CN104910269A - 一种合成特立帕肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成特立帕肽的方法。所述方法将N端偶联有保护基的Phe在偶联试剂和活化试剂作用下和HMP Linker树脂进行酯化反应，得到肽树脂1；按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得特立帕肽树脂，然后酸解获得特立帕肽粗品，特立帕肽粗品纯化转醋酸盐得到特立帕肽纯品。本发明选择合适的合成方案，选择HMP Linker树脂作为载体树脂，并优化了整个合成工艺，获得了高纯度产品，提高了特立帕肽的总收率，并且对任何环境无危害。
Description
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成特立帕肽的方法。
背景技术
特立帕肽是一种合成的34肽，为人甲状旁腺素PTH的1-34氨基酸片段，氨基酸顺序如下：
H-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn10-Leu11-Gly12-Lys13-His14-Leu15-Asn16-Ser17-Met18-Glu19-Arg20-Val21-Glu22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys26-Lys27-Leu28-Gln29-Asp30-Val31-His32-Asn33-Phe34-OH
该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素PTH具有生物活性的N-末端区域。本品的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素PTH以及牛甲状旁腺素PTH(bPTH)完全相同。
特立帕肽是第一种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药，这种甲状旁腺激素的衍生物可以通过增加成骨细胞的活性及数量而促进骨生长，而目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失，特立帕肽是由礼来药厂生产的，涉及到1637例绝经后骨质疏松症患者的临床研究结果显示，与那些只服用了钙和维生素D补加剂的患者相比，96％的患者在接受该药治疗后，其脊柱和臀部的骨(矿物质)密度BMD均表现出显著增加，此外还发现，该药能够分别减少发生脊柱骨折和其他类型骨折危险的65％和53％。
对于本品制备的方法，已有专利技术进行公开。中国专利CN102731643A公开了以2-氯三苯甲基氯树脂(2-CTC树脂)为固相载体风味5个片段进行偶联，虽然该方法可以缩短合成周期，但是其总收率最高仅为32.2％。
当下比较流行的合成方法为固相逐步合成法(SPPS)，该方法具有操作简单和设备要求低的优点，但是该方法也因为总收率较低而限制了特立帕肽的生产效率。如专利CN103467595A，其在逐步合成偶联到17位丝氨酸时，以未保护的丝氨酸和16位天冬酰胺羧基进行酯缩合，在获得粗肽后再将酯键转化为酰胺键，其总收率最高为42.1％。专利CN104017064A也公开了一种逐步合成方法，其在合成16-17位氨基酸时采用假脯氨酸二肽、并以特定的裂解液裂解，其总收率最高为38％。专利CN104530218A公开了一种逐步合成方法，以王树脂或2-CTC树脂为固相载体合成，其总收率为34.72％。
综合上述现有的特立帕肽的合成方案来看，其总收率均不高，最高的为42.1％，虽然CN103467595A在其中声称其总收率介于30-50％，但是根据其实施例的详细记载，最高仅为42.1％。较低的总收率是限制特立帕肽生产效率的主要因素，需要改善现有的合成方案来提高其总收率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特立帕肽的制备方法，使得本发明所述方法在保证较高的纯度前提下，提高特立帕肽的总收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成特立帕肽的方法，包括以下步骤：
步骤1、N端偶联有保护基的Phe在偶联试剂和活化试剂作用下和HMPLinker树脂进行酯化反应，得到肽树脂1；
步骤2、按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得特立帕肽树脂，然后酸解获得特立帕肽粗品，特立帕肽粗品纯化转醋酸盐得到特立帕肽纯品。
特立帕肽主链氨基酸有34个，组成如下：
H-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn10-Leu11-Gly12-Lys13-His14-Leu15-Asn16-Ser17-Met18-Glu19-Arg20-Val21-Glu22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys26-Lys27-Leu28-Gln29-Asp30-Val31-His32-Asn33-Phe34-OH
本发明针对现有技术中均采用王树脂或2-CTC树脂为固相载体，造成特立帕肽总收率较低的缺陷，选择HMP Linker树脂作为固相载体进行特立帕肽的逐步合成，在保证特立帕肽纯度的前提下提高了其总收率。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过tBu保护基保护丝氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链；通过OtBu保护基保护门冬氨酸、谷氨酸的侧链；通过Trt保护基保护组氨酸、门冬酰胺、谷酰胺的侧链；通过Boc保护基保护赖氨酸、色氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的保护氨基酸中，N端均优选通过Fmoc保护基进行保护。被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。作为优选，所述其余保护氨基酸为Boc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH。
作为优选，步骤1所述保护基为Fomc保护基。
作为优选，所述HMP Linker树脂为HMP Linker Amide树脂、HMP LinkerBHA树脂或HMP Linker MBHA树脂。各树脂结构如下(P代表代表聚合物)：
作为优选，所述N端偶联有保护基的Phe和HMP Linker树脂的摩尔比为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1。
作为优选，所述肽树脂1的取代值为0.2-1.0mmol/g肽树脂1，更优选为0.3-0.6mmol/g肽树脂1。
作为优选，所述缩合试剂优选为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为肽树脂中摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。
需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比优选为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-2:1。
作为优选，所述缩合试剂中的有机碱优选为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基***啉(NMM),更优选为DIPEA。
作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并***(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍。
作为优选，所述偶联试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DIC/DMAP)双体系偶联试剂。
作为优选，所述酯化反应和延伸偶联的反应溶剂均采用DMF。
本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与氨基树脂偶联后，剩余氨基酸按照特立帕肽氨基酸的C端到N端的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。本发明偶联时，每次延伸偶联时所述保护氨基酸和对应肽树脂的摩尔比优选为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1；所述偶联反应时间优选为60～300分钟，更优选为100～140分钟。所述对应的肽树脂是指按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，每一个保护氨基酸在逐步偶联时，其需要偶联的肽树脂。
在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)，其余为DMF。去N端保护基时间优选为10～60分钟，优选的为15～25分钟。去N端保护基试剂的用量优选为每0.05mol肽树脂1000-1600mL。
需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数氨基酸按照特立帕肽氨基酸顺序和HMP Linker树脂相连接形成的肽树脂，这其中也包括肽树脂1。
作为优选，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。更优选地，所述酸解采用由体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克特立帕肽树脂需要4～15mL，更优选为9～11mL。所述酸解的时间优选为室温条件下1～6小时，更优选为3～4小时。
作为优选，所述纯化转醋酸盐步骤具体为：
特立帕肽粗品，加10％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品。
由本发明所述方法合成的特立帕肽经HPLC检测，纯度最高大于99％，最大单一杂质小于0.15％，总收率大于47％，远高于现有技术所公开的收率。
由以上技术方案可知，本发明选择合适的合成方案，选择HMP Linker树脂作为载体树脂，并优化了整个合成工艺，获得了高纯度产品，提高了特立帕肽的总收率，并且对任何环境无危害。
具体实施方式
本发明公开了一种合成特立帕肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，本发明中的氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1 英文缩写释义
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：肽树脂1的合成
将200g取代值为0.65mmol/g的HMP Linker Amide树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟后抽干。取100.6g Fmoc-Phe-OH和35.1gHOBt，用DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入35mL DIC和3.2g DMAP，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，甲醇洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Phe-HMP LinkerAmide树脂，取代值为0.50mmol/g。
实施例2：肽树脂1的合成
将200g取代值为0.6mmol/g的HMP Linker BHA树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟后抽干。取92.9g Fmoc-Phe-OH和32.4g HOBt,用DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入32mL DIC和2.9gDMAP，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，甲醇洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Phe-HMP Linker BHA树脂，取代值为0.46mmol/g。
实施例3：肽树脂1的合成
将200g取代值为0.6mmol/g的HMP Linker MBHA树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟后抽干。取92.9g Fmoc-Phe-OH和32.4gHOBt,用DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入32mL DIC和2.9gDMAP，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，甲醇洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Phe-HMP Linker MBHA树脂，取代值为0.49mmol/g。
实施例4：特立帕肽肽树脂的合成
取0.1mol实施例1的Fmoc-Phe-HMP Linker Amide树脂(取代值为0.50mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Phe-HMP Linker Amide树脂。
取0.3mol Fmoc-Asn(Trt)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Phe-HMP LinkerAmide树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Asn(Trt)-Phe-HMP Linker Amide树脂。
同上法依次接入下表保护氨基酸或片段，得到特立帕肽肽树脂：
H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-HMP Linker Amide树脂
实施例5：特立帕肽肽树脂的合成
取0.1mol实施例2的Fmoc-Phe-HMP Linker BHA树脂(取代值为0.50mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Phe-HMP Linker Amide树脂。
取0.3mol Fmoc-Asn(Trt)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Phe-HMP LinkerBHA树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得Asn(Trt)-Phe-HMPLinker BHA树脂。
同上法依次接入下表保护氨基酸或片段，得到特立帕肽肽树脂：
H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-HMP Linker BHA树脂
实施例6：特立帕肽肽树脂的合成
取0.1mol实施例3的Fmoc-Phe-HMP Linker MBHA树脂(取代值为0.50mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Phe-HMP Linker Amide树脂。
取0.3mol Fmoc-Asn(Trt)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Phe-HMP LinkerMBHA树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得Asn(Trt)-Phe-HMP Linker MBHA树脂。
同上法依次接入下表保护氨基酸或片段，得到特立帕肽肽树脂：
H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-HMP Linker MBHA树脂
实施例7：特立帕肽粗品的制备
取0.05mol实施例4制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克特立帕肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为85.7％。
实施例8：特立帕肽粗品的制备
取0.05mol实施例5制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为85％的TFA、体积百分比为7.5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液15mL/克特立帕肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为86.9％。
实施例9：特立帕肽粗品的制备
取0.05mol实施例6制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为85％的TFA、体积百分比为7.5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液15mL/克特立帕肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为87.7％。
实施例10：特立帕肽粗品纯化
取实施例7所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品98.8g，总收率为47.3％，分子量：4178.8(100％M+H)，纯度：99.4％，最大单一杂质0.11％。
实施例11：特立帕肽粗品纯化
取实施例8所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品102.7g，总收率为49.2％，分子量：4178.6(100％M+H)，纯度：99.5％，最大单一杂质0.10％。
实施例12：特立帕肽粗品纯化
取实施例9所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品101.3g，总收率为48.5％，分子量：4178.6(100％M+H)，纯度：99.1％，最大单一杂质0.13％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
Claims (10)
1.一种合成特立帕肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、N端偶联有保护基的Phe在偶联试剂和活化试剂作用下和HMPLinker树脂进行酯化反应，得到肽树脂1；
步骤2、按照特立帕肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得特立帕肽树脂，然后酸解获得特立帕肽粗品，特立帕肽粗品纯化转醋酸盐得到特立帕肽纯品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述HMP Linker树脂为HMPLinker Amide树脂、HMP Linker BHA树脂或HMP Linker MBHA树脂。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述N端偶联有保护基的Phe和HMP Linker树脂的摩尔比为1-6:1。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每次延伸偶联时所述保护氨基酸和对应肽树脂的摩尔比为1-6:1。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱中的一种。
6.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺或N-甲基***啉。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并***或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶双体系偶联试剂。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述纯化转醋酸盐步骤为：
特立帕肽粗品，加10％醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相***为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度***洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；
取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到特立帕肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品。
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Denomination of invention: A method for synthesizing tripeptide Granted publication date: 20180817 Pledgee: Chengdu SME financing Company Limited by Guarantee Pledgor: Chengdu Shengnuo BioTec Co.,Ltd. Registration number: Y2024990000180 |