CN102697791A - 常春藤皂苷元在制备抗老年性脑痴呆的药物中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种常春藤皂苷元或其可药用盐在制备抗老年性脑痴呆、抗脑神经损伤及抗衰老的药物中的应用。本发明应用常春藤皂苷元或其可药用盐治疗上述疾病疗效高,副作用小,安全性高,为临床治疗老年性脑部疾病提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体涉及一种常春藤皂苷元或其可药用盐作为活性成分在制备抗老年性脑痴呆、抗脑神经损伤及抗衰老的药物中应用。
背景技术
老年性脑痴呆又称阿尔茨海默病,是病因未明的原发性退行性脑变性疾病。多起病于老年期,潜隐起病,病程缓慢且不可逆,临床上以智能损害为主。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩,沟回增宽,脑室扩大,神经元大量减少,并可见老年斑,神经原纤维结等病变,胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。起病在65岁以前者旧称老年前期痴呆,或早老性痴呆,多有同病家族史,病情发展较快,颞叶及顶叶病变较显著,常有失语和失用。阿尔茨海默病主要表现为脑细胞的广泛死亡,特别是基底节区的脑细胞。正常情况下,基底节区发出的纤维投射到大脑与记忆和认知有关的皮质,它释放乙酰胆碱。短期记忆的形成必须有乙酰胆碱的参与,患者与正常人相比乙酰胆碱转移酶的含量比正常人减少90%。经解剖发现,患者脑中有广泛的神经元纤维缠结,轴突缠结形成老年斑。老年斑中含有坏死的神经细胞碎片、铝、异常的蛋白,阿尔茨海默病患者脑内β-淀粉样蛋白过度积聚。
已公认的发病机制主要有两种:1、由于淀粉样前蛋白的异常导致蛋白成分漏出细胞膜,导致神经元纤维缠结和细胞死亡,基因位于21号染色体。2、与载脂蛋白E(APO-E4)的基因有关,APO-E4的增多能对抗APO-E2或APO-E3的功能。APO-E4使神经细胞膜的稳定性降低,导致神经元纤维缠结和细胞死亡。APO-基因纯合子比杂合子患病几率高。
目前针对老年性脑痴呆、脑神经损伤等疾病仍缺乏较为理想的药物与治疗方法。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种常春藤皂苷元或其可药用盐在制备抗老年性脑痴呆、抗脑神经损伤及抗衰老的药物中应用。
本发明是通过以下技术方案实现的:
常春藤皂苷元或其可药用盐可在制备抗老年性脑痴呆的药物中应用。常春藤皂苷元或其可药用盐可在制备抗脑神经损伤的药物中应用。常春藤皂苷元或其可药用盐可在制备抗衰老的药物中应用。该药物中常春藤皂苷元或其可药用盐人日用剂量为0.2~1.8g,给药次数可为2-3次/天。
常春藤皂苷元(Hederagenin),别名(3beta,4alpha)-3,23-Dihydroxyolean-12-en-28-oicacid;常春藤皂甙元,分子式C30H48O4,可来源于市售或由多种途径制备得到,分子结构如下:
本发明所述的常春藤皂苷元或其可药用盐作为活性成分可与药学上可接受的载体制备成各种剂型。所述的药物的剂型为药学上认可的任何一种剂型。
上述药学上可接受的载体包括口服制剂辅料或胃肠外途径给药的辅料。给药途径可以是口服、注射、局部给药等。根据本发明的技术方案,该组合物可以是口服制剂或注射用制剂,其中口服制剂包括胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂、滴丸等。所用辅料包括:淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇、微晶纤维素钠、糊精、环糊精、氯化钠、维生素C、半胱氨酸、柠檬酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硬脂酸盐和明胶等常规辅料,制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术,本发明对此不作限定,故在此不予详述。
与现有技术比较本发明的有益效果:本发明首次表明常春藤皂苷元对Aβ25-35诱导的PC-12细胞损伤模型具有修复作用,并且考察了三种剂量的(270mg/Kg、90mg/Kg和30mg/Kg)常春藤皂苷元单体对腹腔注射东莨菪碱所造成的胆碱能***损伤小鼠的保护作用,与模型组比较,给药高剂量给药组(270mg/Kg)能显著地提高小鼠的学***,对东莨菪碱所导致的小鼠胆碱能***损伤有一定的保护作用。因此,常春藤皂苷元或其可药用盐作为活性成分用于抗老年性脑痴呆、抗脑神经损伤及抗衰老具有显著效果。
具体实施方式
实施例1 常春藤皂苷元对Aβ25-35诱导的PC-12细胞损伤模型修复作用
本实验旨在探索常春藤皂苷元具备体外抗AD的活性。
1、材料及方法:
洗液:10g K2Cr2O7、16ml H2O、200ml浓H2SO4混合配制;
D-Hank′s平衡盐溶液:NaCl 4.00g,KCl 0.20g,Na2HPO4·12H2O 0.067g,KH2PO4 0.03g,NaHCO3 0.175g,酚红0.01g,三蒸水500mL,调节pH至7.0~7.4;
PBS平衡盐溶液:NaCl 8.00g,KCl 0.20g,Na2HPO4·12H2O 3.49g,KH2PO4 0.20g,三蒸水1000mL,调节pH至7.2~7.4;
RPMI 1640培养基:RPMI Medium 1640干粉培养基(GIBCO Invitrogen)10.4g,NaHCO3 2.0g,青霉素(400万U单位市售)0.06g,链霉素(100万U单位市售)0.1006g,三蒸水900mL配制,抽滤除菌;
新生牛血清:(Newborn Calf Serum,GIBCO Invitrogen Corporation,New Zealand)在-20℃冷冻保存,使用时室温解冻;
细胞营养液:含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基溶液;
0.25%胰蛋白酶消化液:将胰蛋白酶(Trypsin(1:250)AMRESCO,USA)溶解于PBS平衡盐溶液中,0.22μm滤器过滤除菌;
MTT:3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑兰,南京生兴生物技术有限公司;精密称取MTT 20.0mg加入到西林瓶中,向西林瓶中加入4mL PBS,于磁力搅拌机上搅拌1.5h,使其完全溶解,过滤除菌,冰箱中4℃避光保存。
细胞冻存液:取含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基85mL至100mL血清瓶中,加入DSMO至刻度;
Aβ25-35:Amyloid β-protein Fragment 25-35,Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA);精密称取Aβ25-35 1.0mg用无菌三蒸水配制成75μmol/L,用0.22μm无菌滤器过滤、分装,-20℃冻存;临用前在37℃细胞培养箱中孵育24小时;
常春藤皂苷元对照品(HPLC归一法测定,纯度大于98%)。
常春藤皂苷元药液:精密称取常春藤皂苷元4.72mg,即0.01mmoL。考虑到苷元的溶解性差,先加100μL的DMSO配成100mmol/L的高浓度母液。进行给药时采用少量多次反复稀释的方法用培养基将其分别稀释为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L。该操作要注意细胞接种板中DMSO的含量控制在3‰以下。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞),中国医学科学院基础医学研究所提供。常春藤皂苷元(纯度为94.85%);细胞培养和换液、细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、细胞计数、细胞贴壁率的测定、MTT比色法吸光度与细胞浓度的关系测定均按常规方法进行。
常春藤皂苷元的制备方法:将续断药材粗粉(木通皂苷D含量为4%)用浓度为90%的乙醇浸泡2h,加热回流提取3次,乙醇倍量为续断药材重30倍,提取时间为6h,每次2h,合并3次提取液,过滤;滤液回收乙醇至无醇味得到得到粗提物,粗提物的得率约为6%,木通皂苷D的转移率98%;
在粗提物中加入浓度为95%的乙醇以及浓盐酸,搅匀,得到酸解液,使得酸解液中盐酸体积分数为7%,酸解液中乙醇体积分数为50%,料液比为1:30(每30ml酸解液中含有1g生药),酸解温度为80℃,酸解时间为4h。酸解后得到的溶液回收乙醇至无醇味,在室温条件下放冷,沉淀,过滤,得沉淀物,经少量水洗涤至中性,65℃条件下减压干燥,得常春藤皂苷元样品,常春藤皂苷元纯度94.85%。
常春藤皂苷元对照品溶液的制备:精密称取常春藤皂苷元对照品1.25mg,用甲醇溶解并定容至5ml,摇匀,即得浓度为250μg/ml的对照品溶液。
常春藤皂苷元样品溶液的制备:常春藤皂苷元样品至于蒸发皿内,加入少量甲醇,超声溶解,用干净的滴管转移至容量瓶中,甲醇定容,摇匀,即得浓度为0.2g生药/ml的样品液。移液管精密吸取2.5ml样品液至10mL容量瓶,甲醇定容至刻度线,摇匀,0.45μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液,浓度为0.05g生药/mL。
常春藤皂苷元HPLC检测方法:色谱条件:色谱柱:phenomenex-C18柱(4.6mm×25cm,5μm)及预柱;流动相:乙腈-0.1%甲酸水溶液=64:36;检测波长:212nm;进样量:20μl;流速:1.0ml/min;柱温:30℃。在此条件下,样品中的常春藤皂苷元与其他成分色谱峰均能得到较好的分离,相邻峰间分离度大于1.5,峰形良好,理论塔板数按常春藤皂苷元峰计算不低于10000。
2、细胞增殖活力测定:
(1)细胞接板培养:取生长良好的PC-12细胞,用PBS平衡溶液清洗,经0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液,计数后调节细胞浓度为1×105个/mL。将此细胞悬液接种于上述96孔细胞培养板中,除细胞板四周各孔外,每孔接种100μL。96孔细胞培养板各孔各加入100μL D-hank’s平衡盐溶液。将接种细胞后的培养板置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24h,备用。
(2)细胞分组:将96孔细胞培养板除掉四周的孔外,其余各孔按照列分组。从细胞板的第二列开始,依次设为空白组;模型组;给药组1;给药组2;给药组3等等,每个给药组两个给药浓度,每个给药浓度设置3个复孔。
(3)造模和给药:细胞接板培养了24h后,依据96孔细胞培养板分组情况,按照下述方法对各组细胞进行造模和给药,并放入5%CO2、37℃恒温培养箱中培养48h,备用。
①空白组:每孔加入含水细胞营养液20μL,再加入30μL无菌三蒸水,培养48小时。
②模型组:每孔加入含水细胞营养液20μL,再加入30μL Aβ25-35(75μmol/L)溶液,使Aβ25-35在细胞培养孔中的终浓度为15μmol/L,培养48小时。
③给药组:每孔加入不同浓度的含药细胞营养液20μL,再加入30μL Aβ25-35(75μmol/L)溶液,使Aβ25-35在细胞培养孔中的终浓度为15μmol/L,培养48小时。
3、测定步骤:在各组细胞造模和给药培养了48h之后,每孔均分别加入0.5%MTT溶液各20μL,继续放入5%CO2、37℃恒温培养箱中培养4h。在超净工作台中小心吸掉96孔细胞培养板中每孔中的液体,在分别向各孔中加入150μL DMSO溶液,立即在培养板振荡器上振摇10min,最后置酶标仪570nm处测定OD值。
4、实验结果:通过考察不同浓度常春藤皂苷元对抗Aβ诱导PC12细胞损伤的作用,我们发现当常春藤皂苷元在12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L三个浓度下,有一定程度的对抗Aβ损伤的作用,且6.25μmol/L、3.125μmol/L的浓度下具有显著对抗作用(P<0.05)。实验结果见表1。
表1常春藤皂苷元抗Aβ诱导PC12细胞损伤实验结果
(#表示与空白组比较具有显著性差异;*表示与模型组比较p<0.05)
实施例2常春藤皂苷元抗AD在体药效学探究急性AD在体模型氢溴酸东莨菪碱致小鼠痴呆
1、试药及试剂盒:
常春藤皂苷元(纯度为94.85%,制法同实施例1);氢溴酸东莨菪碱(购于南京泽朗医药科技有限公司);
氢溴酸加兰他敏(陕西康盛生物技术有限公司);
银杏叶提取物(徐州恒凯银杏制品有限公司);
考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);
乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);
超氧化物歧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所);
小鼠β淀粉样蛋白1-40酶联免疫检测试剂盒(上海江莱)。
2、动物
ICR种小鼠,雌雄各半,体重18—22g(青龙山提供)
3、实验溶液的配制:
(1)常春藤皂苷元溶液(27.0mg/mL、9.0mg/ml和3.0mg/ml)
称取适量常春藤皂苷元粉末用0.5%的CMC-Na水溶液配制成浓度为27.0mg/ml、9.0mg/ml和3.0mg/ml的溶液。
(2)银杏叶提取物溶液(6.0mg/mL)
称取适量银杏叶提取物粉末用0.5%的CMC-Na水溶液配制成浓度为6.0mg/ml的溶液。
(3)氢溴酸加兰他敏溶液(0.6mg/ml)
称取适量氢溴酸加兰他敏粉末用0.5%的CMC-Na水溶液配制成浓度为0.6mg/ml的溶液。
(4)氢溴酸东莨菪碱溶液(2mg/ml)
称取适量氢溴酸加兰他敏粉末用0.9%的CMC-Na水溶液配制成浓度为2mg/ml的溶液。
4、给药剂量的确定:
(1)小鼠给药剂量的确定:采用体表面积法,通过人用剂量换算为小鼠剂量。
(2)常春藤皂苷元给药剂量的确定:常春藤皂苷元的给药剂量分为三个级别,高剂量给药组为0.27g/kg,中剂量给药组为0.09g/kg,低剂量给药组为0.03g/kg。剂量依据为MD在体实验的剂量。
(3)西药阳性药对照组剂量的确定:《美国药典》第31版规定氢溴酸加兰他敏的推荐人用剂量为8-24mg·60Kg-1·Day-1。因此20g小鼠的氢溴酸加兰他敏原料用量为24×0.003mg=0.072mg·0.02Kg-1·Day-1。所以采用体表面积法换算的小鼠剂量为0.072mg÷0.02Kg=3.6mg·Kg-1·Day-1。本实验采用的小鼠剂量为6.0mg·Kg-1·Day-1。
(4)中药阳性药对照组剂量的确定:2010版《中国药典》一部规定银杏叶提取物的人用剂量为240mg·60Kg-1·Day-1因为20g 小鼠的银杏叶提取物用量为240×0.003mg=0.72mg·0.02Kg-1·Day-1。所以采用体表面积法换算的小鼠剂量为0.72mg÷0.02Kg=36mg·Kg-1·Day-1。本实验采用的小鼠剂量为60mg·Kg-1·Day-1。
5、实验方法:
(1)实验分组
小鼠适应性饲养1周后,随机分成7组,每组12只,雌雄各半。组别分别为正常对照组(空白组);模型对照组(模型组);西药阳性对照组(西药阳性药组);中药阳性对照组(中药阳性药组);高剂量给药组(高组);中剂量给药组(中组);低剂量给药组(低组)
(2)造模与给药
1)正常对照组
a.上午十点灌胃0.5%CMC-Na水溶液(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给CMC-Na溶液十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给CMC-Na溶液后20分钟,腹腔注射0.9%的生理盐水。(注射体积,0.1ml/10g)
2)模型对照组
a.上午十点灌胃0.5%CMC-Na水溶液(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给CMC-Na溶液十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给CMC-Na溶液后20分钟,腹腔注射东莨菪碱溶液。第一天造模,首剂加倍,2mg/kg,剩余四天1mg/kg。(注射体积,0.1ml/10g)。
3)西药阳性药组
a.上午十点灌胃氢溴酸加兰他敏溶液(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给药十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给药后20分钟,腹腔注射东莨菪碱溶液。第一天造模,首剂加倍,2mg/kg,剩余四天1mg/kg。(注射体积,0.1ml/10g)。
4)中药阳性药组
a.上午十点灌胃银杏叶提取物溶液(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给药十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给药后20分钟,腹腔注射东莨菪碱溶液。第一天造模,首剂加倍,2mg/kg,剩余四天1mg/kg。(注射体积,0.1ml/10g)。
5)高剂量给药组
a.上午十点灌胃常春藤皂苷元溶液,浓度为27mg/ml。(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给药十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给药后20分钟,腹腔注射东莨菪碱溶液。第一天造模,首剂加倍,2mg/kg,剩余四天1mg/kg。(注射体积,0.1ml/10g)。
6)中剂量给药组
a.上午十点灌胃常春藤皂苷元溶液,浓度为9mg/ml。(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给药十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给药后20分钟,腹腔注射东莨菪碱溶液。第一天造模,首剂加倍,2mg/kg,剩余四天1mg/kg。(注射体积,0.1ml/10g)。
7)低剂量给药组
a.上午十点灌胃常春藤皂苷元溶液,浓度为3mg/ml。(给药体积,0.1ml/10g)
b.连续给药十四天,从第15天开始直至生化指标测定当天,连续五天,末次灌胃给药后20分钟,腹腔注射东莨菪碱溶液。第一天造模,首剂加倍,2mg/kg,剩余四天1mg/kg。(注射体积,0.1ml/10g)。
8)造模和给药的期限和频率
给药期限为19天,给药频率为每天一次。造模期限为5天,造模频率为每天一次。
6、实验指标测定
(1)学习和记忆力指标
Y迷宫测定操作:根据小鼠既怕光刺激又怕电刺激的本性,参考杨峰[1]的方法进行Y迷宫实验。Y迷宫由三个相同的臂组成,臂与臂之间的夹角为120°,分别成为Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区。在每个区内,亮灯区为安全区,其余为电击区,即有电刺激无光刺激,有光刺激无电刺激。实验前将小鼠放入Y迷宫其中一个区,不通电不开灯,让其适应5-10分钟,然后无规律的调整安全区,以训练小鼠辨别光刺激及安全区的能力。小鼠受电击后10s一次性逃到安全区的行为成为正确反应,相反为错误反应。在其逃到安全区后,灯光持续15s,让其学习记忆亮灯区为安全区。[2]第一天先给小鼠进行训练,每只小鼠无规律调整安全区10-20次,第二天进行学习记忆测试,记录每只小鼠的正确次数。实验数据采用均数±标准差表示,并用SPSS 13.0统计学软件进行方差分析和组间t检验。P<0.05认为具有显著性差异。
(2)避暗实验的测定原理及操作
根据小鼠的趋暗本性将避暗实验箱分为明、暗两室,在暗室底部通以20V电压,明、暗两室之间设置一个直径为3cm左右的圆洞。实验开始时,先将放入避暗箱中适应3min,根据小鼠趋暗的本性,使小鼠头部对准洞口放到明室一边,小鼠因为喜暗的习性如若进入暗室,底部的通电电流会电击小鼠,促使其从暗室逃到明室。[3]
同上述操作,第一天对所有小鼠进行训练,每只训练5分钟。24小时后,即第二天进行学习记忆测试。测试期间,记录小鼠从明室第一次进入暗室的时间,此时间成为潜伏期,被电击的小鼠后会逃出暗室。记录5分钟内小鼠进入暗室被电击的次数,此次数成为错误次数。潜伏期和错误次数两个数据共同作为学习记忆测试的成绩。
(3)学习及记忆能力测定期间小鼠给药及造模安排
学习记忆能力测定期间小鼠继续给药,给药后20分钟,除正常组腹腔注射等量的生理盐水外,其余各组腹腔注射相应体积的东莨菪碱溶液,造模30分钟后,开始行为学测试。第一天造模东莨菪碱注射用量首剂加倍,浓度为2mg/ml。其余行为学测试期间注射浓度为1mg/ml。
(4)考马斯亮蛋白测定法测定脑组织总蛋白
原理:蛋白质分子具有-NH3 +基团,当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时,考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3 +结合,使溶液变为蓝色,通过测定吸光度可计算出蛋白含量。
(5)TNB法测定小鼠脑组织中TchE活力
原理:乙酰胆碱酯酶(True choline esterase)水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸,胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB(对称三硝基苯,Sym-Trinitrobenzene)黄色化合物,根据颜色深浅进行比色定量,水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力。
目前世界公认胆碱能神经***是学习记忆的主要通路,胆碱能神经递质与学习记忆及老年痴呆记忆障碍关系极为密切。[4]乙酰胆碱酯酶是催化乙酰胆碱水解的主要生物酶,AD患者神经纤维缠结游离于神经元外的乙酰胆碱酯酶活性升高,使脑皮层内乙酰胆碱含量降低,从而导致患者学习记忆能力减退。所以,测定小鼠脑组织内的乙酰胆碱酯酶的活力对考察药物是否具有抗AD的作用有一定的指导作用。
(6)WST-1法测定小鼠脑组织中的SOD活力
WST-1(2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodi um salt),WST-1可以和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜燃料(formazan dye),该反应步骤可以被SOD所抑制。通过对WST-1产物的比色分析可计算SOD的酶活力。
(7)双抗体夹心法测定小鼠脑组织中β淀粉样蛋白1-40
原理:本试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中小鼠β淀粉样蛋白1-40的水平。用纯化的小鼠β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔板中依次加入β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40),再与HRP标记的β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)抗体结合,形成抗体—抗原—酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中的β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)呈正相关。用酶标仪在450nm下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中小鼠β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)浓度。
7.实验结果
(1)学习能力和记忆能力考察
Y迷宫实验:通过Y迷宫对小鼠的学习记忆能力进行考察,以小鼠受到电击后逃避到安全区的次数作为考察指标。实验结果表明,小鼠通过腹腔注射东莨菪碱后,模型组小鼠在第二天的学习记忆时,与正常组相比,学习记忆能力下降。而在阳性对照组和给药组的结果中,在小鼠既给药又采取造模的情况下,相比模型组小鼠学习记忆能力得到了明显的改善,其中加兰他敏组和高中剂量给药组的正确次数提高明显(P<0.01),见表2。
表2小鼠Y迷宫学习记忆能力测试结果
(与正常组比较#p<0.05;##p<0.01;与模型组比较*p<0.05;**p<0.01)
(2)避暗箱:
通过避暗箱对小鼠的学习记忆能力进行考察,以小鼠被电击前的潜伏时间和5分钟测试时间内的总错误次数作为考察指标。实验结果表明,小鼠通过腹腔注射东莨菪碱造模后,模型组小鼠的潜伏时间与正常组相比缩短,且5分钟测试期间错误次数增多,学习能力下降。而在阳性对照组和给药组的结果中,在小鼠既给药又采取造模的情况下,相比模型组小鼠学习记忆能力有了明显的改善。其中加兰他敏组和银杏叶提取物组以及高剂量给药组潜伏时间明显长于模型组,错误次数明显少于模型组(P<0.01),见表3,而低剂量给药组小鼠潜伏时间及错误次数均优于模型组,但是差别不存在显著性差异。
表3小鼠避暗实验测试学习记忆能力结果
(与正常组比较#p<0.05;##p<0.01;与模型组比较*p<0.05;**p<0.01)
综上,通过行为学测试小鼠的学习记忆能力我们得出结论,小鼠通过腹腔注射东莨菪碱造模后,模型组小鼠的学习记忆能力较正常组明显下降。而在阳性药对照组和给药组的测定结果中,阳性药对照组和高中剂量给药组都能不同程度的改善造模小鼠的学习记忆能力。
(3)脑组织中TchE活力考察结果:
在本实验的结果中,与正常组小鼠比较,腹腔注射东莨菪碱造模的模型组小鼠脑组织中TChE活力显著升高(P<0.05)。在加兰他敏组、给药中剂量给药组和低剂量给药组结果中,在小鼠既给药又采取造模的情况下,相对于模型组小鼠脑组织中的TChE活力均有显著性的下降(P<0.01;P<0.01;P<0.01);银杏叶提取物组和给药高剂量给药组结果中,在小鼠既给药又采取造模的情况下,相对于模型组小鼠脑组织中的TChE活力也有显著的下降(P<0.05;P<0.05)。
以上实验结果表明,在腹腔注射东莨菪碱造模的情况下,同时分别给予小鼠加兰他敏、银杏叶提取物及给药高中低剂量组均能够显著对抗损伤所引起的小鼠脑组织中TChE活力的升高,见表4。
表4小鼠10%脑组织匀浆中TChE活力测定结果
(与正常组比较#p<0.05;##p<0.01;与模型组比较*p<0.05;**p<0.01)
(4)脑组织中SOD活力考察结果:
本实验通过测定脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性,来反映小鼠脑内的抗氧化水平。结果表明,腹腔注射东莨菪碱的模型组小鼠0.2%脑组织匀浆液中总SOD活力与正常组比较显著地降低(P<0.05)。而在银杏叶提取物、高剂量给药组结果总SOD活力在小鼠既给药又采取造模的情况下,相对于模型组小鼠脑组织中的SOD活力均有显著性的提高(P<0.05;P<0.05)。而加兰他敏组及给药中低剂量组,小鼠脑组织匀浆中的SOD活力与模型组比较没有显著性差别(P>0.05)。本实验结果证明,银杏叶提取物和给药高剂量给药组能够显著抑制东莨菪碱所致的小鼠脑组织中总SOD活力的下降,提高小鼠脑内的抗氧化水平,而加兰他敏和中低剂量给药组则无明显的抑制作用,见表5。
表5小鼠0.2%脑组织匀浆中SOD活力测定结果
(与正常组比较#p<0.05;##p<0.01;与模型组比较*p<0.05;**p<0.01
(5)脑组织中β淀粉样蛋白1-40含量考察结果:
本实验研究中测定了给药造模后各组小鼠10%脑组织匀浆液中的β淀粉样蛋白1-40的含量。实验结果表明,通过腹腔注射东莨菪碱的模型组小鼠脑组织中的Aβ1-40含量有所升高,但与正常组比较无显著性差别见表6。其他阳性药组和给药组小鼠脑组织中的Aβ1-40含量与模型组相比,经过T检验,无显著性差异。由此可知,该造模方法不能显著升高模型组小鼠脑组织中的Aβ1-40的含量。分析其原因,推测与东莨菪碱的造模机制有关,东莨菪碱作为M受体阻断剂主要以可逆破坏脑组织内的胆碱能***为造模途径,与β样淀粉蛋白的升高相关性不高。
表6小鼠10%脑组织匀浆中Aβ1-40结果
与正常组比较#p<0.05;##p<0.01;与模型组比较*p<0.05;**p<0.01
实施例3取按照实施例1方法制备得到的常春藤皂苷元,加入胶囊剂常用辅料,按常规制备工艺制备成胶囊剂。
实施例4取按照实施例1方法制备得到的常春藤皂苷元,加入口服液常用辅料,按常规制备工艺制备成口服液。
实施例5取按照实施例1方法制备得到的常春藤皂苷元,加入片剂常用辅料,按常规制备工艺制备成片剂。
实施例6取按照实施例1方法制备得到的常春藤皂苷元,加入颗粒剂常用辅料,按常规制备工艺制备成颗粒剂。
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Claims (5)
1.常春藤皂苷元或其可药用盐在制备抗老年性脑痴呆的药物中的应用。
2.常春藤皂苷元或其可药用盐在制备抗脑神经损伤的药物中的应用。
3.常春藤皂苷元或其可药用盐在制备抗衰老的药物中的应用。
4.根据权利要求1、2或3所述的应用,其特征在于所述的药物中常春藤皂苷元或其可药用盐人日用剂量为0.2~1.8g。
5.根据权利要求1、2或3所述的应用,其特征在于所述的药物的剂型为药学上认可的任何一种剂型。
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