CN102743300A

CN102743300A - 海参糖肽、制备方法及在制备化妆品中的应用

Info

Publication number: CN102743300A
Application number: CN2012102483159A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 佟长青; 曲敏; 成芳; 金桥
Original assignee: Dalian Xianglan Biological Technology Co ltd
Current assignee: Yuanmei Biotechnology Development Dalian Co ltd
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-18
Also published as: CN102743300B

Abstract

本发明公开一种海参糖肽，其特征在于分子量小于3000Da，糖链通过GalNAc连接到丝氨酸或苏氨酸上，具有-Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr结构。是以海参为原料，经过酶解等工艺制备而成，原料来源广泛且安全可靠，制备工艺简单、成本低、便于应用。所制备的海参糖肽具有显著的促进成纤维细胞生长及对成纤维细胞紫外辐射损伤具有保护作用，因此可以在制备化妆品中应用，可有效预防紫外线损伤，避免因紫外线照射等引起的皮肤老化。

Description

海参糖肽、制备方法及在制备化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及一种海参酶解物，尤其是一种制备工艺简单、成本低、具有显著的促进成纤维细胞生长及对成纤维细胞紫外辐射损伤具有保护作用的海参糖肽、制备方法及在制备化妆品中的应用。

背景技术

目前，防晒化妆品的种类繁多，其防晒原理各不相同。如中国发明专利号为ZL02817885.8，名称为“二氧化硅被覆混晶氧化物颗粒、其制备方法以及用其制备的化妆品材料”的发明专利就公开了一种具有防晒（预防紫外线造成皮肤损伤）功能的化妆品，是在化妆品基本原料中添加具有遮挡紫外线能力的二氧化硅被覆混晶氧化物颗粒而制成，即通过物理方法预防紫外线损伤。还有一种防晒化妆品是在化妆品基料中添加纤维细胞生长因子，通过促表皮细胞修复增殖预防紫外线损伤，但因现有纤维细胞生长因子生产工艺复杂、价格昂贵，为此限制了它的广泛应用。

目前，以海参为原料所制备的活性物质均粘多糖、肽以及皂苷等小分子活性物质。迄今为止，还没有关于以海参为原料，酶解制备海参糖肽和其在化妆品中应用的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种制备工艺简单、成本低、具有显著的促进成纤维细胞生长及对成纤维细胞紫外辐射损伤具有保护作用的海参糖肽、制备方法及在制备化妆品中的应用。

本发明的技术解决方案是：一种海参糖肽，其特征在于分子量小于3000Da，糖链通过GalNAc连接到丝氨酸或苏氨酸上，具有 -Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser/Thr结构。

所含氨基酸的摩尔百分含量为：天冬氨酸与天冬酰胺11.41 %，苏氨酸4.93 %，丝氨酸5.23%，谷氨酸与谷氨酰胺14.68%，脯氨酸6.28 %，甘氨酸12.33%，丙氨酸13.05%，缬氨酸3.27%，异亮氨酸2.61%，亮氨酸3.9%，酪氨酸1.61%，苯丙氨酸2.18%，组氨酸1.22%，赖氨酸3.8%，精氨酸5.78%，甲硫氨酸1.75%，半胱氨酸1.48%；含糖量为总质量的10~20%，相对湿度不大于10%，溶解度为1克/30毫升水。

一种上述海参糖肽的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 将海参体壁在0~10℃时进行匀浆处理；

b. 向所得匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3：3：4的混合物；

c. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da以下的超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；

d. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，收集OD_280nm吸收峰；

e. 将所收集的液体通过大孔吸附树脂及活性炭后冷冻干燥，制得海参糖肽。

一种上述的海参糖肽在制备化妆品中的应用。

在制备防晒化妆品中的应用。

在所述化妆品基料中掺入总质量0.1~1 %的海参糖肽。

本发明是以海参为原料，经过酶解等工艺制备而成，原料来源广泛且安全可靠，制备工艺简单、成本低、便于应用。所制备的海参糖肽具有显著的促进成纤维细胞生长及对成纤维细胞紫外辐射损伤具有保护作用，因此可以在制备化妆品中应用，可有效预防紫外线损伤，避免因紫外线照射等引起的皮肤老化。

附图说明

图1是本发明实施例1、2、3的紫外线光谱图。

具体实施方式

实施例1：

制备方法按如下步骤进行：

a. 将海参体壁在10℃时进行匀浆处理；

b. 向所得匀浆中加入3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1%的复合酶，酶解48 h；所述复合酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3：3：4的混合物；

d. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱（2.5×60~100cm），收集OD_280nm吸收峰；

e. 将所收集的液体通过大孔吸附树脂（HPD系列）除盐及活性炭后冷冻干燥，制得海参糖肽。

所用碱性蛋白酶是由地衣芽孢杆菌发酵而得（CAS编号: 9014-01-1A0271），碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等原料均为市售产品。

实施例2：

制备方法按如下步骤进行：

a. 将海参体壁在0℃时进行匀浆处理；

b. 向所得匀浆中加入1倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为1%的复合酶，酶解12 h；所述复合酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3：3：4的混合物；

原料同实施例1。

实施例3：

制备方法按如下步骤进行：

a. 将海参体壁在5℃时进行匀浆处理；

b. 向所得匀浆中加入1倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.5%的复合酶，酶解30 h；所述复合酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3：3：4的混合物；

原料同实施例1。

试验一：

称取本发明实施例1或2或3的样品（海参糖肽）5mg，溶于3ml蒸馏水中，然后将样品溶液分成两等份。其中一份加入1.5ml蒸馏水；另一份加入1.5m 0.4mol/L NaOH 溶液；反应2h后，两份溶液分别在200～400nm范围内进行紫外光谱扫描，结果如图1所示：在240 nm处NaOH处理后的海参糖肽的紫外吸收显著增强，说明海参糖肽中存具有 -Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser/Thr结构。

实施例1或2或3所得海参糖肽，时间飞行质谱结果表明其m/z为小于3000Da，糖链通过GalNAc连接到丝氨酸或苏氨酸上，具有 -Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser/Thr结构。

经检测所含氨基酸的摩尔百分含量为：天冬氨酸与天冬酰胺11.41 %，苏氨酸4.93 %，丝氨酸5.23%，谷氨酸与谷氨酰胺14.68%，脯氨酸6.28 %，甘氨酸12.33%，丙氨酸13.05%，缬氨酸3.27%，异亮氨酸2.61%，亮氨酸3.9%，酪氨酸1.61%，苯丙氨酸2.18%，组氨酸1.22%，赖氨酸3.8%，精氨酸5.78%，甲硫氨酸1.75%，半胱氨酸1.48%；含糖量为总质量的10~20%，相对湿度不大于10%，溶解度为1克/30毫升水。

试验二：

将实施例1或2或3制得的海参糖肽应用于化妆品中，可以是粉剂、片剂和针剂等商品剂型，使用时与现有的化妆品混合即可。也可以在化妆品的基料中掺入含有总重量0.1~1% 的海参糖肽制成化妆品，化妆品基料可以是现有的普通化妆品。

含有海参糖肽的护肤霜对成纤维细胞生长促进活性测定：

1．样品制备

护肤霜为表1所示配方：

表1

成分	质量百分比	成分	质量百分比
				单硬脂酸甘油酯	8	尼泊金丙酯	0.5
硬脂酸	8	丙三醇	10
				十六烷醇	1	三乙醇胺	1
对羟苯甲酸丙酯	0.1	蒸馏水	69.9
				二甲基硅油	1	香精	0.5

（1）含海参糖肽的护肤霜样品制备：即按表1将油相原料和油溶性乳化剂，在不断搅拌下混合加热至80℃，维持20 min灭菌，将水相原料和水溶性乳化剂加入至蒸馏水中，搅拌下加热至80℃，维持20min灭菌，然后冷却，将与护肤霜按质量比为千分之一的海参糖肽缓慢加到水相中搅拌乳化，再将水相加入到油相中，当温度降至45℃时加入香精，继续搅拌冷却，即得含海参糖肽的护肤霜。取0.5g含海参糖肽的护肤霜溶于2.5ml蒸馏水中，10000 rpm离心20 min取上清，经过0.2 μm滤膜过滤，4℃保存。

（2）海参糖肽样品的制备：用水配制2.4μg/ml的海参糖肽溶液，10000 rpm离心20 min取上清，经过0.2 μm滤膜过滤，4℃保存。

（3）对照样品：取0.5g护肤霜溶于2.5ml蒸馏水中，10000 rpm离心20 min取上清，经过0.2 μm滤膜过滤，4℃保存。

2．样品对成纤维细胞生长促进作用的测定：

成纤维细胞为第10代体外培养的人成纤维细胞。

将数量为4.5×10⁴ 个/ml处于对数生长期的人成纤维细胞100 μl、不同的样品（含海参糖肽的护肤霜样品、海参糖肽样品、对照样品）溶液各2.5ml，并加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基液至每孔200 μl，在5%CO₂的37^oC培养箱中培养24h后，加入20 μL MTT（５g/L），再培养4h后，弃去培养基，加入180 μl DMSO，在恒温振荡器上振荡60s后，用酶标仪在570 nm/630 nm波长处检测吸光度。

每个样品溶液设3个平行样。

根据测得的吸光度值计算生长促进率：生长促进率=［（实验组吸光度值–对照组吸光度值）/ 对照组吸光度值］×100%。

结果如表2。

表2

样品	对照组	含海参糖肽的护肤霜	海参糖肽
				成纤维细胞生长促进率（%）	0	47.4	58.1

结果表明：含有海参糖肽的护肤霜及海参糖肽对人体成纤维细胞具有促生长作用。

试验三：

因成纤维细胞具有紫外损伤保护作用，为此可将海参糖肽以与化妆品基本原料质量比为千分之一的量添加至现有化妆品中，制成护肤霜、眼霜、隔离霜、护手霜和按摩霜等，可涂敷于皮肤用于预防紫外线造成皮肤损伤。

分别取本发明实施例1或2或3的海参糖肽0.1g、0.2g，各加入100ml蒸馏水，稀释至0.1% 和0.2%，搅拌至均匀。然后分别各取3ml样液和3mlTCA放置试管中。然后每个样液取1.5ml放置离心管中在-4℃以转速10000r/min离心20min。取上清液用紫外可见分光光度计测抗紫外线能力。结果表明在260-315nm紫外区内吸收曲线出现较高峰值，表明海参糖肽在此波长范围的紫外吸收率较大，因此海参糖肽具有一定的抗紫外能力。

Claims

1.一种海参糖肽，其特征在于分子量小于3000Da，糖链通过GalNAc连接到丝氨酸或苏氨酸上，具有 -Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser/Thr结构。

2.根据权利要求1所述的海参糖肽，其特征在于所含氨基酸的摩尔百分含量为：天冬氨酸与天冬酰胺11.41 %，苏氨酸4.93 %，丝氨酸5.23%，谷氨酸与谷氨酰胺14.68%，脯氨酸6.28 %，甘氨酸12.33%，丙氨酸13.05%，缬氨酸3.27%，异亮氨酸2.61%，亮氨酸3.9%，酪氨酸1.61%，苯丙氨酸2.18%，组氨酸1.22%，赖氨酸3.8%，精氨酸5.78%，甲硫氨酸1.75%，半胱氨酸1.48%；含糖量为总质量的10~20%，相对湿度不大于10%，溶解度为1克/30毫升水。

3.一种如权利要求1或2所述海参糖肽的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 将海参体壁在0~10℃时进行匀浆处理；

d. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，收集OD_280nm吸收峰；

4.一种如权利要求1或2所述的海参糖肽在制备化妆品中的应用。

5.根据权利要求4所述的海参糖肽在制备化妆品中的应用，其特征在于：是在制备防晒化妆品中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的海参糖肽在制备化妆品中的应用，其特征在于：是在所述化妆品基料中掺入总质量0.1~1 %的海参糖肽。