CN108295085B - 原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肉瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肿瘤药物中的应用,所述的耐药性骨肿瘤是指对常用的抗肿瘤药物具有耐药性的骨肉瘤细胞系,特别是对甲氨喋呤、阿霉素、顺铂具有耐药性的U2OS肿瘤细胞。同时作为天然植物提取药物,原薯蓣皂苷将在抗肿瘤的药物治疗领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,具体涉及原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肿瘤药物中的应用。
背景技术
原发性骨肉瘤是常见的恶性骨肿瘤,发病年龄主要在青少年时期。因其起病隐匿,进展迅速,发现时已多属中晚期。故而手术治疗效果差,放化疗又都有明显不良反应,导致骨肉瘤患者生存质量差,生存期短。目前亟需有效、安全的抗肿瘤药物用于骨肉瘤的治疗。
正常生理条件下,细胞的增殖受到严格的调控,且细胞可以通过程序性死亡的方式进行代谢,也即发生细胞凋亡。然而,当癌基因激活、抑癌基因失活、修复相关基因的功能缺失、凋亡机制丢失、端粒酶过度表达、信号转导调控机制紊乱等相关分子事件发生时,细胞过度增殖,并伴随着凋亡异常,导致恶性肿瘤的发生。抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡是实现肿瘤治疗最理想的方式。
近年来,以中医药为主的综合治疗手段,可以有效控制骨肉瘤患者病情发展、改善生活质量、延长生存期,并且天然的抗肿瘤药物效果显著且几乎无不良反应。
中国专利CN1224392C发现从穿龙薯蓣等植物中提取的薯蓣皂苷元可以用于治疗胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、神经胶质瘤、红白血病、黑色素瘤、***、肝癌等,可以促进肿瘤细胞死亡,诱导其凋亡。
申请号为201310325252.7的中国专利申请在薯蓣皂苷元-3-位引入氨基直链脂肪酸、氨基酸残基、羰基、C1-C18的烷基、苯基或可接受的盐等,用于结肠癌、肝癌、乳腺癌的治疗。
洪振强等报道了100μmol/L的薯蓣皂苷元作用32h后,对骨肉瘤U-2OS细胞(细胞数量104)的生长抑制率为89.8%(洪振强,等.薯蓣皂苷元诱导人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡的透射电镜观察[J].福建中医药,2009,40(4):39-41)。
然而,在骨肿瘤细胞中存在着对抗肿瘤药物具有耐药性的肿瘤细胞系,这大大减小了传统药物的治疗效果,而薯蓣皂苷元也没有体现出对这类细胞显著性的抑制作用。
上述薯蓣皂苷元的结构如式I所示,分子量为414Da。原薯蓣皂苷的结构与薯蓣皂苷元不同,如式II所示,分子量为1049Da,是在薯蓣皂苷元的R1位增加了一个糖基官能团,而在R2位薯蓣皂苷元的糖环打开糖基化,此过程之后环戊基以及右侧的分子构象也发生了重排,其功能已不同于薯蓣皂苷元。目前,原薯蓣皂苷抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用未见报道,尤其是对耐药性骨肉瘤细胞的研究未见报道。
发明内容
针对现有药物(包括薯蓣皂苷元)对耐药性骨肉瘤治疗效果较差的缺陷,本发明的目的在于提供原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肿瘤药物中的应用,原薯蓣皂苷能够有效地抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导骨肉瘤细胞凋亡;
所述的耐药性骨肿瘤是指对一种或一种以上常用的抗肿瘤药物具有耐药性的骨肉瘤细胞系。
所述的抗肿瘤药物包括甲氨喋呤、阿霉素、顺铂的一种或一种以上。
所述的具有耐药性的骨肉瘤细胞系优选U2OS/MTX300。
原薯蓣皂苷对人骨肉瘤细胞系U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、MG63、SJSA1、G292和原代培养骨肉瘤细胞ZOS、ZOSM也体现出很好的抑制增殖和诱导凋亡的作用。
原薯蓣皂苷在抗骨肉瘤应用的有效浓度为0.01~200μmol/L。
所述的药物还包含可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分;
所述的药物可以为各种剂型,如胶囊剂、片剂、粉剂、酒剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂,或注射剂等。
本发明对骨肉瘤细胞系U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、ZOS、ZOSM、MG63、SJSA1、G292进行常规培养,对具有甲氨喋呤(MTX)耐药性的U2OS/MTX300细胞系用含有300μg/L MTX的培养基进行持续培养,采用MTT检测不同浓度原薯蓣皂苷对骨肉瘤细胞U2OS、U2OS/MTX300、HOS、MNNGHOS、143B、ZOS、ZOSM、MG63、SJSA1、G292活力的影响;通过克隆形成试验检测原薯蓣皂苷处理后U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B细胞增殖能力的影响;通过倒置显微镜观察Hoechst染色检测原薯蓣皂苷处理后U2OS、143B细胞的凋亡情况;通过流式细胞仪检测检测原薯蓣皂苷处理后U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B细胞的凋亡情况。通过western blot技术检测原薯蓣皂苷处理后细胞凋亡相关指标的变化;通过裸鼠动物实验检测原薯蓣皂苷在动物体内对骨肉瘤的治疗作用。实验结果发现:原薯蓣皂苷能够抑制U2OS/MTX300增殖并诱导其凋亡,对其他骨肉瘤细胞系也具有很好的抑制增殖和诱导凋亡的效果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)原薯蓣皂苷对耐药性骨肿瘤细胞具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。
(2)较低浓度的原薯蓣皂苷(5μmol/L)可以起到高浓度薯蓣皂苷元(100μmol/L)对U2OS的抑制效果。
(3)相同给药浓度下,薯蓣皂苷元对耐药性U2OS/MTX300细胞系没有抑制活性,而原薯蓣皂苷体现出良好的抑制活性。
(4)作为天然植物提取药物,原薯蓣皂苷将在抗肿瘤的药物治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度原薯蓣皂苷对骨肉瘤细胞活力的影响图。
图2为原薯蓣皂苷对骨肉瘤细胞增殖能力的影响图。
图3为原薯蓣皂苷作用于骨肉瘤细胞后Hoechst染色图。
图4为原薯蓣皂苷作用于骨肉瘤细胞后流式细胞术检测图。
图5为western blot检测原薯蓣皂苷处理后细胞凋亡相关指标的变化。
图6为原薯蓣皂苷在动物体内对骨肉瘤的治疗作用结果;其中,A-肿瘤体积变化曲线,B-肿瘤大小实测图,C-小鼠体重变化曲线,D-肿瘤质量变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例
原薯蓣皂苷在抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导骨肉瘤细胞凋亡中的应用
本发明所用到的人骨肉瘤U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、MG63、SJSA1、G292细胞系购自中国科学院上海细胞库;U2OS/MTX300细胞系购自意大利RIZZOLI骨软肿瘤研究中心;ZOS、ZOSM为中山大学附属第一医院骨肿瘤科构建的人骨肉瘤原代细胞系;原薯蓣皂苷购自广州安邦生物科技有限公司,Hoechst 33258购自美国Thermo公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自Invitrogen公司;MTT试剂盒购自Sigma公司。裸鼠购自南京大学-南京生物医药研究院。
实验方法:
1.细胞培养和药物配制
U2OS、HOS、MNNGHOS、143B、ZOS、ZOSM、MG63、SJSA1、G292细胞培养液为含10%胎牛血清、100mg/L链霉素和100mg/L青霉素的高糖完全培养液;对U2OS/MTX300的MTX耐药细胞系用含300μg/L MTX、10%胎牛血清、100mg/L链霉素和100mg/L青霉素的高糖完全培养液进行持续培养。培养箱环境为37℃、5%CO2、饱和湿度。
原薯蓣皂苷先用DMSO完全溶解,使用完全培养基稀释。动物实验采用原薯蓣皂苷悬液,配制浓度为60mg/kg。
2.原薯蓣皂苷对细胞增殖能力的影响
用不同浓度原薯蓣皂苷(0~20μmol/L)分别处理骨肉瘤细胞72h后,多功能酶标仪450nm波长下读取吸光度(A)值(OD),并计算出细胞增殖抑制率[抑制率(%)=(1-加药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%]和IC50值。结果如图1所示,经测定,细胞增殖出现抑制效应且呈剂量时间依赖性,原薯蓣皂苷作用骨肉瘤细胞72h的IC50值为0.6551~2.5800μmol/L(具体如表1所示),有抑制活性。
表1
细胞系 | IC50(μM) |
U2OS | 2.1710 |
U2OS/MTX300 | 2.4570 |
HOS | 0.7005 |
MNNGHOS | 0.8308 |
143B | 0.7606 |
MG63 | 1.6370 |
ZOS | 1.6300 |
ZOSM | 2.5800 |
SJSA1 | 0.6551 |
G292 | 0.7478 |
以相同方法检测薯蓣皂苷元对人骨肉瘤甲氨喋呤耐药细胞系
U2OS/MTX300的抑制活性,结果如表2所示,薯蓣皂苷元对U2OS/MTX300没有抑制活性,而原薯蓣皂苷对人骨肉瘤甲氨喋呤耐药细胞系U2OS/MTX300体现出较好的抑制活性。
表2
化合物 | IC50(μM) |
原薯蓣皂苷 | 2.4570 |
薯蓣皂苷元 | —— |
另外,将骨肉瘤细胞U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B均匀铺在六孔板中,1000个细胞/孔,用2.5μmol/L原薯蓣皂苷处理细胞48h后在培养箱持续培养8~10天后(对照组加PBS处理;下同),用PBS洗涤两次后加甲醇固定30min,加入1%结晶紫染色30min,洗净结晶紫后拍照。结果如图2所示,药物处理组的骨肉瘤细胞克隆数大幅减少,证明原薯蓣皂苷对这些细胞的增殖具有抑制作用。
3.原薯蓣皂苷对骨肉瘤细胞凋亡的作用
取对数生长期的U2OS、143B细胞,分别加入终浓度为0、2.5μmol/L的原薯蓣皂苷培养24h后,用PBS洗涤两次后加4%的多聚甲醛固定,加入Hoechst 33258染液,37℃闭光孵育45min,荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照。
形态学观察结果如图3所示,原薯蓣皂苷作用后的细胞呈明显凋亡状态,细胞核固缩、变亮,核小体碎片增加,显著地诱导了骨肉瘤细胞凋亡。
另外,将骨肉瘤细胞U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B,分别加入终浓度为0、2.5μmol/L的原薯蓣皂苷培养48h后,用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。结果如图4所示,原薯蓣皂苷可诱导骨肉瘤细胞发生明显的凋亡。
进一步,用不同浓度原薯蓣皂苷处理U2OS、143B细胞48小时后,用RIPA细胞裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,通过western blot技术检测细胞凋亡相关指标。结果如图5所示,原薯蓣皂苷处理后凋亡指标cleaved PARP随着药物浓度的升高而上升,抗凋亡指标Bcl2、Bcl-xL随着药物浓度的升高而降低,提示原薯蓣皂苷可诱导肿瘤细胞发生凋亡。
4.原薯蓣皂苷在动物体内对骨肉瘤的治疗作用
将骨肉瘤细胞143B接种于4周龄的雌性裸鼠皮下,1周后将裸鼠随机分组,分为对照组、原薯蓣皂苷组、ADM组。对照组进行蒸馏水灌胃,每天1次;原薯蓣皂苷组进行原薯蓣皂苷悬液灌胃,浓度为60mg/kg,每天1次;ADM组进行ADM腹腔注射,浓度为6mg/kg,每周1次。每4天测量动物体重及肿瘤体积。
实验结果如图6所示,从肿瘤的体积和重量变化、以及从小鼠体重的变化上看,原薯蓣皂苷悬液在动物体内对骨肉瘤有治疗作用,且效果比ADM更明显,未观察到原薯蓣皂苷在动物体内有明显的毒副作用。
以上实验结果证明,原薯蓣皂苷能够抑制耐药性骨肉瘤细胞增殖和诱导其凋亡,适合于作为抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.原薯蓣皂苷在制备抗耐药性骨肿瘤药物中的应用,其特征在于:所述的耐药性骨肿瘤是指对甲氨喋呤具有耐药性的骨肉瘤细胞系;
所述对甲氨喋呤具有耐药性的骨肉瘤细胞系是U2OS/MTX300。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的药物包含可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的药物为胶囊剂、片剂、粉剂、酒剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂,或注射剂。
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