CN102676613B - 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，属于食品技术领域。本发明以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离等，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖。本发明涉及的一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时制备，为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备提供了技术依据。
Description
技术领域
一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，属于食品工业技术领域。
背景技术
硫酸软骨素（CS），作为糖胺聚糖的一种，是三种最重要的糖胺聚糖之一。它由D-葡糖醛酸与N-乙酰-D-氨基半乳糖酸硫酸酯组成，是广泛存在于人类和动物的喉骨、鼻中隔、气管等软骨组织中的一类酸性黏多糖。高分子质量的CS表现出高的生物活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化作用、抗炎、免疫调节、抗氧化等，不仅在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用，并已用于医药及临床的应用。但由于高分子量，高表观粘度、低水溶性及复杂的结构，大部分高分子多糖很难通过组织屏障与细胞内部的受体结合。且由于细胞膜的选择透过性等因素，临床应用中大部分糖胺聚糖面临生物利用率较低的主要问题。最近几年，低分子质量CS的功能特性越来越受到人们的重视。与其它糖胺聚糖，如透明质酸，硫酸类肝素相比，低分子量CS的研究相对落后。目前国内对CS的研究主要集中于CS的提取、生理活性及衍生物等方面，对CS寡糖的研究未见报道，国际上对CS寡糖的分离提纯报道也不多，单一寡糖的研究较少。本发明涉及的一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离等，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖，首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时制备，为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备提供了技术依据；为糖类化合物的糖库的建立及糖类药物的筛选提供重要的分离手段；可为临床药物的生产提供一定的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法。
本发明的技术方案：一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离等，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖。步骤为：
（1）硫酸软骨素的酶法降解
将0.2 g硫酸软骨素溶解于10 mL pH 5.9的磷酸盐缓冲液中，置于37℃保温10 min，使其与反应温度达到一致，后向底物溶液中加入透明质酸酶HAase，使其酶活为1.4×105
u/L，以150转/分钟的振荡速度振荡反应22h-24h；反应结束后，加热煮沸20min使酶失活，4000r/min离心15min，取上清液加3倍体积95%乙醇沉淀，静置，用10mL无水乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素寡糖；
（2）硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离
将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150 cm的玻璃层析柱，用去离子水将硫酸软骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液，上样量1 mL，用5倍柱体积的超纯水以4 mL/min流速洗脱，用分布收集器Redfrac95定时自动收集，4mL/管，用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定糖的出峰位置；
（3）G-10脱盐：收集到的样品40℃旋转蒸发浓缩后经Sephadex G-10，1.6×150 cm，脱盐分离以后，浓缩样品到约50mL，再冻干，以捕获自由基能力为检测指标，筛选出抗氧化活性最高的硫酸软骨素寡糖，作为下一步分离对象；
（4）硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离
装柱：将浸泡好的DEAE纤维素52，沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中2cm×20cm，避免胶中气泡产生（如果产生气泡，可用玻璃棒轻轻搅拌，使气泡溢出），根据重力作用使凝胶慢慢沉降，并保持表面平整；
预平衡：层析柱接好恒流泵后，用超纯水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脱3-5个柱体积至基线平稳；
样品处理：将步骤（3）筛选出的硫酸软骨素寡糖用超纯水溶解至10 mL，上样到DEAE纤维素52阴离子交换柱；
洗脱：上样1mL，用0-1mol/L NaCl梯度洗脱75min，洗脱速率为2mL/min，210nm紫外检测；收集各洗脱峰；
（5）硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的天然制备凝胶电泳分离
溶液配制：
A液：硼酸0.1mol/L，Tris 0.1mol/L，乙二胺四乙二酸0.01 mol/L，加水溶解使pH8.3。
质量浓度5%的浓缩胶：每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75
g、甲叉双丙烯酰胺0.25 g，并用盐酸调pH 6.3；每3mL浓缩胶加入10%过硫酸铵水溶液100μL，TEMED10μL。
质量浓度35%的分离胶：每100 mL分离胶含丙烯酰胺31.82 g、甲叉双丙烯酰胺3.18 g和蔗糖15 g。每10mL分离胶加入10%过硫酸铵水溶液200μL，TEMED 20μL。
分离胶和浓缩胶均用A液配制。
电极缓冲液：甘氨酸1.25 mol/L，Tris 0.2 mol/L，加水溶解使pH
8.3。
上样：将经DEAE-52阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样。
电泳条件：室温，400V，4-5h。
染色：0.5%甲苯胺蓝溶于2%乙酸溶液中，染色10min。
脱色：2%乙酸脱色。
样品收集：样品脱色后，分别将电泳条带中含量最多组分剪下，捣碎，置于1mL PBS溶液中震荡。12h后离心，取上清液，置于4℃保存。沉淀继续置于1mL PBS溶液中震荡。重复三次后，将三次所得上清液过AKTA superdex peptide柱脱盐，冷冻干燥即得硫酸软骨素二糖、四糖、六糖。
本发明的有益效果：本发明方法首次实现了硫酸软骨素二糖、四糖、六糖三种硫酸软骨素寡糖的制备，首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时制备，为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备提供了技术依据。
附图说明
图1：硫酸软骨素寡糖的 DEAE纤维素52层析图。
图2：硫酸软骨素寡糖的制备PAGE电泳图。A为图1中A峰的PAGE电泳图，B为图1中B峰的PAGE电泳图，C为图1中C峰的PAGE电泳图；图中画圈部分为提供下一步经凝胶过滤色谱柱进行分子量鉴定的组分a、b、c。
图3：硫酸软骨素二糖、四糖、六糖分子量测定图。a为图2中组分a（硫酸软骨素二糖）分子量测定图、b为图2中组分b（硫酸软骨素四糖）分子量测定图、c为图2中组分c（硫酸软骨素六糖）分子量测定图。
具体实施方式
实施例1
1、酶法降解制备硫酸软骨素寡糖
将0.2 g硫酸软骨素溶解于10 mL pH 5.9的磷酸盐缓冲液中，置于37℃保温10 min，使其与反应温度达到一致，后向底物溶液中加入透明质酸酶（HAase，来自牛睾丸），使其酶活为1.4×105
u/L，150转/分钟振荡反应22h。反应结束后，加热煮沸20min使酶失活，4000r/min离心15min，取上清液加3倍体积95%乙醇沉淀，静置，用10mL无水乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素低聚糖A，并测定所得降解产物的总抗氧化活性（TOA）。
2、总抗氧化活性的测定
据总抗氧化能力（TOA）测定试剂盒说明书测定。
测定原理：机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。
在37℃时，每分钟每毫升溶液使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01，为一个总抗氧化能力单位。
3、硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离
将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150 cm的玻璃层析柱，用去离子水将o-CS配制成40 mg/mL的溶液，上样量1 mL，用5倍柱体积的超纯水以4 mL/min流速洗脱，用分布收集器(Redfrac95)定时自动收集，4mL/管，用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定糖的出峰位置。收集到的样品40℃旋转蒸发浓缩后经Sephadex G-10（1.6×150 cm）脱盐。分离以后浓缩样品到一定的体积再冻干。以总抗氧化活性（TOA）为检测指标筛选出抗氧化活性最高的低分子量CS作为下一步分离对象。
4、咔唑反应检测糖醛酸含量
咔唑试液的配制：咔唑0.0625g，加无水乙醇50mL，震荡使溶解，即得。
硼砂硫酸液：四硼酸钠2.385g，溶于浓硫酸500mL，即得。
标准曲线的制作：
CS标准品500mg溶于10mL水中。精密量取CS标准液0.0mL，0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，置于具塞试管中，各加水至1mL摇匀，冷却至4℃左右。后振摇下缓缓加入硼砂硫酸液5mL，将试管置于沸水浴中加热10min，置常温水中冷却至室温。精密加入咔唑试液0.2mL，混匀，置沸水浴中再加热15min，冷却至室温。在波长530nm处测定吸光度A，以吸光度A对浓度C作图绘制标准曲线。
5、硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离
装柱：将浸泡好的DEAE纤维素52，沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中（2cm×20cm），避免胶中气泡产生（如果产生气泡，可用玻璃棒轻轻搅拌，使气泡溢出）。根据重力作用使凝胶慢慢沉降，并保持表面平整。
预平衡：层析柱接好恒流泵后，用超纯水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脱3-5个柱体积至基线平稳。
样品处理：经凝胶过滤分离筛选出的抗氧化活性最高的组分冻干粉用超纯水溶解至10mL，上DEAE纤维素52阴离子交换柱进行进一步分离。
洗脱：上样1mL，用0-1mol/L
NaCl梯度洗脱75min，洗脱速率为2mL/min，210nm紫外检测；收集各洗脱峰（图1）。
6、硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的天然制备电泳分离
溶液配制：
A液：硼酸0.1mol/L，Tris 0.1mol/L，乙二胺四乙二酸0.01 mol/L，加水溶解使pH8.3。
5%浓缩胶：每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75 g、甲叉双丙烯酰胺0.25 g，并用盐酸调pH
6.3。每3mL浓缩胶加入10%过硫酸铵水溶液100μL，TEMED10μL。
35%分离胶：每100 mL分离胶含丙烯酰胺31.82 g、甲叉双丙烯酰胺3.18
g和蔗糖15 g。每10mL分离胶加入10%过硫酸铵水溶液200μL，TEMED20μL。
分离胶和浓缩胶均用A液配制。
电极缓冲液：甘氨酸1.25 mol/L，Tris 0.2 mol/L，加水溶解使pH
8.3。
上样：将经DEAE-52阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样。
电泳条件：室温，400V，4-5h。
染色：0.5%甲苯胺蓝溶于2%乙酸溶液中，染色10min。
脱色：2%乙酸脱色。
样品收集：样品脱色后，分别将电泳条带中含量最多组分剪下，捣碎，置于1ml PBS溶液中震荡。12h后离心，取上清液，置于4℃保存。沉淀继续置于1ml PBS溶液中震荡。重复三次后，将三次所得上清液过AKTA superdex peptide柱脱盐，冷冻干燥即得硫酸软骨素二糖、四糖、六糖（图2）。
7、硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的分子量的测定
采用高效凝胶过滤色谱（HPGPC）法测定分离所得硫酸软骨素二糖、四糖、六糖（图3）。色谱柱：Ultrahydrogel™Linear 300mm×7.8mmid×2；流动相：0.1mol/L NaNO3；流速：0.9 mL/min；柱温：45℃；检测器：2410示差折光检测器。
Claims (1)
1.一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，其特征在于，以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖；具体步骤为：
（1）硫酸软骨素的酶法降解
将0.2 g硫酸软骨素溶解于10 mL
pH 5.9的磷酸盐缓冲液中，置于37℃保温10 min，使其与反应温度达到一致，后向底物溶液中加入透明质酸酶HAase，使其酶活为1.4×105 u/L，以150转/分钟的振荡速度振荡反应22h-24h；反应结束后，加热煮沸20min使酶失活，4000r/min离心15min，取上清液加3倍体积95%乙醇沉淀，静置，用10mL无水乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素寡糖；
（2）硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离
将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150 cm的玻璃层析柱，用去离子水将硫酸软骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液，上样量1 mL，用5倍柱体积的超纯水以4 mL/min流速洗脱，用分布收集器Redfrac 95定时自动收集，4mL/管，用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定糖的出峰位置；
（3）G-10脱盐：收集到的样品40℃旋转蒸发浓缩后经过由Sephadex G-10装成的1.6×150 cm层析柱脱盐分离以后，浓缩样品到50mL，再冻干，以捕获自由基能力为检测指标，筛选出抗氧化活性最高的硫酸软骨素寡糖，作为下一步分离对象；
（4）硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离
装柱：将浸泡好的DEAE纤维素52，沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中2cm×20cm，避免胶中气泡产生，如果产生气泡，用玻璃棒轻轻搅拌，使气泡溢出，根据重力作用使凝胶慢慢沉降，并保持表面平整；
预平衡：层析柱接好恒流泵后，用超纯水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脱3-5个柱体积至基线平稳；
样品处理：将步骤（3）筛选出的硫酸软骨素寡糖用超纯水溶解至10 mL，上样到DEAE纤维素52阴离子交换柱；
洗脱：上样1mL，用0-1mol/L NaCl梯度洗脱75min，洗脱速率为2mL/min，210nm紫外检测；收集各洗脱峰；
（5）硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的天然制备凝胶电泳分离
溶液配制：
A液：硼酸0.1mol/L，Tris 0.1mol/L，乙二胺四乙二酸0.01
mol/L，加水溶解使pH8.3；
质量浓度5%的浓缩胶：每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75 g、甲叉双丙烯酰胺0.25 g，并用盐酸调pH 6.3；每3mL浓缩胶加入10%过硫酸铵水溶液100μL，TEMED10μL；
质量浓度35%的分离胶：每100 mL分离胶含丙烯酰胺31.82 g、甲叉双丙烯酰胺3.18
g和蔗糖15 g；每10mL分离胶加入10%过硫酸铵水溶液200μL，TEMED 20μL；
分离胶和浓缩胶均用A液配制；
电极缓冲液：甘氨酸1.25
mol/L，Tris 0.2 mol/L，加水溶解使pH 8.3；
上样：将经DEAE-52阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样；
电泳条件：室温，400V，4-5h；
染色：0.5%甲苯胺蓝溶于2%乙酸溶液中，染色10min；
脱色：2%乙酸脱色；
样品收集：样品脱色后，分别将电泳条带中含量最多组分剪下，捣碎，置于1mL PBS溶液中震荡，12h后离心，取上清液，置于4℃保存，沉淀继续置于1mL PBS溶液中震荡，重复三次后，将三次所得上清液过AKTA superdex peptide柱脱盐，冷冻干燥即得硫酸软骨素二糖、四糖、六糖。
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