CN102762593A - 抗btla的完全人抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对BTLA有特异性的结合化合物及其用途。更具体而言，本发明涉及识别人BTLA并调节其在癌症、炎性病症和自身免疫病症中的活性的完全人抗体。

Description

抗BTLA的完全人抗体
本申请要求2009年7月31日提交的美国临时专利申请号61/230,332和2009年11月3日提交的美国临时专利申请号61/257,612的权益，上述各申请通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明总的来说涉及结合BTLA的抗体或抗原结合片段及其用途。更具体而言，本发明涉及识别人BTLA并调节其特别是在炎性、自体免疫性和增殖性病症中的活性的完全人抗体。
发明背景
免疫***起保护个体免遭感染原(例如细菌、多细胞生物和病毒)以及癌症的作用。该***包括若干类型的淋巴样细胞和骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。这些淋巴样细胞和骨髓细胞常常产生称为细胞因子的信号转导蛋白。免疫应答包括炎症，即免疫细胞在全身或在机体特定部位蓄积。在响应感染因素或外源物质时，免疫细胞分泌细胞因子，后者进而调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。例如在涉及过度炎症时，像自身免疫病症一样，免疫应答可产生病理性后果(参见例如Abbas等(主编)(2000)Cellular and Molecular Immunology，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA；Oppenheim和Feldmann(主编)(2001)Cytokine Reference，Academic Press，San Diego，CA；von Andrian和Mackay(2000)New Engl.J.Med.343：1020-1034；Davidson和Diamond(2001)New Engl.J.Med.345：340-350)。
正性和负性共刺激信号在B细胞和T细胞活性的调节中起决定性作用，而且已证实介导这些信号的分子是免疫调节剂的有效靶标。除T细胞受体(TCR)参与(engagement)外，幼稚T细胞的最佳活化也需要正性共刺激，而负性共刺激则被认为是自身免疫耐受性的获得以及效应T细胞功能的终止所需要的。与抗原呈递细胞(APC)表面上的B7.1或B7.2相互作用时，原型(prototypic)T细胞共刺激分子CD28响应TCR参与而发出促进T细胞增殖和分化的信号，但是CD28同源物细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)介导T细胞增殖和效应子功能的抑制(Chambers等，Ann.Rev.Immunol.，19：565-594，2001；Egen等，Nature Immunol，3：611-618，2002)。已发现与B7家族同源的若干新分子(Abbas等，Nat.Med.，5：1345-6，1999；Coyle等，Nat.Immunol.，2：203-9，2001；Carreno等，Annu.Rev.Immunol.，20：29-53，2002；Liang等，Curr.Opin.Immunol.，14：384-90，2002)，并且刚开始阐明它们在T细胞活化中的作用。
这些新的共刺激配体包括B7h、PD-L1、PD-L2和B7-H3。B7h(Swallow等，Immunity，11：423-32，1999)亦称为B7RP-1(Yoshinaga等，Nature，402：827-32，1999)、GL50(Ling等，J.Immunol.，164：1653-7，2000)、B7H2(Wang等，Blood，96：2808-13，2000)和LICOS(Brodie等，Curr.Biol.，10：333-6，2000)，其与活化T细胞上的可诱导的共刺激因子(ICOS)结合，并共刺激T细胞增殖和细胞因子(例如白介素4(IL-4)和IL-10)的产生。
PD-L1(Freeman等，J.Exp.Med.，192：1027-34，2000)亦称为B7-H1(Dong等，Nat.Med.，5，1365-9，1999)和PD-L2(Latchman等，Nat.Immunol.，2：261-8，2001)亦称为B7-DC(Tseng等，J.Exp.Med.，193，839-46，2001)，两者与T细胞和B细胞上的程序性死亡1(PD-I)受体结合。
最后，B7-H3与目前尚未了解的活化T细胞上的反受体结合，据报道提高CD4+T辅助(Th)细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL或Tc)的增殖并选择性提高IFN-γ表达(Chapoval等，Nat.Immunol，2，269-74，2001；Sun等，J.Immunol.，168，6294-7，2002)。
由于具有T细胞共刺活化性的其它分子的重大生物学重要性以及能够影响它们的活性的作用剂的治疗潜力，因此其鉴定令人极感兴趣。能够调节共刺激信号并由此能够调节CD8+CTL和CD4+Th细胞的活化和/或效应子功能的作用剂可应用于调节免疫应答，并且是十分需要的。
尤其是已知许多自身免疫病症涉及自体反应性T细胞和自身抗体。非常需要能够在不损害免疫***抵御病原体的能力的情况下抑制或消除自体反应性淋巴细胞的作用剂。
相反，许多癌症免疫疗法(例如过继免疫疗法)使肿瘤特异性T细胞群扩繁，并指引其攻击并杀死肿瘤细胞(Dudley等，Science298：850-854，2002；Pardoll，Nature Biotech.，20：1207-1208，2002；Egen等，Nature Immunol.，3：611-618，2002)。也非常需要能够提高肿瘤攻击的作用剂。
另外，针对不同抗原(例如微生物抗原或肿瘤抗原)的免疫应答虽然可检出，但幅度常常不足以提供针对表达这些抗原的作用剂(例如感染性微生物或肿瘤细胞)介导的疾病过程的保护。通常需要联合抗原将用作在受试者中提高对抗原的免疫应答的佐剂给予受试者。
在某些情况下，还需要抑制对抗原的正常免疫应答。例如，在接受移植的患者中需要抑制正常的免疫应答，并且非常需要具有这种免疫抑制活性的作用剂。
共刺激信号，特别是正性共刺激信号，还在B细胞活性的调节中起作用。例如，除受抗原刺激以外，B细胞活化和生发中心B细胞的存活也需要T细胞衍生信号。
存在于辅助T细胞表面上的CD40配体与B细胞表面上的CD40相互作用，并在B细胞中介导许多这种T细胞依赖性作用。
蛋白质BTLA(B和T淋巴细胞弱化子)是受体CD28家族的成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和PD-1。根据在加入单克隆抗体后对提高T细胞增殖的功能作用，发现了该家族最初的成员CD28和ICOS(Hutloff等(1999)Nature 397：263-266；Hansen等(1980)Immunogenics 10：247-260)。通过筛选TH1细胞中的差别表达发现了BTLA。另外，BTLA被描述为提供类似于CTLA-4的负性抑制信号。在激动剂抗BTLA Mab存在下，抗CD3和抗CD28活化的T细胞显示IL-2的产生和增殖降低(Kreig等，J.Immunol.，175，6420-6472，2005)。缺乏完整BTLA基因的小鼠显示在免疫后DNP-KLH的效价较高，且对EAE的敏感性提高(Watanabe等，Nat.Immunol，4，670-679，2003)。已经表明HVEM(疱疹病毒进入介体)是BTLA的配体(Scully等(2005)Nat.Immunol.6：90-98；Gonzalez等(2005)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.102：1116-1121)。
因此，需要识别BTLA的作用剂、特别是识别BTLA的抗体及其结合作用剂和使用这些作用剂的方法。
抗体可用作治疗药物。某些抗体在体内用作治疗药物时可引起不需要的抗体免疫原性。因为大多数单克隆抗体来源于啮齿动物，所以在人中重复使用导致产生针对治疗性抗体(例如，人抗小鼠抗体或HAMA)的免疫应答。这类免疫应答至少导致丧失治疗功效，而最高则导致潜在致死过敏反应。降低啮齿动物抗体的免疫原性的一种方法包括嵌合抗体的产生，其中将小鼠可变区(Fv)与人恒定区融合(Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43)。然而，用人可变区和小鼠恒定区的杂合体注射的小鼠发生针对人可变区的强抗抗体应答，这就表明这种嵌合抗体中的完整啮齿动物Fv区的保留仍可在患者中引起有害的免疫原性。
另外，将啮齿动物可变结构域的互补决定区(CDR)环移植到人构架上(即人源化)已被用于进一步将啮齿动物序列减至最低。Jones等(1986)Nature 321：522；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534。然而，CDR环交换仍不能均匀产生具有与起始抗体相同的结合性质的抗体。在人源化抗体中，常常还需要构架残基(FR)(参与CDR环支持的残基)改变以保持抗原结合亲和力。Kabat等(1991)J.Immunol.147：1709。虽然已经报道了许多人源化抗体构建体中CDR移植和构架残基保持的使用，但是难以预测特定序列是否可产生具有所需结合性质以及间或具有生物学性质的抗体。参见例如Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029；Gorman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4181；以及Hodgson(1991)Biotechnology(NY)9：421-5。此外，大部分现有研究对动物轻链和重链可变序列使用不同人序列，致使这种研究的预测性成问题。已在使用已知抗体的序列，或者更通常使用具有已知X射线晶体结构的抗体例如抗体NEW和KOL的序列。参见例如Jones等，同上；Verhoeyen等，同上；以及Gorman等，同上。已经报道了少数人源化构建体的确切序列信息。
存在对用于治疗人病症(例如炎性病症、自身免疫病症和增殖性病症)的抗BTLA抗体、特别是抗BTLA单克隆抗体的需要。这种抗体可优选在人受试者中具有低免疫原性，允许重复给予而无不良免疫应答。
发明概述
本发明涉及在人受试者中具有一种或多种以下所需性质的抗人BTLA抗体：包括高结合亲和力、中和活性、良好的药代动力学和低抗原性。本发明还涉及本发明的抗体在治疗疾病中的用途。
在某些实施方案中，本发明涉及与人B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包括一种或多种选自以下的性质：a)不阻断BTLA与疱疹病毒进入介体(HVEM)结合；b)与食蟹猴BTLA交叉反应；c)与人BTLA结合的KD为至多约2.4X 10-9；和d)在测量B或T细胞活化的体外测定中EC50约为10-100nM。
在其它实施方案中，本发明涉及与人BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的一种或多种性质：a)阻断BTLA与HVEM结合；b)与食蟹猴BTLA交叉反应；和c)与人BTLA结合的KD为至多约4.6X 10-9。
在其它实施方案中，本发明涉及选自hu Mab8D5和hu Mab8A3的与BTLA结合的分离激动剂抗体或其抗原结合片段，其中抗体与BTLA特异性结合且不阻断与HVEM结合。
在其它实施方案中，本发明涉及选自hu Mab21H6和hu Mab19A7的与BTLA结合的分离激动剂抗体或其抗原结合片段，其中抗体与BTLA特异性结合且还阻断与HVEM结合。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO：12、13和14的VL CDR结构域和至少一个选自SEQ ID No.：5、6和7的VH CDR结构域。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及与BTLA结合的分离拮抗剂抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO：26、27、28的VL CDR结构域和至少一个选自SEQ ID NO：19、20和21的VHCDR结构域。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的分离抗体或其抗原结合片段，其中：(a)重链可变区包含SEQ IDNO：11(8D5重链)的氨基酸序列；和(b)轻链可变区包含SEQ ID NO：18(8D5轻链)的氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含以下的分离抗体或其抗原结合片段：(a)包含SEQ ID NO：5(8D5HCDR1)的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO：6(8D5HCDR2)的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ ID NO：7(8D5HCDR3)的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO：12(8D5LCDR1)的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO：13(8D5LCDR2)的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：14(8D5LCDR3)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中抗体与BTLA特异性结合且不阻断与HVEM结合。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含以下的分离抗体或其抗原结合片段：(a)为人VH基因(SEQ ID NO：8)[编码8D5]的产物或来源于该基因的重链可变区；和(b)为人VK基因(SEQ ID NO：15)[编码8D5]的产物或来源于该基因的轻链可变区；其中抗体与BTLA特异性结合。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体与包含以下序列的参比抗体交叉竞争结合BTLA：(a)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11(8D5重链)的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18(8D5轻链)的氨基酸序列的轻链可变区；其中分离单克隆抗体或其抗原片段是BTLA激动剂。
在某些实施方案中，重链和轻链通过挠性接头连接形成单链抗体。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单链Fv抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab′抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是(Fab′)2抗体。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是完全人单克隆抗体或完全人重组抗体。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段降低BTLA活性和/或信号转导。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段提高BTLA活性和/或信号转导。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述任何抗体或抗原结合片段的VL结构域或VH结构域的分离多肽。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码本文所述任何抗体或抗原结合片段的VL结构域或VH结构域的分离核酸。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述一种或多种抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗受试者的因BTLA表达和/或活性降低所引起的病况的方法，所述方法包括将有效量的本文所述药物组合物给予受试者。特别地，以T细胞或B细胞的存在或活性为特征的任何疾病或病症可通过BTLA激动剂抗体治疗(即涉及BTLA阳性免疫细胞存在的疾病或病症可通过活化BTLA受体功能来控制或治疗)。在某些实施方案中，一种或多种抗体或其抗原结合片段选自hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7或huMab4C7。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗受试者的炎性病症或自身免疫病症的方法，该方法包括将有效量的本文所述抗体或抗原结合片段给予受试者。在某些实施方案中，炎性病症或自身免疫病症选自炎性肠病症(例如克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括变应性哮喘)、***反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病、眼色素层炎、移植物抗宿主病(GVHD)、青少年早发性I型糖尿病、移植排斥、SLE和斯耶格伦综合征(
Figure BPA00001531276100081
syndrome)。这种治疗方法还可包括给予一种或多种其它的治疗药物，例如免疫抑制剂或抗炎剂。在另外的其它实施方案中，病症为类风湿性关节炎。
在另外的其它实施方案中，炎性肠病症选自克罗恩病、溃疡性结肠炎和炎性肠病。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗移植排斥和/或移植物抗宿主病的方法。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗I型糖尿病的方法。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述抗体或抗原结合片段在制备治疗受试者的炎性病症或自身免疫病症的药物中的用途。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述抗体或抗原结合片段在制备降低BTLA的活性的药物中的用途。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及提高受试者的免疫应答的方法，该方法包括将有效量的药物组合物给予受试者。在某些实施方案中，一种或多种抗体或其抗原结合片段是hu Mab4C7。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述拮抗剂抗体在制备提高BTLA的活性的药物中的用途。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述任何抗体或抗体片段用于诊断应用中的用途。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述任何抗体或抗原结合片段的药盒。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含BTLA和本文述任一种抗体或抗原结合片段的复合物。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及表达载体，其包含编码多肽的分离核酸，所述多肽编码本文所述任何VH或VL链。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述表达载体的宿主细胞。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及产生本文所述抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：
(a)在表达核酸序列的条件下，将本文所述宿主细胞在培养基中培养，由此产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；和
(b)从宿主细胞或培养基中回收多肽。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体与包含以下序列的参比抗体交叉竞争结合BTLA：
(a)包含SEQ ID NO：23(4C7重链)的氨基酸序列的重链可变区；
(b)包含SEQ ID NO：30(4C7轻链)的氨基酸序列的轻链可变区；其中分离单克隆抗体或其抗原片段是BTLA拮抗剂。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的分离免疫球蛋白多肽，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于重链可变区中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于重链可变区中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的分离免疫球蛋白多肽，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的分离免疫球蛋白多肽，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于重链可变区中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述重链可变区包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于重链可变区中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的分离免疫球蛋白多肽，所述重链可变区包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列。
在某些实施方案中，这些核酸构建体和/或多肽可用于制备抗体的方法。
附图简述
图1A-C表示hu Mab 8D5的重链可变区和轻链可变区的序列。图1A表示VH链的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图1B表示VL链的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图1C表示Hu Mab8D5的重链可变区和轻链可变区的序列特征。
图2A-C表示hu Mab 4C7的重链可变区和轻链可变区的序列。图2A表示VH链的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图2B表示VK的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图2C表示hu Mab4C7的重链可变区和轻链可变区的序列特征。
图3A-D表示hu Mab8D5和hu Mab4C7的结合和交叉反应性特征。图3A表示hu Mab8D5对在CHO细胞上表达的人BTLA的结合概况。图3B表示hu Mab8D5对在CHO细胞上表达的食蟹猴BTLA的结合概况。图3C表示hu Mab4C7对在CHO细胞上表达的人BTLA的结合概况。图3D表示hu Mab4C7对CHO细胞上表达的食蟹猴BTLA的结合概况。
图4A-B表示测试抗体阻断人HVEM与表达人BTLA的CHO细胞结合的能力的结果。图4A表示hu Mab4C7阻断人HVEM与表达人BTLA的CHO细胞结合。图4B表示hu Mab8D5不能阻断人HVEM与表达人BTLA的CHO细胞结合。
图5图示hu Mab8D5以及hu Mab8D5Fab’片段抑制抗CD3诱导的人原始T细胞增殖。
图6A-D图示hu Mab8D5和hu Mab4C7对SEB诱导的人和食蟹猴T细胞应答的作用。
图7A-B图示hu Mab8D5减弱对破伤风类毒素攻击的人记忆T细胞应答。
图8A-B图示hu Mab4C7提高对破伤风类毒素攻击的人记忆T细胞应答。
图9图示hu Mab8D5抑制人B细胞功能。
图10A-B图示hu Mab8D5抑制外周血B细胞趋化因子的产生。
图11图示hu Mab8D5不自主刺激健康供体血液中的免疫活性。
图12A-B为蛋白质印迹，表示hu Mab8D5和hu Mab4C7与BTLA结合(图12A)，且hu Mab8D5减少TCRξ磷酸化(图12B)。
图13A-B图示hu Mab8D5以剂量依赖性方式抑制SEB应答和B细胞增殖。
图14A-D图示受测抗BTLA激动剂抗体不会在人PBMC培养物中引起细胞因子风暴(storm)，正如在人PBMC培养物中测量的缺乏IL-2(图14A、B)、IFNγ(图14C)和TNFα(图14D)的产生一样。
图15图示第28天ELISA结果，表明hu Mab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人抗TT记忆IgG应答。
图16图示第28天ELISA结果，表明hu Mab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人总IgG应答。
图17A-B图示各个治疗小鼠的效价，说明了与同种型对照(图17B)相比，hu Mab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人抗TT记忆IgG应答(图17A)。
图18A-B图示各个治疗小鼠的效价，表明了与同种型对照(图18B)相比，hu Mab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人总IgG应答(图18A)。
发明详述
哺乳动物免疫***已发展控制T淋巴细胞和B淋巴细胞的潜在有害活性的若干途径。它们包括各种细胞因子-受体途径以及涉及受体(像CD28、CTLA-4、PD-1和BTLA)的共刺激途径。尽管CD28-B7相互作用是正性共刺激途径的实例(即CD28触发提高对抗原特异性触发物的T细胞应答)，但其它3种受体表示抑制性共刺激途径。CTLA-4、PD-1和BTLA显示重叠但独特的表达概况，并以非丰余方式限制T淋巴细胞和B淋巴细胞以及其它免疫细胞的活性。(参见Deppong等，JImmunol 2006，Tao等，J Immunol 2005)。虽然CTLA-4与CD28竞争结合B7.1和B7.2(CD80和CD86)并为***和脾中的幼稚T细胞活化设定原始阈值，但是PD-1和BTLA各有自己独特的配体(分别为PD-L1/-L2和HVEM)，并且似乎控制外周T细胞稳态和再活化。(参见Krieg等，Nat Immunol 2007。)
BTLA下调B细胞和T细胞活化
如其名称所表示的一样，B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)在静息和活化的B淋巴细胞和T淋巴细胞两者上表达。BTLA是I型跨膜糖蛋白，具有含有若干抑制酪氨酸基序的胞质尾(Watanabe，2003)。BTLA具有CD28/CTLA-4家族成员的某种结构相似性，但几个因素使之成为独特成员。人BTLA含有下列表征的结构域：Ig包外结构域：残基51-117；跨膜结构域：残基153-173；ITIM结构域：残基255-260；以及ITSM结构域：残基280-285(对于人SEQ ID NO：2)。ITIM表示基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，而ITSM表示基于免疫受体酪氨酸的转换基序。
相当于SEQ ID NO：2的残基43-134的BTLA Ig中间类型(I类类型)胞外结构域负责配体结合，且不存在于CD28/CTLA-4家族的其它成员中。另外，BTLA的配体不是B7家族成员，倒不如说它是TNFR超家族受体疱疹病毒进入介体(HVEM)(Sedy，2005)。HVEM在外周B细胞和T细胞及单核细胞上表达，并且已解析了与BTLA结合的HVEM的晶体结构(Compaan，2005)。
若干体内研究证实了BTLA在淋巴细胞应答中的抑制作用。由Murphy与同事(Washington University St.Louis)制备的BTLA缺陷型小鼠在响应T依赖性抗原产生的IgG方面表现出3倍增加。另外，自BTLA-/-小鼠分离的T细胞和B细胞对分别使用-CD3和抗IgM进行抗原-受体刺激显示较大的增殖应答(Watanabe，2003)。在过量表达研究中，发现BTLA与B细胞受体复合物以及与T细胞受体缔合。与该研究结果一致，在BTLA缺陷型淋巴细胞中，使用Con A(T细胞)或LPS(B细胞)进行抗原-受体非依赖性刺激不受影响，而且使用抗BTLA抗体也不能被调节。
已经表明BTLA敲除小鼠随时间推移发生自发性自身免疫病，且寿命缩短(Oya，2008)。BTLA被HVEM连接导致T细胞活化和增殖的下调(Sedy，2005)。BTLA敲除小鼠显示在自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和变应性气道炎症模型中疾病严重程度加剧，这两种模型均有赖于T细胞活性(Watanabe，2005；Deppong，2006)。也已表明了人BTLA基因中的SNP与RA易感性之间的联系(Lin，2006)。然而，有关BTLA信号转导在病理状态中的作用仍是知之甚少。
因此，对于自身免疫病和某些增殖性疾病，存在开发利用BTLA在淋巴细胞应答中的抑制作用而同时允许BTLA-HVEM结合的治疗的持续需要。
激动剂BTLA抗体特别适于这种作用。在选择利用Ultimab平台产生的200多种mAb的过程中，鉴定出许多激动剂抗体和拮抗剂BTLA抗体。200多种mAb之中，鉴定出活化抑制性BTLA受体功能的几种抗体(即激动剂抗体)，包括hu Mab8D5、hu Mab8A3、huMab21H6和hu Mab19A7。Hu Mab8D5和hu Mab8A3是不阻断HVEM配体与BTLA结合的BTLA激动剂。Hu Mab21H6和hu Mab19A7活化抑制性BTLA受体功能，同时还阻断HVEM配体与BTLA结合。这些激动剂抗体对BTLA的结合亲和力约为12-14nM，并且还在人供体血液中抑制T细胞和B细胞应答，其EC50约为30-100nM。当作为IgG4和单价Fab’片段重新表达时，hu Mab8D5体外保持其免疫抑制活性。这些激动剂BTLA抗体也以类似亲和力与食蟹猴BTLA结合，并表明对食蟹猴T细胞应答的等同抑制。然而，这些激动剂抗体不与小鼠BTLA交叉反应。在小鼠药理学研究中，hu Mab8D5的半寿期为约16天，与对人IgG4的预期一致。这些受体激动剂性mAb体外抑制和阻抑T淋巴细胞和B淋巴细胞活性，而且在体内模型***中也具有这种活性。本发明的激动剂抗体的特征是具有在不消耗B细胞的情况下通过关联抗原抑制B细胞活化的能力。另外，本发明的激动剂抗体的特征还在于同时靶向B细胞和T细胞活化的能力。
除了上述4种激动剂抗BTLA抗体以外，选择还鉴定出拮抗剂抗体hu Mab4C7。该抗体具有图6C-D和图8A-B中所示的免疫刺激作用，因此预期可用作癌症治疗或用于治疗某些病原体感染及用作疫苗的佐剂。预期在癌症情况下使用BTLA拮抗剂(例如Mab4C7)以刺激免疫应答与这些结果以及表明在幼稚CD8+T细胞初敏期间阻断BTLA-HVEM连接有助于T细胞增殖增加的结果有关。(参见Derré等，J.Clin.Invest.2010，120：157-167)。
至于BTLA激动剂，抑制抗原特异性T细胞应答和B细胞应答两者的能力可提供预期可用于以下病况的调节BTLA活性的方法：例如关节炎、SLE、斯耶格伦病、溃疡性结肠炎和克罗恩病以及实体器官移植(即肾、肝和其它器官，包括组织移植)。现有治疗有缺点，部分因为只抑制T细胞不足以达到所需效果。本发明的抗BTLA抗体可通过抑制T细胞应答和B细胞应答两者的能力有效用于治疗关节炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病以及实体器官移植(即肾、肝和其它器官)。在作为IgG4以及单价Fab’片段再表达以保持免疫抑制活性体外和体内模型时，本发明的各种激动剂抗体的能力提供用于新治疗的所需特征。
缩略语
在整个本发明的详述和实施例中将使用下列缩略语：
编号***定义
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定义
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文献其它部分有明确定义，否则本文所用的所有其它科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
本文(包括随附权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。
用于细胞或受体的“活化”、“刺激”和“处理”可具有相同含义，例如细胞或受体用配体活化、刺激或处理，除非上下文另外或明确规定。“配体”包括天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合化合物。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指通过内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。“应答/反应”，例如细胞、组织、器官或生物体的应答，包括生化或生理行为(例如生物区室内的浓度、密度、粘附或迁移、基因表达速率或分化状态)的改变，其中改变与活化、刺激或处理有关，或者与例如遗传编程等内部机制有关。
分子的“活性”可描述或指该分子与配体或受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号转导、分化或成熟的能力；抗原活性；调节其它分子的活性等。分子的“活性”还可指在调节或保持细胞-细胞间相互作用(例如粘附)中的活性，或在保持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)中的活性。“活性”也可指比活，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等。“活性”可指先天免疫***或适应性免疫***的组分的调节。“增殖活性”包括促进、对以下方面是必需的或与以下方面明确有关的活性：例如正常的细胞***以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成。
应用于动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物流体的“给予”和“治疗”是指使外源药物、治疗药、诊断药或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗、药代动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的治疗包括使试剂与细胞接触以及使试剂与流体(其中该流体与细胞接触)接触。“给予”和“治疗”还意指体外和离体治疗，例如细胞用试剂、诊断、结合化合物或用另一种细胞的体外和离体治疗。术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。
本文所用BTLA激动剂抗体是指与BTLA结合并加强其对B细胞和T细胞的共抑制信号的抗体。
本文所用BTLA拮抗剂抗体是指与BTLA结合并防止共抑制信号递送给B细胞和T细胞的抗体。
在本发明的一个实施方案中，可能时，按照Physicians′DeskReference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))，将本发明的组合物给予受试者。
在某些实施方案中，可通过侵入性途径例如通过注射(参见上文)给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段。通过非侵入性途径(例如口服；例如以丸剂、胶囊剂或片剂口服)给药也落入本发明的范围内。在本发明的一个实施方案中，经静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内(例如在关节炎关节中)、通过吸入、气雾剂递送或肿瘤内给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。在某些实施方案中，与以片剂形式口服给予的化疗药物(例如吉非替尼(例如IressaTM))组合，给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，化疗药物是静脉内给予的紫杉醇(例如Taxol
Figure BPA00001531276100181
)。
在又一个实施方案中，抗BTLA抗体或其抗原结合片段与至少一种其它治疗药物组合给予，其它治疗药物例如而不限于针对CTLA-4的其它单克隆抗体(例如AVASTIN(贝伐单抗)、MYLOTARG(吉妥珠单抗)、BEXXAR(托西莫单抗)、RITUXAN(利妥昔单抗)、HERCEPTIN(曲妥珠单抗))，或具有类似作用的蛋白质配体；活化抗原呈递细胞(树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞)的作用剂，包括1型干扰素(例如干扰素α和β)；干扰素γ；BCG；提供任何和所有形式的肿瘤抗原(包括蛋白质抗原、肽抗原、完整细胞裂解物及其衍生物)的作用剂；遗传编码抗原(例如腺病毒编码抗原)；体内或离体改变以加强其免疫性质的免疫***的细胞组分(例如自体树突细胞、淋巴细胞、热激蛋白等)；化疗药物例如但不限于尤其环磷酰胺、甲氨蝶呤、依托泊苷、阿霉素、紫杉烷类、氟尿嘧啶、阿糖胞苷(AraC)和含铂药物。抗原的实例包括PSA抗原(例如PROSTVAC/TRICOM)和黑素瘤来源的gp100抗原。也可与以下成分组合给予联合药物：细胞因子或生长因子，例如但不限于GM-CSF，或者免疫刺激核苷酸，例如但不限于CpG ODNPF3512676(亦称为ProMune，参见WO2007/008463)。
另外，在某些实施方案中，抗BTLA抗体或其抗原结合片段与以下抗体组合给予，例如抗CTLA-4和抗PD1，包括美国专利号6,682,736和美国专利号7,563,869中分别描述的抗体。
可用本领域已知的医疗装置给予组合物。例如，可用皮下注射针经注射给予本发明的药物组合物。
还可用无针皮下注射装置给予本发明的药物组合物；例如美国专利号6,620,135、6,096,002、5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。
给予药物组合物的众所周知的植入物和组件形式的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微型输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流速可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室区室的渗透药物递送***。本领域技术人员熟知许多其它的这类植入物、递送***和组件。
“治疗”意指将治疗药物例如含有本发明的任何结合化合物的组合物，经内部或外部给予具有药物对其具有已知治疗活性的一种或多种疾病症状的患者。通常，以有效减轻受治疗的患者或群体的一种或多种疾病症状的量给予药物，而不论是通过诱导这些症状的消退还是抑制这些症状的进展达任何临床可测量的程度。有效减轻任何特定疾病症状的治疗药物的量(亦称为“治疗有效量”)可随例如患者的疾病状态、年龄和体重及药物在患者中引起所需反应的能力等因素而变化。可通过医师或其他专业保健提供者常用于评价疾病症状的严重程度或进展状态的任何临床测量来评价该症状是否减轻。虽然本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)可能不会有效减轻每位患者的靶疾病症状，但其应在按本领域已知的任何统计检验测定的统计显著数量的患者中减轻靶疾病症状，统计检验例如斯氏t检验、χ2检验、Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。
用于人、兽医或研究对象的“治疗”是指治疗性治疗、预防措施、研究和诊断应用。用于人、兽医或研究对象或者细胞、组织或器官的“治疗”包括使BTLA激动剂或拮抗剂与人或动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体接触。“细胞的治疗”不仅包括例如在流体相或胶态相中BTLA激动剂或拮抗剂与BTLA受体接触的情况，而且还包括激动剂或拮抗剂不与细胞或受体接触的情况。
在某些实施方案中，可单独或组合使用抗BTLA抗体或其抗原结合片段以治疗或预防需要这种治疗或预防的受试者的任何疾病或病况。
至于拮抗剂抗BTLA抗体，在某些实施方案中，病况受例如BTLA的表达或活性升高或者其配体(例如HVEM)的表达升高介导，并且可通过调节BTLA-HVEM配体结合、活性或表达来治疗或预防。在某些实施方案中，疾病或病况受BTLA和/或HVEM水平提高的介导，并且通过降低BTLA-HVEM配体结合、活性或表达来治疗或预防。本文所述拮抗剂抗BTLA抗体可作为负性信号转导分子阻断BTLA的活性，并且可通过T细胞和B细胞引起对肿瘤应答的上调。
术语“B和T淋巴细胞弱化子”和“BTLA”基因/蛋白质可互换使用，其包括变体、同种型、同源物、直向同源物(ortholog)和种内同源物(paralog)。例如，在某些实施方案中，人BTLA特异性抗体可与来自非人物种的BTLA交叉反应。在其它实施方案中，人BTLA特异性抗体可以是人BTLA完全特异性的，并且不具有物种交叉反应性或其它类型的交叉反应性。除非另有说明，否则术语“人BTLA”是指人BTLA序列。除非另有说明，否则人BTLA序列包括所有人同种型和BTLA变体，例如Genbank登记号为AAP44003的人BTLA的完整氨基酸序列。还存在至少两种人BTLA转录物变体。GenBank登记号NP_861445记载的转录物变体1长度为289个氨基酸，并且与登记号AAP44003的BTLA序列有近98％同一性。这种变体代表较长的转录物，并编码较长的289个氨基酸的同种型。转录物变体2(GenBank登记号NM_001085357)与变体1相比，缺乏可变框内外显子，产生与同种型1相比较短的241个氨基酸的蛋白质(同种型2，GenBank登记号NP_001078826)。
人BTLA序列可因具有例如保守突变或非保守区的突变而不同，该BTLA具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的人BTLA基本相同的生物功能。例如，人BTLA的生物功能是抑制免疫应答，例如T细胞应答。也就是说，BTLA被视为负性调节因子。它具有参与降低IL-2产生和T细胞扩繁的C端抑制基序(Watanabe等，Nat.Immunol.，4，670-679，2003；Chemnitz等，J.Immunol.，176，6603-6614，2006)。另外，人BTLA的生物功能可为具有例如在被本公开内容的抗体特异性结合的BTLA的胞外结构域中表位。
具体的BTLA序列一般可与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：35或SEQID NO：37的人BTLA或其它同种型的氨基酸序列有至少90％同一性，并且当与其它物种(例如鼠)的BTLA氨基酸序列相比时，含有鉴定为人的氨基酸序列的氨基酸残基。在某些情况下，人BTLA可与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的人BTLA或其它同种型或变体有至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％同一性。在某些实施方案中，人BTLA序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：37的BTLA或者其它同种型或变体的差异将不超过10个氨基酸。在某些实施方案中，人BTLA与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：35或SEQID NO：37的BTLA或其它同种型或变体的差异可不超过5个或甚至不超过4、3、2、或1个氨基酸。百分比同一性可按本文所述确定。术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。
在某些情况下，对小鼠类似抗体进行推论研究是有用的。可采用本文所述合适方法产生抗BTLA小鼠抗体以及选择和表征小鼠抗BTLA抗体。虽然具有所需性质和活性的任何小鼠BTLA肽可用来产生小鼠BTLA抗体，但优选Watanabe等，Nat.Immunol.4(7)，670-679(2003)描述的序列，包括GenBank登记号AY293285编码的GenBank登记号AAP44002(306个氨基酸)。
另外，已表征了许多小鼠BTLA剪接变体，在某些情况下，这些中的任一种都可用于产生抗小鼠BTLA抗体。对于较长转录物变体1(长为306个氨基酸)，小鼠BTLA剪接变体包括编码序列NM_001037719和相应的氨基酸序列NP_001032808，较短转录物2变体序列描述于GenBank NP_808252(长为305个氨基酸)；其与变体1相比使用3′编码区中的可变框内剪接位点，产生较短的蛋白质(同种型2)。
本文所用术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化(camelized)单结构域抗体。本文所用术语“抗BTLA抗体”或抗体(“亲代抗体”)的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当BTLA结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其BTLA结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的BTLA结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗BTLA抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。
“分离抗体”是指结合化合物的纯化状态，且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。
“Fab片段”由一条轻链及CH1和一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的2个重链片段。该2个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的部分或片段，该重链的部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，使得2个Fab′片段的2条重链之间可形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有2条轻链和2条含有介于CH1和CH 2结构域之间的恒定区的一部分的重链，使得在2条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过2条重链间的二硫键保持在一起的2个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来源于重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。
术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。Fv多肽一般还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun(1994)THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg和Moore主编Springer-Verlag，New York，第269-315页。另参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203。
“结构域抗体”是只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个VH区可靶向相同或不同的抗原。
“二价抗体”包含2个抗原结合部位。在某些情况下，2个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。
除非另有规定，否则本文所用“抗BTLA”抗体是指针对人BTLA或其变体或其任何抗原片段产生的抗体。
本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等(1975)Nature 256：495最早描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。还可采用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597描述的技术，从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。另参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731。
在某些实施方案中，单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们具有所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；以及Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。
本文所用“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常可变结构域获自啮齿动物等实验动物的抗体(“亲代抗体”)，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与亲代啮齿动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。
在某些实施方案中，本文的单克隆抗体还包括骆驼源化单结构域抗体。参见例如Muyldermans等(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。在一个实施方案中，本发明提供单结构域抗体，其包含带有修饰的2个VH结构域从而形成单结构域抗体。
本文所用术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。在例如EP 404,097、WO 93/11161以及Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中，对双抗体进行了更充分的描述。有关工程改造抗体变体的综述一般参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。
本文所用术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fc)。
本发明的抗体还包括具有修饰的(或封闭的)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如美国专利号5,624,821、WO2003/086310、WO2005/120571、WO2006/0057702。这类修饰可用来促进或抑制免疫***的各种反应，在诊断和治疗方面具有可能的有益作用。Fc区的变化包括氨基酸改变(取代、缺失和***)、糖基化或去糖基化和加入多个Fc。Fc的变化还可改变治疗性抗体中抗体的半寿期，使得能够不太频繁地给药，因此增加了方便性，减少了材料使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731第734-35页。
术语“完全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可含有鼠糖链。同样，“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可含有大鼠糖链。同样，“大鼠抗体”是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
抗体结构
总的来说，已知基本的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分或片段可包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分或片段可限定主要负责效应子功能的恒定区。通常将人轻链归类为κ和λ轻链。此外，通常将人重链归类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第7章(Paul，W.主编，第2版。Raven Press，N.Y.(1989)。
每个轻链/重链对的可变区配对形成抗体结合部位。因此，完整IgG抗体一般具有2个结合部位。除双功能或双特异性抗体以外，2个结合部位通常相同。
通常，各链均具有相同的通过3个超变区(亦称为互补决定区或CDR)连接的相对保守构架区(FR)的通用结构。每对的2条链的CDR通常通过构架区对准，使之能与特定表位结合。总的来说，轻链和重链两者从N端到C端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。一般按照以下文献中的定义指定每个结构域的氨基酸：Sequences of Proteins of Immunological Interest，Kabat等；NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.；第5版；NIH公告号91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等(1989)Nature 342：878-883。
本文所用术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)和重链可变结构域的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)和/或“超变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)和重链可变结构域中的26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文所用术语“构架”或“FR”残基是指本文定义为CDR残基的超变区残基以外的可变结构域残基。
“结合物质”是指能够与靶标结合的分子、小分子、大分子、抗体、其片段或类似物或可溶性受体。“结合物质”也可指能够与靶标结合的分子复合物(例如非共价复合物)、离子化分子和例如通过磷酸化、酰化、交联、环化或有限切割修饰的共价或非共价修饰分子。“结合物质”还可指能够与稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂组合而结合靶标的分子。“结合”可定义为结合物质与靶标缔合，其中缔合导致结合物质的正常布朗运动减少，在这种情况下结合物质可溶解或悬浮在溶液中。
“有效量”包括足以改善或预防医学病症的症状或体征的量。有效量还意指足以允许或便于诊断的量。特定患者或兽医对象的有效量可根据例如待治疗的病况、患者的总体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重程度等因素而变化(参见例如授权给Netti等的美国专利号5,888,530)。有效量可以是避免明显副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。结果可导致诊断测量或参数改进至少5％、通常为至少10％、更常为至少20％、最常为至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、最优选至少60％、理想为至少70％、更理想为至少80％、最理想为至少90％，其中100％定义为正常受试者显示的诊断参数(参见例如Maynard等(1996)A Handbook of SOPs for Good ClinicalPractice，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)GoodLaboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK)。
“外源的”是指根据上下文在生物体、细胞或人体外部产生的物质。“内源的”是指根据上下文在细胞、生物体或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当所比较的两个序列中某一位置被相同碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如如果两个DNA分子每个中某一位置均被腺嘌呤占据，则分子在该位置上是同源的。两个序列间的同源性百分比是两个序列共有的匹配位置或同源位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果在对序列进行最佳比对时两个序列10个位置中有6个匹配或同源，则两个序列是60％同源的。一般在比对两个序列时进行比较以得到最大百分比同源性。
“免疫病况”或“免疫病症”包括例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫病症或疾病。“免疫病况”还指感染、持续感染和增殖性病况，例如癌症、肿瘤和血管生成，包括抵抗免疫***根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性病况”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管生成和癌前病况，例如发育异常。
“炎性病症”意指其中病理全部或部分由例如免疫***细胞的数目改变、迁移速率改变或活化改变引起的病症或病理状况。免疫***细胞包括例如T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞、小胶质细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞或与免疫学特别有关的任何其它细胞，例如产细胞因子的内皮或上皮细胞。
“分离结合化合物”是指结合化合物的纯化状态，在这种情况下意指分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质，例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”一般并非是指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲剂或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。
“分离核酸分子”意指基因组、mRNA、cDNA或合成来源或其某些组合的DNA或RNA，其不与多核苷酸的全部或部分缔合(其中分离多核苷酸天然存在)，或者与其天然不连接的多核苷酸连接。对于本公开内容的目的，应当理解的是，“包含”特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整的染色体。除规定序列外，“包含”规定核酸序列的分离核酸分子还可包括多达10个或甚至多达20个或更多个其它蛋白质或其部分或片段的编码序列，或者可包括有效连接的控制所列举的核酸序列编码区表达的调节序列，和/或可包括载体序列。
表述“调控序列”是指特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的调控序列包括启动子、任选操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当与另一核酸序列处于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则前序列或分泌前导区的DNA与多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列有效连接；或者如果核糖体结合位点的定位有利于翻译，则核糖体结合位点与编码序列有效连接。总的来讲，“有效连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，而在分泌前导区的情况下，是邻接的且是符合读相的(in reading phase)。然而，增强子不一定是邻接的。连接通过在合宜的限制位点连接而实现。如果这种位点不存在，则按常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头
本文所用表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，所有这类名称包括子代。因此，术语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞和由其得到的培养物而不论传递次数。还要理解的是，由于有意的或不经意的突变所致，所有子代的DNA内容物可能并不完全相同。包括了在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的突变型子代。虽然指定不同名称，但从上下文看将是清楚的。
本文所用“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中按照例如美国专利号4,683,195中所述扩增极少量的核酸、RNA和/或DNA的特定片段的方法或技术。一般目标区末端或以外的序列信息必须是可得的，使得可设计寡核苷酸引物；这些引物可与待扩增模板的相反链的序列相同或相似。2个引物的5′端核苷酸可与扩增材料的末端一致。可采用PCR扩增特定的RNA序列、来自全基因组DNA的特定DNA序列和自细胞总RNA、噬菌体或质粒序列转录的cDNA等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich主编(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y)。本文所用PCR被视为是一个(但不是唯一的)用于扩增核酸试验样品的核酸聚合酶反应方法的实例，该方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶以扩增或产生特定的核酸片段。
本文所用术语“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用任何合适来源的未重排的免疫球蛋白。
“抑制剂”和“拮抗剂”或“活化物”和“激动剂”分别是指抑制或活化分子，例如用于例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的活化。例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性可因其调节性质被活化、抑制或者改变。调节剂可单独起作用，或者可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。抑制剂是降低、阻断、防止、延迟活化、钝化、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。活化物是提高、活化、利于、促进活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂还可定义为降低、阻断或钝化组成型活性的化合物。“激动剂”是与靶标相互作用引起或促进靶标活化增加的化合物。“拮抗剂”是对抗激动剂的作用的化合物。拮抗剂防止、降低、抑制或中和激动剂的活性。甚至在没有已鉴定的激动剂的情况下，拮抗剂还可防止、抑制或降低靶标(例如靶受体)的组成型活性。在BTLA的情况下，BTLA激动剂可启动和增强BTLA递送给B细胞和T细胞的负信号。另一方面，BTLA拮抗剂可阻断对B细胞和T细胞的信号转导，因此增加B细胞和T细胞活化/增殖。
为了检查抑制程度，将例如包含给定蛋白质、基因、细胞或生物体的样品或实验物用潜在活化物或抑制剂处理，并与无抑制剂的对照样品进行比较。将对照样品(即未用拮抗剂处理的样品)的相对活性值指定为100％。当活性值相对于对照为以下值时便达到抑制：约90％以下、通常85％以下、更通常80％以下、最通常75％以下、普遍70％以下、更普遍65％以下、最普遍60％以下、通常55％以下、通常50％以下、更常45％以下、最常40％以下、优选35％以下、更优选30％以下、甚至更优选25％以下、最优选小于25％。当活性值相对于对照为以下较高值时便达到活化：约110％、普遍至少120％、更普遍至少140％、更普遍至少160％、时常至少180％、更时常至少2倍、最时常至少2.5倍、通常至少5倍、更常为至少10倍、优选至少20倍、更优选至少40倍和最优选超过40倍。
可如下监测活化或抑制中的终点。可通过终点监测例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人受试者的活化、抑制和对治疗的反应。终点可包括例如炎症迹象、致肿瘤性或细胞脱粒或分泌(例如细胞因子、毒性氧或蛋白酶的释放)的预定量或百分比。终点可包括例如预定量的离子流出或转运、细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖、转移潜力、细胞分化以及表型的改变，例如与炎症、细胞凋亡、转化、细胞周期或转移有关的基因表达的改变(参见例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood和Cheresh(2002)Nature Rev.Cancer 2：91-100；Timme等(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins和Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady和Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer等(2001)Glia36：235-243；Stanimirovic和Satoh(2000)Brain Pathol.10：113-126)。
抑制的终点一般是对照的75％以下，优选对照的50％以下，更优选对照的25％以下，最优选对照的10％以下。活化的终点一般为对照的至少150％，优选至少2倍于对照，更优选至少4倍于对照，最优选至少10倍于对照。
“配体”是指例如可用作受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽和膜缔合或膜结合分子或其复合物。“配体”还包括不是激动剂或拮抗剂但可与受体结合的物质。此外，“配体”包括例如通过化学或重组方法改变成膜结合配体的可溶性形式的膜结合配体。按惯例，如果配体在第一细胞上是膜结合的，则受体通常出现在第二细胞上。第二细胞可具有与第一细胞相同或不同的特性。配体或受体可以是完全胞内的，也就是说，它可存在于细胞溶胶、核或某些其它胞内区室中。配体或受体可改变其位置，例如从胞内区室变到质膜的外表面。配体和受体的复合物称为“配体受体复合物”。如果配体和受体参与信号转导途径，则配体出现在信号转导途径的上游位置，而受体出现在下游位置。HVEM是TNF受体超家族成员。除与BTLA结合以外，其还可与LIGHT、LTα和CD160结合。
“小分子”定义为分子量小于10kDa、通常小于2kDa、优选小于1kDa、最优选小于约500Da的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗药，与大分子相比，小分子可以是更易透过细胞、较不易降解和较不易诱导免疫应答。已对小分子例如抗体的肽模拟物和细胞因子以及小分子毒素进行了描述(参见例如Casset等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.307：198-205；Muyldermans(2001)J.Biotechnol.74：277-302；Li(2000)Nat.Biotechnol.18：1251-1256；Apostolopoulos等(2002)Curr.Med.Chem.9：411-420；Monfardini等(2002)Curr.Pharm.Des.8：2185-2199；Domingues等(1999)Nat.Struct.Biol.6：652-656；Sato和Sone(2003)Biochem.J.371：603-608；授权与Stewart等人的美国专利号6,326,482)。
提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时的“特异性”或“选择性”结合，是指确定异质蛋白质群和其它生物制剂中蛋白质存在的结合反应。因此，在指定条件下，具体配体与特定受体结合，而不以显著的量与样品中存在的其它蛋白质结合。预期方法的抗体或由抗体的抗原结合部位衍生的结合化合物与其抗原或其变体或突变蛋白结合，其亲和力比与任何其它抗原的亲和力高，为至少2倍、优选至少10倍、更优选至少20倍、最优选至少100倍。
本文所用术语“免疫调节剂”是指抑制或调节免疫应答的天然或合成的作用剂。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。
本文所用“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制药”是用于免疫抑制治疗以抑制或防止免疫***活性的治疗药。在临床上它们用于防止移植器官和组织(例如骨髓、心脏、肾、肝)排斥和/或用于以下疾病的治疗：自身免疫病或很可能是自身免疫起因的疾病(例如类风湿性关节炎、重症肌无力、***性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、多发性硬化)。免疫抑制药可分为：糖皮质激素；细胞抑制剂；抗体；生物反应修饰剂，例如Ig融合蛋白，包括CTLA-4/Ig(AbataceptTM)；作用于抑免蛋白的药物；其它药物，包括用于治疗增殖性病症的已知化疗药物，例如霉酚酸吗乙酯(MMF)。特别是对于多发性硬化，本发明的抗体可与称为copaxone的一类新的髓磷脂结合蛋白样治疗药联合给予。
“抗炎剂”或“抗炎药”是指甾体治疗药和非甾体治疗药两者。甾体，亦称为皮质甾类，是非常像皮质醇(一种由肾上腺天然产生的激素)的药物。甾体用作某些炎性病况例如***性血管炎(血管炎症)和肌炎(肌肉炎症)的主要治疗。还可选择性使用甾体以治疗炎性病况，例如：类风湿性关节炎(身体两侧关节内发生的慢性炎性关节炎)；***性红斑狼疮(因免疫***功能异常引起的全身性疾病)；斯耶格伦综合征(引起眼干和口干的慢性病症)。
非甾体抗炎药，通常缩写为NSAID，是具有镇痛、解热和抗炎作用的药物—它们减轻疼痛、发热和炎症。使用术语“非甾体”将这些药物与(除多种其它作用以外)具有类似的降类二十烷酸、抗炎作用的甾体区分开来。NSAID一般适用于以下病况的症状缓解：类风湿性关节炎；骨关节炎；炎性关节病(例如强直性脊柱炎、银屑病关节炎、赖特综合征(Reiter′s syndrome))；急性痛风；痛经；转移性骨疼痛；头痛和偏头痛；术后疼痛；因炎症和组织损伤所致的轻度-中度疼痛；发热和肾绞痛。NSAID包括水杨酸酯、芳基烷酸类(arlyalknoic acid)、2-芳基丙酸(洛芬)、N-芳基氨茴酸(芬那酸)、昔康、昔布和磺苯胺。
可给予缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)，时常与NSAID联用。普遍处方使用的DMARD包括羟氯喹/氯喹、甲氨蝶呤、金疗法、柳氮磺吡啶和硫唑嘌呤。
“信号转导途径”是指在信号从细胞的一个部分传递到细胞的另一个部分中起作用的各种信号转导分子间的生化关系。本文所用表述“细胞表面受体”包括例如能够接收信号和跨细胞质膜传递这种信号的分子和分子复合物。本公开内容的“细胞表面受体”的实例是BTLA受体。
人BTLA特异性抗体
本发明总的来讲涉及与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段和这类抗体或其抗原结合片段的用途。更具体而言，本发明提供分离的完全人抗BTLA抗体以及这些抗体或其抗原结合片段在疾病治疗中的应用方法。完全人抗BTLA抗体的实例包括但不限于：HuMab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7和hu Mab4C7。
本发明提供分离的抗BTLA激动剂抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段具有一种或多种下列性质：(1)不阻断HVEM或LIGHT与人BTLA结合；(2)与食蟹猴BTLA交叉反应；(3)在蛋白质结合测定(例如Biacore)中与人BTLA结合的KD为至多约2.5x10-9；和(4)在T细胞和B细胞活化测定中的EC50为至少约10nM。在一个实施方案中，在蛋白质结合测定(例如Biacore；实施例2-3)中，抗BTLA抗体或其抗原结合片段与人BTLA结合的KD为至多约2.5x10-9，在T细胞和B细胞活化测定中的EC50为约10-100nM。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是阻断HVEM与BTLA结合的分离的完全人抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，这种抗体的实例包括但不限于完全人抗BTLA抗体hu Mab4C7。
与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段可包含本发明所述抗体和抗原结合片段的1、2、3、4、5或6个互补决定区(CDR)。1、2、3、4、5或6个CDR可独立选自本发明的抗体和抗原结合片段的所述CDR序列(例如表1，表2)。或者，1、2、3、4、5或6个CDR可选自本发明的单个所述抗体或抗原结合片段的CDR序列。在某些实施方案中，1、2或3个CDR选自所述激动剂抗体的VL CDR(例如表1；SEQ ID NO：12-14)和/或1、2或3个CDR选自所述发明的VH CDR(例如表2；SEQ ID NO：5-7)。在另一个实施方案中，1、2或3个CDR选自所述拮抗剂抗体的VL CDR(例如表1；SEQ ID NO：26-28)和/或1、2或3个CDR选自所述发明的VH CDR(例如表2；SEQ ID NO：19-21)。
与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段可包含至少一个抗体轻链可变(VL)结构域，其包含一个或多个选自以下的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3：(a)抗体hu Mab8D5可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(b)抗体hu Mab8A3可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(c)抗体hu Mab21H6可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和(d)抗体hu Mab19A7可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段可包含至少一个抗体重链可变(VH)结构域，其包含一个或多个选自以下的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3：(a)抗体hu Mab8D5可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；(b)抗体hu Mab8A3可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；(c)抗体hu Mab21H6可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(d)抗体hu Mab19A7可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一个优选的实施方案中，与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段包含至少一个抗体轻链可变(VL)结构域和至少一个抗体重链可变(VH)结构域，所述抗体轻链可变(VL)结构域包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：(a)抗体hu Mab8D5可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(b)抗体hu Mab8A3可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(c)抗体hu Mab21H6可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和(d)抗体hu Mab19A7可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；而所述抗体重链可变(VH)结构域包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：(a)抗体hu Mab8D5可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；(b)抗体hu Mab8A3可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；(c)抗体hu Mab21H6可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(d)抗体hu Mab19A7可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
本发明抗体轻链和重链CDR的序列分别见表1和表2。通过举例而非限制，激动剂抗体的VL结构域CDR选自SEQ ID NO：12-14，而拮抗剂抗体的VL结构域CDR选自SEQ ID NO：26-28。同样，激动剂抗体的VH结构域CDR选自SEQ ID NO：7-9，而拮抗剂抗体的VH结构域CDR选自SEQ ID NO：10-12。
表1：轻链CDR
  抗体  CDR1  CDR2  CDR3
  8D5(激动剂) (SEQ ID NO：12) (SEQ ID NO：13) (SEQ ID NO：14)
  4C7(拮抗剂) (SEQ ID NO：26，VK) (SEQ ID NO：27，VK) (SEQ ID NO：28，VK)
表2：重链CDR
  抗体  CDR1  CDR2  CDR3
  8D5(激动剂) (SEQ ID NO：5) (SEQ ID NO：6) (SEQ ID NO：7)
  4C7(拮抗剂) (SEQ ID NO：19) (SEQ ID NO：20) (SEQ ID NO：21)
本发明还提供与BTLA结合、起激动剂抗体作用并包含抗体HuMab8D5的成熟VL结构域(SEQ ID No：18)的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。优选的完全人激动剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab8D5、huMab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7及其抗原结合片段。
本发明还提供与BTLA结合、起拮抗剂作用并包含抗体HuMab4C7的成熟VL结构域(SEQ ID NO：32)的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。优选的完全人拮抗剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab4C7及其抗原结合片段。
本发明还提供与BTLA结合、起激动剂作用并包含选自(a)抗体Hu Mab8D5的成熟VH结构域(SEQ ID NO：11)的至少一个VH结构域的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人单克隆激动剂抗BTLA抗体。优选的完全人激动剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7及其抗原结合片段。
本发明还提供与BTLA结合、起拮抗剂作用和包含选自(a)抗体hu Mab4C7的成熟VH结构域(SEQ ID NO：25)的至少一个VH结构域的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人拮抗剂抗BTLA抗体。优选的完全人拮抗剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab4C7及其抗原结合片段。
本发明提供与BTLA结合并且具有选自SEQ ID NO：12、13和14的至少一个VL结构域和选自SEQ ID NO：5、6和7的至少一个VH结构域的分离激动剂抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人激动剂抗BTLA抗体。优选的完全人激动剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、huMab19A7及其抗原结合片段。
本发明提供与BTLA结合并具有选自SEQ ID NO：26、27、28的至少一个VL结构域和选自SEQ ID NO：19、20和21的至少一个VH结构域的分离拮抗剂抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人拮抗剂抗BTLA抗体。优选的完全人拮抗剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab4C7及其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明的分离抗体包含重链恒定区，优选人恒定区，例如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，结合化合物包含轻链恒定区，优选人轻链恒定区，例如λ或κ人轻链区或其变体。通过举例而非限制，人重链恒定区可为γ1，人轻链恒定区可为κ。在一个备选的实施方案中，抗体的Fc区是具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman，J等，Mol.Immunol.38：1-8，2001)。
在一个实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)2和双抗体。
本发明还提供包含本发明抗体的VL结构域(例如SEQ ID NO：16、18、30、32、37和38)的分离多肽和包含本发明抗体的VH结构域(例如SEQ ID NO：9、11、23和25)的分离多肽。在一个实施方案中，本发明提供与BTLA结合并具有至少95％、90％、85％、80％、75％或50％序列同源的VL结构域VH结构域的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或以上的保守或非保守氨基酸取代，同时仍具有所需结合性质的VL和VH结构域(含或不含信号序列)。
“保守修饰变体”或“保守取代”是指蛋白质中的氨基酸被具有相似性质(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得在不改变蛋白质的生物活性的情况下可频繁进行变化。本领域技术人员认识到，多肽非必要区的单个氨基酸取代一般不会显著改变生物活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biologyof the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版))。另外，结构或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。本发明各种实施方案的结合化合物包含具有下述序列的多肽链：与本文公开的具体氨基酸序列(例如SEQ ID NO：5、6、7、9、11、12、13、14、16、18、19、20、21、23、25、30、32和37)比较时，其包括至多0(无变化)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或更多个保守氨基酸取代。本文所用表述“至多X个”保守氨基酸取代包括0个取代和取代至多X的任何数目并包括X个取代的取代。这种示例性取代优选按照下列表3给出的取代进行：
表3
示例性保守氨基酸取代
  原始残基   保守取代
  Ala(A)   Gly；Ser
  Arg(R)   Lys；His
  Asn(N)   Gln；His
  Asp(D)   Glu；Asn
  原始残基   保守取代
  Cys(C)   Ser；Ala
  Gln(Q)   Asn
  Glu(E)   Asp；Gln
  Gly(G)   Ala
  His(H)   Asn；Gln
  Ile(I)   Leu；Val
  Leu(L)   Ile；Val
  Lys(K)   Arg；His
  Met(M)  Leu；Ile；Tyr
  Phe(F)  Tyr；Met；Leu
  Pro(P)   Ala
  Ser(S)   Thr
  Thr(T)   Ser
  Trp(W)   Tyr；Phe
  Tyr(Y)   Trp；Phe
  Val(V)   Ile；Leu
本发明还预期了本发明抗体的功能保守变体。“功能保守变体”是其中蛋白质或酶中的一个或多个氨基酸残基在不改变多肽的整体构象和功能的情况下发生改变的变体，包括但绝不限于氨基酸被具有类似性质的氨基酸置换。
氨基酸取代
本发明还提供包含本发明的激动剂BTLA抗体的VL结构域(例如SEQ ID NO：16和18)的分离多肽和包含激动剂BTLA抗体的VH结构域(例如SEQ ID NO：9和11)的分离多肽，其具有至多0、1、2、3、4或5个或更多个氨基酸取代，同时仍具有与BTLA结合的能力。
在其它实施方案中，本发明提供包含本发明的拮抗剂BTLA抗体的VL结构域(例如SEQ ID NO：30或32)的分离多肽和包含拮抗剂BTLA抗体的VH结构域(例如SEQ ID NO：23或25)的分离多肽，其具有至多0、1、2、3、4或5个或更多个氨基酸取代，同时仍具有与BTLA结合的能力。
在另一个实施方案中，本发明提供与人BTLA结合并具有VL结构域VH结构域的抗体或其抗原结合片段，所述VL结构域VH结构域与本文所述一个或多个VL结构域或VH结构域有至少95％、90％、85％、80％、75％或50％序列同源性，并与人BTLA结合。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含具有至多0、1、2、3、4或5个或更多个氨基酸取代并与人BTLA结合的VL和VH结构域(含或不含信号序列)。
在某些实施方案中，合意的是如下将含有暴露侧链的某些氨基酸改变成其它氨基酸残基从而为最终抗体提供较大的化学稳定性。例如，可将天冬酰胺(Asn)残基变成Gln或Ala以降低在CDR的任何Asn-Gly序列处形成异天冬氨酸的可能性。类似的问题可出现在Asp-Gly序列处。参见Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。异天冬氨酸形成可削弱或完全破坏抗体与靶抗原结合。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731第734页。在一个实施方案中，将天冬酰胺变成谷氨酰胺(Gln)。还可能合意的是改变天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基附近的氨基酸以降低脱酰胺的可能性，当在天冬酰胺或谷氨酰胺附近出现小氨基酸时，以较高比率发生脱酰胺。参见Bischoff和Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。另外，可将CDR的任何甲硫氨酸残基(通常为暴露于溶剂的Met)变成Lys、Leu、Ala或Phe，以降低甲硫氨酸的硫氧化的可能性，这种氧化可降低抗原结合亲和力，还有助于最终抗体制备物中的分子异质性(出处同上)。在一个实施方案中，将甲硫氨酸变成丙氨酸(Ala)。另外，为了防止可能易断裂的Asn-Pro肽键或使之减至最少，可能合意的是将存在于CDR中的任何Asn-Pro组合变为Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有这种取代的抗体以确保取代不降低BTLA结合亲和力或其它所需生物活性至不可接受的水平。
表4.示例性的稳定CDR变体
Figure BPA00001531276100421
8D5VH的示例性CDR变体包括：
CDR1：SYDMH(SEQ ID NO：5)
CDR1变体SYDXH＝其中X为M、K、L、A或F(SEQ ID NO：38)
CDR3：EGMAAHNYYGMDV(SEQ ID NO：7)
CDR3变体EGX1AAHX2YYGX1DV＝其中X1为M、K、L、A或F；X2为N、Q或A(SEQ ID NO：39)
在任何组合中可独立地选择VH CDR的X变化。
8D5VL的示例性CDR变体包括：
CDR2：DASNRAT(SEQ ID NO：13)
CDR2变体：DASXRAT＝其中X为Q或(SEQ ID NO：40)
CDR3：QQRSNWPPIT(SEQ ID NO：14)
CDR3变体：QQRSXWPPIT＝其中X为Q或A(SEQ ID NO：41)
在任何组合中可独立选择VL CDR的X变化。另外，可在任何组合中独立选择本文所述的任何X变化，只要保持所需活性或结合能力即可。
4C7VH的示例性CDR变体包括：
CDR2：YIYYSGSTKYNPSLKS(SEQ ID NO：20)
CDR2变体：YIYYSGSTKYX1X2SLKS＝其中X1X2为N-P、Q-P、A-P或N-A(SEQ ID NO：42)
CDR3：EWPYYYYEMDV(SEQ ID NO：21)
CDR3变体：EWPYYYYEXDV＝其中X为M、K、L、A或F(SEQID NO：43)
可在任何组合中独立地选择VH CDR的X变化。
贯穿说明书和权利要求书所用术语“基本由……组成”或变体，表示包括任何所列举的要素或要素组，并任选包括与所列举的要素相比性质相似或不同的其它要素，其不会在很大程度上改变具体剂量方案、方法或组合物的基本性质或新的性质。作为非限制性实例，基本由所述氨基酸序列组成的结合化合物还可包括不会在很大程度上影响结合化合物的性质的一个或多个氨基酸。
核酸杂交背景
本发明包括抗BTLA抗体和其片段，例如由表1-2所述核酸编码的抗BTLA抗体和其片段，或编码表4所述氨基酸残基的抗BTLA抗体和其片段，以及与之杂交的核酸。优选核酸在低严格性条件下杂交，更优选在中等严格性条件下杂交，最优选在高严格性条件下杂交，并且优选具有BTLA结合活性。当核酸分子的单链形式可与其它核酸分子在适当的温度和溶液离子强度条件下退火时，核酸分子与另一核酸分子(例如cDNA、基因组DNA或RNA)是“可杂交的”(参见Sambrook等，同上)。温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。典型的低严格性杂交条件包括55℃、5X SSC、0.1％SDS且无甲酰胺；或42℃下的30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。典型的中等严格性杂交条件类似于低严格性条件，只是杂交在40％甲酰胺、5X或6X SSC和0.1％SDS中于42℃下进行。高严格性杂交条件类似于低严格性条件，只是杂交条件在50％甲酰胺、5X或6X SSC中于42℃下进行，或者任选在较高温度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下进行。SSC一般为0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。杂交需要两个核酸含有互补序列，但是这取决于杂交的严格性，碱基间的错配是可能的。核酸杂交的适当严格性取决于核酸长度和互补程度这些本领域周知的变量。两个核苷酸序列间相似性或同源性的程度越高，核酸可杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂合体，已推导出计算解链温度的方程式(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于与较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
还包括在本发明中的有包含核苷酸序列的核酸和包含氨基酸序列的多肽，在通过BLAST算法进行比较时，所述核苷酸序列和氨基酸序列与参比核苷酸和氨基酸序列有至少约70％同一性、优选至少约80％同一性、更优选至少约90％同一性、最优选至少约95％同一性(例如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选择该算法的参数以在相应参比序列全长内的相应序列之间得到最大匹配。还包括在本发明中的有包含氨基酸序列的多肽，所述氨酸酸序列在通过BLAST算法进行比较时，与任何参比氨基酸序列有至少约70％相似性，优选至少约80％相似性，更优选至少约90％相似性和最优选至少约95％相似性(例如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选择该算法的参数以在相应参比序列全长内的相应序列之间得到最大匹配。
序列同一性是指进行比较的2个序列的核苷酸或氨基酸之间的严格匹配。序列相似性是指进行比较的2个多肽的氨基酸之间的严格匹配以及不相同的生物化学上相关的氨基酸之间的匹配。上文论述了具有相似性质并可互换的生物化学上相关的氨基酸。
下列有关BLAST算法的参考文献是有用的：BLASTALGORITHMS：Altschul，S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.等(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton，J.C.等(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock，J.M.等(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS：Dayhoff，M.O.等，″A model of evolutionary change in proteins(蛋白质中进化改变的模型)″，载于Atlas of Protein Sequence and Structure，(1978)，第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(主编)，第345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Schwartz，R.M.等，″Matrices fordetecting distant relationships(检测远缘关系的矩阵)″，载于Atlas ofProtein Sequence and Structure，(1978)，第5卷，增刊3.″M.O.Dayhoff(主编)，第353-358页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Altschul，S.F.，(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States，D.J.等(1991)Methods 3：66-70；Henikoff，S.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919；Altschul，S.F.等(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；ALIGNMENT STATISTICS：Karlin，S.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin，S.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877；Dembo，A.等(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；以及Altschul，S.F.″Evaluating the statistical significance of multiple distinctlocal alignments(多个截然不同的局部比对的统计显著性评价)″，载于Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai主编)，(1997)第1-14页，Plenum，New York。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离核酸，例如DNA，其编码本发明的分离抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，分离核酸编码包含至少一个成熟抗体轻链可变(VL)结构域和至少一个成熟抗体重链可变(VH)结构域的激动剂抗体或其抗原结合片段，其中VL结构域包含至少3个具有选自SEQ ID NO：12-14的序列的CDR，VH结构域包含至少3个具有选自SEQ ID NO：5-7的序列的CDR。在一个实施方案中，分离核酸分别编码SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：11的成熟轻链和重链可变区序列。在一些实施方案中，分离核酸编码单个核酸分子上的轻链和重链两者，而在其它实施方案中，在两个或更多个独立核酸分子上编码轻链和重链。在另一个实施方案中，核酸还编码信号序列。
本发明还提供包含本发明的分离核酸的表达载体，其中核酸与调控序列有效连接，所述调控序列在宿主细胞用载体转染时被宿主细胞识别。还提供包含本发明的表达载体的宿主细胞。本发明还涉及产生本发明的结合化合物的方法，所述方法包括将带有编码结合化合物的表达载体的宿主细胞在培养基中培养，并从宿主细胞或培养基中分离结合化合物。
本发明还涉及与抗体hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6或hu Mab19A7(即激动剂抗体)或hu Mab4C7(即阻断与HVEM结合的拮抗剂抗体)一样结合人BTLA上的相同表位的抗体或其抗原结合片段，例如能够交叉阻断任何本发明抗体的结合的抗体。
通过举例而非限制，本发明的完全人抗体与人BTLA结合的KD值不超过约100nM(1x10-7M)；优选不超过约10nM；更优选不超过约1nM。甚至更优选的实施方案中，抗体的KD值不超过约200pM(2x10-10M)、100pM、50pM、20pM、10pM、5pM或甚至2pM。
可采用用于产生抗体的任何合适方法来产生本发明的抗体。任何合适形式的人BTLA都可用作产生抗体的免疫原(抗原)。通过举例而非限制，任何人BTLA同种型或其片段都可用作免疫原。实例包括但不限于本文所述的人BTLA的同种型和剪接变体。在一个备选的实施方案中，猕猴BTLA可用作产生抗体的免疫原。
在一个优选的实施方案中，使用携带人免疫***而非小鼠***的组成部分的转基因小鼠，产生针对BTLA的完全人单克隆抗体。这些转基因小鼠(本文亦可称为“HuMAb”小鼠)含有人免疫球蛋白基因微小基因座(miniloci)以及使内源μ和κ链基因座钝化的靶向突变，所述微小基因座编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列(Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠的小鼠IgM或κ的表达降低，并且在响应免疫时，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述见Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.等(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；以及Harding，F.等(1995)Ann.N.Y Acad.Sci764：536-546)。HuMab小鼠的制备是本领域公知的，且描述于例如Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)JImmunol.152：2912-2920；Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Taylor，L.等(1994)InternationalImmunology 6：579-591；Lonberg，N.等(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷：65-93；Harding，F.等(1995)Ann.N.Y Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和Harding等(1995)Annals NY Acad.Sci.764：536-546。另参见美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、5,770,429和5,545,807以及国际专利申请公开号WO 98/24884、WO94/25585、WO 93/12227、WO 92/22645和WO 92/03918。
为了产生抗BTLA的完全人单克隆抗体，可按照Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和WO 98/24884所述，用抗原BTLA多肽优选SEQ ID NO：35的残基31-152免疫HuMab小鼠。优选小鼠在第一次免疫时可为6-16周龄。例如，可使用BTLA的纯化制备物经腹膜内和/或皮下免疫HuMab小鼠。也可用稳定转染有BTLA基因的完整HEK293或CHO细胞免疫小鼠。“抗原BTLA多肽”可指BTLA多肽或其任何片段，优选为优选在HuMab小鼠中诱导抗BTLA免疫应答的任何BTLA片段。
总的来讲，在最初腹膜内(IP)和/或皮下用MPL
Figure BPA00001531276100481
+TDM佐剂(Sigma，产品号M6536)中的抗原免疫，接着用MPL
Figure BPA00001531276100482
+TDM佐剂中的抗原每隔一周或每两周或三周IP免疫(通常至多共6次)时，HuMAb转基因小鼠应答良好。小鼠可先用表达BTLA的细胞(例如稳定转染的HEK293或CHO细胞)免疫，然后用BTLA的可溶性片段(例如SEQ IDNO：35的残基31-152)免疫，并持续接受两种抗原的交替免疫。可在免疫方案过程中，用通过眶后放血获得的血浆样品监测免疫应答。例如可通过ELISA，筛选血浆中存在的抗BTLA抗体，具有足够免疫球蛋白效价的小鼠可用于融合。处死和取出脾脏前4天，用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫。预期可能需要进行各抗原的2-3次融合。对于各抗原，可免疫几只小鼠。
产生单克隆完全人抗BTLA抗体的杂交瘤细胞可通过本领域公知的方法产生。这些方法包括但不限于最初由Kohler等(1975)(Nature256：495-497)研发的杂交瘤技术；以及三源杂交瘤技术(Hering等(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：211-216和Hagiwara等(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4：15)；人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)ImmunologyToday 4：72和Cote等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A80：2026-2030)；EBV-杂交瘤技术(Cole等，载于Monoclonal Antibodies  and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页，1985)；及采用CytoPulse大室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse large chamber cull fusionelectroporator)(Cyto Pulse Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)的基于电场的电融合。优选根据标准方案，分离出小鼠脾细胞，用PEG或通过电融合与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后可筛选产生抗原特异性抗体的所得杂交瘤。例如，在50％PEG的情况下，可将来源于免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。可将细胞以约2x 105个细胞/mL接种在平底微量滴定板中，接着在含有20％胎Clone Serum、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择培养基中孵育2周。2周后，可将细胞在HAT用HT替换的培养基中培养。然后可通过ELISA针对人抗BTLA单克隆IgG抗体筛选各孔。一旦出现大规模杂交瘤生长，通常可在10-14天后对培养基进行观察。分泌抗体的杂交瘤可再次接种、筛选，如果仍为人IgG阳性，则可通过有限稀释对抗BTLA单克隆抗体进行亚克隆至少两次。然后可体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。
还可重组产生本发明的抗BTLA抗体及其抗原结合片段(例如在上述大肠杆菌(E.coli)/T7表达***中)。在该实施方案中，可将编码本发明的抗体分子(例如VH或VL)的核酸***基于pET的质粒中，并在大肠杆菌/T7***中表达。有若干种本领域已知的产生重组抗体的方法。用于重组产生抗体的方法的一个实例公开于美国专利号4,816,567。可通过将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法进行转化。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中多核苷酸的包封、生物射弹注射和直接显微注射DNA至核中。另外，可通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞。转化细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。
还可通过美国专利号6,331,415中给出的任何方法合成抗BTLA抗体。
作为表达宿主可获得的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如Sf9细胞)、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。在将编码重链或抗原结合部分或其片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够的一段时间，以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中，来产生抗体。
可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可采用多种已知技术，提高本发明的抗体(或其中的其它部分)在生产细胞系中的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达***(GS***)是在某些条件下提高表达的通用方法。全部或部分结合欧洲专利号0 216 846、0256 055和0 323 997及欧洲专利申请号89303964.4，对GS***进行了论述。
很可能由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分，而不论抗体的糖基化如何。同样，在某些实施方案中，非岩藻糖基化抗体是有利的，因为它们通常在体外和体内具有比其岩藻糖基化对应物更强力的功效，并且不可能是免疫原性的，因为它们的糖结构是天然人血清IgG的正常组分。
本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群中获得的抗体，即组成群的各个抗体除可少量存在的可能的天然存在的突变以外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一抗原位点。单克隆抗体是有利的，因为可通过杂交瘤培养合成，基本上不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示属于基本均质的抗体群的抗体的特征，并且不得解释为需要通过任何特殊方法产生抗体。如上所述，用于本发明的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备。
多克隆抗体是在一种或多种其它不相同的抗体中或者在一种或多种其它不相同的抗体存在下产生的抗体。多克隆抗体一般在产生不相同抗体的若干其它B淋巴细胞存在下由B淋巴细胞产生。通常从免疫动物获得多克隆抗体。
双特异性或双功能抗体是具有2个不同的重链/轻链对和2个不同的结合部位的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过各种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如Songsivilai等(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321、Kostelny等(1992)J Immunol.148：1547-1553。另外，双特异性抗体可形成为“双抗体”(Holliger等(1993)PNAS USA 90：6444-6448)或形成为“Janusins”(Traunecker等(1991)EMBO J.10：3655-3659和Traunecker等(1992)Int.J.CancerSuppl.7：51-52)。
本发明包括“嵌合抗体”—一种包含与来源于另一种非人物种(例如小鼠、马、兔、狗、牛、鸡)的抗体区(例如恒定区)融合或嵌合的本发明的可变区的抗体。这些抗体可用来调节BTLA在非人物种中的表达或活性。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段具有抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。sFv多肽一般还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够使sFv形成用于抗原结合的所需结构。可对所述用于产生单链抗体的技术(美国专利号5,476,786、5,132,405和4,946,778)作改动以产生抗BTLA特异性单链抗体。有关sFv的综述参见Pluckthun载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，N.Y.，第269-315页(1994)。
“二硫键稳定化Fv片段”和“dsFv”是包含通过二硫桥连接的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的抗体分子。
本发明范围内的抗体片段还包括F(ab)2片段，其可由例如胃蛋白酶酶促切割IgG而产生。Fab片段可通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2而产生。Fab片段为通过二硫桥悬接在VH-CH1链上的VL-CL链。F(ab)2片段是继而通过2个二硫桥悬接的两个Fab片段。F(ab)2分子的Fab部分包括二硫桥位于其间的Fc区的部分。FV片段为VL或VH区。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类别。有至少5个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。
抗体工程
本发明的工程改造抗体包括已对VH和/或VL内的构架残基进行修饰以例如改进抗体的性质的抗体。通常进行这种构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是使一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体而言，经历体细胞突变的抗体可含有不同于从其得到该抗体的种系序列的构架残基。通过将抗体构架序列与从其得到抗体的种系序列进行比较，来鉴定这类残基。
例如，表A表示构架区氨基酸位置(采用Kabat编号***)不同于种系的区以及这种位置如何可通过指定取代而回复突变至种系：
Figure BPA00001531276100521
另一种类型的构架修饰包括使构架区内或甚至使一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以除去T细胞表位从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法亦称为“去免疫原性(deimmunization)”，更多详情参见美国专利公开号20030153043。
除了在构架区或CDR区内进行修饰以外或备选地，可对本发明抗体进行工程改造以包括Fc区内的修饰，通常为了改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半寿期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可对本发明的抗体进行化学修饰(例如可将一个或多个化学部分与抗体连接)或修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。下文更详细地描述了这些实施方案中的每一个。Fc区残基的编号是Kabat的EU索引的编号。
在一个优选的实施方案中，抗体是IgG4同种型抗体，其包括在对应于重链恒定区铰链区228位的位置上丝氨酸至脯氨酸的突变(S228P；EU索引)。据报道，这种突变消除了铰链区重链间二硫桥的异质性(Angal等，同上；241位以Kabat编号***为基础)。例如，在各种实施方案中，本发明的抗BTLA抗体可包含与人IgG4恒定区连接的8D5(SEQ ID NO：9或11)或4C7(SEQ ID NO：23或25)的重链可变区，其中与Angal等(同上)描述的241位相应的位置上的丝氨酸突变成脯氨酸。因此，对于与人IgG4恒定区连接的8D5和4C7重链可变区，这种突变相当于根据EU索引的S228P突变。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰使得铰链区中半胱氨酸残基数目改变，例如增加或降低。美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，以例如有利于轻链和重链的装配或者提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半寿期。更具体而言，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得抗体与天然Fc-铰链结构域SpA结合相比，葡萄球菌蛋白A(SpA)结合减少。美国专利号6,165,745中更详尽描述了这种方法。
在另一个实施方案中，对抗体进行修饰以延长其生物半寿期。各种方法均是可行的。例如，可引入一个或多个下列突变：T252L、T254S、T256F，参见美国专利号6,277,375。或者，为了延长生物半寿期，可在CH1或CL区内对抗体进行改变，以含有取自IgG Fc区CH2结构域的2个环的补救受体(salvage receptor)结合表位，参见美国专利号5,869,046和6,121,022。
在另外的其它实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可用不同的氨基酸残基置换，使得抗体对效应配体的亲和力改变，但保持亲代抗体的抗原结合能力。对其亲和力发生改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。美国专利号5,624,821和5,648,260中更详细地描述了这种方法。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可用不同的氨基酸残基置换，使得抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)减弱或消除。美国专利号6,194,551中更详细地描述了这种方法。
在另一个实例中，氨基酸231和239位的一个或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体结合补体的能力。PCT公开号WO 94/29351进一步描述了这种方法。
在又一个实例中，通过修饰一个或多个下列位置上的氨基酸对Fc区进行修饰，以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。PCT公开号WO 00/42072中进一步描述了这种方法。此外，已绘制人IgG1上对于FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合部位的图谱，并且描述了具有改进结合的变体(参见Shields等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。256、290、298、333、334和339位上的特定突变表明改进与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体表明改进FcγRIII结合：T256a/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在再一个实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可制备非糖基化抗体(即抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现这种糖修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区构架糖基化位点的剔除，从而消除在该位点上的糖基化。这种非糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
另外或备选地，可制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基数量减少的低岩藻糖基化抗体或平分型GlcNac结构增加的抗体。已证实这类糖基化形式的改变提高抗体的ADCC能力。可通过例如在糖基化机制发生改变的宿主细胞中表达抗体来实现这类糖修饰。本领域已描述了糖基化机制改变的细胞，且其可用作表达本发明的重组抗体从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺乏岩藻糖。通过使用2个置换载体定向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol Bioeng87：614-22)。作为另一个实例，EP 1,176,195描述了具有功能受破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在这类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α-1，6键-相关酶而具有低岩藻糖基化。EP1,176,195还描述了具有将岩藻糖添加至结合抗体Fc区的N-乙酰氨基葡萄糖上的低酶活性或不具酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开号WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其将岩藻糖与Asn(297)连接糖连接的能力降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(另参见Shields等(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。还可在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化特征的抗体，参见PCT公开号WO 06/089231。或者，可在植物细胞中产生具有修饰糖基化特征的抗体，例如浮萍(Lemna)(美国专利7,632,983)。用于在植物***中产生抗体的方法公开于美国专利6,998,267和7,388,081。PCT公开号WO 99/54342描述了经工程改造表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程改造细胞系中表达的抗体的平分型GlcNac结构增加，这导致了抗体的ADCC活性提高(另参见Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶切下抗体的岩藻糖残基；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖基残基(Tarentino等(1975)Biochem.14：5516-23)。
本公开内容所预期的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可对抗体进行聚乙二醇化以例如延长抗体的生物(例如血清)半寿期。为了使抗体聚乙二醇化，通常在使一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选通过酰化反应或烷化反应用反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)进行聚乙二醇化。本文所用术语“聚乙二醇”意指包括已用于衍生其它蛋白质的任何PEG形式，例如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是非糖基化抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可应用于本发明的抗体。参见例如EP 0 154316和EP 0 401 384。
抗体物理性质
本公开内容的抗体可通过其各种物理性质来表征，以检测和/或区分其不同类别。
本公开内容的抗体在轻链可变区或重链可变区中可含有一个或多个糖基化位点。这种糖基化位点可因抗原结合改变而引起抗体的免疫原性提高或抗体的pK改变(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem41：673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology12：43R-56R；Parekh等(1985)Nature316：452-7；Mimura等(2000)MolImmunol 37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。在某些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗BTLA抗体。这可通过选择在可变区中不含糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变来实现。
在一个优选的实施方案中，本公开内容的抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可发生于N-G或D-G序列，并且导致将扭结引入多肽链并降低其稳定性的异天冬氨酸残基的产生(异天冬氨酸效应)。
各种抗体可具有独特的等电点(pI)，其通常落入6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落入7-9.5的pH范围内，IgG4抗体的pI通常落入6-8的pH范围内。有推测认为具有正常范围以外的pI的抗体在体内条件下可能有些解折叠和不稳定。因此，优选具有pI值落入正常范围的抗BTLA抗体。这可通过选择pI在正常范围内的抗体或通过使带电荷的表面残基突变来实现。
各种抗体可具有特有的解链温度，解链温度越高，表明体内整体稳定性越大(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr PharmBiotechnol 3：361-71)。一般优选TM1(最初解折叠的温度)大于60℃，优选大于65℃，甚至更优选大于70℃。可采用差示扫描量热法(Chen等(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等(1999)Immunol Lett68：47-52)或圆二色性(Murray等(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)测量抗体的熔点。
在一个优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。可使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander AJ和Hughes DE(1995)AnalChem 67：3626-32)测量抗体的降解。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体，聚集效应可导致触发不需要的免疫应答和/或改变或者不利的药代动力学性质。具有以下聚集的抗体一般是可接受的：25％以下、优选20％以下、甚至更优选15％以下、甚至更优选10％以下和甚至更优选5％以下。可通过包括大小排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射在内的若干技术测量聚集。
抗体缀合物
还可将本发明的抗BTLA抗体分子与化学部分缀合。化学部分尤其可以是聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。优选化学部分是延长抗体分子在受试者体内的半寿期的聚合物。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)公开了使抗体与连接放射性金属螯合剂(radiometal chelator)(二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))的PEG缀合。
本发明的抗体和抗体片段还可与以下标记缀合：例如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th和40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。
本发明的抗体和抗体片段还可与包括以下在内的荧光或化学发光标记缀合：荧光团例如稀土元素螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹酰、伞形酮、萤光素、鲁米那标记、异鲁米那标记、芳族吖啶
Figure BPA00001531276100581
酯标记、咪唑标记、吖啶
Figure BPA00001531276100582
盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2，3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记和稳定的游离基。
抗体分子还可与以下细胞毒性因子缀合：例如白喉毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白和化合物(例如脂肪酸)、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜(momordicacharantia)抑制蛋白、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(saponariaofficinalis)抑制蛋白、曲霉丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。
可采用用于使本发明的抗体分子与各种部分缀合的本领域已知的任何方法，包括以下文献描述的方法：Hunter等(1962)Nature144：945；David等(1974)Biochemistry 13：1014；Pain等(1981)J.Immunol.Meth.40：219；以及Nygren，J.，(1982)Histochem.andCytochem.30：407。用于缀合抗体的方法是本领域常规的并且是周知的。
在另外的其它实施方案中，可将不同恒定结构域悬接至来源于本文提供的CDR的人源化VL和VH区上。例如，如果特别计划使用的本发明抗体(或片段)需要经改变的效应子功能，则可使用不是IgG1的重链恒定结构域，或者可利用杂交IgG1/IgG4。
虽然IgG1抗体提供长的半寿期并提供效应子功能，例如补体活化和抗体依赖性细胞毒性，但是这种活性可能不是抗体全部应用所需要的。在这种情况下，例如可使用IgG4恒定结构域。在hu Mab8D5中，IgG4恒定结构域在108位(相当于EU***的228位和KABAT***的241位)不同于天然人IgG4恒定结构域(Swiss-Prot登记号P01861.1)，其中为了防止可能干扰适当链间二硫键形成的Cys106和Cys109(相当于EU***的Cys 226和Cys 229位，以及KABAT***的Cys 239和Cys 242位)之间的潜在链间二硫键，将天然Ser108用Pro置换。参见Angal等(1993)Mol.Imunol.30：105。
对于hu Mab21H6、hu Mab8A3、hu Mab15C5、hu Mab19A7和hu Mab 20H4，表7中所述序列基于人重链IgG1。
疾病
本发明还提供用本发明的抗体或其抗原结合片段(优选完全人抗体)治疗需要用分离抗体或其抗原结合片段治疗的受试者(包括人受试者)的方法。这类受试者可患有炎性病症或自身免疫病症，例如炎性肠病症(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括变应性哮喘)、***反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病、眼色素层炎、移植物抗宿主病(GVHD)、青少年早发性I型糖尿病、移植排斥、SLE和斯耶格伦综合征。这种治疗方法还可包括给予一种或多种其它的治疗药物，例如免疫抑制剂或抗炎剂。通过举例而非限制，用本文所述方法治疗炎性肠病症。在一个特别优选的实施方案中，通过本文所述方法治疗克罗恩病和溃疡性结肠炎。
炎性肠病(IBD)
IBD是一组病症(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的名称，其中肠发炎，引起腹部痉挛和疼痛、腹泻、体重减轻和肠出血。IBD影响600,000多美国人。常规治疗选择包括柳氮磺吡啶、皮质甾类(例如***)、免疫***抑制剂例如硫唑嘌呤和巯基嘌呤或用于克罗恩病的抗生素(例如甲硝唑)。治疗性单克隆抗体治疗包括依那西普、那他珠单抗和英利昔单抗。
可使用本发明的抗BTLA抗体治疗需要这种治疗的受试者的IBD。本发明的抗BTLA抗体还可与IBD的其它治疗组合，例如IL-10(参见美国专利号5,368,854、7,052,686)、甾体和柳氮磺吡啶。
移植物抗宿主病(GVHD)
移植物抗宿主病(GVHD)是同种异体骨髓移植的常见并发症，其中移植骨髓中的功能性免疫细胞将接受者视为“外源”，并发动免疫攻击。在某些情况下，也会发生在输血中。3个标准通常与GVHD有关：
1)给予具有有活力的和功能性免疫细胞的免疫活性移植物；
2)接受者在免疫上完全不同—组织不相容的；和
3)接受者是无免疫应答的，因此不能破坏或钝化移植的细胞。
在骨髓移植后，在将宿主组织感知为抗原外源的之后，存在于移植物中的T细胞攻击移植接受者的组织。T细胞产生过量的细胞因子，包括TNFα和干扰素-γ(IFNg)。大量宿主抗原可引发移植物抗宿主病，其中有人白细胞抗原(HLA)。然而，甚至当HLA相同的同胞为供体时，也可发生移植物抗宿主病。HLA相同的同胞或HLA相同的无关供体时常具有在遗传上不同的蛋白质(即次要组织相容性抗原)，其可被MHC分子呈递给将这些抗原视为外源并因此发动免疫应答的接受者的T细胞。
预期BTLA激动剂抗体抑制与存在于接受者或宿主组织中的同种异体抗原(包括但不限于次要和主要组织相容性抗原)反应的移植的T细胞和B细胞的活化、增殖和效应子功能。预期通过这些移植物来源的T细胞和B细胞在细胞表面上表达BTLA而产生对它们的抑制。虽然不受理论的束缚，但是预期BTLA激动剂抗体通过‘强制参与’抑制致病性免疫应答。BTLA激动剂抗体可例如通过其它抑制性细胞(例如调节性T细胞)的活化，或通过对抗原呈递细胞的调节，间接抑制致病性免疫应答。预期BTLA激动剂抗体单独或与用于预防或治疗移植物抗宿主病症状的其它免疫抑制剂组合，来阻抑或抑制来源于移植物的淋巴细胞的抗宿主反应。
在又一个实施方案中，本发明还涉及治疗方法，所述方法包括给予治疗有效量的抗BTLA抗体或其抗原结合片段以及一种或多种其它的治疗药物。通过举例而非限制，一种或多种治疗药物包括抗IL-23、IL-1β、IL-6、TGF-β、CTLA4融合蛋白和小分子抗炎药，例如霉酚酸吗乙酯、甲氨蝶呤(参见例如Veldhoen(2006)Immunity 24：179-189；Dong(2006)Nat.Rev.Immunol.6(4)：329-333)或组合。在各种实施方案中，在抗BTLA抗体或其抗原结合片段之前、与之同时或之后给予一种或多种其它的治疗药物。
另外，在某些实施方案中，可与包括下列一种或多种的任何组合的用于治疗移植排斥的免疫抑制药组合给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段：
钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢素和他克莫司)，
mTOR抑制剂(例如西罗莫司和依维莫司)，
抗增殖药(例如硫唑嘌呤和霉酚酸)，
皮质甾类(例如***龙和氢化可的松)，
具有免疫抑制作用的抗体(例如单克隆抗IL-2Rα受体抗体，包括巴利昔单抗和达克珠单抗)，
以及多克隆抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和抗淋巴细胞球蛋白(ALG))。
本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物和制剂，其包含结合化合物和药学上可接受的载体或稀释剂及任选一种或多种免疫抑制剂或抗炎剂。
实验和诊断应用
本发明的抗体和片段可用作亲和纯化剂。在这种过程中，采用本领域众所周知的方法，将抗体或片段固定在诸如Sephadex树脂或滤纸等固相上。使固定化抗体或片段与含有待纯化的BTLA蛋白(或其片段)的样品接触，之后将支持体用合适的溶剂洗涤，该溶剂可除去样品中除了与固定化抗体或片段结合的BTLA蛋白外几乎所有的物质。最后，支持体用从柱(例如A蛋白)上洗脱结合的BTLA的溶剂洗涤。这种固定化抗体构成本发明的组成部分。
本发明还提供产生可用于例如进行蛋白质印迹和本文所述的其它免疫测定的第二抗体的抗原。具体而言，本发明包括包含可变区和/或CDR序列的多肽，其可用于产生抗BTLA或抗BTLA第二抗体。可检测标记的抗hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7、hu Mab4C7或抗Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7、hu Mab4C7第二抗体均落入本发明的范围。
抗BTLA抗体或其片段还可用于BTLA蛋白质的诊断测定，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。这种诊断方法可用于各种疾病诊断。
例如，本发明的实施方案包括并入了本发明的抗BTLA抗体或其片段应用的ELISA测定(酶联免疫吸附测定)。例如，在本发明的一个实施方案中，这样的方法包括下列步骤：
(a)用抗BTLA抗体或其抗原结合片段包覆基质(例如微量滴定板(例如塑料板)孔的表面)；
(b)将待测试BTLA存在情况的样品施加到基质上；
(c)洗涤板，使得去除样品中未结合的材料；
(d)加入同样对BTLA抗原有特异性的可检测标记的抗体(例如酶联抗体)；
(e)洗涤基质，使得去除未结合的标记抗体；
(f)如果标记抗体是酶联的，则加入被酶转化成荧光信号的化学物质；和
(g)检测标记抗体的存在。
在本发明的一个实施方案中，标记抗体用过氧化物酶标记，过氧化物酶与ABTS(例如2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应产生可检测的颜色变化。或者，标记抗体用可检测放射性同位素(例如3H)标记，放射性同位素可在闪烁体存在下通过闪烁计数器检测。本发明的抗BTLA抗体可用于蛋白质印迹或免疫蛋白质印迹方法。这样的方法构成本发明的组成部分，并包括例如：
(1)使待测试结合BTLA或其片段存在情况的膜或其它固体基质与本发明的抗BTLA抗体或其抗原结合片段接触。这种膜可呈硝酸纤维素或基于乙烯基的(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))膜的形式，在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳)凝胶中待测试BTLA存在情况的蛋白质被转移到该膜上(例如在凝胶中进行电泳分离后)。在使膜与抗BTLA抗体或片段接触前，膜任选用例如脱脂奶粉等封闭，以结合膜上的非特异性蛋白质结合部位。
(2)洗涤膜一次或多次以去除未结合的抗BTLA抗体或片段和其它未结合的物质；和
(3)检测结合的抗BTLA抗体或片段。
可通过使抗体或片段与可检测标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合，然后检测第二抗体的存在情况，来进行结合抗体或片段的检测。
本发明的抗BTLA抗体及其抗原结合片段还可用于免疫组织化学。这样的方法构成本发明的组成部分，并包括例如，(1)使待测试BTLA存在情况的细胞与本发明的抗BTLA抗体或其抗原结合片段接触；和(2)检测细胞上或细胞中的抗体或片段。
如果抗体或片段本身是可检测标记的，则可直接检测。或者，抗体或片段可被检测的可检测标记的第二抗体结合。
本发明的某些抗BTLA拮抗剂抗体及其抗原结合片段还可用于体内肿瘤成像。这样的方法构成本发明的组成部分，并可包括将放射性同位素标记的本发明的抗BTLA抗体或其抗原结合片段注射到待测试与BTLA表达相关的肿瘤的存在情况的患者体内，接着通过对患者身体的核成像，在例如包含高浓度的结合肿瘤的抗体或片段的基因座中检测标记抗体或片段的存在情况。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射型计算机断层成像)或PET成像(正电子发射断层成像)。标记包括例如碘-123(123I)和锝-99m(99mTc)，例如与SPECT成像或11C、13N、15O或18F联合，例如与PET成像或铟-111联合(参见例如Gordon等，(2005)International Rev.Neurobiol.67：385-440)。
药盒
本发明还提供呈药盒形式的包括本发明的联合药物的组分的药盒。本发明的药盒包括一种或多种组分，包括但不限于本文所述的与BTLA特异性结合的结合组合物(例如激动剂抗体hu Mab8D5、huMab8A3、hu Mab21H6或hu Mab19A7或者拮抗剂抗体hu Mab4C7)以及一种或多种其它组分，包括但不限于本文所述药学上可接受的载体和/或化疗药物。可将结合组合物和/或化疗药物配成纯的组合物或在药物组合物中与药学上可接受的载体组合。
在一个实施方案中，药盒包括在一个容器(例如无菌玻璃或塑料小瓶)中的本发明的结合组合物(例如激动剂抗体hu Mab8D5、huMab8A3、hu Mab21H6或hu Mab19A7，或者拮抗剂抗体hu Mab4C7)或其药物组合物以及在另一个容器(例如无菌玻璃或塑料小瓶)中的其药物组合物和/或化疗药物。
在本发明的另一个实施方案中，药盒包括本发明的联合药物，包括在单个公用容器中的结合组合物组分(例如激动剂抗体hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6或hu Mab19A7，或者拮抗剂抗体hu Mab4C7)连同药学上可接受的载体，任选与配制在一起的一种或多种化疗药物组分联合，任选在药物组合物中。
如果药盒包括用于胃肠外给予受试者的药物组合物，则药盒可包括进行这种给予的装置。例如，药盒可包括一个或多个皮下注射针或上述的其它注射装置。
药盒可包括药品说明书，其包括有关药盒中的药物组合物和剂型的信息。这类信息一般帮助患者和医师有效安全地使用所附药物组合物和剂型。例如，药品说明书中可提供有关本发明的联合药物的下列信息：药代动力学、药效学、临床研究、效果参数、适应证和用法、禁忌证、警告事项、预防措施、不良反应、过量使用、适当剂量和给药、供应规格、合适的贮存条件、参考、生产商/批发商信息和专利信息。
药物组合物和给药
为了制备本发明的抗huBTLA抗体的药物组合物或无菌组合物，将抗体与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。
可通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备以下形式的治疗剂和诊断剂的剂型：例如冻干粉、膏剂、水溶液剂或混悬剂(参见例如Hardman等(2001)Goodman and Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，NY；Avis等(主编)(1993)PharmaceuticalDosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：DisperseSystems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。在一个实施方案中，将本发明的抗BTLA抗体在乙酸钠溶液(pH 5-6)中稀释到适当浓度，加入NaCl或蔗糖以利渗透压。可加入其它物质(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)以提高稳定性。
可在细胞培养物或实验动物中，通过标准药学方法测定单独给予或与另一种物质组合给予的抗体组合物的毒性和治疗功效，例如测定LD50(50％群的致死剂量)和ED50(50％群的治疗有效剂量)。毒性作用和治疗作用的剂量比为治疗指数(LD50/ED50)。优选具有高治疗指数的抗体。获自这些细胞培养物测定和动物研究的数据可用于配制人用的多种剂量。这类化合物的剂量优选在循环浓度(包括几乎无毒性或无毒性的ED50)的范围内。剂量可在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和给药途径。
可以改变给药方式。合适的给药途径包括口服、直肠、经粘膜或肠给予；胃肠外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。给药还可以各种常规方式进行，例如口服摄入、吸入、吹入、局部施用或皮肤、经皮、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。优选静脉内给予患者。
或者，可以局部而不是全身方式给予抗体，例如通常以贮库制剂或缓释制剂，通过将抗体直接注射入关节炎性关节或特征是免疫病理的病原体诱导的病灶中。此外，可以靶向药物递送***给予抗体，例如在包覆组织特异性抗体的脂质体中，靶向例如关节炎性关节或特征是免疫病理的病原体诱导的病灶。脂质体可靶向患病组织并被患病组织选择性吸收。
给药方案取决于若干因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可及性。优选给药方案递送足够的治疗性抗体以实现靶疾病状态的改善，同时使不良副作用降到最低。因此，递送的生物剂(biologic)的量部分取决于具体的治疗性抗体和待治疗病况的严重程度。可获得有关选择适当剂量的治疗性抗体方面的指引(参见例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy，Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(主编)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，NewYork，NY；Bach(主编)(1993)Monoclonal Antibodies and PeptideTherapy in Autoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等(2000)NewEngl.J.Med.343：1594-1602)。
例如利用本领域已知或推测影响治疗的参数或因素，临床医生可确定适当剂量。总的来讲，剂量以稍小于最佳剂量的量开始，之后以少的增量增加直到达到相对于任何负面的副作用是所需的效果或最佳效果。重要的诊断方法包括例如炎症症状或所产生的炎性细胞因子水平的诊断方法。优选可使用的生物剂来源于与靶向治疗的动物相同的物种，从而使对试剂的炎症、自身免疫或增殖应答降到最低。例如，在人受试者的情况下，优选嵌合、人源化和完全人抗体。
可通过连续输注，或者通过给药剂量，例如每日一次、每周1-7次、一周一次、两周一次、每月一次、两月一次等，提供抗体、抗体片段和细胞因子。可经静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。一周一次总剂量普遍为至少0.05μg/kg体重、更普遍为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg以上(参见例如Yang等(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。还可提供剂量以在受试者血清中达到抗BTLA抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml以上。在其它实施方案中，按一周一次、两周一次或“每四周”的基础，以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者皮下或静脉内给予本发明的完全人BTLA抗体。
本文所用“抑制”或“治疗”或“处理”包括病症相关症状的发展延迟和/或这类病症症状的严重程度减轻。该术语还包括改善现有的不受控制的或有害的症状，预防其它症状和改善或预防这类症状的根本起因。因此，该术语表明已为患有病症、疾病或症状的脊椎动物受试者或者可能发生这类病症、疾病或症状的脊椎动物受试者提供有益结果。
本文所用术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的BTLA结合化合物当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的结合化合物的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时，治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量，不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。
与例如细胞因子、另一治疗性抗体、甾体、化疗药物或抗生素等第二治疗药物共同给予的方法是本领域公知的，参见例如Hardman等(主编)(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第10版，McGraw-Hill，New York，NY；Poole和Peterson(主编)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A PracticalApproach，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(主编)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA。本发明的药物组合物还可含有免疫抑制剂或免疫调节剂。可以使用任何合适的免疫抑制剂，包括但不限于抗炎剂、皮质甾类、环孢素、他克莫司(即FK-506)、西罗莫司、干扰素、可溶性细胞因子受体(例如sTNRF和sIL-1R)、中和细胞因子活性的药剂(例如英利昔单抗(inflixmab)、依那西普)、霉酚酸吗乙酯、15-脱氧精胍菌素、沙利度胺、格拉默、硫唑嘌呤、来氟米特、环磷酰胺、甲氨蝶呤等。药物组合物还可与其它治疗药征(例如光线疗法和放射疗法)一起应用。
本发明的BTLA结合化合物还可与其它细胞因子的一种或多种激动剂或拮抗剂(例如抗体)联用，其它细胞因子包括但不限于IL-23、IL-1β、IL-6、CTLA-4、CTLA-4/Ig融合物和TGF-β。参见例如Veldhoen(2006)Immunity 24：179-189；Dong(2006)Nat.Rev.Immunol.6(4)：329-333。在各种实施方案中，在给予其它激动剂或拮抗剂之前、同时或之后给予本发明的BTLA结合化合物。在一个实施方案中，本发明的BTLA结合化合物单独或与IL-23拮抗剂组合用于治疗急性早期不良免疫应答(例如MS、克罗恩病、青少年早发性I型糖尿病)。在后一种情况下，BTLA结合化合物可逐步减少，并继续单独用IL-23拮抗剂的治疗以维持对不良应答的抑制。或者，可在本发明的BTLA结合化合物的同时、之前或之后给予IL-1β、IL-6和/或TGF-β的拮抗剂。参见Cua和Kastelein(2006)Nat.Immunol.7：557-559；Tato和O’Shea(2006)Nature 441：166-168；Iwakura和Ishigame(2006)J.Clin.Invest.116：1218-1222。
典型的兽医、实验或研究对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。
应用
本发明提供使用工程改造的抗BTLA抗体治疗和诊断炎性病症和病况以及自身免疫病症和增殖性病症的方法。提供用于诊断、预防或治疗以下疾病的方法：炎性肠病(IBD)、多发性硬化(MS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)、银屑病、全身性硬皮病、GVHD、同种异体移植物排斥、SLE、斯耶格伦综合征、青少年早发性I型糖尿病、自身免疫性心肌炎和腹膜粘连(参见例如Chung等(2002)J.Exp.Med.195：1471-78)。
在某些实施方案中，可使用与人BTLA特异性结合的本发明的抗体或抗原结合片段增加、提高、刺激或上调与BTLA活性有关的免疫应答。在某些实施方案中，不阻断BTLA与HVEM结合的本发明抗体(例如激动剂抗体Hu Mab8D5、huMab8A3)在治疗上用来稳定需要长时间BTLA活性的受试者中的BTLA。抗BTLA激动剂抗体(例如Hu Mab8D5、huMab8A3、hu Mab21H6和hu Mab19A7)活化BTLA的抑制受体功能。可获益于这种治疗的受试者包括患有以下炎性病症或自身免疫病症的患者：例如炎性肠病症(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括变应性哮喘)、***反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病、眼色素层炎、移植物抗宿主病(GVHD)、青少年早发性I型糖尿病、移植排斥、SLE和斯耶格伦综合征。这种治疗方法还可包括给予一种或多种其它的治疗药物，例如免疫抑制剂或抗炎剂。
类风湿性关节炎(RA)
RA是以滑膜关节的炎症为特征的进行性全身性疾病，影响约0.5％的全球人口。参见Emery(2006)BMJ 332：152-155。关节炎症可导致畸形、疼痛、僵硬和肿胀，最终导致关节不可逆退化。受影响关节包括膝、肘、颈和手足关节。常规治疗包括使用NSAID缓解症状，接着给予缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)，例如金、青霉胺、柳氮磺吡啶和甲氨蝶呤。最近进展包括用TNF-α抑制剂的治疗，包括英利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗等单克隆抗体，以及受体融合蛋白，例如依那西普。用这些TNF-α抑制剂治疗显著降低因疾病所致的结构损害。
本发明的抗BTLA激动剂抗体可用来治疗需要这种治疗的受试者的RA。本发明的抗BTLA抗体还可与RA的其它治疗组合，例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、甾体、霉酚酸吗乙酯、NSAID或TNF-α抑制剂(抗体或受体片段)。
在一个实施方案中，本发明的抗BTLA抗体用来治疗之前对仅DMARD治疗的反应不足的人受试者。在另一个实施方案中，用本发明的抗BTLA抗体的治疗始于病程早期，而无需之前的DMARD疗法失效。例如，一旦抗体疗法的安全性得到强有力的证实，这种早期介入便可能是适当的。
通过测定ACR评分测量临床改善，ACR评分的更多详述参见实施例18。在各种实施方案中，20、50和70的ACR评分为所需终点，可在治疗期间的任何合适的点上(例如5、10、15、24、40、50周或更多周)评价这些终点。
炎性肠病(IBD)
IBD是一组病症(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的名称，其中肠发炎，导致腹部痉挛和疼痛、腹泻、体重减轻和肠出血。IBD影响600,000多美国人。常规治疗选择包括柳氮磺吡啶、皮质甾类(例如***)、免疫***抑制剂例如硫唑嘌呤和巯基嘌呤或用于克罗恩病的抗生素(例如甲硝唑)。治疗性单克隆抗体治疗包括依那西普、那他珠单抗和英利昔单抗。
本发明的抗BTLA激动剂抗体可用来治疗需要这种治疗的受试者的IBD。本发明的抗BTLA激动剂抗体还可与IBD的其它治疗(例如IL-10(参见美国专利号5,368,854、7,052,686)、甾体和柳氮磺吡啶)组合。
银屑病
皮肤起内环境与外界之间的重要边界作用，防止与潜在的有害抗原接触。在抗原/病原体侵入的情况下，诱导炎症反应以消除抗原。这种反应导致主要由T细胞、多形核细胞和巨噬细胞组成的皮肤浸润(参见例如Williams和Kupper(1996)Life Sci.，58：1485-1507)。通常，由病原体引发的这种炎症反应处于严密严控制之下，并在病原体消除时停止。
在某些情况下，这种炎症反应在没有外部刺激的和没有适当控制的情况下发生，导致皮肤炎症。本发明提供用于治疗和诊断皮肤炎症的方法。皮肤炎症(上述细胞浸润以及从这些细胞分泌的细胞因子的结果)，包括若干炎性病症，例如疤痕性类天疱疮、硬皮病、化脓性汗腺炎、中毒性表皮坏死松解症、痤疮、骨炎、移植物抗宿主病(GvHD)、坏疽性脓皮症(pyroderma gangrenosum)和贝切特综合征(Behcet’sSyndrome)(参见例如Williams和Griffiths(2002)Clin.Exp.Dermatol.，27：585-590)。最常见的皮肤炎症形式是银屑病。
银屑病的特征在于T细胞介导的角质形成细胞过度增殖伴发炎症浸润。该病具有某些明显重叠的临床表型，包括慢性斑块病变、皮疹和脓疱病变(参见例如Gudjonsson等(2004)Clin Exp.Immunol.135：1-8)。大约10％银屑病患者发生关节炎。该疾病具有强而复杂的遗传素因，在单卵孪生中有60％一致性。
典型的银屑病病变是边界十分清楚的红斑，红斑被厚的银色鳞屑覆盖。与正常皮肤相比，银屑病组织的炎症和过度增殖与不同的组织学、抗原和细胞因子概况有关。与银屑病有关的细胞因子为：TNFα、IL-19、IL-18、IL-15、IL-12、IL-7、IFNγ、IL-17A和IL-23(参见Gudjonsson等，同上)。
单独或与其它作用剂组合的本发明的抗BTLA抗体，也可用于预防、治疗、诊断和预测银屑病突发。
***性红斑狼疮(SLE)
红斑狼疮是***疾病。狼疮是当机体免疫***攻击其自身组织和器官时发生的慢性炎性疾病。由狼疮引起的炎症可影响许多不同的人体***，包括关节、皮肤、肾、血细胞、心脏和肺。女性比男性更常发生狼疮，但是其原因不明。存在4种类型的狼疮—***性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、药物诱发红斑狼疮和新生儿狼疮。这些狼疮中，***性红斑狼疮是最常见和最严重的狼疮形式。在某些实施方案中，本发明的抗BTLA激动剂抗体可用来治疗需要这种治疗的受试者的狼疮。抗BTLA抗体可与狼疮的其它治疗组合，包括NSAID、某些抗疟疾药物(例如羟氯喹和皮质甾类、免疫抑制药(例如环磷酰胺(Cytoxan)和硫唑嘌呤(Imuran)和霉酚酸吗乙酯(CellCept))、利妥昔单抗和脱氢表雄酮(DHEA)。
斯耶格伦综合征是另一种引起眼干和口干的慢性病症。在某些实施方案中，本发明的抗BTLA抗体可用于治疗患有斯耶格伦综合征的个体。本发明的抗BTLA抗体也可与斯耶格伦综合征的其它治疗以及对狼疮所述治疗组合。
多发性硬化(MS)
MS被认为是涉及神经纤维丧失髓鞘、导致斑块或病变的中枢神经***(CNS)的自身免疫病。最常见的形式是复发/缓解型MS，其中发生界线十分清楚的症状性突发，接着是部分或完全缓解期。常规治疗选择包括干扰素-β-1a和-1b、米托蒽醌、四肽醋酸格拉默、治疗性α-4-整联蛋白特异性抗体(那他珠单抗)或α-4-整联蛋白的小分子拮抗剂(例如WO2003/084984中公开的拮抗剂)。
在某些实施方案中，本发明的抗BTLA激动剂抗体可用来治疗需要这种治疗的受试者的MS。抗BTLA抗体也可与MS的其它治疗组合，例如干扰素-β、干扰素-α、甾体或α-4-整联蛋白特异性抗体。
癌症
本发明的拮抗剂抗体或抗原结合片段(以hu Mab4C7为例)可用于治疗癌症(即抑制肿瘤细胞的生长或存活)。优选其生长可使用本发明的拮抗剂抗体抑制的癌症包括通常对免疫疗法起反应的癌症，而且还包括迄今为止与免疫疗法无关的癌症。适于治疗的优选的癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、***癌(例如激素难治性***癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、***、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其它恶性肿瘤。另外，本发明包括其生长可用本发明的抗体抑制的难治性或复发性恶性肿瘤。
本发明的拮抗剂抗体或抗体片段可单独使用或与以下药物联用：其它抗肿瘤药或免疫原性剂(例如减毒癌细胞、肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、抗原呈递细胞例如用肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IFNa2、GM-CSF)和用编码免疫刺激性细胞因子(例如但不限于GM-CSF)的基因转染的细胞)；标准癌症治疗(例如化学疗法、放射疗法或手术)；或其它抗体(包括但不限于针对以下的抗体：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体、其它生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB、PD-1、PD-L1、CTLA-4、ICOS和负调节途径中的其它分子)。
感染性疾病
本发明的拮抗剂抗体或抗原结合片段(以hu Mab4C7为例)也可用于预防或治疗感染和感染性疾病。抗体或抗体片段可以单独使用或与疫苗联用，以刺激对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。抗体或其抗原结合片段可用来刺激对人感染性病毒的免疫应答，例如但不限于人免疫缺陷病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、EB病毒(Eppstein Barrvirus)、人巨细胞病毒、人***瘤病毒、疱疹病毒。抗体或其抗原结合片段可用来刺激针对细菌或真菌寄生物和其它病原体感染的免疫应答。
接种佐剂
本发明的拮抗剂抗体或抗原结合片段(以hu Mab4C7为例)可与其它重组蛋白和/或肽(例如肿瘤抗原或癌细胞)联用以增强对这些蛋白质的免疫应答(即在接种方案中)。
例如，在某些实施方案中，抗BTLA拮抗剂抗体及其抗体片段可用于通过与目标抗原(例如疫苗)一起共同给予抗BTLA抗体来刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一个方面，本发明提供加强对受试者中的抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者：(i)抗原；和(ii)本发明的抗BTLA抗体或其抗原结合片段，使得对受试者中的抗原的免疫应答得到加强。抗原可以为例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这类抗原的非限制性实例包括而不限于肿瘤抗原或来自病毒、细菌或其它病原体的抗原。
Th2介导的疾病
在某些实施方案中，本发明的抗BTLA拮抗剂抗体和抗体片段(以hu Mab4C7为例)也可用于治疗Th2介导的疾病，例如哮喘和***反应。这是以本发明的抗体可有助于诱导Th1应答的研究结果为依据。因此，本发明的抗体可用于Th2介导的疾病以产生更平稳的免疫应答。
T细胞的离体活化
在某些实施方案中，本发明的抗体和抗原片段(以hu Mab4C7为例)还可用于抗原特异性T细胞的离体活化和扩繁以及这些细胞过继转移至接受者中以增加针对肿瘤的抗原特异性T细胞。这些方法还可用来活化针对感染原(例如CMV)的T细胞应答。可预期在抗BTLA抗体存在下的离体活化提高过继转移T细胞的频率和活性。
其它联合疗法
如前所述，本发明的抗BTLA抗体与以下一种或其它多种治疗药物共同给予：例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。可将抗体与该作用剂连接(作为免疫复合物)或者可与作用剂分开给予。在后一种情况下(分开给予)，抗体可在该作用剂之前、之后或同时给予，或者可与其它已知疗法共同给予。
本发明的抗体和抗原结合片段还可用来加强供体植入的肿瘤特异性T细胞的功效。
对本领域技术人员显而易见的是，可对本发明进行许多改进和改变而又不偏离其精神和范围。本发明由随附权利要求书以及该权利要求书享有权利的等同内容的整个范围界定。包括下列实施例在内的本文所述具体实施方案仅作为实例提供，并非通过其细节来限制本发明的范围。
通用方法
文献记载了分子生物学的标准方法(Maniatis等(1982)MolecularCloning，Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，AcademicPress，San Diego，CA)。标准方法还见于Ausbel等(2001)CurrentProtocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons，Inc.NewYork，NY，该文献描述了细菌细胞中的克隆与DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞与酵母中的克隆(第2卷)、复合糖与蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
文献记载了蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶(Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York)。文献记载了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，JohnWiley and Sons，Inc.，New York；Ausubel等(2001)CurrentProtocols inMolecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Products for Life ScienceResearch，St.Louis，MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory，Piscataway，N.J.，第384-391页)。文献记载了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和断裂(Coligan等(2001)Current Protcolsin Immunology，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Harlow和Lane，同上)。可获得表征配体/受体相互作用的标准技术(参见例如Coligan等(2001)Current Protocols inImmunology，第4卷，John Wiley，Inc.，New York)。
可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean(主编)(2000)Monoclonal Antibodies，Oxford Univ.Press，New York，NY；Kontermann和Dubel(主编)(2001)Antibody Engineering，Springer-Verlag，New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，第139-243页；Carpenter等(2000)J.Immunol.165：6205；He等(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等(1989)Nature 342：877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美国专利号6,329,511)。
人源化的备选方法是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1：837-839；Mendez等(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等(2001)Phage Display：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Kay等(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A LaboratoryManual，Academic Press，San Diego，CA；de Bruin等(1999)NatureBiotechnol.17：397-399)。
文献记载了单链抗体和双抗体(参见例如Malecki等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；以及美国专利号4,946,778)。文献提供了双功能抗体(参见例如Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods248：7-15；Volkel等(2001)Protein Engineering 14：815-823；Segal等(2001)J.Immunol.Methods 248：1-6；Brennan等(1985)Science229：81-83；Raso等(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Traunecker等(1991)EMBO J.10：3655-3659；以及美国专利号5,932,448、5,532,210和6,129,914)。
文献还提供了双特异性抗体(参见例如Azzoni等(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey等(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。
对于抗体的产生，抗原的纯化不是必需的。可携带目标抗原的细胞免疫动物。然后从免疫动物中分离出脾细胞，并可将脾细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见例如Meyaard等(1997)Immunity7：283-290；Wright等(2000)Immunity 13：233-242；Preston等，同上；Kaithamana等(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。
可使抗体与例如药物小分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)缀合。抗体可用于治疗、诊断、药盒或其它目的，并包括与例如染料、放射性同位素、酶或胶态金等金属偶联的抗体(参见例如Le Doussal等(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等(2002)J.Immunol.168：883-889)。
可获得用于流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选术(FACS)(参见例如Owens等(1994)Flow Cytometry Principles for ClinicalLaboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ)。可获得适于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体的例如用作诊断试剂的荧光试剂(Molecular Probes(2003)Catalogue，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。
文献记载了免疫***的组织学标准方法(参见例如Muller-Harmelink(主编)(1986)Human Thymus：Histopathology andPathology，Springer Verlag，New York，NY；Hiatt等(2000)Color Atlas ofHistology，Lippincott，Williams，and Wilkins，Phila，PA；Louis等(2002)Basic Histology：Text and Atlas，McGraw-Hill，New York，NY)。
可获得用于测定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库(参见例如GenBank，Vector NTI
Figure BPA00001531276100791
Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCGWisconsin Package(Aceelrys，Inc.，San Diego，CA)；DeCypher
Figure BPA00001531276100792
(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne等(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等(2000)BioinformaticsApplications Note  16：741-742；Wren等(2002)Comput.MethodsPrograms Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。
实施例1
完全人BTLA抗体
利用Medarex，Inc.的UltiMAb抗体生产平台，用过量表达膜结合的huBTLA和huBTLA-Fc融合蛋白的CHO细胞在MPL
Figure BPA00001531276100801
+TDM佐剂中的组合免疫小鼠，来产生完全人单克隆人BTLA特异性抗体。用BTLA-Fc融合蛋白或表达具有成熟胞外结构域(SEQ ID NO：35的残基31-152)的膜结合BTLA的细胞免疫小鼠。该序列与GenBank登记号NP_861445序列(其与人BTLA转录物1变体(NP_861445)匹配)所述转录物1变体的胞外结构域一致，其中相对于NP_861445(SEQ IDNO：37，在胞内结构域的267位有一个氨基酸差异((Pro267Leu，SEQ IDNO：35，由SEQ ID NO：36编码)。在多轮免疫和血清滴定后，选择选出的小鼠用于融合。一轮融合产生49种抗BTLA Mab，其中大多数为IgG4同种型。另一轮融合产生154种MAb，其中大多数为IgG1同种型，包括Mab8D5。
在人γ/κ筛选后，通过对CHO/huBTLA和CHO亲代细胞的ELISA、FACS/FMAT筛选以清除CHO阳性Mab以及针对其阻断HVEM与BTLA CHO细胞结合的能力，根据与BTLA-Ig的结合，对抗BTLA Mab进行初步表征和选择。采用BIACore表面等离子共振分析，进行相对亲和力测定。hu Mab8D5与人和食蟹猴BTLA两者的结合同样好，但不具有阻断活性。在本文所述的B细胞和T细胞功能测定中，Hu Mab8D5也具有激动剂活性。
Hu Mab8D5是IgG4/κ同种型(含有稳定的228脯氨酸突变)的完全人单克隆抗体，其与人BTLA结合的亲和力约为2nM(BIAcore)。HuMab8D5抗体是非阻断的，并且不干扰HVEM结合。其它3种抗体hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7具有相似的功能性质，但功能性质与hu Mab8D5的不同。虽然hu Mab8A3也是不干扰HVEM结合的非阻断性激动剂抗体，但是hu Mab21H6和hu Mab19A7是也阻断HVEM与BTLA结合的激动剂。
抗BTLA抗体同种型选择
IgG4同种型的抗体与补体C1q的结合差，因此不会明显活化补体。IgG4抗体还与Fcγ受体弱结合，导致依赖抗体的细胞毒性(ADCC)无效或缺乏(有关综述见Presta，2002)。使最初选择的8D5IgG1 Mab再次表达为含有稳定的Adair S228P突变的人IgG4，以产生缺乏效应子功能的抗BTLA抗体。将可变区亚克隆至Ubiquitous ChromatinOpening Element(UCOE；Millipore，Billerica，MA)载体中，其含有人κ恒定区和具有S228P铰链突变的人γ4恒定区(Angal，1993)。使重链和轻链表达载体线性化，并共转染至CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在含有G418和嘌罗霉素的CD CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中选出稳定的克隆。采用人γ/κ夹心ELISA筛选表达的克隆，按比例提高最佳产生线至2L用于生产和纯化。原始8D5Mab的IgG4形式本文称为hu Mab8D5(或hu Mab8D5G4)。8D5的IgG1形式本文称为hu Mab8D5G1。
抗BTLA抗体序列
采用基于简并引物PCR的方法，测定hu Mab8D5和hu Mab4C7序列的重链和轻链可变区的DNA序列。按照生产商的说明书(Qiagen，Valencia，CA，USA)，使用RNeasy Mini Kit由5x 106个杂交瘤细胞制备总RNA。通过用SMART RACE cDNA Amplification Kit(ClontechLaboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)和SuperScript II ReverseTranscriptase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的5’-RACE方案(两者均按生产商的说明书)，制备cDNA。各个抗体的V区使用与5’RACE通用引物混合物配对的3’人特异性恒定区引物(VH引物HLB02(SEQID NO：33)；VK引物LY49(SEQ ID NO：34))扩增。将含有V区的PCR产物克隆至pCR4-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，并转化至大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。制备小提DNA或Templiphi(GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ，USA)，并进行DNA测序(Sequetech，Mountain View，CA，USA)。分析所得DNA序列的框内重排和其它抗体性质。hu Mab8D5重链和轻链可变区的序列见图1A-C。标出互补决定区(CDR)。序列特征概括于图1C。拮抗剂抗体Hu Mab4C7重链和轻链可变区的序列见图2A-C。
实施例2
抗BTLA抗体结合亲和力
采用基于细胞的流式细胞术测定hu Mab8D5(图3A-B)和huMab4C7(图3C-D)与人和食蟹猴BTLA的表观结合亲和力。对于huMab8D5的IgG1和IgG4形式两者，人和食蟹猴BTLA的半最大结合出现在约12nM处。对于激动剂结合分析(图3A-B)，在含有0.02％叠氮化钠防止受体内化的4℃缓冲剂中，对表达人BTLA的CHO细胞从20μg/ml开始进行hu Mab8D5的3倍滴定，或者对表达食蟹猴BTLA的CHO细胞从50μg/ml开始进行hu Mab8D5的2倍滴定。PE-抗huFc用于检测。该数据表明hu Mab8D5与人和食蟹猴BTLA结合。激动剂huMab8A3、hu Mab21H6和hu Mab19A7具有与hu Mab8D5相似的结合亲和力。
对于拮抗剂结合分析(图3C-D)，在含有0.02％叠氮化钠防止受体内化的4℃缓冲剂中，对表达人BTLA的CHO细胞从20μg/ml开始进行hu Mab4C7的3倍滴定，或者对表达食蟹猴BTLA的CHO细胞从50μg/ml开始进行hu Mab4C7的2倍滴定。PE-抗huFc用于检测。对于hu Mab4C7，hu Mab4C7的IgG1和IgG4形式两者的人和食蟹猴BTLA的半最大结合出现在约1.6nM处，见图3C-D。该数据表明huMab4C7与人和食蟹猴BTLA结合。
实施例3
BIAcore
为了采用表明快开慢关动力学(fast-on slow-off kinetics)的BIAcore分析阐明结合动力学和计算平衡结合常数，对抗体进行进一步的概况分析。对于BIAcore，在抗CH1芯片上捕获试验抗体。
Hu Mab8D5G4的表观Kd为2.4nM。拮抗剂抗体hu Mab4C7的表观Kd为4.6nM。
表6BIAcore结果
  HuMAb   Ka(1/Ms)*(104)   Kd(1/s)*(10-4)   KD(nM)
 8D5(G4)激动剂   7.9   1.9   2.4
  4C7拮抗剂   9.25   4.3   4.6
实施例4
HVEM阻断能力
测试抗体以确定其阻断HVEM与人BTLA结合的能力。采用竞争性基于细胞的流式细胞测定，测定了阻断HVEM与人BTLA结合的能力。将连续稀释的hu Mab8D5加入表达人BTLA的CHO细胞(在含有0.02％叠氮化钠防止受体内化的缓冲液中)达15分钟后，在4℃加入生物素化人HVEM-Fc(R&D Systems；1μg/mL)达30分钟。对于图4B所示结果，自50μg/ml开始进行hu Mab8D5的3倍滴定，PE-SA用于检测。
相同测定的hu Mab4C7的HVEM阻断能力见图4A。将连续稀释的hu Mab4C7加入表达人BTLA的CHO细胞(在含有0.02％叠氮化钠防止受体内化的缓冲液中)达15分钟以后，在4℃下加入生物素化人HVEM-Fc(R&D Systems；1μg/mL)达30分钟。对于图4A所示结果，自50μg/ml开始进行hu Mab4C7的3倍滴定，PE-SA用于检测。将经洗涤的细胞重悬于含有碘化丙啶(PI)以及防止受体内化的0.02％叠氮化钠的4℃缓冲剂中后，通过流式细胞术分析。根据从FSC/SSC门排除PI阳性细胞，对活细胞进行门控，并测量其几何平均荧光。图4A中的结果表示hu Mab4C7阻断人HVEM(hHVEM)与表达hBTLA的CHO细胞结合。
如图4B所示，hu Mab8D5不抑制HVEM与人BTLA的结合或者与HVEM竞争结合人BTLA。对于抗体huMab8A3得到类似结果。如图4A所示，huMAb4C7抑制HVEM与人BTLA的结合或与HVEM竞争结合人BTLA。对于抗体hu Mab21H6、hu Mab19A7得到类似阻断结果。
实施例5
hu Mab8D5抑制对CD3交联的人T细胞应答
使用得自在不同设置中刺激的健康志愿者的血细胞，测试抗BTLA激动剂抗体和抗体片段体外降低T细胞活性的能力。采用经典的T细胞刺激测定，该测定利用抗CD3Mab以交联全部感受态人T细胞的细胞表面上的T细胞受体复合物。
使用PHA和IL-2，在来自人PBMC的培养物中产生原始T细胞。在可溶性hu Mab8D5、hu Mab8D5Fab片段或IgG1同种型对照存在或不存在时，用固定化抗CD3Ab刺激原始细胞48小时。通过胸苷掺入测定增殖，见图5。
在该测定中，证实了hu Mab8D5抑制增殖，这就表明抗原受体和BTLA对T细胞同时刺激的结果是抑制T细胞应答(图5)。加入这些培养物中作为单价Fab’片段的hu Mab8D5抗体具有相似活性，这就强有力地表明hu Mab8D5通过命中功能表位，而非通过细胞表面上的多个BTLA分子的交联来活化BTLA受体功能。该数据表明hu Mab8D5抑制抗CD3诱导的人原始T细胞的增殖。
实施例6
人T细胞对SEB的应答被hu Mab8D5抑制，被hu Mab4C7增加
用于表征活化BTLA受体的功能性后果的另一个测定利用葡萄球菌肠毒素B(SEB)参与并活化表达Vβ3、Vβ12、Vβ14、Vβ17和一些其它T细胞受体链的所有人T细胞，这取决于SEB的剂量。取决于供体，SEB活化至多20％的由IL-2产生测定的全部T细胞。
在本发明的分析中，健康人(图6A)或食蟹猴供体血液(图6B)以1∶10稀释，并与抗体预温育后，将超抗原SEB(1μg/ml)加入培养物中。人IgG4(HuIgG4)是hu Mab8D5的同种型对照Mab。显示了单一代表性的人和猴供体。
2天后，通过ELISA测定IL-2产生。在人和猴供体两者中，与对照人IgG4相比，Hu Mab8D5降低IL-2产生。
可溶性CTLA-4-Ig融合蛋白(CTLA-4/Ig)阻断共刺激受体CD28及其配体CD80/CD86间的相互作用，其降低SEB诱导的IL-2产生，进一步证实了SEB刺激测定为在操纵共刺激途径后定量测定T细胞活性的方法。发现因受测激动剂抗BTLA抗体而引起的IL-2产生的减少是剂量依赖性的(图6A-B)。抗体hu Mab8A3、hu Mab21H6、huMab19A7对于IL-2产生也可有类似作用。
按照上述方法，还用hu Mab4C7进行了这些测定。与CTLA-4/Ig和hu Mab8D5不同，Hu MAb4C7在人(图6C)和猴供体(图6D)两者中与对照人IgG4相比增加IL-2产生。
受测抗人BTLA Mab与猴BTLA交叉反应的能力尤其可用于测试Mab在表示体内疾病调节的充分检验的模型(例如猴肾移植和EAE***)中调节T细胞应答的能力。受测激动剂抗BTLA抗体在SEB刺激测定中减少IL-2产生的能力表明，这些抗体适用于控制或预防移植物抗宿主病等病况。
实施例7
得自接种破伤风类毒素(TT)的供体的血细胞中的hu Mab8D5抑制TT依赖性IFNγ产生和增殖
另外，使用破伤风类毒素(TT)记忆抗原，检查抗BTLA治疗是否具有抑制抗原特异性应答的能力。将TT以0.1μg/ml加入PBMC中，7天后对细胞因子和增殖进行了分析。在Abatacept(CTLA-4/Ig)、huMab8D5或对照同种型抗体IgG4存在或不存在时，使用TT体外再刺激得自最近接种TT的个体的PBMC 7天。通过ELISA测量干扰素γ(IFNγ)产生，并通过氚标记胸苷掺入测量增殖。
与仅抗原相比，CTLA-4/Ig及hu Mab8D5显著降低TT诱导的IFNγ产生(图7A)和增殖(图7B)。这些数据表明，hu Mab8D5能够抑制通过(抗原特异性)T细胞受体复合物引发的T细胞应答。在huMab8D5存在下，初次应答和再次(记忆)应答两者受抑制。
实施例8
得自接种破伤风类毒素(TT)的供体的血细胞中的hu Mab4C7提高破TT依赖性IFNγ产生和增殖
如上所述，还使用拮抗剂抗体hu Mab4C7进行了IFNγ产生(图8A)和增殖分析(图8B)。与仅抗原相比，hu Mab4C7显示提高TT诱导的IFNγ产生(图8A)和增殖(图8B)。这些结果表明，hu Mab4C7能够加强通过抗原特异性T细胞受体复合物引发的T细胞应答。在huMab4C7存在下，初次应答和再次(记忆)应答被加强。
实施例9
hu Mab8D5抑制人B细胞功能
从外周血分离人B细胞，并在抗BTLAMab存在或不存在时用抗IgM刺激。具体而言，通过阴性选择从人全血中分离B细胞，并在huMab8D5、CTLA-4/Ig或同种型对照存在或不存在时用10μg/ml抗IgMF(ab’)2片段刺激。48小时后通过胸苷掺入测量增殖。Hu Mab8D5产生B细胞增殖的剂量依赖性降低，而同种型对照和CTLA-4/Ig无作用，见图9。对于抗体huMab8A3得到类似结果。
实施例10
hu Mab8D5抑制外周血B细胞趋化因子产生
幼稚B细胞上表面IgM的交联导致MIP1α和MIP1β等趋化因子的产生增加。图10A-B的图表示hu Mab8D5抑制外周血B细胞趋化因子的产生。通过阴性选择从人全血中分离B细胞，并在hu Mab8D5或同种型对照存在或不存在时用10μg/ml抗IgM F(ab’)2片段刺激。通过ELISA测量MIP1α和β的产生。
除了限制B细胞增殖以外，hu Mab8D5以剂量依赖性方式降低抗IgM引发的B细胞的MIP1α(图10A)和MIP1β(图10B)的趋化因子产生。重要的是，在实验中，使用非抗原特异性引发剂，例如可能诱导B细胞增殖而不参与B细胞受体的CD40L加IL-4，对hu Mab8D5和对照抗体进行了测试。在这些情况下，未检出hu Mab8D5活性。
实施例11
Hu Mab8D5不会自主诱导免疫活性
图11图示hu Mab8D5不会自主刺激健康供体血液中的免疫活性。在hu Mab8D5或CTLA-4-Ig存在或不存在时，用超抗原SEB刺激稀释的人全血。HuIgG4是hu Mab8D5的同种型对照mAb。还在缺乏SEB刺激的情况下，将Hu Mab8D5加入血液中。48小时(h)后，通过ELISA测量IL-2产生。
在TT记忆应答测定中，以及在SEB刺激测定中(使用人全血)，在没有同时发生T细胞受体特异性刺激的情况下，hu Mab8D5不会刺激可检出的增殖或细胞因子应答。这就表明hu Mab8D5不太可能诱导患者非有意的细胞因子风暴样事件。
实施例12
Hu Mab8D5引发BTLA抑制信号转导活性
Hu Mab8D5和hu Mab4C7使B细胞的BTLA蛋白免疫沉淀，并且用hu Mab8D5预处理降低TCRξ磷酸化。用各种BTLA HuMab使人外周血B细胞的裂解物免疫沉淀。huIgG4是同种型对照，hu Mab4C7(拮抗剂抗体)和2G9是其它BTLA HuMab。对于图12B，从外周血分离CD4T细胞，并如下处理：泳道1＝未刺激的细胞，泳道2＝用抗CD3T细胞膨胀珠刺激30分钟，泳道3＝用膨胀珠刺激30分钟前用25μg/ml hu Mab8D5-(标为克隆8D5)处理。探测全部细胞裂解物最上面的印迹中的总CD3ξ，而底部印迹用phospho特异性CD3ξAb探测。M泳道是分子量标志物，数字表示kD。
在来源于健康供体的外周血B细胞中，显示hu Mab8D5和huMab4C7与BTLA特异性结合并使其免疫沉淀(图12A)。在用抗CD3加抗CD28刺激的外周血CD4+T细胞中，发现用hu Mab8D5预培育减少对于起始TCR/CD3信号转导是决定性的TCRξ链的磷酸化(图12B)。
实施例13
Hu Mab8D5作为单价Fab’具有活性
对于图13A，在hu Mab8D5Fab或hu Mab8D5的同种型对照Fab存在或不存在时，用超抗原SEB刺激稀释人全血。48小时后，通过ELISA测量IL-2产生。对于图13B，在hu Mab8D5Fab或同种型对照Fab存在或不存在时，通过阴性选择从人全血中分离B细胞，并用10μg/ml抗IgM F(ab’)2片段刺激。48小时后，通过胸苷掺入测量增殖。图13A-B说明hu Mab8D5以剂量依赖性方式抑制SEB应答和B细胞增殖。
如本文所述，发现当hu Mab8D5作为单价Fab’加入T细胞或B细胞培养物中时引发BTLA活性。Fab’的相对效能(而非相对功效)大约是完全Mab的相对效能的1/10，这就表明效能的丧失只不过是由亲合力所致。Hu Mab8D5作为Fab’片段能够剂量依赖性地抑制人全血中的SEB应答和抗IgM诱导的B细胞增殖(图13A-B)。像其它Ig-fold细胞表面受体一样，当将任何BTLA结合抗体包覆在塑料(通过多种受体的交联)上时，也可引发BTLA免疫抑制活性。然而，hu Mab8D5与BTLA的单价结合似乎完全活化抑制功能的事实，似乎是BTLA的独特性质(例如不为负性共刺激蛋白质家族成员PD-1或CTLA-4共有)。因为hu Mab8D5不会阻碍BTLA的天然配体HVEM的结合，虽然不希望受理论束缚，但这就表明了hu Mab8D5命中诱导构象变化和随后的胞内信号转导的BTLA胞外结构域上的(潜在变构)表位。
实施例14
细胞因子风暴
BTLA是CD28家族的免疫调节受体。使用激动剂抗体的一种潜在并发症是体内诱导“细胞因子风暴”活性。细胞因子风暴是全身性炎症反应，其特征在于因细胞因子和免疫细胞之间的正反馈回路中断引起快速诱导促炎细胞因子。已开发出改善免疫调节治疗药的预测性临床前安全性测试的方法(例如National Institute for Biological Standardsand Control，UK，参见Stebbings，2007)。利用预测体内细胞因子风暴可能性的现有模型和方法，进行了hu Mab8D5的体外测试。使用纯化阳性细胞因子风暴对照激动剂抗体作为阳性对照，进行了细胞因子风暴测定。在这些测定中，在不存在其它刺激时，固定化阳性对照激动剂mAb产生稳固的IL-2应答。当以类似方式固定化时，hu Mab8D5和对照IgG4两者均不诱导IL-2分泌，如图14A-B所示。图14B-D说明激动剂抗体hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab15C5、hu Mab20H4和hu Mab19A7在超交联(在上述条件下)时也不诱导炎性细胞因子干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生。相比之下，阳性对照激动剂mAb产生IFNγ和TNFα应答。因此，受测抗BTLA激动剂抗体均不在人PBMC培养物中诱导细胞因子风暴，根据在这个体外参比模型中的结果，预期其也不会体内诱导细胞因子风暴。
如实施例11和图11中所述，在所采用的任何功能测定中，huMab8D5不会自主刺激免疫功能。在不存在T细胞特异性引发时加入hu Mab8D5不会产生细胞因子分泌或增殖的可测量变化。此外，在通过将hu Mab8D5包覆在塑料上而推动较高水平交联的试验中，mAb不会诱导细胞因子释放或增殖。根据这些数据，BTLA-HVEM相互作用的抑制性质和引发BTLA引起抑制胞内信号转导的事实，认为细胞因子风暴的潜在风险是非常不太可能的。
实施例15
动物模型中的耐受性和副作用
在使用hu Mab8D5或hu Mab4C7的任何动物研究中没有显著的耐受性问题或副作用。
实施例16
8D5在SCIDhu SPL-人免疫应答模型中的作用
为了确定HuMab抗BTLA激动剂IgG4克隆8D5是否可在人SCIDhu SPL模型中抑制人T细胞依赖性介导的B细胞IgG产生，利用免疫应答探测HuMab体内调节免疫应答的可能性。CTLA-4-Ig用作对照，因为它是降低T细胞应答的免疫抑制药，并已知其影响B细胞的T细胞依赖性抗体产生。
简单地说，用人脾细胞腹膜内植入SCID小鼠，用100μg破伤风类毒素免疫，并在第0、5、9和14天用200μg靶标特异性抗体或对照抗体治疗。在第7天用TT给小鼠加强免疫。第28天，使小鼠安乐死，收集血清，收获腹膜渗出物细胞(PEC)。通过淋巴细胞亚群标志物表达的FACS对PEC进行分析，以评价Ab治疗对相对细胞数的影响。在第28天血清中通过ELISA定量测定了TT特异性和总人IgG浓度。
第28天血清的ELISA表明，与同种型对照huIgG4(图17B和18B)相比，hu MAb8D5抑制SCIDhu SPL小鼠中的人抗TT记忆应答和总IgG应答(图15，16，17A和18A)。与同种型对照huIgG4治疗小鼠相比，抗BTLA hu MAb8D5在降低总IgG效价和TT特异性IgG效价方面具有与CTLA-4-Ig类似的功效。图17A、17B、18A和18B表示各个治疗小鼠的效价的曲线图。总之，这些数据与以下结果一致：huMAb8D5起BTLA的激动剂的作用，并且hu MAb8D5诱导的BTLA信号转导抑制人T细胞活化、扩繁和随后人B细胞的T细胞依赖性记忆Ag特异性IgG和总IgG的产生。
实施例17
SCID-RA滑膜模型
SCID-RA滑膜模型包括将RA患者的滑膜移植到免疫缺陷型SCID小鼠中以产生人源化小鼠RA模型。RA滑膜移植物可在SCID小鼠中存留，并保持RA关节的形态和性质，包括滑膜增生、炎症、免疫反应性和血管生成。从关节置换手术(例如髋部、膝、肩)获得RA滑膜。SCID免疫缺陷型小鼠没有功能性T细胞和B细胞，没有移植排斥。
在手术期间收集滑膜，并直接加工成小片(6mm的活检样品)。将新鲜的滑膜样品移植入SCID小鼠背部所谓的皮下袋中。7天植入期后，在第7和10天给予对照或治疗/试验抗体的腹膜内注射。第14天，处死小鼠，收集血液和滑液。分析包括血清细胞因子ELISA、H+E染色和血清抗体定量测定。
序列索引
表7
Figure BPA00001531276100921
Figure BPA00001531276100931
参考文献
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本文所述的具体实施方案不限制本发明的范围。实际上，从前述说明书和附图来看，除了本文所述改动以外，本发明的各种改动对本领域技术人员而言是显而易见的。预期这种改动落入随附权利要求书的范围内。
贯穿本申请引用了专利、专利申请、Genbank登记号和出版物，其公开内容，尤其包括其中全部公开的化学结构和抗体氨基酸序列，均通过引用结合到本文中。无意将上述出版物或文献的引用认定为上述任一个是有关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何认定。本文所引用的全部参考文献通过引用结合到本文中，其程度与每个独立出版物、专利申请或专利具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。
上述书面说明被视为足以使本领域技术人员实施本发明。从前述描述来看，除本文所显示和所描述的改动外，本发明的各种改动对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且都落入随附权利要求书的范围内。
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Claims (15)

1.一种与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO：12、13和14的VL CDR结构域和至少一个选自SEQ ID NO：5、6和7的VH CDR结构域。
2.一种与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO：26、27、28的VL CDR结构域和至少一个选自SEQ ID NO：19、20和21的VH CDR结构域。
3.一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)所述重链可变区包含SEQ ID NO：11(8D5重链)的氨基酸序列；和
(b)所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18(8D5轻链)的氨基酸序列。
4.一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：5(8D5HCDR1)的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：6(8D5HCDR2)的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：7(8D5HCDR3)的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：12(8D5LCDR1)的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：13(8D5LCDR2)的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：14(8D5LCDR3)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体与BTLA特异性结合且不阻断与HVEM结合。
5.一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)重链可变区，其是人VH基因(SEQ ID NO：8)[编码8D5]的产物或来源于所述人VH基因；和
(b)轻链可变区，其是人VK基因(SEQ ID NO：15)[编码8D5]的产物或来源于所述人VK基因；其中所述抗体与BTLA特异性结合。
6.一种分离多肽，其包含权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段的VL结构域或VH结构域。
7.一种分离核酸，其编码权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段的VL结构域或VH结构域或者权利要求6的分离多肽。
8.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求6的分离多肽，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
9.一种治疗受试者的因BTLA表达和/或活性降低引起的病况的方法，所述方法包括将有效量的包含一种或多种权利要求1或3-5中任一项的抗体或抗原结合片段的组合物给予受试者。
10.一种治疗受试者的炎性病症或自身免疫病症的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1或3-5中任一项的激动剂抗体或抗原结合片段给予受试者。
11.权利要求10的方法，其中所述炎性病症或自身免疫病症选自克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、炎性纤维化、硬皮病、肺纤维化、和肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括变应性哮喘)、***反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病、眼色素层炎、移植物抗宿主病(GVHD)、青少年早发性I型糖尿病、移植排斥、SLE和斯耶格伦综合征。
12.一种提高受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的包含权利要求2的抗体或抗原结合片段的组合物给予受试者。
13.一种表达载体，其包含权利要求7的分离核酸。
14.一种宿主细胞，其包含权利要求13的表达载体。
15.一种产生权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
a.在表达核酸序列的条件下，将权利要求14的宿主细胞在培养基中培养，从而产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；和
b.从所述宿主细胞或培养基中回收所述多肽。
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