CN115806973A

CN115806973A - 一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法及应用

Info

Publication number: CN115806973A
Application number: CN202211622325.4A
Authority: CN
Inventors: 冯超; 苏畅; 陈西广; 丛欣
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2042-12-16
Also published as: CN115806973B

Abstract

本发明属于生物材料技术领域，涉及一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法及应用，其方法包括如下步骤：1)硅藻生物硅的金属矿化；2)生物质的快速提取。本发明无需复杂的反应容器和溶剂，不会破坏生物质结构，通过改变pH调节金属矿化的硅藻生物硅对不同生物质的吸附强度实现吸附收集、解吸附收集，进一步提高生物质纯度；通过引入金属矿化的硅藻生物硅和缓冲液从生物样本中快速提取和分离生物质，选择性将金属元素固化在硅藻生物硅表面，减少分离后生物质中的金属残留，操作简单，提取效率高；是一种简便、快速、稳定提取生物质的方法，降低了生物质提取成本，特别适用于生物诊断检测及下游分子生物学的研究。

Description

一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法及应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法及应用，利用硅藻生物硅的层级多孔结构对生物质进行快速提取并检测。

背景技术

核酸扩增检测(Nucleic acid amplification tests，NAATs)行业规模的不断扩大使得生物诊断检测领域越来越受到人们的重视。作为生物诊断检测的重要组成部分和必备过程，如何快速有效提取生物质这一问题受到研究者的广泛关注。

目前，领域内广泛采用的生物质提取方法主要分为液相提取和固相提取。液相提取是根据化合物的相对溶解度不同，对生物质化合物来进行分离，其中有机溶剂萃取法是最经典的液相提取法，然而由于其涉及的有毒试剂较多，且提取周期长，已逐渐被淘汰。与液相提取相比，生物质的固相提取具有分离效率高，污染风险低和样品需求少的特点。目前最常用的固相提取法是离心柱法和磁珠法。磁珠法存在材料价格昂贵且样本提取量小的缺点，应用限制较多。除磁珠外，二氧化硅材料也常作为固相基质用于生物质提取，其价格相对低廉，目前多用于离心柱的基材，配合含金属盐的缓冲液体系完成生物质提取。但现有技术使用的缓冲体系中的金属盐对生物质的活性会带来后续不良效应，例如拜奥卡蒂斯生物股份有限公司的公开号为CN114450419A的中国发明专利申请，公开了一种利用二氧化硅固体支持物来进行核酸提取的方法，该方法可从溶液中高效富集核酸分子，然而提取缓冲液引入了多种金属离子，导致其对于下游的核酸扩增反应产生抑制，增加了后续检测的难度。因此，如何快速且高效地对样本中的生物质进行提取和富集，提高生物质的浓度，减少对生物质结构的破坏，不妨碍后续检测过程是生物质提取技术的关键。

硅藻是一种单细胞光合藻类，其种类繁多、分布广泛，其硅质化的细胞壁具有互相贯通的3D层级多孔结构，被命名为硅藻生物硅(DOI:10.1021/acsami.6b12317)。申请人团队在公开号为CN111087472A的中国发明发明专利申请“一种3D结构层级多孔二氧化硅微颗粒的制造方法”公开了硅藻生物硅的提取方法，其提纯过程简单易行，获得的硅藻生物硅形态完整且有机质含量少(图1)，其为本发明所用硅藻生物硅的来源。横跨纳米到微米尺度的3D层级多孔结构使得硅藻生物硅具有巨大的比表面积和优越吸附性能，已被应用于药物递送、催化、吸附剂、电极材料等领域。基于硅藻生物硅的优越吸附性、亲血性和激活内源性凝血通路的能力，申请人团队开发出了一系列新型止血材料(DOI:10.1039/d0bm02116d)，并发现其对酶、凝血因子、血清蛋白等生物质具有吸附作用。国内外研究团队对硅藻生物硅的生物质吸附作用也有相关报道，但由于缺乏对吸附的生物质进行有效的分离手段，鲜有将硅藻生物硅作为生物质提取工具的报道。

发明内容

本发明针对上述的现有技术存在的不足，提供一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法及应用。

本发明的具体技术方案如下：

一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，包括如下步骤：

1)硅藻生物硅的金属矿化：将硅藻生物硅均匀分散在蒸馏水中，然后加入金属离子盐和反应液，混合均匀，进行加热处理，降至室温后离心收集沉淀物，用蒸馏水漂洗3-4次并干燥；

2)生物质的快速提取：采用所述步骤1)制备的金属矿化的硅藻生物硅和缓冲液提取和分离生物样本中的生物质。

在上述方法中，硅藻生物硅的金属矿化是该技术方案的关键，通过改变pH来调节金属矿化的硅藻生物硅对不同生物质的吸附强度以实现吸附收集、解吸附收集的目标，进一步提高生物质的纯度；仅通过引入金属矿化硅藻生物硅和缓冲液便可从生物样本中快速提取和分离生物质，可选择性将金属元素固化在硅藻生物硅表面，减少分离后生物质中的金属残留，操作简单，提取效率高。

进一步地，所述步骤2)采用方法一或方法二；

所述方法一：将生物样本与金属矿化的硅藻生物硅加入到离心管的缓冲液一中，调节缓冲液一的pH为4～10，经离心机离心收集底部金属矿化的硅藻生物硅沉淀，并加入缓冲液二重悬，再次经离心机离心收集上清；

所述方法二：将生物样本加入到填充有金属矿化的硅藻生物硅的色谱柱中，在重力流速下，用pH为4～10的缓冲液三洗脱并收集色谱柱上吸收的生物样品组分。

进一步地，所述的硅藻生物硅包括硅藻土、硅藻壳等。

进一步地，所述的金属离子为铁、锌、铜、铈、钙等金属离子的一种或者两种及以上，来源于相应的金属盐。

进一步地，所述硅藻生物硅和金属离子的摩尔比为1：(0～20)。

进一步地，所述反应液为弱碱溶液，包括氨水、氢氧化钾溶液等，其中氨水溶液的氨浓度为0.01～12mol/L，氢氧化钠的浓度为0.01～12mol/L，氢氧化钾的浓度为0.01～12mol/L。

进一步地，所述步骤1)中，所述加热的温度为90～250℃，所述加热的时间为0.01～24小时。

进一步地，所述生物样本为含有蛋白、核酸、多糖等生物大分子，可拓展至核糖核酸、脱氧核糖核酸、氨基酸、脂肪酸、单糖等单体。

进一步地，所述步骤2)中，所述金属矿化的硅藻生物硅的浓度为1×10^-1～1×10⁶μg/mL。

进一步地，所述缓冲液二的pH为4～10，所述离心机的转速为1000～5000rpm，所述离心收集的时间为1-60s。

进一步地，所述步骤2)中，所述缓冲液一、缓冲液二和缓冲液三各自独立的包括但不限于甲酸铵±甲酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、巴比妥酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液。

上述利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，可应用于生物医药、环境工程、食品科学、工程材料、化学化工等领域。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种简便、快速、稳定提取生物质的方法，降低了生物质提取的成本，特别适用于生物诊断检测，以及下游分子生物学的研究。本发明无需复杂的反应容器和溶剂且不会破坏生物质的结构，通过改变pH来调节金属矿化的硅藻生物硅对不同生物质的吸附强度以实现吸附收集、解吸附收集的目标，进一步提高生物质的纯度；通过引入硅藻生物硅和缓冲液便可从生物样本中快速提取和分离生物质，可选择性将金属元素固化在硅藻生物硅表面，减少分离后生物质中的金属残留，操作简单，提取效率高。

附图说明

图1为本发明实施例所用的硅藻生物硅扫描电镜图；

A-5.00μm；B-1.00μm。

图2为本发明实施例1的检测结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

申请人团队在CN 111087472 A的发明专利中的硅藻生物硅提取方法中提纯过程简单易行，获得的硅藻生物硅形态完整且有机质含量少，如图1所示，其为本发明实施例中所用硅藻生物硅的来源。

实施例1：

1)硅藻生物硅的金属矿化：将30mg硅藻生物硅均匀分散在5mL蒸馏水中，然后将45mg硫酸铜和1mL氨水加入反应釜中混合均匀，反应液中氨浓度为2mol/L并在250℃下高温加热2小时，降温后离心收集沉淀物，将离心收集的沉淀物用蒸馏水漂洗4次并干燥，得到铜矿化的硅藻生物硅。

2)生物质的快速提取：100μg铜矿化的硅藻生物硅加入到100μL浓度为0.5mg/mL牛血清白蛋白溶液中，调节pH为6并在漩涡振荡器上振荡60s，然后在3000rpm条件下离心20s，收集底部铜矿化的硅藻生物硅，再向离心管中加入100μL pH为8的碳酸盐缓冲液重悬铜矿化的硅藻生物硅，在3000rpm条件下离心20s，收集上清。

检测结果如图2所示，在上清中检测到牛血清白蛋白的浓度为0.711±0.006mg/mL，即铜矿化的硅藻生物硅对牛血清白蛋白的吸附量为71.1±6.2mg/g。

实施例2：

1)硅藻生物硅的金属矿化：与实施例一相同，在此不再赘述。

2)生物质的快速提取：

将牛血液生物样本加入到色谱柱中，色谱柱的填料为铜矿化的硅藻生物硅，缓慢滴加甲酸铵±甲酸缓冲液洗脱色谱柱上吸附的牛血液生物样本组分，甲酸铵±甲酸缓冲液的pH为6，间隔10秒钟更换收集瓶，在收集瓶中检测到了目标蛋白。

实施例3：

1)硅藻生物硅的金属矿化：将20mg硅藻生物硅均匀分散在9mL蒸馏水中，然后将30mg硫酸锌和1mL氨水加入反应釜中混合均匀，反应液中氨浓度为1.2mol/L，并在110℃下保持24小时，然后降温后离心收集的沉淀物用蒸馏水漂洗4次并干燥，得到锌矿化的硅藻生物硅。

2)生物质的快速提取：10μg锌矿化的硅藻生物硅加入到100μL的金黄色葡萄球菌的菌液(1x10⁵ CFU/mL)中，调节pH为5并在漩涡振荡器上振荡60s，然后在2000rpm条件下离心20s，收集底部锌矿化的硅藻生物硅，再向离心管中加入20μL pH为9的Tris-HCl缓冲液重悬锌矿化的硅藻生物硅，在3000rpm条件下离心20s，收集上清然后加入0.2mM的dNTPs，TBgreen和0.5U Taq DNA polymerase，进行核酸扩增反应检测，即可在扩增溶液中检测金黄色葡萄球菌的nuc基因。

由此可见，本发明利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，无需复杂的反应容器和溶剂且不会破坏生物质的结构，通过改变pH来调节金属矿化的硅藻生物硅对不同生物质的吸附强度以实现吸附收集、解吸附收集的目标，进一步提高生物质的纯度；通过引入硅藻生物硅和缓冲液便可从生物样本中快速提取和分离生物质；是一种简便、快速、稳定提取生物质的方法，具有显著的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)硅藻生物硅的金属矿化：将硅藻生物硅均匀分散在蒸馏水中，然后加入金属离子盐和反应液，混合均匀，进行加热处理，降至室温后离心收集沉淀物，用蒸馏水漂洗3-4次并干燥，得金属矿化的硅藻生物硅；

2)生物质的快速提取：采用所述步骤1)制备的金属矿化的硅藻生物硅和缓冲液用于提取和分离生物样本中的生物质。

2.根据权利要求1所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述步骤2)采用方法一或方法二；

3.根据权利要求1所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述的硅藻生物硅包括硅藻土、硅藻壳；所述的金属离子为铁、锌、铜、铈或钙离子中的一种或者两种及以上；所述硅藻生物硅和金属离子的摩尔比为1：0～20。

4.根据权利要求1所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述反应液为碱性溶液，所述碱性溶液溶液为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液，所述氨水溶液的氨浓度为0.01～12mol/L，所述氢氧化钠的浓度为0.01～12mol/L，所述氢氧化钾的浓度为0.01～12mol/L。

5.根据权利要求2所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述步骤1)中，加热的温度为90～250℃，加热的时间为0.01～24小时。

6.根据权利要求1所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述生物样本为生物大分子、核糖核酸、脱氧核糖核酸、氨基酸或单糖。

7.根据权利要求5所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述金属矿化的硅藻生物硅的浓度为1×10^-1～1×10⁶μg/mL。

8.根据权利要求6所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述缓冲液二的pH为4～10，所述离心机的转速为1000～5000rpm，离心收集的时间为1-60s。

9.根据权利要求1所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述缓冲液为甲酸铵±甲酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、巴比妥酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

10.权利要求1-9任一项所述的利用硅藻生物硅快速提取生物质的方法在生物医药、环境工程、食品科学、工程材料或化学化工领域的应用。