CN102731643A - 一种治疗骨质疏松多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了一种治疗骨质疏松多肽的制备方法，具体说是一种特立帕肽的制备方法。所述制备方法为制备组成特立帕肽的各肽树脂片段，将各肽树脂片段在固相上逐步偶联特立帕肽树脂，然后裂解得到特立帕肽粗品，纯化得到产品特立帕肽。与现有技术相比，本发明所述制备方法操作简单、合成周期短、成本低、环境污染小、特立帕肽收率高，总收率大于30%，适合于特立帕肽大规模产业化生产，并且制得的特立帕肽纯度高、副产物少，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。

Description

一种治疗骨质疏松多肽的制备方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，涉及一种治疗骨质疏松多肽的制备方法。尤其涉及一种特立帕肽的制备方法。

背景技术

特立帕肽，英文名为Teriparatide，是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素PTH具有生物活性的N-末端区域的1-34氨基酸片段，分子式为C₁₈₁H₂₉₁N₅₅O₅₁S₂，分子量为4177.77，其肽序为：

1  2  3    4   5   6   7   8   9  10  11  12  13  14  15  16  17   18  19  20H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-21  22   23 24  25  26   27 28  29  30   31 32   33  34Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。

特立帕肽由美国礼来公司开发，美国食品药品监督管理局于2002年11月26日批准了特立帕肽用于治疗男人和绝经期妇女的具有高度骨折风险的骨质疏松症，也用于治疗男人的原发和或由于性机能减退造成的具有高骨折风险的骨质疏松。特立帕肽是第一种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药。目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失，而特立帕肽这种甲状旁腺激素的衍生物有增加成骨细胞数目、增强其活性及阻止成骨细胞凋亡的作用。因其可增加成骨细胞的活性及数量，从而可以促进骨生长，用于严重骨质疏松的二线治疗。此外特立帕肽副作用很小，通常只是恶心、眩晕和腿痛性痉挛。因此特立帕肽具有很高的药用价值和广阔的市场前景。

礼来公司是采用基因表达得到特立帕肽。此外也有多篇基因表达得到特立帕肽的专利如US6590081，然而基因表达有着工作量大、三废严重、无法大规模生产等缺点。

目前，还有一种比较流行的方法是固相逐步合成（SPPS）方法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是由于特立帕肽由34个氨基酸组成，固相逐步合成方法产品收率低，而且产品纯化困难，不易得到高纯度的特立帕肽。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种收率高的特立帕肽的制备方法，所述方法制得的特立帕肽纯度高，适合于特立帕肽的大规模生产。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种特立帕肽的制备方法，制备组成特立帕肽的各肽树脂片段，将各肽树脂片段在固相上逐步偶联得到特立帕肽树脂，然后裂解得到特立帕肽粗品，纯化得到产品特立帕肽。

本发明所述特立帕肽的制备方法采用不同片段偶联策略，通过固相合成组成特立帕肽的各肽树脂片段，然后以合适的树脂为载体，将各肽树脂片段在固相上逐步偶联得到特立帕肽树脂，最后裂解得到特立帕肽粗品，纯化得到产品特立帕肽。本发明所述组成特立帕肽的各肽树脂片段的合成可以同时进行，使合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终制备得到特立帕肽产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于特立帕肽的大规模生产。

特立帕肽由34个氨基酸残基组成，因此存在海量的可能片段和偶联顺序。在一个具体实施方式中，将组成特立帕肽的34个氨基酸残基分为5个片段，即特立帕肽序列1-6位氨基酸、序列7-12位氨基酸、序列13-20位氨基酸、序列21-25位氨基酸、序列26-34位氨基酸。所述制备方法具体包括以下步骤：

A）制备组成特立帕肽的5个肽片段：肽树脂片段1、侧链保护肽片段2，侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5，其中所述肽树脂片段1为特立帕肽序列34-26位氨基酸，所述侧链保护肽片段2为特立帕肽序列25-21位氨基酸，所述侧链保护肽片段3为特立帕肽序列20-13位氨基酸，所述侧链保护肽片段4为特立帕肽序列12-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段5为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

B）将侧链保护肽片段2和肽树脂片段1偶联得到肽树脂Ⅰ；

C)将侧链保护肽片段3和肽树脂Ⅰ偶联得到肽树脂Ⅱ；

D)将侧链保护肽片段4和肽树脂Ⅱ偶联得到肽树脂Ⅲ；

E)将侧链保护肽片段5和肽树脂Ⅲ偶联得到肽树脂Ⅳ；

F)肽树脂Ⅳ裂解得到特立帕肽粗品

G）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

其中所述肽树脂片段1为H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(otbu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-树脂。

所述侧链保护肽片段2为Fmoc-Val-Glu(otbu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-OH。

所述侧链保护肽片段3为Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Met-Glu(otbu)-Arg(pbf)-OH。

所述侧链保护肽片段4为Fmoc-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH。

所述侧链保护肽片段5为Fmoc-Ser(tbu)-Val-Ser(tbu)-Glu(otbu)-IIe-Gln(Trt)-OH。

所述侧链保护肽片段2与肽树脂片段1偶联得到的肽树脂片段Ⅰ为H-Val-Glu(otbu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)--Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(otbu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-树脂。

所述侧链保护肽片段3与肽树脂片段Ⅰ偶联得到的肽树脂片段Ⅱ为H-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Met-Glu(otbu)-Arg(pbf)--Val-Glu(otbu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)--Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(otbu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-树脂。

所述侧链保护肽片段4与肽树脂片段Ⅱ偶联得到的肽树脂片段Ⅲ为H-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly--Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Met-Glu(otbu)-Arg(pbf)--Val-Glu(otbu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)--Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(otbu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-树脂。

所述侧链保护肽片段5与肽树脂片段Ⅲ偶联得到的肽树脂片段Ⅳ为H-Ser(tbu)-Val-Ser(tbu)-Glu(otbu)-IIe-Gln(Trt)--Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly--Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Met-Glu(otbu)-Arg(pbf)--Val-Glu(otbu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)--Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(otbu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-树脂。

作为优选，所述步骤A）中肽树脂片段1所用的固相载体为王树脂。

作为优选，所述步骤A）中侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5所用的固相载体为2-氯三苯甲基氯树脂。

作为优选，所述步骤A）中肽树脂片段1、侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。

侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5是将氨基酸偶联在树脂上后裂解获得的。作为优选，所述步骤A）中侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4、侧链保护肽片段5的裂解剂为TFE。

侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5从树脂中裂解下来后用***沉淀得到粗品，粗品无需纯化直接冻干，控制水分在2%以下。冻干后的全保护片段纯度都大于90%，可直接用于下一步反应。

作为优选，所述步骤B）-步骤E)中侧链保护肽与肽树脂偶联的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。

作为优选，所述步骤B）-步骤E)中侧链保护肽片段与肽树脂偶联的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。

也就是说，作为本发明所述步骤B）中，冻干后的侧链保护肽片段2与肽树脂1反应得到肽树脂Ⅰ，采用的偶联剂优选为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。更优选为TBTU/HOBt/DIPEA。进一步的，所述TBTU、HOBt与DIPEA的摩尔比为1:1:2。

也就是说，作为本发明所述步骤B）中，冻干后的侧链保护肽片段2与肽树脂1反应得到肽树脂Ⅰ，采用的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。更有优选为DMF与DMSO体积比为1:1的混合液。

也就是说，作为本发明所述步骤C）中，冻干后的侧链保护肽片段3和肽树脂Ⅰ偶联得到肽树脂Ⅱ，采用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。更优选为PyBOP/HOBt/DIPEA。进一步的，所述PyBOP、HOBt与DIPEA的摩尔比为1:1:2。

也就是说，作为本发明所述步骤C）中，冻干后的侧链保护肽片段2与肽树脂片段1反应得到肽树脂Ⅰ，采用的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。更有优选为DMF与NMP体积比为1:1的混合液。

也就是说，作为本发明所述步骤D）中，冻干后的侧链保护肽片段4和肽树脂Ⅱ偶联得到肽树脂Ⅲ，采用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。更优选为PyBOP/HOBt/DIPEA。进一步的，所述PyBOP、HOBt与DIPEA的摩尔比为1:1:2。

也就是说，作为本发明所述步骤D）中，冻干后的侧链保护肽片段4和肽树脂Ⅱ偶联得到肽树脂Ⅲ，采用的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。更有优选为DMF与DMSO体积比为1:1的混合液。

也就是说，作为本发明所述步骤E）中，冻干后的侧链保护肽片段5和肽树脂Ⅲ偶联得到肽树脂Ⅳ，采用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。更优选为PyBOP/HOBt/DIPEA。进一步的，所述PyBOP、HOBt与DIPEA的摩尔比为1:1:2。

也就是说，作为本发明所述步骤E）中，冻干后的侧链保护肽片段5和肽树脂Ⅲ偶联得到肽树脂Ⅳ，采用的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。更有优选为DMF与NMP体积比为1:1的混合液。

作为优选，所述步骤F)中，肽树脂Ⅳ裂解的裂解液为TFA与水体积比为95:5的混合溶液、TFA、DET、PHOH与水体积比为90:5:3:2的混合溶液或TFA、DET、TIS、PHOH与水体积比为80:5:5:5:5的混合溶液。进一步优选为TFA、DET、TIS、PHOH与水体积比为80:5:5:5:5的混合溶液。

作为优选，所述制备方法步骤G)中纯化为反相高效液相色谱纯化。

反相高效液相色谱，英文名reversed phase high performance liquidchromatography，简称，RP-HPLC，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离纯化。本发明所述步骤G)采用反相高效液相色谱纯化、冻干得到特立帕肽，纯度大于99%。

进一步的，在某一具体实施方式中，所述反相高效液相色谱纯化的色谱条件为：采用Waters 2695RP-HPLC***，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，规0.2%TFA(A)-乙腈(B)为流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters 2695RP-HPLC***，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2%醋酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到特立帕肽醋酸盐盐精肽。

在一些具体实施例中，本发明将组成特立帕肽的34个氨基酸残基分为3个片段，即特立帕肽序列1-10位氨基酸、序列11-25位氨基酸和序列26-34位氨基酸。所述制备方法具体包括以下步骤：

1）制备组成特立帕肽的3个肽片段：肽树脂片段a、侧链保护肽片段b和侧链保护肽片段c，其中所述肽树脂片段a为特立帕肽序列34-26位氨基酸，所述侧链保护肽片段b为特立帕肽序列25-11位氨基酸，所述侧链保护肽片段c为特立帕肽序列10-1位氨基酸；

2）将侧链保护肽片段b和肽树脂片段a偶联得到肽树脂A；

3)将侧链保护肽片段3和肽树脂A偶联得到肽树脂B；

4)肽树脂B裂解得到特立帕肽粗品

5）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

在一些具体实施例中，本发明将组成特立帕肽的34个氨基酸残基分为4个片段，即特立帕肽序列1-6位氨基酸、序列7-15位氨基酸、序列16-28位氨基酸和序列29-34位氨基酸。所述制备方法具体包括以下步骤：

a）制备组成特立帕肽的4个肽片段：肽树脂片段A、侧链保护肽片段B，侧链保护肽片段C和侧链保护肽片段D，其中所述肽树脂片段A为特立帕肽序列34-29位氨基酸，所述侧链保护肽片段B为特立帕肽序列28-16位氨基酸，所述侧链保护肽片段C为特立帕肽序列15-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段D为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

b）将侧链保护肽片段B和肽树脂片段A偶联得到肽树脂i；

c)将侧链保护肽片段C和肽树脂i偶联得到肽树脂ii；

d)将侧链保护肽片段D和肽树脂ii偶联得到肽树脂iii；

e)肽树脂iii裂解得到特立帕肽粗品

f)特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

在一些具体实施例中，本发明将组成特立帕肽的34个氨基酸残基分为5个片段，即特立帕肽序列1-6位氨基酸、序列7-12位氨基酸、序列13-19位氨基酸、序列20-28位氨基酸、序列29-34位氨基酸。制备方法具体包括以下步骤：

Ⅰ）制备组成特立帕肽的5个肽片段：肽树脂片段①、侧链保护肽片段②，侧链保护肽片段③、侧链保护肽片段④和侧链保护肽片段⑤，其中所述肽树脂片段①为特立帕肽序列34-29位氨基酸，所述侧链保护肽片段②为特立帕肽序列28-20位氨基酸，所述侧链保护肽片段③为特立帕肽序列19-13位氨基酸，所述侧链保护肽片段④为特立帕肽序列12-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段⑤为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

Ⅱ）将侧链保护肽片段2和肽树脂片段1偶联得到肽树脂a；

Ⅲ）将侧链保护肽片段3和肽树脂a偶联得到肽树脂b；

Ⅳ）将侧链保护肽片段4和肽树脂b偶联得到肽树脂c；

V）将侧链保护肽片段5和肽树脂c偶联得到肽树脂d；

VI）肽树脂d裂解得到特立帕肽粗品；

VII）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

在另一些具体实施例中，本发明将组成特立帕肽的34个氨基酸残基分为5个片段，即特立帕肽序列1-6位氨基酸、序列7-12位氨基酸、序列13-20位氨基酸、序列21-28位氨基酸、序列29-34位氨基酸。所述制备方法具体包括以下步骤：

i）制备组成特立帕肽的5个肽片段：肽树脂片段Ⅰ、侧链保护肽片段Ⅱ，侧链保护肽片段Ⅲ、侧链保护肽片段Ⅳ和侧链保护肽片段V，其中所述肽树脂片段Ⅰ为特立帕肽序列34-29位氨基酸，所述侧链保护肽片段Ⅱ为特立帕肽序列28-21位氨基酸，所述侧链保护肽片段Ⅲ为特立帕肽序列20-13位氨基酸，所述侧链保护肽片段Ⅳ为特立帕肽序列12-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段V为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

ii）将侧链保护肽片段Ⅱ和肽树脂片段Ⅰ偶联得到肽树脂①；

iii)将侧链保护肽片段Ⅲ和肽树脂①偶联得到肽树脂②；

iv)将侧链保护肽片段Ⅳ和肽树脂②偶联得到肽树脂③；

v)将侧链保护肽片段V和肽树脂③偶联得到肽树脂④；

vi)肽树脂④裂解得到特立帕肽粗品

vii）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

与现有技术相比，本发明所述制备方法操作简单、合成周期短、成本低、环境污染小、特立帕肽收率高，总收率大于30%，适合于特立帕肽大规模产业化生产，并且制得的特立帕肽醋酸盐精肽纯度大于99%，纯度高、副产物少，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种特立帕肽的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：

Fmoc	9-芴甲氧羰基
		Boc	叔丁氧羰基
tBu	叔丁基
		Trt	三苯甲基
NMP	N-甲基吡咯烷酮
		DMSO	二甲基亚砜
DMF	N,N-二甲基甲酰胺
		DCM	二氯甲烷
DBLK	20%六氢吡啶/DMF溶液
		DIC	N,N-二异丙基碳二亚胺
DIPEA	N,N-二异丙基乙胺

DMAP	4-二甲胺基吡啶
		PYBOP	六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基
TBTU	O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
		HOBT	1-羟基苯并***
TFE	三氟乙醇
		TFA	三氟乙酸
EDT	1,2-乙二硫醇
		PHOH	苯酚
TIS	三异丙基硅烷

实施例1：按照策略1制备特立帕肽

一、肽树脂片段1（特立帕肽序列34-26位氨基酸）

1.Fmoc-Phe-Wang Resin制备

称取替代度为0.8mmol/g的Wang Resin 1.2g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取0.51g Fmoc-Phe-OH、0.13gHOBT和0.01gDMAP用DMF溶解，冰水浴下加入0.16mL DIC活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入5mL吡啶和5.5ml乙酸酐封闭12小时。用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Phe–Wang Resin，检测替代度为0.20mmol/g。

2．肽树脂片段的制备

称取替代度为0.20mmol/g的Fmoc-Phe-Wang Resin 1.5g，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Phe-Wang Resin 30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将0.90g Fmoc-Asn(Trt)-OH，0.25g HOBt，0.29ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽树脂片段1（序列（34-26））的顺序，依次完成Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，最后用DBLK脱除Fmoc保护，得到肽树脂片段1。

二、侧链保护肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）的制备

1.肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）肽树脂的制备

称取替代度为0.47mmol/g的2-CTC树脂5.26g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取3.24g Fmoc-Arg(pbf)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入1.7mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时,用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。

将1.77g Fmoc-Leu-OH，0.74g HOBt，0.86ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽片段2（序列（25-21））的顺序，依次完成Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH，其中最后一个氨基酸Val偶联结束后不用脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）肽树脂8.12g。

2.裂解肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）肽树脂，侧链保护肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）

称取肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）肽树脂8.12g，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂82ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至﹤25vol%后，滴加至200ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：***=1:4），离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到侧链保护肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸），将粗品溶于水后冻干，得0.7g侧链保护肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸），纯度95%。

按上述方法制备侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4、侧链保护肽片段5。

三、肽树脂Ⅰ的制备

称取0.7g侧链保护肽片段2（特立帕肽序列25-21位氨基酸）、1.9g TBTU、0.74g HOBt，用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入1.7mlDIPEA，混合液加入步骤一固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂Ⅰ。

四、肽树脂Ⅱ的制备

称取0.9g侧链保护肽片段3、2.6gPyBOP、0.74gHOBt，用DMF和NMP为1:1的混合液溶解后加入1.7mlDIPEA，混合液加入步骤三中肽树脂固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂Ⅱ。

五、肽树脂Ⅲ的制备

称取0.55g侧链保护肽片段4、2.6gPyBOP、0.74gHOBt，用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入1.7mlDIPEA，混合液加入步骤四中肽树脂固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂Ⅲ。

六、肽树脂Ⅳ的制备

称取0.82g侧链保护肽片段5、2.6gPyBOP、0.74gHOBt，用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入1.7ml DIPEA，混合液加入步骤五中肽树脂固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到3.1g肽树脂Ⅳ。

七、肽树脂Ⅳ裂解得到粗品特立帕肽

将步骤六中的3.1g肽树脂Ⅳ加入到100ml烧瓶中，配置裂解试剂（体积比，TFA:DET:TIS:PHOH:H2O=80:5:5:5:5），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至300ml***试剂中，离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到1.2g.特立帕肽粗品，纯度75.4%。

八、特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽

称取1.2g特立帕肽粗肽用50mL水溶解后，采用Waters 2695RP-HPLC***，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters 2695RP-HPLC***，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到特立帕肽醋酸盐盐精肽0.4g，HPLC纯度99.3%，总收率32.2%。

实施例2：按照策略2制备特立帕肽

一、侧链保护肽片段b（特立帕肽序列25-11位氨基酸）的制备

1.侧链保护肽片段b肽树脂的制备

称取替代度为0.47mmol/g的2-CTC树脂5.35g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取3.24g Fmoc-Arg(pbf)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入1.7mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时,用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。

将1.77g Fmoc-Leu-OH，0.74g HOBt，0.86ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽片段b（特立帕肽序列25-11位氨基酸）的顺序，依次完成Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH。其中最后一个氨基酸Leu偶联结束后不用脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到侧链保护肽片段b肽树脂15.4g。

2.裂解侧链保护肽片段b肽树脂，侧链保护肽片段b

侧链保护肽片段b肽树脂15.4g，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂150ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至﹤25vol%后，滴加至200ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：***=1:4），离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到侧链保护肽片段b，将粗品溶于水后冻干，得1.4g侧链保护肽片段序列（25-11），纯度85％。

二、侧链保护肽片段c的制备

1.侧链保护肽片段c肽树脂的制备

称取替代度为0.47mmol/g的2-CTC树脂5.33g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取3.11g Fmoc-Asn(Trt)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入1.7mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。

将3.25g Fmoc-His(Trt)-OH，0.74g HOBt，0.86ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照侧链保护肽片段c的顺序，依次完成Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-IIe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH。其中最后一个氨基酸Ser偶联结束后不用脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到肽片段序列（10-1）肽树脂14.6g。

2.裂解侧链保护肽片段c肽树脂，侧链保护肽片段c

侧链保护肽片段c肽树脂14.6g，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂150ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至﹤25vol%后，滴加至200ml沉淀试剂中（体积比，正己烷：***=1:4），离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到侧链保护肽片段c，将粗品溶于水后冻干，得1.3g侧链保护肽片段序列（10-1），纯度80.5％。

三、侧链保护肽片段b与实施例1肽树脂片段1（特立帕肽序列34-26位氨基酸）缩合反应得肽树脂A

称取1.4g侧链保护肽片段b、1.9g TBTU、0.74g HOBt，用DMF和DMSO为1∶1的混合液溶解后加入1.7mlDIPEA，混合液加入实施例1中得到的肽树脂片段1固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂A。

四、侧链保护肽片段c与肽树脂A的缩合反应得肽树脂B

取1.3g侧链保护肽片段c、1.9g TBTU、0.74g HOBt，用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入1.7mlDIPEA，混合液加入步骤三固相反应柱中，室温反应3h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到2.8g肽树脂B。

五、肽树脂B裂解得到粗品特立帕肽

将步骤四中的2.8g肽树脂B加入到100ml烧瓶中，配置裂解试剂（体积比，TFA:DET:TIS:PHOH:H₂O=80:5:5:5:5），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至300ml***试剂中，离心，无水***洗涤，并且真空干燥，得到1.0g.特立帕肽粗品，纯度80.5%。

六、特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽

称取1.0g特立帕肽粗肽用50mL水溶解后，采用Waters 2695RP-HPLC***，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters 2695RP-HPLC***，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到特立帕肽醋酸盐盐精肽0.25g，HPLC纯度99.1%，总收率20.5%。

实施例3：

分别按照策略3、4和5制备特立帕肽。统计各方法制得的特立帕肽粗肽和特立帕肽醋酸盐精肽的纯度及总收率，结果见表1。

表1实施例1~3中各方法制得的特立帕肽结果

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (15)

1.一种特立帕肽的制备方法，其特征在于，制备组成特立帕肽的各肽树脂片段，将各肽树脂片段在固相上逐步偶联得到特立帕肽树脂，然后裂解得到特立帕肽粗品，纯化得到产品特立帕肽。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

A）制备组成特立帕肽的5个肽片段：肽树脂片段1、侧链保护肽片段2，侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5，其中所述肽树脂片段1为特立帕肽序列34-26位氨基酸，所述侧链保护肽片段2为特立帕肽序列25-21位氨基酸，所述侧链保护肽片段3为特立帕肽序列20-13位氨基酸，所述侧链保护肽片段4为特立帕肽序列12-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段5为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

B）将侧链保护肽片段2和肽树脂片段1偶联得到肽树脂Ⅰ；

C)将侧链保护肽片段3和肽树脂Ⅰ偶联得到肽树脂Ⅱ；

D)将侧链保护肽片段4和肽树脂Ⅱ偶联得到肽树脂Ⅲ；

E)将侧链保护肽片段5和肽树脂Ⅲ偶联得到肽树脂Ⅳ；

F)肽树脂Ⅳ裂解得到特立帕肽粗品

G）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤A）中肽树脂片段1所用的固相载体为王树脂。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤A）中侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5分别由各片段的氨基酸偶联在树脂获得各片段的肽树脂，然后裂解制得。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤A）中侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5所用的固相载体为2-氯三苯甲基氯树脂。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤A）中肽树脂片段1、侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4和侧链保护肽片段5的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤A）中侧链保护肽片段2、侧链保护肽片段3、侧链保护肽片段4、侧链保护肽片段5的裂解剂为TFE。

8.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤B）-步骤E)中侧链保护肽与肽树脂偶联的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA或TBTU/HOBt/DIPEA。

9.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤B）-步骤E)中侧链保护肽片段与肽树脂偶联的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。

10.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤F)中肽树脂Ⅳ裂解的裂解液为TFA与水体积比为95:5的混合溶液、TFA、DET、PHOH与水体积比为90:5:3:2的混合溶液或TFA、DET、TIS、PHOH与水体积比为80:5:5:5:5的混合溶液。

11.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤G)中纯化为反相高效液相色谱纯化。

12.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

1）制备组成特立帕肽的3个肽片段：肽树脂片段a、侧链保护肽片段b和侧链保护肽片段c，其中所述肽树脂片段a为特立帕肽序列34-26位氨基酸，所述侧链保护肽片段b为特立帕肽序列25-11位氨基酸，所述侧链保护肽片段c为特立帕肽序列10-1位氨基酸；

2）将侧链保护肽片段b和肽树脂片段a偶联得到肽树脂A；

3)将侧链保护肽片段3和肽树脂A偶联得到肽树脂B；

4)肽树脂B裂解得到特立帕肽粗品；

5）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

13.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

a）制备组成特立帕肽的4个肽片段：肽树脂片段A、侧链保护肽片段B，侧链保护肽片段C和侧链保护肽片段D，其中所述肽树脂片段A为特立帕肽序列34-29位氨基酸，所述侧链保护肽片段B为特立帕肽序列28-16位氨基酸，所述侧链保护肽片段C为特立帕肽序列15-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段D为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

b）将侧链保护肽片段B和肽树脂片段A偶联得到肽树脂i；

c)将侧链保护肽片段C和肽树脂i偶联得到肽树脂ii；

d)将侧链保护肽片段D和肽树脂ii偶联得到肽树脂iii；

e)肽树脂iii裂解得到特立帕肽粗品；

f)特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

14.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

Ⅰ）制备组成特立帕肽的5个肽片段：肽树脂片段①、侧链保护肽片段②，侧链保护肽片段③、侧链保护肽片段④和侧链保护肽片段⑤，其中所述肽树脂片段①为特立帕肽序列34-29位氨基酸，所述侧链保护肽片段②为特立帕肽序列28-20位氨基酸，所述侧链保护肽片段③为特立帕肽序列19-13位氨基酸，所述侧链保护肽片段④为特立帕肽序列12-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段⑤为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

Ⅱ）将侧链保护肽片段2和肽树脂片段1偶联得到肽树脂a；

Ⅲ）将侧链保护肽片段3和肽树脂a偶联得到肽树脂b；

Ⅳ）将侧链保护肽片段4和肽树脂b偶联得到肽树脂c；

V）将侧链保护肽片段5和肽树脂c偶联得到肽树脂d；

VI）肽树脂d裂解得到特立帕肽粗品；

VII）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。

15.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

i）制备组成特立帕肽的5个肽片段：肽树脂片段Ⅰ、侧链保护肽片段Ⅱ，侧链保护肽片段Ⅲ、侧链保护肽片段Ⅳ和侧链保护肽片段V，其中所述肽树脂片段Ⅰ为特立帕肽序列34-29位氨基酸，所述侧链保护肽片段Ⅱ为特立帕肽序列28-21位氨基酸，所述侧链保护肽片段Ⅲ为特立帕肽序列20-13位氨基酸，所述侧链保护肽片段Ⅳ为特立帕肽序列12-7位氨基酸，所述侧链保护肽片段V为特立帕肽序列6-1位氨基酸；

ii）将侧链保护肽片段Ⅱ和肽树脂片段Ⅰ偶联得到肽树脂①；

iii)将侧链保护肽片段Ⅲ和肽树脂①偶联得到肽树脂②；

iv)将侧链保护肽片段Ⅳ和肽树脂②偶联得到肽树脂③；

v)将侧链保护肽片段V和肽树脂③偶联得到肽树脂④；

vi)肽树脂④裂解得到特立帕肽粗品；

vii）特立帕肽粗品经纯化得到特立帕肽。