有望抑制TDP43的磷酸化，从而抑制TDP43包涵体的形成。

通过向对象施用IRAK1和/或IRAK4的小分子抑制剂可以抑制IRAK1和/或IRAK4。合适的IRAK1抑制剂的例子及其亲和力列于下表中。在本发明的特定实施例中，IRAK1和/或IRAK4激酶活性的抑制剂是吉非替尼。

表2.IRAK1抑制剂

P-糖蛋白(P-gp)是一种跨膜外排泵，是减少药物进入CNS的最重要的药物转运蛋白。在一些实施例中，EGFR信号传导抑制剂(特别是EGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂)和/或MyD88依赖性TLR/IL-1R信号传导抑制剂(特别是IRAK1和/或IRAK4的小分子抑制剂)可以与P-gp抑制剂(例如环孢菌素A、酮康唑(ketoconazole)、奎尼丁(quinidine)、利托那韦(ritonavir)、维拉帕米(verapamil)、依维莫司(everolimus)或依克立达(elacridar，GF120918))同时给药或先后给药，以增加信号传导抑制剂的CNS暴露。

根据一个实施例，通过以吉非替尼(易瑞沙)向对象给药来实现EGFR信号传导的抑制和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导的抑制。吉非替尼是一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂，也抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导通路中IRAK1和IRAK4的激酶活性。因此，以吉非替尼给药将：

·阻断EGFR信号传导，从而：

o减少星形胶质细胞和小神经胶质细胞的活化

o抑制对IL-1β和TLR配体的TLR/IL-R1应答

o增加HDAC6活性从而降低TDP43的乙酰化状态(从而抑制聚集)

·抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导，从而：

o重新平衡通向IRF3产生(并远离NFkB产生)的TLR/IL-R1信号传导通路，与神经保护一致

o减少NFkB产生、炎症和坏死性凋亡

o通过抑制IRAK1激酶活性来抑制TDP43的磷酸化(并因此聚集)。

吉非替尼是一种P-糖蛋白(P-gp)底物(参见Togashi et al.,Cancer ChemotherPharmacol.2012Sep；70(3):399-405)。在一些实施例中，以吉非替尼与P-gp抑制剂(诸如环孢菌素A、酮康唑、奎尼丁、利托那韦、维拉帕米、依维莫司或依克立达(GF120918))同时给药或先后给药以增加CNS暴露(如在小鼠中那样，Chen et al.,Lung Cancer.2013Nov；82(2):313-8)。

根据本发明，提供了药物组合物，其包含EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，其中EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是不同的化合物。

根据本发明，还提供了组合制剂，其包含：(a)EGFR信号传导抑制剂；和(b)MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂，其中EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是不同的化合物。

根据本发明进一步提供了本发明的药物组合物或组合制剂，其还包含P-糖蛋白抑制剂。

根据本发明还提供了组合物，其包含EGFR信号传导抑制剂、MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。

根据本发明还提供了药物组合物，其包含EGFR信号传导抑制剂、MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂、P-糖蛋白抑制剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

根据本发明，还提供了组合制剂，其包含：(a)EGFR信号传导抑制剂；(b)MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂；和(c)P-糖蛋白抑制剂。

EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂可以是相同的化合物或不同的化合物。在一些实施例中，EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂可以是吉非替尼。在其他实施例中(特别是在EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是相同化合物的情况下)EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1抑制剂信号可能不包括吉非替尼。

EGFR信号传导抑制剂、MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂和P-糖蛋白抑制剂可以一起给药(即同时给药)或以任何顺序先后给药。在特定的实施例中，在EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂之前，以P-糖蛋白抑制剂给药。

根据本发明还提供了组合物，其包含吉非替尼和P-糖蛋白抑制剂。

根据本发明还提供了药物组合物，其包含吉非替尼和P-糖蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

还提供了组合制剂，其包含：(a)吉非替尼；和(b)P-糖蛋白抑制剂。

所述P-糖蛋白抑制剂可以选自环孢菌素A、酮康唑、奎尼丁、利托那韦、维拉帕米、依维莫司、或依克立达(GF120918)，例如奎尼丁。在特定的实施例中，所述P-糖蛋白抑制剂是依克立达。

根据本发明，进一步提供了用于预防或治疗神经退行性疾病的本发明的组合物、药物组合物或组合制剂。根据本发明，还提供了本发明的组合物、药物组合物或组合制剂在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

根据本发明，还提供了预防或治疗神经退行性疾病的方法，其包括以有效量的吉非替尼和P-糖蛋白抑制剂向需要这种预防或治疗的对象给药。

吉非替尼和P-糖蛋白抑制剂可以同时给药，或者先后给药。

神经退行性疾病可以是运动神经元病，例如肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

神经退行性疾病可以是家族性或散发性神经退行性疾病。在特定的实施例中，神经退行性疾病(特别是运动神经元病，例如ALS)是家族性神经退行性疾病。在其他特定的实施例中，神经退行性疾病(特别是运动神经元病，例如ALS)是散发性神经退行性疾病。

本发明的组合制剂的成分可以同时、单独或先后使用。

本文使用的术语“组合制剂”是指“多部分试剂盒”(Kit of parts)，其意义是组合成分(a)和(b)可以独立地给药或采用不同固定组合给药，所述不同固定组合具有显著量的组合成分(a)和(b)。所述成分可以同时或一个接一个地给药。如果所述成分一个接一个地给药，优选给药之间的时间间隔选择为使得：所述成分组合使用时对被治疗的失调或疾病的效果大于仅使用组合成分(a)和(b)中的任何一种所获得的效果。

组合制剂的成分可以以一种组合单位剂型，或作为组分(a)的第一单位剂型和组分(b)的单独的第二单位剂型存在。例如为了应对待治疗的患者亚群或者单个患者的需要(这可能是由于例如患者的特定疾病、年龄、性别或体重所致)，可以改变组合制剂中组合成分(a)与组合成分(b)的总量的比例。

优选地，存在至少一种有益效果，例如其中1种成分的效果增强，或组合成分(a)和(b)的效果相互增强，例如与非有效剂量的组合成分(a)和(b)中的一种或两种相比，超过相加作用、附加的有利效果、较少的副作用、较小的毒性或组合的治疗效果，并且非常优选地，组合成分(a)和(b)的协同作用。

在本发明的一些实施例中，神经退行性疾病是运动神经元病，例如ALS、PLS、PMA、PBP或假性延髓麻痹、或阿尔茨海默病、或帕金森病、或额颞叶痴呆(FTD)。

如本申请所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响而言，该效果可以是治疗性的。如本申请所用的“治疗”涵盖对哺乳动物，特别是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患该疾病但尚未诊断出患有该疾病的对象中预防疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止或减缓其发展；以及(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。

本申请使用的术语“对象”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马。

应该理解，在本发明的方法中，应该以治疗有效量的EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂(适当的话，和P-糖蛋白抑制剂)向对象给药。

“治疗有效量”是指EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂的量，当向对象给药以治疗疾病时，所述量足以使对疾病的这种治疗有效。“治疗有效量”将根据所使用的抑制剂、疾病及其严重程度和待治疗的对象的年龄、体重等而变化。

例如，当与P-gp抑制剂同时给药或先后给药时，吉非替尼的治疗有效量为每天100-750mg。在一些实施例中，例如当直接给药至CNS(例如直接给药至大脑或脊髓)时，在不进行P-gp抑制剂给药的情况下，吉非替尼的治疗有效量也可以为每天100-750mg。

EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂可以使用任何适用于将药物递送至CNS的方法和途径，包括全身或局部途径，向对象给药。通常，本发明考虑的给药途径包括但不限于肠内、肠胃外或吸入途径。

非吸入给药的肠胃外给药途径包括但不一定限于局部、透皮、皮下、肌内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、鞘内和静脉内途径，即除了通过消化道之外的任意给药途径。可以进行肠胃外给药以实现全身或局部递送。当期望全身递送时，给药通常涉及药物制剂的侵入性或全身性吸收的局部或粘膜给药。肠内给药途径包括但不一定限于口服和直肠(例如使用栓剂)递送。

常规和药学上可接受的给药途径包括鼻内、肌内、气管内、鞘内、颅内、皮下、皮内、局部、静脉内、腹膜内、动脉内(例如通过颈动脉)、脊柱或大脑递送、直肠、鼻腔、口服和其他肠内和肠胃外给药途径。

在一些实施例中，EGFR信号传导抑制剂和/或MyD88依赖性TLR/IL-1R信号传导抑制剂通过注射和/或递送给药，例如给药至脑动脉中的位点或直接注入脑组织中。

在特定的实施例中，EGFR信号传导抑制剂和/或MyD88依赖性TLR/IL-1R信号传导抑制剂通过直接递送至CNS来给药，特别是例如通过脑室内(ICV)给药递送至脊髓或大脑中。直接给药至大脑内可以与受控递送装置(例如住院插管或泵(例如，在合适位置处皮下植入))组合进行。例如，Paul等人(J Clin Invest.2015；125(3):1339-1346))描述了ICV给药至人类对象给药的合适方法。

本发明的组合物可以提供为适合于或用于直接给药至CNS(特别是给药至例如人类对象的脊髓或大脑)的制剂。在一些实施例中，所述制剂包含存在于内源性CSF中的一种或多种电解质。在特定的实施例中，一种或多种电解质选自钠、钾、钙、镁、磷和氯离子。在一个特定的实施例中，所述制剂包含与待治疗的对象(例如人类对象)的内源性CSF的电解质浓度非常匹配的溶液。例如，在特定的实施例中，所述制剂包含含有以下任何项(或每一项)的溶液：100-200mM钠离子；1-5mM钾离子；1-2mM钙离子；0.5-1.5mM镁离子；0.5-1.5mM磷离子；以及100-200mM氯离子。例如，在特定实施例中，所述制剂包含含有150mM钠离子、3mM钾离子、1.4mM钙离子、0.8mM镁离子、1.0mM磷离子以及155mM氯离子的溶液。

在特定的实施例中，适用于或用于直接给药至CNS，特别是给药至例如人类对象的脊髓或脑，的本发明的组合物不包含P-糖蛋白抑制剂。

所述抑制剂可以以单剂量或多剂量给药。适合的给药频率可以是每天至少一次，隔日一次，每周一次，每两周、三周或四周一次，每月一次，每两个月或每三至六个月一次。例如，考虑到它的半衰期，吉非替尼的合适给药频率为每天至少一次。所述抑制剂可以在至少一周，至少一个月，至少三至六个月，至少一、二、三、四或五年，或在整个疾病过程中，或在对象的有生之年内给药。

在EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是不同化合物的情况下，它们可以同时给药或先后给药。如果所述抑制剂先后给药，它们可以以任何顺序给药。应该理解的是，应当在第一抑制剂保持有效的同时，进行第二抑制剂给药。先后给药的时间将取决于各种因素，例如抑制剂各自的半衰期和它们的生物利用度。然而，通常预期抑制剂应该在彼此的96、72、48、36、24、12、6、5、4、3、2或1小时内给药。

在使用P-gp抑制剂的情况下，可以将其与EGFR和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂同时给药，或将P-gp抑制剂与EGFR和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂先后给药，例如在彼此的96、72、48、36、24、12、6、5、4、3、2或1小时内给药(即P-gp抑制剂可以在EGFR和MyD88-依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂之前或之后给药)。例如，如果EGFR和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是吉非替尼，则P-gp抑制剂和吉非替尼可以同时给药，或者先后给药，例如在彼此的96、72、48、36、24、12、6、5、4、3、2或1小时内给药。P-gp抑制剂可以在吉非替尼之前给药，或者吉非替尼可以在P-gp抑制剂之前给药。在特定的实施例中，P-gp抑制剂是依克立达。

与EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂同时给药或先后给药的P-gp抑制剂的量可能取决于所用的特定抑制剂。然而，本领域普通技术人员可以容易地确定每种抑制剂的合适给药量，以确保治疗有效量的EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂渗透到待治疗的对象的CNS中。例如，基于以下实施例3中获得的结果，预计当以100mg每天的P-gp抑制剂依克立达进行同时给药或先后给药时，对于人类对象的吉非替尼的治疗有效量为每天100-750mg。

制备药物组合物的方法对于本领域技术人员来说是已知的，或是显而易见的。参见，例如文献[Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,17th edition,1985]。

本发明的组合物可以通过与适当的药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂或药学上可接受的赋形剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。

药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂可包括，例如：水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、盐，如NaCl、MgCl₂、KCl、MgSO₄等；缓冲剂，如磷酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂；洗涤剂，如非离子型洗涤剂，例如吐温-20等；甘油；等等。

药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以例如包括：缓冲剂，例如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(例如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，例如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如明胶或血清白蛋白；螯合剂，例如EDTA；糖，例如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡萄糖胺、N-甲基葡萄糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子型表面活性剂，例如吐温、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。

对于口服制剂，本发明的药物组合物可包含合适的添加剂以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如：用常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；用粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、***胶、玉米淀粉或明胶；用崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；用润滑剂，如滑石或硬脂酸镁；并且如果需要的话，用稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂。

注射用药物组合物可以通过将活性成分溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂中来制备，所述溶剂例如植物油或其它类似的油、丙二醇、合成脂肪酸甘油酯、可注射有机酯(例如油酸乙酯)、高级脂肪酸的酯或丙二醇；并且如果需要的话，添加常规添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等。典型地，将可注射组合物制备成液体溶液或混悬液；也可以制备成适合于在注射之前溶解或悬浮于液体载体中的固体形式。

所述药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式复原的液体形式，其中冻干制剂在给药前要用无菌溶液重构。用于重构冻干组合物的标准程序是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干过程中去除的体积)；不过可以用包含抗菌剂的溶液来生产用于肠胃外给药的药物组合物；可参见[Chen(1992)Drug Dev Ind Pharm 18,1311-54]。

张度剂可包含在制剂中以调节制剂的张度。示例性张度剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸、糖及其组合的任何成分。在一些实施例中，含水制剂是等渗的，但高渗或低渗溶液也可能是合适的。术语“等渗”表示与其比较的某些其他溶液(例如生理盐溶液或血清)具有相同张度的溶液。

下面参照附图仅以举例的方式描述本发明的实施例，其中：

图1展示了EGFR信号传导的示意图；

图2展示了TLR/IL-1R信号传导的示意图；

图3展示了吉非替尼在体外模型中的作用，在所述模型中，源自三个不同ALS患者(ALS1、ALS2和ALS3)的成纤维细胞的诱导性星形胶质细胞与小鼠运动神经元共培养。在共培养的小鼠Hb9-GFP运动神经元接种之前，用各种浓度的吉非替尼预处理ALS诱导性星形胶质细胞24小时。然后在接种运动神经元24和72小时后测量活的运动神经元的数量，计算运动神经元存活百分比，然后归一化为相应线的未处理对照。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Dunnett事后检验的单因素方差分析。数据是平均值±SD。n＝5-6；以及

图4显示了以不同P-gp抑制剂给药后，口服吉非替尼，之后吉非替尼进入C57BL/6小鼠大脑的分析结果。这些图显示了在口服剂量两小时后，血液(μM)(a)和脑部(μM)(b)中的吉非替尼水平，以及大脑与血液中的吉非替尼浓度的比率(c)。图中显示的吉非替尼的每种剂量(30或100mg/kg口服)(按从左到右的顺序)：仅吉非替尼；吉非替尼+依维莫司10mg/kg腹腔注射(-0.5h)；吉非替尼+依克立达10mg/kg静脉注射(0h)；以及吉非替尼+依克立达100mg/kg口服(-4h)。

实施例1-ALS的治疗

向患有ALS的人类对象以250mg吉非替尼与600mg奎尼丁(一种P-gp抑制剂)每天同时给药一次。250mg吉非替尼给药导致约250nM的血浆浓度。在小鼠中，这种血浆浓度与约100nM的总大脑浓度相关联。吉非替尼与奎尼丁的同时给药增加了大脑的吉非替尼暴露。基于其药理学特性，预计以这种量的吉非替尼给药足以抑制EGFR和IRAK1：

EGFR Ki：1nM

IRAK1Ki：70nM

IRAK4Ki：500nM

实施例2-吉非替尼在ALS的体外模型中的作用

本实施例描述了吉非替尼在ALS体外模型中对运动神经元存活的影响。所述模型使用共培养的人成纤维细胞衍生的星形胶质细胞和小鼠Hb9-GFP+运动神经元(Meyer etal.,2014,PNAS 111,829–832)。将成纤维细胞重编程为诱导性神经祖细胞(iNPC)，该祖细胞分化成星形胶质细胞。源自ALS患者的星形胶质细胞导致共培养中野生型Hb9-GFP+小鼠运动神经元的死亡，这是在来自正常(非ALS)患者的星形胶质细胞中未见的特性。有趣的是，ALS星形胶质细胞在代谢和氧化应激中表现出一些异常，在运动神经元存在的情况下所述异常增加10-15倍。

材料和方法

如前所述(Meyer et al.2014,PNAS 111,829–832)，iNPC来源于ALS患者的成纤维细胞，其通过在补充的DMEM(Sigma)(10％(v/v)FBS(Sigma)、50单位/ml青霉素/链霉素(Lonza)、1X N-2补充剂(Thermo-Fisher Scientific))中培养至少5天，分化成诱导性星形胶质细胞。如前所述(Haidet-Phillips et al.2011,Nature Biotechnology 29,824–828；Wichterle et al.2002,Cell 110,385–397)，小鼠Hb9-GFP+运动神经元由小鼠Hb9-GFP+胚胎干细胞通过拟胚体分化而来。

在纤连蛋白包被的384孔板上每孔接种3000个人类诱导性星形胶质细胞。24小时后，使用Echo550液体处理器(Labcyte)将吉非替尼(Cayman Chemical Company,cat.#13166)溶于100％药物级DMSO中递送至诱导性星形胶质细胞培养基。所有孔中培养基内DMSO的最终浓度为0.24％(v/v)。将孔板在1,760x g离心60秒。24小时后，在运动神经元培养基(KnockOut DMEM(45％v/v)、F12培养基(45％v/v)、KO血清替代物(10％v/v)、50单位/ml青霉素/链霉素(Lonza)、1mM L-谷氨酰胺、1X N-2补充剂(Thermo-Fisher Scientific)、0.15％过滤后的葡萄糖、0.0008％(v/v)2-巯基乙醇、20ng/ml GDNF、20ng/ml BDNF、20ng/ml CNTF)内每孔接种2,000个小鼠Hb9-GFP+运动神经元，并在预处理的诱导性星形胶质细胞的顶上共培养。将孔板在1,760x g离心60秒。使用INCELL分析仪2000(GE Healthcare)在24和72小时后对Hb9-GFP+运动神经元进行成像，并使用INCELL分析仪软件(GEHealthcare)计算存活的运动神经元的数量。

在共培养72小时后存活的运动神经元(定义为具有至少1个轴突的GFP+运动神经元)的数量计算为共培养24小时后存活的运动神经元的数量的百分比。然后将运动神经元的存活率百分比对每一个体的诱导性星形胶质细胞系的DMSO对照进行归一化。进行Dunnett事后检验的单因素方差分析。

结果

绘制在图3中的结果显示，吉非替尼促进三个不同患者共培养物中运动神经元存活的剂量依赖性增加，表明吉非替尼将对ALS患者有益。

结论

从这些结果得出如下结论，ALS星形胶质细胞/运动神经元共培养物中运动神经元存活减少，其显示源自ALS患者的星形胶质细胞的毒性被吉非替尼降低。尽管不希望被理论束缚，但这些结果与吉非替尼对EGFR和IRAK1的抑制一致。预计这种抑制会抑制由Myddosome驱动的NFkB的产生，从而保护运动神经元。

实施例3-在存在P-gp抑制剂的情况下将吉非替尼渗透到CNS中

吉非替尼要在ALS的治疗中起作用，重要的一点是所述吉非替尼要能进入到CNS中。本实施例描述了以不同P-gp抑制剂给药后，口服吉非替尼，之后吉非替尼进入C57BL/6小鼠的大脑中的分析结果。

以单剂量的依维莫司(10mg/kg腹腔注射，-0.5h)、依克立达(10mg/kg静脉注射，0h)或依克立达(100mg/kg口服)向小鼠给药，或者不给药。然后小鼠口服单剂量的30mg/kg或100mg/kg的吉非替尼。在以吉非替尼给药2小时后收集血液和大脑，并且使用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用(UHPLC-TOF-MS)测量血液和大脑中的吉非替尼水平。其结果绘制于图4中，该图显示血液(a)、大脑(b)中的吉非替尼水平，以及大脑中的吉非替尼浓度与血液中的吉非替尼浓度的比率(c)。n＝3。图中显示了各个点以及平均值和SD。

所述结果显示，口服100mg/kg的P-gp抑制剂依克立达显著增加了较低剂量的吉非替尼(30mg/kg口服)和较高剂量的吉非替尼(100mg/kg口服)的CNS渗透。吉非替尼对IRAK1的IC₉₀约为0.7μM，对EGFR的IC₉₀约为10nM(IC₉₀：酶活性被抑制90％时的浓度)。从所述结果得出的结论是，在给以吉非替尼之前，先对小鼠进行依克立达给药导致CNS中吉非替尼的浓度足以抑制EGFR和IRAK1。

令人惊讶的是，P-gp抑制剂依维莫司增加了吉非替尼的血浆暴露，但依维莫司以10mg/kg腹腔注射剂量给药时对C57BL/6小鼠中吉非替尼的CNS渗透没有表现出任何影响。其原因尚未完全了解，不过依维莫司可能不抑制负责从大脑中排除吉非替尼的血脑屏障转运蛋白。

Claims (64)

1.一种预防或治疗神经退行性疾病的方法，包括：在需要所述预防或治疗的对象的中枢神经***(CNS)中，抑制EGFR信号传导，且抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述对象的小神经胶质细胞、星形胶质细胞或神经元中抑制EGFR信号传导和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，抑制EGFR信号传导以抑制小神经胶质细胞的活化和/或TDP43包涵体的形成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过诱导TDP43的脱乙酰化来抑制TDP43的包涵体的形成。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过抑制对象中的EGFR酪氨酸激酶活性来抑制EGFR信号传导。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过以EGFR酪氨酸激酶抑制剂向对象给药来抑制EGFR信号传导。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂是小分子酪氨酸激酶抑制，其选自吉非替尼、厄洛替尼、布里替尼、拉帕替尼、阿法替尼和艾考替尼。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，以所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂与P-糖蛋白抑制剂同时或先后向对象给药。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，通过抑制配体与EGFR的胞外结合结构域的结合来抑制EGFR信号传导。

10.根据权利要求1-4，或9中任一项所述的方法，其特征在于，通过以特异性结合至EGFR的细胞外结合结构域的单克隆抗体向所述对象给药来抑制EGFR信号传导。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导以抑制IL-1β和NFkB的产生和/或抑制TDP43包涵体的形成。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，通过抑制TDP43的磷酸化来抑制TDP43包涵体的形成。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过抑制IRAK1和/或IRAK4来抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，通过以IRAK1和/或IRAK4的小分子抑制剂向对象给药来抑制IRAK1和/或IRAK4。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述抑制剂选自由来他替尼、塔马替尼、舒尼替尼、SU-14813、十字孢碱、NVP-TAE684、KW-2449、克里唑蒂尼、吉非替尼、AST-487、多韦替尼、JNJ-2312141、fedratinib、阿法替尼、卢索替尼、卡奈替尼、alvocidib、博舒替尼、伊马替尼、凡德他尼、PHA-665752、BI-2536、来那替尼和坦度替尼。

17.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是吉非替尼。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过以吉非替尼向对象给药来抑制EGFR信号传导和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂直接给药至对象的大脑或脊髓。

20.根据权利要求15至18任一项所述的方法，其特征在于，以IRAK1和/或IRAK4抑制剂与P-糖蛋白抑制剂同时或先后向所述对象给药。

21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病是运动神经元病。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述运动神经元病是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病是家族性神经退行性疾病。

24.EGFR信号传导抑制剂，和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂，用于预防或治疗神经退行性疾病。

25.EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

26.根据权利要求24或25所述的用途，其特征在于，所述EGFR抑制剂抑制EGFR信号传导，从而抑制小神经胶质细胞的活化和/或TDP43包涵体的形成。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其特征在于，所述EGFR抑制剂通过诱导TDP43的脱乙酰化来抑制TDP43包涵体的形成。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的用途，其特征在于，所述EGFR抑制剂通过抑制EGFR酪氨酸激酶活性来抑制EGFR信号传导。

29.根据权利要求24至28中任一项所述的用途，其特征在于，所述EGFR信号传导抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。

30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂是小分子酪氨酸激酶抑制剂，其选自吉非替尼、厄洛替尼、布里替尼、拉帕替尼、阿法替尼和艾考替尼。

31.根据权利要求24至28中任一项所述的用途，其特征在于，所述EGFR信号传导抑制剂抑制配体与EGFR的细胞外结合结构域的结合。

32.根据权利要求24-28，或31中任一项所述的用途，其特征在于，所述EGFR信号传导抑制剂是特异性结合至EGFR的细胞外结合结构域的单克隆抗体或其抗原结合片段。

33.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗。

34.根据权利要求24至33中任一项所述的用途，其特征在于，MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导，从而抑制IL-1β和NFkB的产生和/或抑制TDP43包涵体的形成。

35.根据权利要求34所述的用途，其特征在于，所述MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂通过抑制TDP43的磷酸化来抑制TDP43包涵体的形成。

36.根据权利要求24至35中任一项所述的用途，其特征在于，所述MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂通过抑制IRAK1和/或IRAK4来抑制MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导。

37.根据权利要求36所述的用途，其特征在于，所述MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是IRAK1和/或IRAK4的小分子抑制剂。

38.根据权利要求36或37所述的用途，其特征在于，所述抑制剂选自：来他替尼、塔马替尼、舒尼替尼、SU-14813、十字孢碱、NVP-TAE684、KW-2449、克里唑蒂尼、吉非替尼、AST-487、多韦替尼、JNJ-2312141、fedratinib、阿法替尼、卢索替尼、卡奈替尼、alvocidib、博舒替尼、伊马替尼、凡德他尼、PHA-665752、BI-2536、来那替尼和坦度替尼。

39.根据权利要求36或37所述的用途，其特征在于，所述抑制剂是吉非替尼。

40.根据权利要求24至39中任一项所述的用途，其特征在于，所述EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是吉非替尼。

41.根据权利要求24至40中任一项所述的用途，其特征在于，将所述EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂直接给药至大脑或脊髓。

42.根据权利要求24至40中任一项所述的用途，其进一步包括P-糖蛋白抑制剂。

43.根据权利要求24至42中任一项所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是运动神经元病。

44.根据权利要求43所述的用途，其特征在于，所述运动神经元病是ALS。

45.根据权利要求24至44中任一项所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是家族性神经退行性疾病。

46.一种药物组合物，其包含EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，其中，EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是不同的化合物。

47.一种组合制剂，包含：(a)EGFR信号传导抑制剂；和(b)MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂，其中EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂是不同的化合物。

48.根据权利要求46所述的药物组合物或根据权利要求47所述的组合制剂，其还包含P-糖蛋白抑制剂。

49.根据权利要求8或20所述的方法，或根据权利要求48所述的药物组合物或组合制剂，其特征在于，所述P-糖蛋白抑制剂选自环孢菌素A、酮康唑、奎尼丁、利托那韦、维拉帕米、依维莫司和依克立达。

50.一种组合物，其包含吉非替尼和P-糖蛋白抑制剂。

51.一种药物组合物，其包含吉非替尼和P-糖蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

52.一种组合制剂，包含：(a)吉非替尼；和(b)P-糖蛋白抑制剂。

53.根据权利要求50所述的组合物、根据权利要求51所述的药物组合物或根据权利要求52所述的组合制剂，其特征在于，所述P-糖蛋白抑制剂选自环孢菌素A、酮康唑、奎尼丁、利托那韦、维拉帕米、依维莫司和依克立达。

54.根据权利要求50所述的组合物、根据权利要求51所述的药物组合物或根据权利要求52所述的组合制剂，其特征在于，所述P-糖蛋白抑制剂是奎尼丁。

55.一种药物组合物，其包含EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，其中，所述药物组合物适用于或用于直接给药至CNS。

56.根据权利要求55所述的药物组合物，其包含存在于内源CSF中的一种或多种电解质，其中，所述一种或多种电解质选自钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、磷离子和氯离子。

57.根据权利要求56所述的药物组合物，其包含含有150mM钠离子、3mM钾离子、1.4mM钙离子、0.8mM镁离子、1.0mM磷离子和155mM氯离子的溶液。

58.根据权利要求55至57中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述EGFR信号传导抑制剂和MyD88依赖性TLR/IL-R1信号传导抑制剂为吉非替尼。

59.根据权利要求50至58中任一项所述的组合物、药物组合物或组合制剂用于预防或治疗神经退行性疾病。

60.根据权利要求50至58中任一项所述的组合物、药物组合物或组合制剂在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

61.根据权利要求59或60所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是运动神经元病。

62.根据权利要求61所述的用途，其特征在于，所述运动神经元病是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

63.根据权利要求59至62中任一项所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是家族性神经退行性疾病。

64.根据权利要求8或20所述的方法、根据权利要求42所述的用途、根据权利要求48所述的药物组合物或组合制剂、根据权利要求50所述的组合物、根据权利要求51所述的药物组合物、或根据权利要求52所述的组合制剂，其特征在于，所述P-糖蛋白抑制剂是依克立达。