CN102690838B - OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 - Google Patents
OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102690838B CN102690838B CN201210182988.9A CN201210182988A CN102690838B CN 102690838 B CN102690838 B CN 102690838B CN 201210182988 A CN201210182988 A CN 201210182988A CN 102690838 B CN102690838 B CN 102690838B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- osmads57
- sequence
- albumen
- plant
- pun1301
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 73
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 101001036577 Oryza sativa subsp. japonica MADS-box transcription factor 57 Proteins 0.000 title claims abstract 21
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title description 68
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 abstract description 3
- 241000746966 Zizania Species 0.000 abstract 1
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 8
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 8
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 8
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 241000208000 Striga Species 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 101100382854 Arabidopsis thaliana CCD7 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100327165 Arabidopsis thaliana CCD8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100008048 Caenorhabditis elegans cut-4 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 101150081330 MOC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000625767 Oryza sativa subsp. japonica Transcription factor TB1 Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 101100129496 Arabidopsis thaliana CYP711A1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100018067 Arabidopsis thaliana HTD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- IXVMHGVQKLDRKH-VRESXRICSA-N Brassinolide Natural products O=C1OC[C@@H]2[C@@H]3[C@@](C)([C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(C)C)C)C)CC3)CC[C@@H]2[C@]2(C)[C@@H]1C[C@H](O)[C@H](O)C2 IXVMHGVQKLDRKH-VRESXRICSA-N 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100083446 Danio rerio plekhh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000018700 F-Box Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010066805 F-Box Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100382855 Oryza sativa subsp. japonica CCD7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000702632 Rice dwarf virus Species 0.000 description 1
- 101100041989 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sds23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150016368 TAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 235000007241 Zea diploperennis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000017556 Zea mays subsp parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 241000172407 Zea mays subsp. huehuetenangensis Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- IXVMHGVQKLDRKH-KNBKMWSGSA-N brassinolide Chemical compound C1OC(=O)[C@H]2C[C@H](O)[C@H](O)C[C@]2(C)[C@H]2CC[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]3[C@@H]21 IXVMHGVQKLDRKH-KNBKMWSGSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N cephamycin Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](C)[C@]21OC UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- BYGOPQKDHGXNCD-UHFFFAOYSA-N tripotassium;iron(3+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] BYGOPQKDHGXNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用。本发明提供了OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体在促进植物分蘖中的应用。本发明的实验证明,在粳稻中花十号中克隆到一个OsMADS57基因,将其正向***表达载体,得到正义表达载体;利用正义表达载体导入水稻中花十号,得到正义转基因水稻株系,与野生型水稻相比,正义转基因水稻株系的分蘖增多。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用。
背景技术
植物株型是影响作物产量的重要因素之一,特别对水稻作物而言。目前知道水稻的分蘖数目、分蘖角度、植株高度、叶夹角、水稻穗子的大小和水稻小穗分支多少共同决定了水稻株型,而水稻的分蘖数和穗子的形状又是决定水稻产量的最重要因素。对于水稻分蘖发育而言,分蘖期是水稻营养生长的最主要时期,包括从分蘖芽的分化到幼穗的形成。一般水稻品种,生长环境条件(温度、水分、营养状况)及其种植密度也会影响分蘖的发育。生长周期长的水稻品种一般比生长周期短的水稻分蘖要少一些。水稻分蘖包括一级分蘖和二级分蘖。根据分蘖结实的情况,分蘖又分为有效分蘖和无效分蘖两种。有效分蘖的多少是决定水稻产量重要因素之一,所以我们通过各种手段尽可能的增加可育分蘖数量。
随着科学研究的进展,特别是水稻的基因组学和生物信息学的迅速发展。目前,水稻中与分蘖发育相关的一些基因陆续被克隆出来。如我国学者李家洋实验室克隆的MOC1基因直接影响水稻的分蘖数目,当该基因突变后表现出分蘖减少的表型,该基因的超表达转基因植株表现出分蘖增多的表型。该实验室最新研究发现MOC1相互作用的蛋白TAD1,编码这个蛋白的基因突变后表现出分蘖增多的表型。研究表明水稻中D17/HTD1及拟南芥同源基因MAX3和D10及拟南芥同源基因MAX4均编码类胡萝卜素切割双氧酶蛋白,它们分别简称carotenoid cleavage deoxygenate protein 7(CCD7)和carotenoid cleavage deoxygenate protein 8(CCD8)。MAX3和MAX4这两个基因参与了植物分支激素(独脚金内酯)的生物合成,这个激素合成的途径中发现位于CCD7和CCD8的下游存在另外一些关键基因,例如拟南芥中编码一种细胞色素P450酶MAX1,水稻还没有相关同源基因的报道。2009年李家洋课题组报道了一个和d10经典分蘖突变体表型类似的突变体d27,D27编码一个铁离子包含蛋白,亚细胞定位显示该基因和叶绿体共定位,主要在茎和根的微管细胞中表达。最终实验证据表明D27可能是独脚金内酯生物合成途径的一个新成员。另一个影响水稻分蘖发育的基因D3则编码一个含F-box的LRR蛋白,这个基因突变后也表现出分蘖增多的表型。2009年几个课题组相继报道了另一个和分蘖相关的突变体d14/htd2/d88,同样具有独脚金内酯途径中经典突变体的表型,即分蘖数增多和植株矮化,还表现出穗子变短和种子变小的表型。2003年日本一个课题组根据同源性分析发现玉米的TEOSINTEBRANCHED1(TB1)高度同源性基因OsTB1/FC1,该基因编码TCP转录因子家族的蛋白,是分蘖发育的负调控因子。这个基因的突变体表现出分蘖数增多和半矮化的表型,该基因超表达转基因植株表现出分蘖减少的表型。2009年日本另外一个课题组发现了这个基因的另一个突变体fc1,独脚金内酯处理该突变体的生理实验证明fc1表现出对这个激素不敏感的表型,作者推测OsTB1/FC1也可能位于MAX/RMS/D遗传途径的下游,部分参与了独脚金内酯的信号传导。2009年a rice dwarf and low-tillering(dlt)mutant被发现和研究,这个突变体表现出矮化和分蘖减少的表型,相应的DLT转基因证实了该突变体的表型,结果表明dlt突变体表现出类似于水稻中油菜素内酯缺陷和信号突变体的表型。
组成型超表达技术和反义转基因是一个已经发展比较成熟的研究基因功能的技术。它是将基因以正向和反向的方式***到强启动子的下游,可以使表达的基因转录本在体内得到强的表达和表达量降低,从而使目的蛋白表达量增加和表达量减少。当对某一个感兴趣的基因进行功能鉴定时,采用组成型超表达和反义转基因技术可以使我们了解在该基因的表达很大程度的增强和内源基因的表达量减少,研究目的基因表达增强和表达减少的情况下,植物的生长发育等过程是否会受到影响,从未可以推断该基因的可能的生物学功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体的新用途。
本发明提供了OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体在促进植物分蘖中的应用;
所述OsMADS57蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
上述应用中,所述OsMADS57蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸;
所述表达OsMADS57的重组载体为将所述OsMADS57的编码基因***表达载体中,得到表达OsMADS57的载体;
所述表达OsMADS57的重组载体具体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸***表达载体pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体,且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接,所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。
上述应用为将所述OsMADS57蛋白的编码基因导入目的植物中,得到分蘖数大于所述目的植物的转基因植物。
上述应用中,所述OsMADS57蛋白的编码基因通过所述表达OsMADS57的重组载体导入目的植物中。
上述应用中,所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物,所述单子叶植物具体为水稻。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法,为将上述的应用中的所述OsMADS57蛋白的编码基因导入目的植物中,得到分蘖数大于所述目的植物的转基因植物。
上述方法中,所述OsMADS57蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
上述方法中,所述重组载体具体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸***表达载体pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体,且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接,所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体,为将上述的应用中的所述OsMADS57的编码基因***表达载体中,得到表达OsMADS57的载体。
所述重组载体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸***表达载体pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体,且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接,所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。
本发明的实验证明,在粳稻中花十号中克隆到一个OsMADS57基因,将其正向***表达载体,得到正义表达载体;利用正义表达载体导入水稻中花十号,得到正义转基因水稻株系,与野生型水稻相比,正义转基因水稻株系的分蘖增多。
附图说明
图1为RT-PCR方法扩增到OsMADS57的全长
图2为超表达载体pUN-OsMADS57(正义)的物理图谱
图3为超表达转基因水稻(正义)的定量PCR鉴定
图4为OsMADS57超表达转基因水稻(正义)分蘖的表型
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、OsMADS57蛋白及其编码基因的获得
根据数据库分析的结果设计引物:
超表达载体构建使用引物:5′端引物:5’-CGGGATCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为BamHI位点,序列3),3′端引物:5’-GGGGTACCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为KpnI位点,序列4)。
提取粳稻中花十号三叶期幼苗总RNA,采用RT-PCR方法扩增到OsMADS57的726bp全长cDNA。具体操作过程如下:
1)植物总RNA的提取:选取100mg三叶期水稻中花十号(Oryza sativa L.cvZhonghua 10)的幼苗(李梅芳,水稻花培品种—中花10号,农业科技通讯,1998年第1期第26页。公众可从中国科学院植物研究所获得。)为材料,在液氮中研磨,将液氮中研碎的冻干粉转入到含1ml Trizol试剂(Invitrogen)的1.5ml离心管中,充分混匀;25℃放置5分钟;每管中加入0.2ml新鲜氯仿,剧烈振摇15秒,25℃温育2-3分钟;12,000rpm,4℃,离心15分钟;把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中,加0.5ml异丙醇,25℃放置10分钟使RNA沉淀;12,000rpm,4℃,离心10分钟;去上清,将RNA沉淀用1ml 75%乙醇清洗2次,超净台吹至半干;用50μl DEPC-ddH2O重悬沉淀,60℃水浴10分钟,以溶解RNA沉淀获得RNA溶液。将此RNA溶液分装后-70℃保存,备做反转录的模板。
2)RT-PCR:取1μl上述RNA溶液,用DEPC-ddH2O稀释100倍,用分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒(Promega)说明书,根据RNA的定量结果,取含有2μgRNA的上述RNA溶液,加1.0μg Oligo dT引物,用DEPC-ddH2O补充至15μl,混匀后70℃变性5分钟,冰浴5分钟。短暂离心后,加入25μl反转录混合物(5μlM-MLV 5×Reaction Buffer,6μl dNTP Mixture(2.5mM),1μl M-MLV ReverseTranscriptase,0.5μl RNase Inhibitor,12.5μl DEPC-ddH2O)。混匀后,42℃水浴1小时完成反转录过程;75℃水浴10分钟使反转录酶失活,得到含有第一链cDNA的混合物。
取1μl上述第一链cDNA作为PCR的模板,按以下体系进行PCR反应:0.2μl LATaq(5U/μl)、10μl 2×GC buffer,1.8μl dNTPs,0.5μl 5′端引物(10μM),0.5μl3′端引物(10μM),加ddH2O终体积20μl。
5′端引物和3′端引物分别如下:
以超表达构建引物序列5′端引物:5’-CGGGATCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为BamHI位点,序列3),3′端引物:5’-GGGGTACCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为KpnI位点,序列4)为引物,进行PCR扩增,得到PCR产物(正义)。
上述PCR程序为:94°C预变性30s后进入PCR循环,循环参数为98°C 10秒变性→55°C 15秒复性→72°C 40秒延伸,35个循环后在72°C继续合成10分钟。
将上述PCR产物(正义)经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离,结果如图1所示,PCR产物(正义)的条带大小为726bp。
回收PCR产物(正义)进行测序,结果为PCR产物(正义)的核苷酸序列具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸,序列1的OFR为序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸。该PCR产物的基因命名OsMADS57,OsMADS57编码的蛋白为OsMADS57,该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
实施例2、OsMADS57蛋白及其编码基因的应用
一、过表达载体pUN-MADS57(正义)
1、pUN1301质粒的获得
第一步:剪取约0.2g玉米幼苗,置于液氮中研磨;然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0,50mM EDTA,0.5M NaCl,1%SDS和1%β-巯基乙醇),剧烈振荡使其全部悬浮;65℃水浴30分钟,每5分钟颠倒混匀一次;然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液,立即颠倒混匀,冰浴5分钟;加入等量酚/氯仿,抽提一次,12000rpm离心5分钟;收集上清液,加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA,室温放置40分钟;4℃12000rpm离心15分钟,弃上清;沉淀用70%、100%乙醇各洗一次;干燥后,溶于20μL含100μg/mL RNaseA的ddH2O中,得到玉米基因组DNA。
第二步:取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板,以带有Hind III识别位点的5′引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)为引物,进行PCR扩增,PCR反应条件为:先94℃3分钟;再94℃45秒,62℃45秒,72℃2分钟,共35个循环,最后72℃10分钟。反应结束后,对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,表明得到长度约为2kb的扩增片段,与预期结果相符,回收该目的片段,用限制性内切酶Hind III和BamHI双酶切后回收,得到片段经测序,该片段为序列表中的序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸,为带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)。(玉米泛素启动子(UbiPro)也可以人工合成获得。)
第三步:用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI 121(北京拜尔迪生物技术有限公司目录号:MP-091)上切下,连接到载体pUC19(北京百泰克生物技术有限公司目录号:DP7801)的Sac I和EcoR I位点间,得到重组载体,命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶Hind III和BamHI双酶切pUC19-Noster,琼脂糖凝胶电泳检测后,回收线性化的载体大片段,并将该回收片段与第二步中经酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连,得到重组载体,命名为pUN19。
第四步:用限制性内切酶EcoR I部分酶切和Hind III完全酶切从第三步购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段,将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和Hind III位点处,得到重组载体,命名为pUN1301。
2、过表达载体pUN-MADS57(正义)的获得
用限制性内切酶KpnI和BamHI对1步骤获得的质粒pUN1301进行双酶切,酶切体系为:质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、BglII1μl(10U/μl)、SacI 0.8μl(10U/μl),加ddH2O补充反应体系至50μl,37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离,回收线性化的pUN1301大片段,溶于20μl ddH2O中。
用限制性内切酶KpnI和BamHI对由实施例1得到的726bp PCR产物(正义)进行双酶切,酶切体系为:质粒10μl,酶切缓冲液5μl、BamHI1μl(10U/μl)、加ddH2O补充反应体系至50μl,37℃酶切4个小时。再加入KpnI 0.2μl(10U/μl),37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离,用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断,回收726bp的OsMADS57片段(正义)。
将10μl回收的726bp的OsMADS57(正义)、6μl回收的载体pUN1301大片段溶液、2μl(3U/μl)T4 DNA连接酶和2μl 10x连接酶缓冲液混和,16℃连接16小时,得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。
提取阳性克隆中的重组质粒,进行测序验证,该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸***pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体,将该质粒命名为pUN-OsMADS57(正义),且序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接,序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。pUN-OsMADS57中启动子、基因和终止子的结构正确。在该表达载体中采用玉米泛素启动子(UbiPro)启动目的片段OsMADS57在植物中超表达,其物理图谱示意图如图2所示。
二、转OsMADS57水稻(正义)的获得及鉴定
1、转OsMADS57水稻(正义)的获得
参照电激仪(Easy JecT Plus电激仪,英国EquiBio公司)操作指南,将pUN-MADS57(正义)用电击法转化农杆菌EHA105(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11),经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌,命名为EHA105/pUN-OsMADS57(正义)。
将EHA105/pUN-OsMADS57(正义)导入中花十号水稻(Oryza sativaL.cv Zhonghua10,以下简称野生型水稻)的愈伤组织中,再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍,无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上,筛选一代;两周后,转移至N6D2S2培养基上筛选二代(2周/代);取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织,转移至分化培养基(1),上,在分化培养箱(12小时光周期,白天28℃,夜晚25℃)中培养7天;然后转移至分化培养基(2),上,在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗;待小苗长至10厘米左右时,打开容器封口膜,炼苗2-3天,然后将小苗移入人工气候室栽培,获得10个株系共60棵T0代转OsMADS57水稻(正义)。
所用培养基如下:
2、转OsMADS57水稻(正义)的鉴定
1)、GUS组织化学染色:
将由实施例1获得的70棵T0代转OsMADS57水稻(正义)的2-3mm长的根段分别放到GUS染色液中,抽气几分钟,然后置于37℃温育过夜,染色后的组织用70%乙醇脱色。根呈蓝色的植株即为阳性转基因材料。GUS染色液(pH 7.0)组分为:100mM Na3PO4(pH 7.0),0.1%Triton X-100,10mM EDTA,0.5mM亚铁***,0.5mM铁***,1mg/ml X-Gluc。结果共鉴定出6个株系合计50棵阳性T0代转OsMADS57水稻(正义),将此幼苗移至温室栽培,按照不同株系收种,得到T1代转基因种子,在此基础上经过繁种得到纯合T2代种子。在以后的实验中选取转OsMADS57水稻(正义)株系1(OE1)和2(OE2)的纯合种子T2为材料。
2)、定量PCR鉴定:
从OE1和OE2的T2转OsMADS57水稻(正义)幼苗中提取mRNA,并分别转录获得cDNA,以野生型水稻(水稻中花十号)为对照。利用荧光实时定量PCR法,以cDNA为模板,以1μl 5′端引物1(10μM)(5′-GCACCAACATGAAAACTGTGA-3′),1μl 3′端引物1(10μM)(5′-CTCCCTCTGCCAAATCTTAATT-3′)为引物,对阳性T2转OsMADS57水稻(正义)的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBR Green Realtime PCRMaster Mix(TOYOBO)。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液,稀释50倍作为模板,按以下体系进行PCR反应:10μl SYBRGreen Realtime PCR Master Mix,4μl模板,1μl 5′端引物1(10μM),1μl 3′端引物1(10μM),加ddH2O终体积20μl。
结果如图3所示,在Actin基因作为内参的情况下,与野生型水稻相比,OE1和OE2的T2幼苗中OsMADS57的表达丰度有了不同程度的上调,说明目的基因(OsMADS57)再转录水平已经成功表达。
采用同样的方法将空载体pUN1301导入野生型水稻中得到T0代转空载体水稻,从T0代转pUN1301水稻上收获T1代转pUN1301水稻种子,播种,从T1代转pUN1301水稻上收获T2代转pUN1301水稻种子。
三、转OsMADS57水稻(正义)的表型观察
将T2代转OsMADS57水稻(正义)的OE1和OE2种子、中花十号野生型水稻种子(ZH10)和T2代转pUN1301水稻种子,均播种在花卉营养土和蛭石的混合物里(两者的混合比例为4:1),30℃萌发后放在温室里(32℃)培养至3叶期,接着把生长的幼苗种植于水稻田中。每个株系30个,实验重复三次,结果取平均值。
对植株分蘖数进行观察,结果如下:
拍照如图4A所示,可以看出,与野生型水稻相比,T2代转OsMADS57水稻(正义)OE1的分蘖数增多。
在播种后约第70天统计T2代转OsMADS57水稻(正义)的OE1和OE2种子、中花十号野生型水稻种子(ZH10)和T2代转pUN1301水稻分蘖数,结果如图4B所示,T2代转OsMADS57水稻(正义)OE1、T2代转OsMADS57水稻(正义)OE2、中花十号野生型水稻(ZH10)的分蘖数分别为14个、17个和26个。
T2代转pUN1301水稻和野生型水稻结果无显著差异。
Claims (7)
1.OsMADS57蛋白或其编码基因或表达OsMADS57的重组载体在促进植物分蘖中的应用;
所述OsMADS57蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2;
所述植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述OsMADS57蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸;
所述表达OsMADS57的重组载体为将所述OsMADS57的编码基因***表达载体中,得到表达OsMADS57的载体;
所述表达OsMADS57的重组载体具体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸***表达载体pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体,且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接,所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述应用为将所述OsMADS57蛋白的编码基因导入目的植物中,得到的转基因植物的分蘖数大于所述目的植物。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述OsMADS57蛋白的编码基因通过所述表达OsMADS57的重组载体导入目的植物中。
5.一种培育转基因植物的方法,为将权利要求1-4中任一所述的应用中的所述OsMADS57蛋白的编码基因导入目的植物中,得到的转基因植物的分蘖数大于所述目的植物;
所述目的植物为水稻;
所述OsMADS57蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述OsMADS57蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述重组载体为将所述OsMADS57的编码基因***表达载体中,得到表达OsMADS57的载体;
所述重组载体具体为将所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸***表达载体pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体,且所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接,所述序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210182988.9A CN102690838B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210182988.9A CN102690838B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102690838A CN102690838A (zh) | 2012-09-26 |
CN102690838B true CN102690838B (zh) | 2014-03-26 |
Family
ID=46856573
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210182988.9A Expired - Fee Related CN102690838B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102690838B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105462992B (zh) * | 2016-01-06 | 2019-03-05 | 河南师范大学 | 水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101018864A (zh) * | 2002-12-26 | 2007-08-15 | 先正达合作有限公司 | 细胞增殖相关多肽及其应用 |
-
2012
- 2012-06-05 CN CN201210182988.9A patent/CN102690838B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Oryza sativa japonica group Os02g0731200(Os02g0731200)mRNA,complete cds NCBI Reference Sequence:NM_001054553.1;Tanaka,T et al;《GenBank 数据库》;20100608;1-3 * |
Tanaka,T et al.Oryza sativa japonica group Os02g0731200(Os02g0731200)mRNA,complete cds NCBI Reference Sequence:NM_001054553.1.《GenBank 数据库》.2010,1-3. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102690838A (zh) | 2012-09-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102675441B (zh) | OsMADS57蛋白或其编码基因在抑制水稻分蘖中的应用 | |
CN103695438B (zh) | 拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用 | |
CN102329805B (zh) | 一种水稻OsMYB基因的编码序列和应用 | |
CN113667693B (zh) | 一种快速实现植物遗传转化的方法 | |
CN107674873A (zh) | 小麦热激转录因子基因TaHsfA2i及其编码蛋白与应用 | |
AU2020100982A4 (en) | Wheat salt tolerance gene taaap3 and its application | |
CN102690341A (zh) | 一种与植物分蘖相关蛋白及其编码基因 | |
Chen et al. | Enhance sucrose accumulation in strawberry fruits by eliminating the translational repression of FabZIPs1. 1 | |
CN103388004B (zh) | OsGRF6蛋白在调控植物株高中的应用 | |
CN102220330A (zh) | 一种与植物抗旱性相关的miRNA——gma-miR156b及其应用 | |
CN102690838B (zh) | OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 | |
CN114085854B (zh) | 一种水稻抗旱、耐盐基因OsSKL2及其应用 | |
CN102533761A (zh) | 一种花粉特异性启动子及其表达载体和应用 | |
CN115851821A (zh) | Bbx16基因在提高植物盐耐受性中的应用 | |
CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
CN113024645B (zh) | 小麦转录因子wrky70基因在调控植物生长发育中的应用 | |
CN102676520B (zh) | microRNA444a或其编码基因在调控水稻株高中的应用 | |
CN102417911B (zh) | 过表达甘蓝型油菜BnLAS基因提高植物抗旱性 | |
CN104513825A (zh) | 一种小麦耐盐基因TaNAS1及其应用 | |
CN110129337A (zh) | 玉米高亲和磷转运体ZmPHT1;5基因启动子的缺失突变体及其应用 | |
CN103387983B (zh) | microRNA396d或其编码基因在调控水稻叶夹角中的应用 | |
CN103923916A (zh) | OsFLA19蛋白在调控植物叶夹角中的应用 | |
CN113025621B (zh) | Cipk14基因在提高木豆抗旱中的应用 | |
CN117431256B (zh) | 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 | |
CN103788187A (zh) | 植物开花相关蛋白GmSOC1-like及其编码基因与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140326 Termination date: 20190605 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |