CN105001348B - 一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，属于海藻加工利用技术领域。本发明采用海蕴为原材料，采用高压匀浆的方法提取岩藻多糖，提取时间短，提取效率高，而且最大程度的保留了岩藻多糖天然组分的含量。通过与化学降解法或酶法降解法相结合降解岩藻多糖、超滤技术，最终获得抗肿瘤活性明显的中低分子量的岩藻多糖。本发明制得的岩藻多糖的得率在21％‑34％，纯度85％‑90％，其中岩藻糖含量达70％‑75％，有机硫酸跟含量达20％‑30％。
Description
技术领域
本发明涉及一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，属于海藻加工利用技术领域。
背景技术
我国藻类资源丰富，尤以褐藻资源突出，是海藻生产和消费大国。褐藻中含有丰富的多糖成分，如褐藻胶，海带多糖，卡拉胶等，均已成为重要的食品或医药原料并被广泛应用。在我国、日本冲绳、沿海均有分布。
岩藻多糖(Fucoidan)，是褐藻中所固有的细胞间多糖，存在于细胞壁基质中。近代研究表明，岩藻多糖具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、促进肌肤再生、皮肤保湿等超过20项的生理功效，低分子量岩藻多糖尤其以抗肿瘤功效最为突出。与灵芝多糖、姜黄素等相比，岩藻多糖不仅能够增强人体免疫力，而且具有诱导肿瘤细胞凋亡的特殊功效，在功能性食品和药品行业具有很大的发展潜力。
岩藻多糖主要成分是L-岩藻糖，线性主链一般是岩藻糖以α-1,3或α-1,4糖苷键连接而成同时伴有半乳糖，甘露糖，葡萄糖，木糖等单糖组分的硫酸化杂多糖。吴兴中等研究发现岩藻糖链在肝癌细胞迁移中可起到抑制作用，外源性的加入岩藻糖糖链时，癌细胞迁移抑制呈浓度依赖性，由此可知，该多糖中岩藻糖的含量与岩藻多糖的生物学活性具有相关联系。一般以褐藻为来源的岩藻多糖的岩藻糖含量在10-50％。硫酸多糖中硫酸根的含量是决定其活性大小的极为重要的指标，同时也是研究构效关系的重要方面。对来源于褐藻的天然硫酸多糖岩藻多糖，硫酸根的存在对其物理化学性质及生物活性同样具有重要影响，因此硫酸根的含量是鉴定岩藻多糖样品及分析构效关系的重要参数。岩藻多糖的传统提取方法中以水提法和酸提法最为常见，然而采取传统的提取发法所得的岩藻多糖杂质多，得率低，品质低。当今市场所出售的岩藻多糖品质不高，含有部分褐藻胶成分，质量不足以用于保健品行业，故寻求“高附加值，高效率，低成本”的海藻加工技术已成为新的发展方向。由于原岩藻多糖分子质量大、溶解性差，不容易被吸收，严重限制了其应用，但经过部分降解的低分子质量岩藻多糖，生物活性更加显著，研究表明，分子量8000-30000的岩藻多糖抗肿瘤活性较高。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，是从海蕴中制备抗肿瘤岩藻多糖的的方法，该方法可高效制备出环保、无污染、高纯度的岩藻多糖产品。
本发明的目的是提供一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，所述方法包括：以海蕴为原料，经高压均质、离心取上清、乙醇沉糖、过滤、干燥，得岩藻多糖。
所述高压均质，在本发明的一种实施方式中，是在10-20Mpa下，按料水比1:30-1:160，均质1-3次。
所述料水比，在本发明是指海蕴的干重与水的质量比。
所述海蕴，在本发明的一种实施方式中，是干海蕴(湿度可以是8-10％)或者新鲜海蕴。当使用干海蕴作为原料时，先加水泡一泡，吸水溶胀后再进行高压均质。
所述乙醇沉糖，在本发明的一种实施方式中，是使用体积分数为70-80％的乙醇。
所述乙醇沉糖，在本发明的一种实施方式中，是取离心后的上清液，即提取液，加入3-4倍体积的无水乙醇，混匀、静置，得沉淀物。
所述离心，在本发明的一种实施方式中，是在4000-5000rpm下离心10-15min。
所述过滤，在本发明的一种实施方案中，是采用离心或者板框过滤。
所述干燥，在本发明的一种实施方案中，为真空干燥。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，离心取上清与乙醇沉糖步骤之间，还包括化学降解或者酶法降解、超滤，以获得相应分子量范围的岩藻多糖。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)高压均质：取海蕴，按料水比1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均质1-3次；(2)离心取上清：将高压均质后的物料进行离心，取上清液，即为提取液；(3)化学降解：浓缩提取液至原体积的1/4-1/2，然后加入30％的H2O2，，50-60℃水浴，降解1-4h，调节降解液pH至中性，然后加过氧化氢酶反应10-20min；(4)超滤：降解液流经不同截留分子量的超滤柱，得截留液；(5)乙醇沉糖：在上一步得到的截留液中加入3-4倍体积的无水乙醇，混匀，静置；(6)沉淀物经过滤、干燥，即得岩藻多糖。
所述步骤(3)，在本发明的一种实施方式中，30％H2O2的添加量为每L中添加5-8mL。
所述步骤(3)，在本发明的一种实施方式中，过氧化氢酶酶活为1万-5万U/mL，添加量0.1-0.4mL/L。
所述步骤(3)，在本发明的一种实施方式中，是采用截留分子量为30KD、10KD的超滤柱，从而得到分子量在10000-30000之间的岩藻多糖。
所述步骤(3)，在本发明的一种实施方式中，是采用减压浓缩，条件为温度70-75℃，真空度为-0.1MPa。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)高压均质：取海蕴，按料水比1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均质1-3次；(2)离心取上清：将高压均质后的物料进行离心，取上清液，即为提取液；(3)酶法降解：浓缩提取液，加柠檬酸-柠檬酸钠调pH至5-6，按照每L浓缩提取液添加50-55U的岩藻多糖酶，降解2-5h，降解液过超滤柱，得截留液；(5)乙醇沉糖：在上一步得到的截留液中加3-4倍体积的无水乙醇，混匀，静置；(6)沉淀物经过滤、干燥，即得岩藻多糖。
所述岩藻多糖酶，在本发明的一种实施方式中，提取自黑曲霉。
所述岩藻多糖酶，在本发明的一种实施方式中，是通过以下方式得到的：将黑曲霉进行液体发酵培养，发酵液离心后的上清液为粗酶液1，菌体经复溶、超声破碎、冷冻离心后的上清为粗酶液2；取粗酶液，4℃加入硫酸铵固体至饱和度为80％，搅拌2h，静置过夜，10000rpm/min，冷冻离心20min，收集沉淀，T-buffer溶解，10000rpm/min，冷冻离心20min后取上清，并在4℃下透析24h，浓缩，过DEAE-sepharose FF阴离子交换柱，T-buffer平衡，用0-2M NaCl梯度洗脱,收集洗脱峰，合并组分，浓缩，在4℃下透析24h，浓缩，过凝胶色谱柱sphacryl S-300,磷酸缓冲液平衡，洗脱收集活性组分，浓缩，冻干得纯酶。
所述岩藻多糖酶，在本发明的一种实施方式中，其酶活测定方法为：将待测酶液加到0.5％岩藻多糖溶液(用缓冲液配制)，在50℃，反应1h。沸水浴灭酶15min，用DNS法测定还原糖含量，空白为将待测酶液于沸水浴15min后，再进行上述操作；酶活单位定义为50℃、pH值6.0条件下每小时释放1μmol岩藻糖需要的酶量。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，高压均质步骤后紧接水提步骤；所述水提是在超声或者搅拌条件下进行。
所述水提，在本发明的一种实施方式中，是将高压均质后的物料，在超声或者搅拌条件下提取1-6h，然后再进行下一步的离心操作。
所述水提，在本发明的一种实施方式中，是在50-60℃水浴下进行。
所述水提，在本发明的一种实施方式中，是反复提取2-3次，提取液合并。
本发明所具有的优点：
1.本发明采用海蕴为原材料，采用高压匀浆的方法提取岩藻多糖，提取时间短，提取效率高，而且最大程度的保留了岩藻多糖天然组分的含量。
2.本发明利用高压匀浆，与化学降解法或酶法降解法相结合降解岩藻多糖，通过超滤技术，最终获得抗肿瘤活性明显的中低分子量的岩藻多糖。
3.本发明提取条件温和，不用酸碱类，最大限度的保证了岩藻多糖的生物活性，而且提取过程中无酸碱类废液的排放，有利于环保。
4.本发明制得的岩藻多糖的得率在21％-35％，纯度85％-90％，其中岩藻糖含量达70％-75％，有机硫酸跟含量达20％-23％，分子量10000-30000，达到市场一级以及优级品标准。
具体实施方式
岩藻多糖测定：采用苯酚硫酸法测多糖，以岩藻糖标准做标准曲线；以岩藻糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程y＝0.0135x+0.0066，R2＝0.9991。
岩藻多糖的单糖组分分析：离子色谱-脉冲安培法(IC-PAD)，色谱柱为CarboPacPA20；流动相：H2O，250mmol/LNaOH，1mol/L NaAc；流速：0.5mL/min；检测器：脉冲安培检测器。
样品前处理：称取多糖样品1mg溶于1.0mL 4mol/L三氟乙酸,充氮气封管，90℃水解1h，冷却后用氮气吹干，加水10mL溶解，用微孔过滤膜过滤后供进样。
硫酸根含量测定使用明胶-氯化钡法、比浊法测定。
实施例1：高压均质法直接提取岩藻多糖
称取干海蕴50g，粉碎机粉碎，100目过筛，按照干海蕴：水＝1:30的质量比加水，浸泡一段时间，搅匀，在15Mpa下，均质1次。
高压均质后，于4000rpm下离心15min，取离心后的上清液(即提取液)，提取液浓缩，按每L提取液加入3体积的无水乙醇，混匀、静置，得沉淀物。沉淀物经过滤、真空干燥，即得精制的岩藻多糖。
得到岩藻多糖15.48g，得率为30.96％(产物/原料干重×100)，纯度为88.22％，有机硫酸根含量22.03％。其中岩藻多糖中岩藻糖的摩尔含量为73.84％。
实施例2：高压均质法结合化学降解法提取岩藻多糖(1)
称取新鲜海蕴0.5kg(干重约20-25g)，清洗干净，加入1.5kg水(即料水比1:60-1:75)，在20Mpa下，均质1次。然后于5000rpm下离心10min，取离心后的上清液(即提取液)。将提取液浓缩至原体积的1/2，然后按照每L液体中添加8mL的30％的H2O2，60℃水浴，降解1h，1M NaOH溶液调节降解液pH至中性，然后加过氧化氢酶反应20min。降解液流经截留分子量为30KD、10KD的超滤柱，收集10-30KD的浓缩液得截留液，在截留液中加4倍体积的无水乙醇，混匀，静置24h，收集固体沉降物；沉淀物经板框过滤、50℃减压干燥，即得岩藻多糖。
得到岩藻多糖6.84g，得率为27.4-34％，纯度为84.26％，分子量10000-30000，有机硫酸根含量20.35％。其中岩藻多糖中岩藻糖的摩尔含量为75.19％。
实施例3：高压均质法结合化学降解法提取岩藻多糖(2)
称取新鲜海蕴0.5kg(干重约20-25g)，清洗干净，加水4kg(即料水比1:160-1:200)，在10Mpa下，均质3次。离心，取上清液(即提取液)。将提取液浓缩至原体积的1/4，然后按照每L液体中添加5mL的30％的H2O2，50℃水浴，降解4h，1M NaOH溶液调节降解液pH至中性，然后加过氧化氢酶反应10min。降解液流经截留分子量为30KD、10KD的超滤柱，收集10-30KD的浓缩液得截留液，在截留液中加4倍体积的无水乙醇，混匀，静置，收集固体沉降物；沉淀物经板框过滤、50℃减压干燥，即得岩藻多糖。
得到岩藻多糖5.18g，得率为20.72-25.9％，纯度为82.97％，分子量10000-30000，有机硫酸根含量20.18％。其中岩藻多糖中岩藻糖的摩尔含量为72.36％。
实施例4：“高压均质法+水提+酶法降解”提取岩藻多糖
称取新鲜海蕴0(干重为20-25g)，清洗干净，加入2.5kg的水(即料水比1:100)，在10Mpa下，均质2次。离心，取上清液(即提取液)。将高压均质后的物料置于50-60℃水浴中，在超声或者搅拌条件下提取1-6h，离心得到提取液。
酶法降解：浓缩提取液，加柠檬酸-柠檬酸钠调pH至5-6，按照每L浓缩提取液添加50-55U的岩藻多糖酶，降解2-5h，降解液流经截留分子量为30KD、10KD的超滤柱，收集10-30KD的浓缩液得截留液，在截留液中加3倍体积的无水乙醇，混匀，静置，收集固体沉降物；沉淀物经板框过滤、50℃减压干燥，即得岩藻多糖。
得到岩藻多糖6.9g，得率为27.6％-34.5％，纯度为89.46％，有机硫酸根含量22.09％。其中岩藻多糖中岩藻糖的摩尔含量为73.18％。
实施例5：高压均质对岩藻多糖品质的影响
称取新鲜海蕴，清洗干净，加水4kg，在5-25Mpa下，均质1次。离心，取上清液，浓缩，然后添加30％的H2O2，50℃水浴降解，调节降解液pH至中性，再加过氧化氢酶反应10min。降解液流经不同截留分子量的超滤柱，得截留液，在截留液中加4倍体积的无水乙醇，混匀，静置，收集固体沉降物；沉淀物经过滤、减压干燥，即得岩藻多糖。
改变高压均质的压强条件，其他步骤一致，比较了不同压强对提取得到的岩藻多糖的影响。结果如表1所示。结果表明，压强太低(5MPa以下)会影响岩藻多糖的得率，而压强过高(25MPa)会影响SO4 2-含量，从而影响岩藻多糖的生物活性。
表1 高压均质压强对产品的影响
实施例6：原料种类对岩藻多糖品质的影响
改变原料种类，采用10Mpa，其他步骤与实施例5一致，比较了从不同原料中采用相同方法提取得到的岩藻多糖的结果，如表2所示。结果表明，按本发明方法，以海蕴为原料提取岩藻多糖，得率可达21.36％，远远高于海带和裙带菜。同时多糖含量和SO4 2-含量也显著提高，岩藻糖含量可达74％。
表2 原料对产品的影响
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，其特征在于，
所述方法包括：(1)高压均质：取海蕴，按料水比1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均质1-3次；(2)离心取上清：将高压均质后的物料进行离心，取上清液，即为提取液；(3)化学降解：浓缩提取液，在提取液加入30％的H2O2，50-60℃水浴，降解1-4h，调节降解液pH至中性，然后加过氧化氢酶反应10-20min；(4)超滤：降解液流经不同截留分子量的超滤柱，得截留液；(5)乙醇沉糖：在上一步得到的截留液中加3-4倍体积的无水乙醇，混匀，静置；(6)沉淀物经过滤、干燥，即得岩藻多糖；
或者所述方法包括：(1)高压均质：取海蕴，按料水比1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均质1-3次；(2)离心取上清：将高压均质后的物料进行离心，取上清液，即为提取液；(3)酶法降解：浓缩提取液，加柠檬酸-柠檬酸钠调pH至5-6，按照每L浓缩提取液添加50-55U的岩藻多糖酶，降解2-5h，降解液过超滤柱，得截留液；(5)乙醇沉糖：在上一步得到的截留液中加3-4倍体积的无水乙醇，混匀，静置；(6)沉淀物经过滤、干燥，即得岩藻多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压均质步骤后紧接水提步骤；所述水提是在超声或者搅拌条件下进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水提是将高压均质后的物料，在超声或者搅拌条件下提取1-6h，然后再进行下一步的离心操作。
4.根据权利要求1-3任一所述方法得到的岩藻多糖。
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