CN102666583A

CN102666583A - ***特异性结合化合物

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Publication number: CN102666583A
Application number: CN2010800411386A
Authority: CN
Inventors: T.博蒙特; M.J.克瓦肯博斯; E.J.布朗; J.H.莫里萨基; W.L.W.哈曾博斯; S.马里亚撒桑; K.卡吉哈拉; Y.夏
Original assignee: AIMM Therapeutics BV; Genentech Inc
Current assignee: AIMM Therapeutics BV; Genentech Inc
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: IL217497A0; EA031447B1; CN105440133A; AU2010271582B2; US20150376266A1; HK1222418A1; MX350234B; US20170067880A1; IL217497A; NZ616921A; TW201107470A; JP6192294B2; AU2016250398B2; HUE038277T2; US20110020323A1; AR077756A1; PL2454284T3; US9399673B2; AU2016250398A1; US9458228B2

Abstract

本发明提供改良的结合化合物，其能够特异性结合***。本发明还提供完全人的结合化合物，其能够在人个体中进行治疗性应用。

Description

***特异性结合化合物

本发明涉及生物学、免疫学和医学领域。

革兰氏阳性微生物引起多数***感染。这些革兰氏阳性病原体的一个重要成员是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)。约20％的群体是金黄色葡萄球菌的长期携带者。金黄色葡萄球菌能引起一系列病，从局部的皮肤感染，诸如丘疹、脓疱病(也可由酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)引起)、疖、蜂窝织炎、毛囊炎、疔疮、痈、皮肤烫伤综合征和脓肿，到危及生命的疾病，诸如肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征(TSS)、和败血症。金黄色葡萄球菌能够感染所有种类的器官和组织。金黄色葡萄球菌感染发生于免疫胜任的以及免疫受损的人。美国重症监护室中约50％的感染是由这种病原体引起的。美国每年报告300,000例金黄色葡萄球菌感染，导致12,000例死亡(Moran et al.NEMJ 355，666-674(2006))。

一个主要问题是金黄色葡萄球菌越来越强的抗生素抗性。甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)出现于二十世纪六十年代。它最初是在医疗环境中鉴定到的。然而，MRSA表现为存在于从未住院的社会中的人。MRSA的治疗是困难且昂贵的，原因在于MRSA对抗生素的有限敏感性。然而，可用的抗生素备选很少。常常使用万古霉素来治疗青霉素抗性MRSA。美国专利6,939,543记载一种针对脂磷壁酸(LTA)的鼠抗体，其能够结合金黄色葡萄球菌。基于这种鼠抗体，生成了一种重组嵌合小鼠/人抗体，其含有人重链和轻链恒定域。然而，此类嵌合小鼠/人抗体具有存在鼠序列的缺点，这涉及施用于人时严重副作用的发现。

本发明的一个目标是提供用于抵抗和/或预防***相关疾病的手段和方法。本发明的又一个目标是提供备选的和/或改良的针对各种***，优选葡萄球菌属物种，更优选的MRSA的结合化合物。本发明的又一个目标是提供针对各种***，优选葡萄球菌属物种，更优选MRSA的人结合化合物。

本发明提供能够特异性结合处于其天然背景中的葡萄球菌属物种的抗体、其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物。因此，它们可用于抵抗和/或预防和/或诊断与葡萄球菌属物种的存在有关的病症。优选地，抵抗金黄色葡萄球菌。在一个特别优选的实施方案中，抵抗MRSA。抵抗的另一种优选葡萄球菌属物种是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)。

表皮葡萄球菌通常是非致病性的，但是免疫***受损的患者常常有风险发生感染。感染常常是医院和社区获得的，但是它们对住院患者更加构成威胁。对表皮葡萄球菌感染最易感的人是静脉内药物使用者、新生儿、老年人、和使用导管或其它人工矫正器的人。感染与血管内装置(心瓣膜假体、分流器、等)有关，但是也常常发生于关节假体、导管、和大伤口。症状包括发热、头痛、疲劳、食欲缺乏和呼吸困难。

在一个优选的实施方案中，本发明提供分离的或重组的能够特异性结合葡萄球菌属物种的人抗体、其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物。依照本发明的人抗体和功能性部分能够结合处于其天然背景中的葡萄球菌属物种，使得在施用所述抗体、其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物时抵抗各种葡萄球菌属物种。所述人抗体，其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物因此特别适合于治疗或预防此类葡萄球菌属物种所致感染。与嵌合抗体相比，所述依照本发明的人抗体、其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物更加适合于人个体的治疗和/或预防用途，原因在于非人序列的缺失。这显著降低不利副作用的风险。

依照本发明的一种特别优选的抗体是称作“F1”的抗体，其具有图1所示重链和轻链可变域序列。如本文中使用的，术语“F1”涵盖所有F1抗体，例如分离的或重组生成的F1。重组生成的F1在本文中也称作“rF1”。F1的CDR序列对F1的抗原结合特性做出特别贡献，它们也描绘于图1。抗体F1是完全人的，能够特异性结合葡萄球菌属物种诸如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，而且因此是人个体的治疗用途优选的。

重要地，抗体F1能够在体内以及在体外结合完整细菌。因此进一步提供一种分离的或重组的能够特异性结合金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的人抗体或其功能性部分。另外，抗体F1能够结合已经在例如动物的受感染组织中生长的细菌。因此提供一种分离的结合体内生长的金黄色葡萄球菌的抗体，其中“体内生长”定义为在金黄色葡萄球菌感染期间在动物的受感染组织中生长。还提供一种分离的、重组的或合成的免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌特异性的人免疫球蛋白可变区的至少一种CDR序列。

抗体的功能性部分定义为在性质上，不必在数量上，与所述抗体具有至少一种共享特性的部分。所述功能性部分能够与所述抗体结合相同抗原，虽然不必以相同的程度。抗体的功能性部分优选包含单域抗体、单链抗体、纳米抗体、unibody、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab′)₂片段。

抗体的功能性部分也可以这样制备，即通过改变抗体，使得所得化合物的至少一种特性(优选抗原结合特性)，在性质上，不必在数量上，基本相同。这以多种方式进行，例如经由保守氨基酸替代，其中一个氨基酸残基用另一种具有大体相似特性(大小、疏水性、等)的残基替代，使得总体功能很可能没有受到严重影响。

如技术人员公知的，抗体的重链是构成免疫球蛋白分子的两类链中较大的。重链包含多个恒定域和一个可变域，该可变域涉及抗原结合。抗体的轻链是构成免疫球蛋白分子的两类链中较小的。轻链包含一个恒定域和一个可变域。该可变域与重链的可变域一起参与抗原结合。

互补决定区(CDR)是重链可变域和轻链可变域中存在的高变区。抗体的重链和所连接的轻链的CDR一起形成抗原结合位点。

免疫球蛋白链的功能性等同物在本文中定义为包含免疫球蛋白链的至少一种CDR序列的人造结合化合物。

由于本发明认识到图1所示CDR序列提供期望结合特征，因此技术人员完全能够生成包含至少一种改变的CDR序列的变体。例如，应用保守氨基酸替代。也可能改变图1所示至少一种CDR序列以生成与F1相比具有至少一种改变的特性的变异抗体或其功能性部分。优选地，提供如下抗体或功能性部分，其包含与图1所示CDR序列至少70％相同的CDR序列，使得F1的有利结合特征至少部分维持或甚至改进。优选改变图1所示CDR序列，使得所得抗体或功能性部分包含至少一种与F1相比改良的特性，诸如例如改良的结合亲和力、选择性和/或稳定性。包含与图1所示CDR序列至少70％相同的氨基酸序列的变异抗体或其功能性部分因此也在本发明的范围内。本领域中有多种方法可用于改变氨基酸序列。例如，人工合成具有期望CDR序列的重链或轻链序列。优选地，突变编码CDR序列的核酸序列，例如使用随机或定点诱变。

在一个实施方案中，本发明因此提供一种抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含：

-重链CDR1序列，其包含与序列RFAMS(SEQ ID NO：1)具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-重链CDR2序列，其包含与序列SINNGNNPYYARSVQY(SEQ IDNO：2)具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-重链CDR3序列，其包含与序列DHPSSGWPTFDS(SEQ ID NO：3)具有至少70％序列同一性的序列。

进一步提供一种抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含：

-轻链CDR1序列，其包含与序列RASENVGDWLA(SEQ ID NO：4)具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-轻链CDR2序列，其包含与序列KTSILES(SEQ ID NO：5)具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-轻链CDR3序列，其包含与序列QHYXRFPYT(SEQ ID NO：6)具有至少70％序列同一性的序列，其中X为I或M。

上文所述CDR序列是抗体F1；VHIgHV323和VLIgKV15，及其变体的CDR序列。包含与F1CDR具有至少70％序列同一性CDR序列的结合化合物特别适合于抵抗和/或预防金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌所致感染(的影响)。发现了包含VHIgHV323和VLIgKV15的一种F1变体(其中轻链的轻链CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸)仍然能够特异性结合葡萄球菌属物种，诸如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。

优选地，依照本发明的结合化合物包含与图1所示至少一种CDR序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％相同的CDR序列。最优选地，依照本发明的结合化合物包含与图1所示至少一种CDR序列至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％相同的CDR序列。上文所述特别优选的抗体F1包含由图1所示CDR序列组成的CDR序列。依照本发明的一个特别优选的实施方案如此提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能性等同物，其能够特异性结合金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌且其包含：

-重链CDR1序列，其包含序列RFAMS(SEQ ID NO：1)，和/或

-重链CDR2序列，其包含序列SINNGNNPYYARSVQY(SEQ IDNO：2)，和/或

-重链CDR3序列，其包含序列DHPSSGWPTFDS(SEQ ID NO：3)，和/或

-轻链CDR1序列，其包含序列RASENVGDWLA(SEQ ID NO：4)，和/或

-轻链CDR2序列，其包含序列KTSILES(SEQ ID NO：5)，和/或

-轻链CDR3序列，其包含序列QHYXRFPYT，其中X为I或M(SEQ IDNO：6)。

在一个实施方案中，提供如下结合化合物，其包含图1所示重链CDR1和CDR2序列和轻链CDR1和CDR2序列，或与其至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％相同的序列。因此进一步提供一种分离的、合成的或重组的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含重链CDR1序列(其包含与序列RFAMS(SEQ ID NO：1)至少70％相同的序列)和重链CDR2序列(其包含与序列SINNGNNPYYARSVQY(SEQ ID NO：2)至少70％相同的序列)和轻链CDR1序列(其包含与序列RASENVGDWLA(SEQ ID NO：4)至少70％相同的序列)和轻链CDR2序列(其包含与序列KTSILES(SEQ ID NO：5)至少70％相同的序列)。所述结合化合物优选包含与上文所述重链CDR序列和轻链CDR序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、最优选至少95％相同的CDR序列。优选地，所述结合化合物还包含重链CDR3序列(其包含与序列DHPSSGWPTFDS(SEQ IDNO：3)至少70％相同的序列)和/或轻链CDR3序列(其包含与序列QHYXRFPYT至少70％相同的序列，其中X为I或M(SEQ ID NO：6))。还提供包含上文所述重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及上文所述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的结合化合物。

由于已通过本发明提供能够特异性结合葡萄球菌属物种的人抗体，因此生成包含对葡萄球菌属物种特异性的人免疫球蛋白可变域的至少一种CDR序列的免疫球蛋白链或其功能性等同物变成可能。如此进一步提供一种分离的、重组的或合成的免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含对葡萄球菌属物种特异性的人免疫球蛋白可变区的至少一种CDR序列。在一个优选的实施方案中，提供人抗体。任选地，优化所述至少一种人CDR序列或至少一种框架区中的至少一种序列，优选为了改进结合效率或稳定性。这例如通过诱变实验进行，其后优选测试所得化合物的稳定性和/或结合效率并选择改良的结合化合物。

在优化CDR序列以改进结合效率或稳定性之外，优化至少一种框架区中的至少一种序列常常是有利的。这优选为了改进结合效率或稳定性进行。框架序列例如通过突变编码此类框架序列的核酸分子，其后优选测试所得抗体或功能性部分的特征来优化。这样，可能获得改良的抗体或功能性部分。在一个优选的实施方案中，将人种系序列用于依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物中的框架区。种系序列的使用优选使所述抗体、免疫球蛋白链或功能性等同物或部分的免疫原性风险降至最低，因为这些序列不太可能含有如下体细胞改变，其对衍生框架区的个体是独特的，且在应用于另一人个体时可引起免疫原性应答。

还提供包含与图1所示重链序列具有至少70％序列同一性的重链氨基酸序列的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物。此类重链序列提供期望结合特性，如抗体F1证明的。此外，与图1所示轻链序列具有至少70％序列同一性的轻链氨基酸序列，和其中CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸的轻链序列也提供期望结合特性，如抗体F1和包含所述改变的一种抗体F1变体证明的。因此进一步提供依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M(SEQ ID NO：8)。

在上文所述变体(其中轻链CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸)之外，已开发F1抗体的数种变体。这些变体能够结合葡萄球菌属物种。此类抗体变体的例子包括依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和轻链序列，该重链序列包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：9)，和/或序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)，该轻链序列包含序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA，其中X为I或M (SEQ ID NO：10)，和/或序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV，其中X为I或M (SEQ ID NO：11)，和/或序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中X为I或M(SEQ ID NO：8)。

依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物特异性结合包含丝氨酸-天冬氨酸(SD)重复的蛋白。SD重复(Sdr)蛋白是存在于数种细菌诸如葡萄球菌属物种中的细胞表面结合蛋白。Sdr蛋白一般包含氨基端信号序列、称作A区的功能域、SD重复区、跨细胞壁区、LPXTG基序、疏水性跨膜域、和一系列带正电荷的残基。LPXTG基序是在苏氨酸和甘氨酸残基之间切割该基序且将该蛋白锚定至***细胞壁肽聚糖的转肽酶的靶物。认为Sdr蛋白与宿主分子相互作用。已知的Sdr蛋白包括金黄色葡萄球菌的ClfA(SdrA)、ClfB(SdrB)、SdrC、SdrD和SdrE，表皮葡萄球菌的SdrF、SdrG和SdrH，腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)的SdrI，头状葡萄球菌(S. capitis)的SdrX，和山羊葡萄球菌(S. caprae)的SdrY和SdrZ。

因此，依照本发明的一种优选的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物特异性结合金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、头状葡萄球菌(S.capitis)、和山羊葡萄球菌(S.caprae)。优选所述抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或其部分结合金黄色葡萄球菌的ClfA(SdrA)、ClfB(SdrB)、SdrC、SdrD和SdrE，表皮葡萄球菌的SdrF、SdrG和SdrH，腐生葡萄球菌的SdrI，头状葡萄球菌的SdrX，和山羊葡萄球菌的SdrY和SdrZ。依照本发明的抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分的表位包含Sdr蛋白中的SD重复依赖性表位，例如金黄色葡萄球菌ClfA、ClfB、SdrC、SdrD和SdrE中存在的SD重复依赖性表位。SD重复依赖性表位在本文中定义为受到抗体F1识别的表位，该表位要求存在于但不限于金黄色葡萄球菌ClfA、ClfB、SdrC、SdrD和SdrE和表皮葡萄球菌SdrF、SdrG和SdrH中的至少部分SD重复区的存在。在一个实施方案中，所述表位可包含结合或连接Sdr蛋白的分子的至少一部分。此类分子的例子包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、糖和糖残基。在另一个实施方案中，所述表位包含SD重复区的修饰。所述修饰包含例如但不限于糖基化、酰胺化和/或磷酸化。技术人员会明白这两个实施方案的组合也是可能的。

因此，本发明提供依照本发明的能够结合SD重复依赖性表位的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。还提供能够结合金黄色葡萄球菌ClfA、ClfB、SdrC、SdrD和SdrE的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。进一步提供能够与依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物竞争对葡萄球菌属物种，优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌和/或腐生葡萄球菌和/或头状葡萄球菌和/或山羊葡萄球菌，更优选MRSA的结合的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。

抗体的一个缺点是它们的稳定性可降低，例如在苛刻条件下。例如，可发生脱酰胺，即除去功能性酰胺基团。脱酰胺是一种蛋白质降解途径，它可影响蛋白质的生物学功能，而且主要发生于天冬酰胺残基且较低程度发生于谷氨酰胺残基。在一个实施方案中，因此，依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物的脱酰胺通过将天冬酰胺或谷氨酰胺用另一种氨基酸替换来防止。天冬酰胺优选用谷氨酰胺以外的氨基酸来替换，因为脱酰胺也可发生于谷氨酰胺残基。对天冬酰胺的替换优选不实质性影响本发明的抗体对抗原的结合亲和力。在一个实施方案中，重链第53位(编号方式依照Kabat，1991)处天冬酰胺的脱酰胺通过将所述天冬酰胺用另一种氨基酸替换来防止。通过防止第53位处天冬酰胺的脱酰胺，依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物的稳定性优选提高。如实施例中所示，尽管事实是所述天冬酰胺位于CDR中，但是替换所述位置处的天冬酰胺不实质性影响本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物对抗原的结合亲和力。重链第53位处的天冬酰胺优选用谷氨酰胺以外的氨基酸来替换，更优选所述位置处的天冬酰胺用丝氨酸来替换。因此，本发明还提供依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其中天冬酰胺，优选重链第53位处的天冬酰胺用另一种氨基酸，优选丝氨酸来替换。

在一个实施方案中，将依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物偶联至另一种模块以形成抗体-药物偶联物。例如将依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物偶联至细胞毒剂，诸如抗生素。如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指降低或阻断细菌的功能或生长和/或引起对细菌的破坏的物质。优选经由硫醇基团将所述其它模块，例如细胞毒剂偶联至所述抗体或其功能性部分。因此，优选将一个或多个半胱氨酸掺入所述抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物。半胱氨酸含有硫醇基团且因此，将一个或多个半胱氨酸掺入依照本发明的抗体或其功能性部分或将依照本发明的抗体或其功能性部分的一个或多个氨基酸用一个或多个半胱氨酸替换能够将其偶联至另一种模块。优选在不影响所述抗体或功能性等同物的折叠且不改变抗原结合或效应器功能的位置将所述一个或多个半胱氨酸引入依照本发明的抗体或其功能性等同物。因此，本发明提供依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其中至少一个半胱氨酸以外的氨基酸已用半胱氨酸替换。优选至少两个半胱氨酸以外的氨基酸已用半胱氨酸替换。在一个优选的实施方案中，所述至少一个半胱氨酸以外的氨基酸是轻链第15位处的缬氨酸，和/或轻链第144位处的丙氨酸，和/或轻链第168位处的丝氨酸，和/或轻链第205位处的缬氨酸和/或轻链第110位处的缬氨酸，和/或重链第84位处的丙氨酸，和/或重链第114位处的丙氨酸，和/或重链第168位处的丙氨酸，和/或重链第172位处的丝氨酸，更优选轻链第205位处的缬氨酸和/或轻链第110位处的缬氨酸，和/或重链第114位处的丙氨酸(编号方式依照Kabat，1991)。技术人员会理解，作为替换和/或补充，重链和/或轻链的一个或多个其它氨基酸可以用半胱氨酸替换，如果该替换不影响所述抗体或功能性等同物的折叠且不改变抗原结合或效应器功能的话。

在国际专利申请WO2006/034488、WO2008/141044、WO2009/052249、WO2009/012256、WO2009/012268和WO2009/099728中，记载了用反应性半胱氨酸残基改造抗体的方法以及适合于半胱氨酸改造的氨基酸位置。

依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物优选包含与图1所示重链序列和/或轻链序列，或其中CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸的图1所示轻链序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的可变重链序列和/或可变轻链序列。同一性越高，所述结合化合物越像抗体F1。依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物优选包含像F1重链和轻链的重链以及轻链。因此进一步提供抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含与图1所示重链序列和轻链序列，或其中CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸的图1所示轻链序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链序列和轻链序列。在一个实施方案中，提供抗体或功能性部分，其具有图1所示重链序列和图1所示轻链序列或其中CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸的图1所示轻链序列。

一个实施方案提供抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含重链序列和/或包含轻链序列，该重链序列由图1所示重链序列组成，该轻链序列由图1所示轻链序列或其中CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸的图1所示轻链序列组成。或者，正如技术人员公知的，可能生成缩短的重链或轻链序列，同时维持感兴趣的结合特性。优选地，生成此类缩短的重链或轻链，其具有与初始重链或轻链相比缩短的恒定区。优选维持可变域。例如，生成基于图1所示重链序列或轻链序列的Fab片段或F(ab′)₂片段或单域抗体或单链抗体或纳米抗体或unibody或scFv片段。因此还提供抗体的功能性部分，其至少包含图1所示序列或其中CDR3中的异亮氨酸改成甲硫氨酸的图1所示轻链序列的功能性部分。所述功能性部分具有至少20个氨基酸的长度且包含至少一种选自下组的序列：与图1所示重链CDR1序列至少70％相同的序列和与图1所示重链CDR2序列至少70％相同的序列和与图1所示重链CDR3序列至少70％相同的序列和与图1所示轻链CDR1序列至少70％相同的序列和与图1所示轻链CDR2序列至少70％相同的序列和与图1所示轻链CDR3序列或其中异亮氨酸改成甲硫氨酸的图1所示轻链CDR3序列至少70％相同的序列。

本发明进一步提供一种分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其具有至少15个核苷酸、优选至少30个核苷酸、更优选至少50个核苷酸、更优选至少75个核苷酸的长度，编码依照本发明的结合化合物。此类核酸例如分离自能够生成依照本发明的抗体的B细胞。一个优选的实施方案提供包含与图1所示核酸序列的至少15个核苷酸具有至少70％序列同一性的序列的核酸序列。依照本发明的核酸序列优选包含与图1所示核酸序列的至少15个核苷酸具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％序列同一性的序列。优选地，所述图1所示核酸序列包含至少一种CDR编码序列。

一个优选的实施方案提供一种分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其具有至少15个核苷酸的长度，编码依照本发明的抗体或免疫球蛋白链的至少一种CDR序列。所述核酸序列优选编码至少一种与抗体F1的CDR区具有至少70％序列同一性的CDR序列。编码F1CDR区的核酸序列显示于图1。因此进一步提供一种分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其包含与选自下组的序列具有至少70％序列同一性的序列：cgctttgccatgagc (SEQ ID NO：12)，tcgatcaataatgggaataacccatactacgcacggtcggtacaatac (SEQ ID NO：13)，gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc (SEQ ID NO：14)，cgggccagtgaaaacgttggtgactggttggcc(SEQ ID NO：15)，aagacatctattctagaaagt(SEQID NO：16)和caacactatatacgtttcccgtacact(SEQ ID NO：17)。

所述核酸序列或功能性等同物优选包含与任何上文所述序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％序列同一性的序列。进一步提供核酸序列或其功能性等同物，其包含与图1所示核苷酸序列的至少部分具有至少70％序列同一性的序列，所述部分具有至少15个核苷酸且编码至少一种CDR区。

依照本发明的核酸序列或其功能性等同物优选编码与F1CDR区、F1重链和/或F1轻链具有至少70％序列同一性的区。如此，一个实施方案提供一种分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其包含编码下述氨基酸序列的序列，该氨基酸序列与序列RFAMS(SEQ ID NO：1)具有至少70％序列同一性，和/或与序列SINNGNNPYYARSVQY(SEQ ID NO：2)具有至少70％序列同一性，和/或与序列DHPSSGWPTFDS(SEQ ID NO：3)具有至少70％序列同一性，和/或与序列RASENVGDWLA(SEQ ID NO：4)具有至少70％序列同一性，和/或与序列KTSILES(SEQ ID NO：5)具有至少70％序列同一性，和/或与序列QHYXRFPYT具有至少70％序列同一性，其中X为I或M(SEQ IDNO：6)，和/或与序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)具有至少70％序列同一性，和/或与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M(SEQ ID NO：8)。还提供核酸序列或其功能性等同物，其编码依照本发明的F1抗体的变体。本发明提供例如核酸序列，其编码重链序列，该重链序列包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO：9)，和/或序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)，及编码轻链序列，该轻链序列包含序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA，其中X为I或M (SEQ ID NO：10)，和/或序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV，其中X为I或M (SEQ ID NO：11)，和/或序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV，其中X为I或M(SEQ ID NO：8)。

在一个实施方案中，重链第53位(编号方式依照Kabat，1991)处的天冬酰胺用谷氨酰胺以外的另一种氨基酸替换，以防止所述位置处天冬酰胺的脱酰胺。优选所述天冬酰胺用丝氨酸替换。

术语“％序列同一性”在本文中定义为在比对两种序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比同一性之后，候选氨基酸或核酸序列中与参照序列中的残基相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。

如本文中使用的，本发明的核酸分子或核酸序列优选包含核苷酸，更优选DNA和/或RNA的链。在其它实施方案中，本发明的核酸分子或核酸序列包含其它种类的核酸结构，诸如例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)和/或核酶。此类其它核酸结构称作核酸序列的功能性等同物。术语“核酸序列的功能性等同物”还涵盖包含展现与天然核苷酸相同的功能的非天然核苷酸、经修饰核苷酸和/或非核苷酸构件块的链。

依照本发明的核酸序列特别可用于生成对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌特异性的结合化合物。这例如通过将此类核酸序列导入细胞，使得该细胞的核酸翻译机制会生成编码的结合化合物来进行。在一个实施方案中，编码依照本发明的重和/或轻链的基因在所谓的生产者细胞中比对，诸如例如中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO(一种小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞系的细胞，它们中的一些适合于商业性抗体生产。所述生产者细胞的增殖导致能够生成依照本发明的抗体或其功能性部分的生产者细胞系。优选地，所述生产者细胞系适合于生成在人中使用的化合物。因此，所述生产者细胞系优选没有致病剂，诸如致病性微生物。最优选地，由人序列组成的结合化合物使用依照本发明的核酸序列来生成。

因此还提供能够生成依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物的分离的或重组的抗体生成细胞，以及用于生成依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物的方法，包括提供具有依照本发明的核酸序列或功能性等同物的细胞并容许所述细胞翻译所述依照本发明的核酸序列或功能性等同物，由此生成所述依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。

抗体生成细胞在本文中定义为能够生成和/或分泌抗体或其功能性部分的细胞，和/或能够开发成能够生成和/或分泌抗体或其功能性部分的细胞的细胞。依照本发明的抗体生成细胞优选是适应商业性抗体生产的生产者细胞。优选地，所述生产者细胞适合于生成在人中使用的化合物。

依照本发明的方法优选进一步包括收获、纯化和/或分离所述依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物的步骤。如此获得的依照本发明的结合化合物优选用于诊断葡萄球菌感染，分离或检测葡萄球菌属细菌，区分葡萄球菌属物种和其它***和对人进行治疗，任选在别的纯化、分离和/或其它加工步骤之后。

依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物特别适合于诊断性用途。例如，可以自个体或自怀疑感染有葡萄球菌属细菌，优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，更优选MRSA的任何其它来源获得样品，诸如组织或血液样品。随后，可以将所述样品与依照本发明的抗体或免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分混合。所述抗体、免疫球蛋白链或功能性等同物或部分会特异性结合葡萄球菌属细菌，优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。可以使用本领域已知的任何方法自样品分离结合至抗体、免疫球蛋白链或功能性等同物或部分的细菌，例如但不限于使用磁珠、链霉亲合素包被珠的分离、或经由使用柱上固定化的二抗的分离。在清洗结合的细菌和抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分之后，可以通过本领域已知的任何方法自所述抗体、免疫球蛋白链或功能性等同物或部分洗脱细菌。例如，细菌和抗体、免疫球蛋白链或功能性等同物或部分之间的结合可通过提高盐浓度和/或降低或提高pH，和/或通过添加过量的表位来破坏。

葡萄球菌属细菌，优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的分离可用于各种应用。例如，数种不同***的感染均可导致个体中交叠的症状。在此类情况中，区分金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌和其它***会是困难的。然后，依照本发明的抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分可用于检测金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的存在，或用于区分金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌和其它细菌。自怀疑罹患金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染的个体的样品或自任何其它来源，诸如细菌培养物分离细菌能推动所述葡萄球菌属细菌的检测，因为分离导致所述葡萄球菌属细菌浓度升高和/或纯度更高。

葡萄球菌属物种，优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，更优选MRSA的分离可例如进一步用于鉴定样品中的特定金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌菌株，优选MRSA菌株。所述菌株的鉴定可例如通过测定细菌DNA的序列来实施。在此类情况中，优选首先获得分离的金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。

在本发明的一个实施方案中，标记依照本发明的抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分以能够检测所述抗体、免疫球蛋白链或功能性等同物或部分，例如但不限于荧光标记或放射性标记。或者，使用经过标记的二抗(其针对所述依照本发明的抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分)来检测依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物。如果检测到所述抗体、免疫球蛋白链或其功能性等同物或部分的结合，那么存在金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。

本发明因此提供依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物用于诊断葡萄球菌感染，优选金黄色葡萄球菌感染，更优选MRSA感染，用于检测金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，优选MRSA，和用于区分金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，优选MRSA和其它***的用途。还提供用于诊断葡萄球菌感染，优选金黄色葡萄球菌感染，更优选MRSA感染的依照本发明的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物。

进一步提供使用依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物自溶液分离金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌细菌的方法。所述方法优选包括提供怀疑罹患金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，优选MRSA感染的个体的或来自任何其它来源，诸如细菌培养物的样品，将依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物添加至所述样品，在存在时容许所述依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物结合金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌细菌，并自所述样品分离结合至依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物的金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌细菌。

由于已提供依照本发明的***特异性结合化合物和编码它们的核酸序列，包括人结合化合物，因此改良的治疗性应用变得可用。通过依照本发明的结合化合物来抵抗***诸如金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。依照本发明的结合化合物因此特别适合于用作药物或预防剂。优选地，使用由人序列的组成或具有至多5％的非人序列的结合化合物，以降低治疗人个体时不利副作用的机会。本文中因此还提供用作药物和/或预防剂的依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物。在施用依照本发明的核酸或功能性等同物时，它会原位翻译成依照本发明的结合化合物。在一个特别优选的实施方案中，所述抗体包含抗体F1或其功能性部分。所述药物或预防剂优选用于抵抗或至少部分预防金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌所致感染或用于抵抗或至少部分预防金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌所致感染的不利效应。因此进一步提供用作药物和/或预防剂的依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物，该药物和/或预防剂用于至少部分治疗和/或预防与金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌有关的状况。此类状况的非限制性例子是皮肤感染、丘疹、脓疱病、疖、蜂窝织炎、毛囊炎、疔疮、痈、皮肤烫伤综合征、脓肿、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征和败血症。优选地，抵抗或至少部分预防金黄色葡萄球菌感染。最优选地，抵抗、减轻和/或至少部分预防MRSA相关状况。因此还提供依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物用于制备药物和/或预防剂的用途，该药物和/或预防剂用于至少部分治疗和/或预防金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，以及用于至少部分治疗或预防与金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌有关的状况的方法，该方法包括对有所需要的个体施用治疗有效量的依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，优选在所述个体已诊断为受到金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染之后。所述状况优选包含上文所列金黄色葡萄球菌相关状况中的至少一种，最优选MRSA相关状况。

所述抗体优选包含抗体F1或其功能性部分。

为了抵抗***，优选在感染发生之前将依照本发明的结合化合物施用于个体。或者，在个体早就受到感染时施用依照本发明的结合化合物。优选将所述结合化合物施用于并发症风险升高的个体，诸如例如住院的个体和/或免疫力受损的个体。老年人也具有升高的患细菌性病症风险。优选经一次或多次注射来施用依照本发明的结合化合物。基于存在严格方案要求的临床试验中临床上的越来越多的剂量研究来设计上文所述治疗性应用中要使用的依照本发明的结合化合物的剂量范围。典型剂量介于0.1和10mg每kg体重之间。对于治疗性应用，通常将依照本发明的结合化合物与药学可接受载体、稀释剂和/或赋形剂组合。合适载体的例子例如包含匙孔

血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白(例如BSA或RSA)和卵清蛋白。在一个优选的实施方案中，所述合适载体包含溶液，像例如盐水。

在还有另一个实施方案中，使用编码依照本发明的结合化合物的核酸。正如早就描述的，在施用此类核酸时，结合化合物由宿主的机制来生成。生成的结合化合物能够预防和/或抵抗***感染和/或此类感染的不利效应。因此，本文中还提供用作药物和/或预防剂的依照本发明的核酸序列或功能性等同物。所述核酸优选用于抵抗金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌，更优选金黄色葡萄球菌，最优选MRSA。因此进一步提供依照本发明的核酸序列或功能性等同物用于制备药物和/或预防剂的用途，该药物和/或预防剂用于至少部分治疗和/或预防***相关状况。所述***相关状况优选包含金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌所致感染，更优选金黄色葡萄球菌感染，最优选MRSA感染。

进一步提供药物组合物，其包含依照本发明的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物和药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。所述药物组合物优选适合于人使用。

在下面的实施例中进一步解释本发明。这些实施例不限制本发明的范围，但是仅仅用来澄清本发明。

通过述及将详述中提到的所有专利文件和其它出版物收入本文用于所有目的。

实施例

实施例1

方法

B细胞分离

通过Ficoll分离和MACS微珠的CD4/CD8负选择，如制造商(MiltenyiBiotech)所述，自成人的新鲜血液获得B细胞。为了获得记忆B细胞，在FACSaria(Becton Dickinson)上对细胞分选CD19+CD3-CD27+IgD-IgA-。这些组织的使用得到了科研医学伦理委员会的批准且视知情同意而定。基于携带医院获得的MRSA菌株(其具有基因型簇109和16)来选择捐献者。

细胞培养

在稳定表达CD40L(CD40L-L细胞，10⁵个细胞/ml)和重组的小鼠IL-21(25ng/ml，R&D systems)的γ-照射(50Gy)的小鼠L细胞成纤维细胞上共培养在含有IMDM(Gibco)、8％FBS(HyClone)和青霉素/链霉素(Roche)的标准培养基中维持的B细胞。rhIL-4(R&D)以50ng/ml使用。通过PCR例行测试细胞，并发现支原体和EBV的存在为阴性(数据未显示)。

通过FACS细胞分选来纯化大批经过转导的对NGFR和GFP为双重阳性的人记忆B细胞，并以500个细胞每孔的细胞密度在96孔板中培养。在ELISA中使用Newman和SH1000菌株的细菌裂解物测试培养物上清液。以10个细胞/孔的细胞密度在96孔板中亚克隆阳性培养物，并再次通过ELISA来测试。随后，以1个细胞每孔接种阳性培养物，并再次通过ELISA来测试针对金黄色葡萄球菌菌株Newman和SH1000的反应性。

逆转录病毒转导

BCL6逆转录病毒构建物之前已有记载(Shvarts A.et al.Genes Dev 16，681-686(2002))。编码人Bcl-xL的cDNA由Stanley Korsmeyer博士馈赠。将BCL6和Bcl-xL分开克隆入BCL6-NGFR和BclxL-GFP构建物。将这些构建物转染入LZRS逆转录病毒包装细胞，phoenix，如之前所述(Jaleco A.C.et al.Blood 94，2637-2646(1999)；Scheeren F.A.et al.Nat Immunol 6，303-313(2005))。在CD40L-L细胞上在rmIL-21存在下激活36小时之后，用含有BCL6和Bcl-xL的逆转录病毒双重转导记忆B细胞，如之前所述(Diehl S.A.et al.JImmunol 180，4805-4815(2008)；Kwakkenbos M.et al.Nat Med in press(2009))。在具有rmIL-21的CD40L-L细胞上维持经过转导的细胞。

ELISA

为了测定抗体内容，将ELISA板用PBS中的5μg/ml抗人IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories)于37℃包被1小时或于4℃包被过夜，并在ELISA清洗缓冲液(PBS，0.5％Tween-20)中清洗。使用PBS中的4％牛乳作为封闭剂，之后添加细胞培养物上清液的连续稀释液和偶联有酶的检测抗体(偶联有HRP的抗IgG(Jackson)1∶2500稀释)。使用TMB底物/终止溶液(Biosource)来进行ELISA显色。

为了筛选目的，我们使用来自Newman和SH1000菌株的裂解物。二者都在PBS中制备，而且以5-10μgml^-1直接包被，之后测试B细胞培养物上清液或1∶2稀释。

为了探索人IgG1克隆F1的抗原特异性，开发了LTA检测ELISA。将纯化的来自金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)、粪链球菌(S.faecalis)和酿脓链球菌(Sigma)的LTA制备物添加至经多克隆IgG纯化的小鼠抗LTA(1/200储液1mg ml^-1，QED Bioscience)包被的ELISA板，之后添加二抗。

另外，我们在直接ELISA中测试了自由W. Fischer(Institut fur Biochemie，Univ of Erlangen，Germany)开发且由B.Appelmelk(VU，Amsterdam，Netherlands)馈赠的文库衍生的数份LTA制备物(更多详情参见(Keller R.et al.Infect Immun 60，3664-3672(1992)，Polotsky V.Y. et al.Infection and Immunity64，380-383(1996)和Greenberg J.W et al.Infection and Immunity 64，3318-3325(1996))，而且综述参见(Weidenmaier C.et al.Nat Rev Microbiol 6，276-287(2008)))。以1μg ml^-1包被LTA制备物，之后添加rF1(10μg ml^-1)或对照抗体(杂交瘤上清液的1∶5稀释液)，并进一步用经过偶联的抗人或小鼠抗体来检测。纯化的LTA制备物的组包括：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，乳酸乳球菌(L.lactis)，格氏乳球菌(L.garvieae)，双歧杆菌(B.bifidum)，藤黄微球菌(M.luteus)，干酪乳杆菌(L.casei)，肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，威氏李斯特氏菌(L.welshimeri)，小肠肠球菌(E.hirae)，棉子糖乳球菌(L.raffinolactis)，变异链球菌(S.mutans)，肺炎链球菌(S.pneumoniae)。数种变体含有或缺乏丙氨酸残基和/或脂锚(此处未描绘)。

F1抗体对细菌培养物的结合

使用Newman金黄色葡萄球菌和肺炎肺炎链球菌菌株(血清型3)。在TSH50ml中培养Newman过夜，然后1ml在100ml中重悬浮2-2.5小时至OD：1并收集细菌。在混有酵母培养基的Todd Hewitt培养基中培养肺炎链球菌。之后，将细菌与F1抗体、对照IgG(D25，一种人抗RSV抗体)或仅与二抗(仅IgG-PE)一起温育，用100％总小鼠血清预处理细胞以防止背景染色。清洗之后，添加二抗(IgG-PE)。抗体在冰上孵育20分钟。

F1序列测定和表达克隆

我们使用Trizol(Invitrogen)分离总RNA，使用superscript RT生成cDNA，实施PCR并将重链和轻链可变区克隆入pCR2.1TA克隆载体(Invitrogen)。为了排除逆转录酶或DNA聚合酶诱导的突变，我们实施数个独立的克隆实验。为了生成重组的F1单抗，我们以人IgGl和κ恒定区的读码框将F1重链和轻链可变区克隆入基于pcDNA3.1(Invitrogen)的载体并瞬时转染293T细胞。我们用蛋白A自培养物上清液纯化重组的F1。

结果

F1克隆的生成

自3名MRSA测试为阳性但没有病的受试者收集50-60ml肝素血并在ficoll纯化步骤之后分离外周B细胞。给来自数个B细胞群的B细胞双重转导含有BCL6-NGFR和Bcl-xL-GFP的逆转录病毒(Diehl et al和Kwakkenbos et a1)。自IgG、CD27阳性群，多克隆微型培养B细胞培养在96孔板中以500个细胞/孔的细胞密度开始。收集这些微型培养物的上清液并在ELISA中用于筛选金黄色葡萄球菌特异性IgG抗体的存在(在这些ELISA中，包被是两种金黄色葡萄球菌菌株，SH1000和Newman的细胞裂解物)。SH1000以及Newman金黄色葡萄球菌二者筛选为阳性的微型培养物在新的微型培养中以10个细胞/孔的密度接种。再次，收集这些微型培养物的上清液并在SH1000和NewmanELISA中筛选。两种ELISA筛选为阳性的克隆接种入单克隆培养(即1个细胞/孔)。在测试这些单克隆培养物的上清液之后，发现一个克隆(命名为F1)生成金黄色葡萄球菌特异性单克隆IgG抗体。

F1克隆的上清液中的抗体结合来自金黄色葡萄球菌的LTA制备物

生成F1克隆，我们发现了F1的上清液结合两种金黄色葡萄球菌菌株，SH1000和Newman的细菌细胞裂解物。***的主要细胞壁化合物是LTA，因此我们决定在ELISA中测试F1上清液对金黄色葡萄球菌LTA制备物的结合。如表1所示，F1克隆的上清液结合SH1000和Newman金黄色葡萄球菌菌株的细菌细胞裂解物，但也结合商购的纯化的金黄色葡萄球菌LTA制备物。然而，我们注意到对LTA制备物的结合显著低于用完整细菌观察到的结合。

表1：F1克隆的上清液结合金黄色葡萄球菌LTA制备物。使用抗小鼠-HRP偶联二抗作为阴性对照。另一种对照是只检测流感H3蛋白的抗流感病毒抗体。

重组生成的F1抗体结合来自多种来源的LTA制备物

将抗体基因克隆入表达载体并在表达***中生成重组的F1(rF1)抗体之后，在来自数种细菌的纯化的LTA制备物上测试rF1抗体。如图2A所示，rF1抗体较好地结合自金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌获得的商品化LTA样品，且显著性略低一点地结合来自粪链球菌和酿脓链球菌的LTA样品。rF1抗体不结合来自肺炎链球菌的LTA样品(数据未显示)。另外，rF1识别来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和两种金黄色葡萄球菌分离物的高度纯化的LTA样品(图2b)。rF1不结合来自变异链球菌(图2b)或来自乳酸乳球菌、格氏乳球菌、双歧杆菌、藤黄微球菌、干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、威氏李斯特氏菌、小肠肠球菌、棉子糖乳球菌、变异链球菌和肺炎链球菌(结果未显示)的LTA制备物。

重组的F1抗体结合活的金黄色葡萄球菌细菌

为了研究rF1抗体是否也会识别活的***，使用流式细胞术测试了rF1抗体对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的结合。如图3A所示，rF1抗体结合活的金黄色葡萄球菌细菌(Newman株)，但不结合肺炎链球菌。另外，我们显示了rF1识别6种临床金黄色葡萄球菌分离物；1种PVL阳性的致病性菌株，3种常规菌株和2种MRSA菌株(图3b)。

实施例2

方法

细菌菌株和培养。

甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S. aureus，MRSA)菌株USA300(1114)、USA400、N315、USA100、USA1000、COL、MRSA252，以及甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株Reynolds、Becker、Smith弥散、MN8，和万古霉素中度敏感性(VISA)菌株Mu50均得自金黄色葡萄球菌抗生素抗性网络(NARSA)；MSSA菌株Newman和Rosenbach来自ATCC。表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、和酿脓链球菌得自Ward’s Natural Science；单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)得自ATCC。细菌在补充有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上于37℃培养18小时。对于液体培养，将来自TSA板的单菌落接种入胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)并在以200rpm摇动中于37℃温育18小时。这些培养物的新鲜100倍稀释液在新鲜的TSB中再进行多次次培养。

rF1结合体外培养的完整细菌的FACS分析。

为了完整细胞的抗体染色，通过以1700x g离心20分钟，自TSA板或TSB培养物收获细菌，并用没有酚红、补充有0.1％BSA(无IgG；Sigma)和10mMHepes，pH 7.4(HB缓冲液)的Hank氏缓冲盐溶液(HBSS)清洗。通过读取630nm处的光密度来估算细菌浓度。将HB缓冲液中20x10⁸个CFU/mL的细菌悬浮液与等体积的300μg/mL家兔IgG(Sigma)混合，并于室温(RT)温育1时以封闭非特异性IgG结合。添加一抗(包括rF1和人IgG1同种型对照)至终浓度2μg/mL，并将这些混合物于RT温育15分钟。用HB清洗两次之后，在荧光抗人IgG二抗(Jackson Immunoresearch)的溶液中重悬浮细菌团粒并于RT温育15分钟。将细菌用PBS清洗两次，在含1％低聚甲醛的PBS中重悬浮，并通过流式细胞术来分析。

rF1结合来自受感染组织的完整细菌的FACS分析。

为了分析抗体对来自受感染组织的细菌的结合，用PBS清洗USA300在TSB中的4小时次培养物。给小鼠静脉内注射100μL USA300在PBS中的悬浮液，估算浓度为10x10⁸个CFU/mL。3天后，收获肾、肝、和肺并使用锥形组织研磨管(VWR)匀浆。根据指示，在感染的不同时间点收获器官。为了裂解小鼠细胞，将匀浆物在含有0.1％Triton-X100(Thermo)、10μg/mL DNA酶I(Roche)和完全迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)的PBS中于RT温育10分钟，并通过40μm滤器(Falcon)。将细胞悬浮液用PBS清洗两次并在HB缓冲液中重悬浮，与等体积的600μtg/mL人IgG(Sigma)混合，并于RT温育1小时。添加一抗(包括rF1和人IgG1同种型对照)至终浓度2μg/mL。为了区分来自小鼠器官碎片的细菌，添加家兔IgG抗金黄色葡萄球菌(Abcam)至浓度20μg/mL。于RT温育15分钟之后，将细胞用HB缓冲液清洗两次，并在抗人IgG和抗家兔IgG二抗的混合物中重悬浮，二抗均标记有不同荧光染料(JacksonImmunoresearch)。用PBS清洗两次之后，将细胞在含2％低聚甲醛的PBS中重悬浮并通过流式细胞术来分析。通过对家兔IgG抗金黄色葡萄球菌的阳性染色来控门自双重荧光点选择细菌之后，生成了rF1和同种型对照的荧光强度的覆盖式柱状图。

结果

rF1强烈结合14种金黄色葡萄球菌菌株和表皮葡萄球菌

7种甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株、6种甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株、1种万古霉素中度敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)菌株、表皮葡萄球菌和7种其它革兰氏阳性物种测试对rF1抗体的结合。如图4所示，rF1强烈结合所有14种金黄色葡萄球菌菌株(图4A)和表皮葡萄球菌(图4B)，但不结合其它测试的革兰氏阳性物种(图4B)。

rF1结合来自不同生长阶段的和来自体内感染的MRSA

我们测试了单抗rF1结合不同组织中的和感染过程里的细菌的能力。我们发现了rF1结合感染后2天自鼠肾、肝和肺组织分离的细菌，而且对自受感染肾分离的细菌的结合是稳定的，结合感染后2、3和8天的细菌。

测试了rF1抗体对MRSA(菌株USA300)TSB培养中的不同生长阶段，即对数生长早期(2小时)和指数生长后(8小时)，及TSA板上固体菌落的生长的结合。rF1强烈结合所有测试的生长阶段的菌株(图5A)。

在小鼠受到MRSA***感染后3天来自小鼠的匀浆肾中测试了rF1抗体对MRSA(菌株USA300)对来自受感染组织的完整细菌的结合。如图5B所示，rF1结合自受感染组织获得的MRSA。

实施例3

实施了进一步实验来鉴定受到抗体rF1结合的表位。虽然已观察到对LTA制备物的结合(见例如实施例1)，该结合不像对完整细菌的结合那样强提示rF1结合可能涉及另一个表位。

方法

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌细胞壁裂解物和商品化WTA制备物的免疫沉淀、Western印迹和质谱术

将40微克来自Wood46金黄色葡萄球菌菌株(Biodesign/Meridian LifeSciences，Maine)的商品化壁磷壁酸(WTA)制备物拆分成两部分并用1ug/m1rF1或同种型对照人抗体免疫沉淀。用蛋白A/G Ultralink树脂(Pierce)捕捉抗体。然后将样品用50mM二硫苏糖醇、10mM 2-碘乙酰胺处理，并在8％Tris-甘氨酸凝胶上运行，随后用rF1进行Western印迹。

制备USA300金黄色葡萄球菌菌株的20ml过夜培养物的细胞壁制备物，即在30％棉子糖缓冲液中于37℃用100mg/ml溶葡萄球菌素处理培养物(40mg细胞团粒/ml)30分钟。将这个细胞壁制备物过滤，用NP40裂解缓冲液稀释至10ml并与抗Flag M2琼脂糖(Sigma)一起温育两次以尽可能多地自细胞壁制备物消减蛋白A。将最终的细胞壁制备物拆分成两部分并用1ug/ml rFl或同种型对照人抗体免疫沉淀。用蛋白A/G Ultralink树脂(Pierce)捕捉抗体。然后样品用50mM二硫苏糖醇、10mM 2-碘乙酰胺处理，并在8％Tris-甘氨酸凝胶上运行，随后进行银染色或用rF1进行Western印迹。

通过NP40裂解缓冲液中的珠打浆自表皮葡萄球菌的20ml过夜培养物制备裂解物。将所得裂解物制备物用NP40裂解缓冲液稀释至10ml，拆分成两部分并用1ug/ml rF1或对照抗体免疫沉淀。用蛋白A/G Ultralink树脂(Pierce)捕捉抗体。然后将样品用50mM二硫苏糖醇、10mM 2-碘乙酰胺处理，并在8％Tris-甘氨酸凝胶上运行，随后进行银染色或用rF1进行Western印迹。

为了蛋白质组分析，将样品应用于预装填SDS PAGE微型凝胶并用考马斯蓝对解析的蛋白质染色。切出来自凝胶中与通过rF1Western印迹显现的条带对应的区域的凝胶片并还原，用碘乙酰胺烷化，并用胰蛋白酶原位消化。通过微毛细管反相液体层析-数据依赖性实验中杂合线性离子阱傅里叶(Fourier)变换离子回旋加速器共振质谱仪(LTQ-FT；Thermo Fisher)上的纳米电喷射串联质谱术分析所得胰蛋白酶消化肽。使用Mascot软件(MatrixScience)提交串联质谱结果进行数据库检索。

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(e. coli)中表达的外源ClfA的表达

带His标签的ClfA的金黄色葡萄球菌表达：自USA300基因组DNA PCR扩增聚集因子(Clumping factor)-A(ClfA)基因，从编码信号序列的序列到编码LPXTG基序中甘氨酸的序列。在LPXTG基序的终点处改造c端His标签并连接入pTet金黄色葡萄球菌表达载体(pSAS10，来自Genentech)。然后将所得构建物电穿孔入金黄色葡萄球菌WT RN4220。自过夜培养物接种经过电穿孔的RN4220或RN4220空(不携带pTet表达载体)的20ml培养物(起始OD600为0.15)，在胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)培养1小时，然后用去水四环素(200ng/ml)诱导蛋白质表达2小时。在诱导期结束时，将金黄色葡萄球菌培养物用溶葡萄球菌素(50ug/ml)预裂解，然后通过裂解缓冲液(150mM NaCl，20mMTris pH 7.5，1％triton-X，和Roche蛋白酶抑制剂无EDTA片)中的珠打浆进一步裂解。然后在10mM咪唑存在下将经过清除的裂解物与NiNta树脂(Qiagen)一起于4℃温育1时以拉下重组的ClfA蛋白。

带His标签的Clfa的大肠杆菌表达：自USA300基因组DNAPCR扩增聚集因子-A(ClfA)基因，从编码N端信号序列的序列(有起始甲硫氨酸)到编码C端LPXTG基序中甘氨酸的序列。然后以c端His标签的读码框将扩增的PCR产物连接入pET 21b(+)大肠杆菌表达载体(Novagen)。将所得构建物转化入大肠杆菌BL21-gold(DE3)感受态细胞(Stratagene)并用IPTG依照制造商的指示诱导蛋白质表达3.5小时。通过裂解缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris pH 7.5，1％triton-X，和Roche蛋白酶抑制剂无EDTA片)中的珠打浆裂解经过诱导的大肠杆菌培养物。然后在10mM咪唑存在下将经过清除的裂解物与NiNta树脂(Qiagen)一起于4℃温育1小时以拉下重组的ClfA蛋白。

大肠杆菌中表达的外源ClfA的表达和金黄色葡萄球菌裂解物一起的温育

大肠杆菌中金黄色葡萄球菌细胞表面SDR蛋白ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE的表达和纯化：自USA300基因组DNAPCR扩增ClfA、ClfB、SdrC、SdrD和SdrE基因，从编码成熟蛋白起点的序列到编码LPXTG基序中甘氨酸的序列并以N端Unizyme标签的读码框连接入ST239载体(Genentech)。将构建物转化入大肠杆菌58F3(Genentech)，诱导蛋白质表达并随后纯化。

NiNta对带NT Unizyme标签的SDR蛋白的捕捉：将500ug纯化的N端带Unizyme标签的SDR蛋白(ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE)在含有蛋白酶抑制剂的PBS(无EDTA)中稀释并与NiNta树脂(Qiagen)一起于4℃温育1.5小时。然后将NiNta树脂及捕捉的带Unizyme标签的SDR蛋白用清洗缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl；pH 8.0)清洗一次。

金黄色葡萄球菌裂解物对大肠杆菌生成的SDR蛋白的修饰：25ml培养始于ΔPan Sdr突变体(ClfA-ClfB-SdrCDE-null；由Tim Foster，Trinity CollegeDublin馈赠)Newman金黄色葡萄球菌的过夜培养物(起始OD600为0.15)并在TSB中37℃，200rpm培养3小时(指数期)。将指数期培养物在1ml PBS中重悬浮并于37℃在250个单位Benzonase核酸酶(Novagen)存在下用200ug/ml溶葡萄球菌素裂解30分钟。通过在微量离心机中于4℃以最大速度旋转10分钟对裂解物清除碎片。进行NiNta捕捉的大肠杆菌SDR蛋白的修饰，即将与经过清除的ΔPan Sdr突变体金黄色葡萄球菌裂解物一起于37℃温育1小时。

经过修饰的大肠杆菌SDR蛋白的Western印迹：然后将未经修饰的或经过修饰的NiNta捕捉的大肠杆菌SDR蛋白样品用清洗缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑；pH 8.0)清洗三次，准备Western印迹并在8％Tris甘氨酸凝胶(Invitrogen)上运行。用rF1抗体或抗Unizyme抗体(Genentech)进行Western印迹。

SDR域鉴定为rF1的抗原

MBP-SD构建物的金黄色葡萄球菌表达：自pMAL-c5x载体(New EnglandBioLabs[NEB]，Ipswich，MA，USA)PCR克隆麦芽糖结合蛋白(MBP)基因，从编码成熟蛋白的起点的序列到编码因子Xa切割位点的终点的序列。作为单链寡核苷酸合成不同长度的c端带His标签的SD(SD、SDS、DSD、SDSD、SDSDS、SDSDSD)并一起退火以生成双链DNA。自相应质粒pTet.ClfA.SD618A或pTet.ClfA.SD709S(Genentech)PCR扩增ClfA基因的Sdr区，从编码Sdr区起点(560D)的序列开始，包括直至编码SD区618A或709S的序列，接着是编码His标签的DNA序列。作为对照，自质粒pTet.ClfA.Adom.538G(Genentech)PCR扩增编码ClfA基因的A域的序列，从成熟蛋白的起点到编码A域终点(538G)的序列，接着是编码His标签的序列。将MBP***物连同各种SD***物之一或ClfA域连接入pTet金黄色葡萄球菌表达载体(pSASl0，来自Genentech)。然后将所得构建物电穿孔入金黄色葡萄球菌RN4220Δ分选酶(RN4220背景中的分选酶删除突变体菌株)。

自过夜培养物接种经过电穿孔的RN4220Δ分选酶或RN4220Δ分选酶空(不携带pTet表达载体)的20ml培养物(起始OD600为0.15)，在补充有葡萄糖(2g/L)的胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)中培养1小时，然后用去水四环素(200ng/ml)诱导蛋白质表达2小时。在诱导期结束时，将金黄色葡萄球菌培养物在柱缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris pH 7.5和Roche蛋白酶抑制剂无EDTA片)中重悬浮并于37℃在250个单位Benzonase核酸酶(Novagen)存在下用200ug/ml溶葡萄球菌素裂解30分钟。通过在微量离心机中于4℃以最大速度旋转10分钟对裂解物清除碎片。然后经过清除的裂解物与直链淀粉树脂(NEB)连同终浓度1mM的EDTA一起于4℃温育1.5小时以捕捉表达的MBP-SD蛋白。

金黄色葡萄球菌表达的MBP-SD构建物的Western印迹：将直链淀粉树脂及捕捉的MBP-SD蛋白用柱缓冲液清洗三次，进一步准备Western印迹分析并在8％Tris-甘氨酸凝胶上运行。用rF 1抗体、抗五His抗体(Qiagen)或抗MBP抗体(NEB)进行Western印迹。

结果

rF1与金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中的SDR(Ser-Asp重复)蛋白的独特家族反应

商品化磷壁酸制备物和金黄色葡萄球菌(USA300株)细胞壁裂解物(WTA)测试免疫沉淀后对rF1的结合。rF1结合商品化磷壁酸制备物(图6A，左边小图)和金黄色葡萄球菌细胞壁裂解物(图6B，左边小图)的数种成分。使用质谱术，这些WTA制备物和细胞壁裂解物成分鉴定为ClfA(SdrA)、ClfB(SdrB)、SdrC、SdrD和SdrE(图6A，右边小图和图6B，右边小图)。

表皮葡萄球菌细胞壁裂解物测试免疫沉淀后对rF1的结合。图6C(左边小图)显示rF1对表皮葡萄球菌细胞壁裂解物的数种成分的结合。这些成分与对照抗体不同。使用质谱术，这些细胞壁成分鉴定为SdrF、SdrG和SdrH(图6C右边小图)。

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中的外源ClfA表达

在金黄色葡萄球菌中表达的外源ClfA对rF1有反应性，而在大肠杆菌中表达的ClfA没有(图7A)。然而，将大肠杆菌表达的Sdr蛋白ClfA(SdrA)、ClfB(SdrB)、SdrC、SdrD和SdrE与金黄色葡萄球菌裂解物一起温育再次获得rF1反应性(图7B)。

rF1结合在金黄色葡萄球菌中表达的SDR域

rF1抗体结合在金黄色葡萄球菌中表达的由ClfA560D-618S和ClfA560D-709S组成的ClfA Sdr区(图8)。rF1不结合ClfA的A域或由多至3个SD重复组成的小肽序列。

实施例4

方法

rF1的可变区克隆入pRK载体中

Phusion DNA聚合酶，限制酶EcoRV、KpnI、PvuII、ApaI、AgeI、和AhdI，T4DNA连接酶购自New England BioLabs，Ipswich，MA，USA。Pfu DNA聚合酶，快速改变II定点诱变试剂盒购自Stratagene/Agilent Technologies，Santa Clara，California，USA。2％琼脂糖凝胶购自Invitrogen，Carlsbad，Califomia，USA。pRK载体pRK.LPG3.HuKappa和pRK.LPG4.HumanHC得自Genentech/Roche，South San Francisco，California，USA。

将来自pCPEO载体的rF1Mab重链和轻链可变域放置入pRK哺乳动物表达载体。以50μl总体积使用Pfu DNA聚合酶依照标准PCR规程实施聚合酶链式反应(PCR)。用引物YiHCF)5’-ATG GCT GAG GTG CAG CTG GTG GAGTCT G-3’(SEQ ID NO：18)和YiHCR25’-GAA CAC GCT GGG GCC CTT GGTGCT GGC ACT CGA GAC TGT GAC CAG GGT GCC AGG T*CC CCA G-3’(SEQ ID NO：19)扩增VH(PVuII和ApaI的限制性位点标有下划线且*指示单核苷酸G变成T以消除内部ApaI位点)，并用引物YiLCF 5’-CGG CTC GAC CGA TAT CCA GCT GAC CCA GAG-3’(SEO ID NO：20)和YiLCR 5’-GAT TTCCAG CTT GGT ACC CTG GCC G-3’(SEO ID NO：21)扩增VL(EcoRV和KpnI标有下划线)。直接消化唯一的PCR产物，分别为393(VH)和328(VL)bp，PVuII和ApaI用于VH，EcoRV和KpnI用于VL，接着是凝胶纯化(Invitrogen，Catalog# K2100-12)。使用T4DNA连接酶将VH和VL各自连接入pRK载体片段，pRK/PvuII，ApaI用于重链，pRK/EcoRV，KpnI用于轻链。DNA质粒通过限制酶消化样式来确认，即在2％琼脂糖凝胶上，rF1VH通过AgeI释放～300bp和5.8kb条带，而rF1VL通过AhdI显示2.3和3.1kb条带。

化学应力测试

通过将抗体一级序列数据与实验观察到的降解事件比较，明白了某些序列基序可能趋于降解(即DD、DG、和DS序列处的天冬氨酸异构化和NG序列处的天冬酰胺脱酰胺)。如果抗体的CDR中出现此类降解“热点”的话，结合和效力可能受到负面影响。对于含有热点的分子，通过将抗体放置入平台配制缓冲液中并将对照样品与于40℃承压2周的样品比较，化学应力测试提供评估这些基序对降解的易感性的途径。如果观察到降解的话，可再次改造一级序列以消除热点。

在样品于40℃承压2周之后，实施多种分析性测定法来评估降解发生的位置和程度。实施成像毛细管等电聚焦(icIEF)分析来检查电荷变体，并使用质谱术来验证完整和缩小的抗体质量，并实施LC-MS/MS肽图来获得位点特异性降解信息。

诱变

rF1pRK质粒经快速改变II定点试剂盒(Quik change II Site-Directed Kit)经历一系列定点诱变以使用FHV 5’-GGT GGC CAG CAT CAA CAG CGGCAA CAA CCC CTA CTA CG-3’(SEQ ID NO：22)和RHV 5’-CGT AGT AGGGGT TGT TGC CGC TGT TGA TGC TGG CCA CC-3’(SEO ID NO：23)(诱变位点标有下划线)通过重链CDR2中的N(AAC)53S(AGC)来稳定rF1Mab。

对诱变变体测序。

结果

抗体rF1的一级序列含有轻链CDR2中的一个潜在的天冬酰胺降解位点：NNGNN (SEQ ID NO：24)。应力测试揭示了承压样品中在N53(编号方式依照Kabat，1991)处的脱酰胺的升高。实施了定点诱变，通过重链CDR2中N(AAC，(SEQ ID NO：25))至53S(AGC，(SEQ ID NO：26))的替代来稳定rF1Mab。对诱变变体的测序确认了N53S突变。

实施例5

用于抗体-药物偶联物(ADC)应用的Cys变体的开发

rF1pRK质粒经Stratagene的定点法经历一系列定点诱变，其中使用寡聚物rF1pRK.LC(205/210)VCF (468075)5’-GGG CCT GAG CTC GCC CTG CAC AAA GAG CTT CAA CAG-3’(SEQ ID NO：27)和rF1pRK.LC(205/210)VCR (468076)5’-CTG TTG AAG CTC TTT GTG CAGGGC GAG CTC AGG CCC-3’(SEQ ID NO：28)(Cys突变体标有下划线)来生成rF1thioMab的轻链接头，并使用rF1pRK.HCN53S.A121CF(468464)5’-CTGGTC ACA GTC TCG AGT TGC AGC ACC AAG GGC CCA TC-3’(SEO IDNO：29)和rF1pRK.HCN53S.A121CR(468465)5’-GAT GGG CCC TTG GTGCTG CAA CTC GAG ACT GTG ACC AG-3’(SEQ ID NO：30)(Cys突变体标有下划线)来生成rF1thioMab的重链接头。轻链V205C和重链A114C通过对变体测序来确认(图9)。

附图简述

图1：抗体F1的重链和轻链序列

图2：F1抗体结合来自数种***的LTA制备物。(a)LTA制备物衍生自Sigma且在用小鼠多克隆抗LTA进行的捕捉ELISA中测试或(b)一组高度纯化的LTA制备物衍生自W.Fischer。人抗RSV抗体D25用作非特异性阴性对照且小鼠单克隆抗LTA抗体用作阳性对照。

图3：重组的F1抗体结合金黄色葡萄球菌但不结合肺炎链球菌。(a)将细菌与F1抗体或对照IgG(人抗RSV抗体D25)一起或在没有一抗的情况(仅IgG-PE)中温育。清洗后，添加二抗(IgG-PE)。(b)对6份临床分离物在两个分开的实验中测试F1的结合。测试了PVL+菌株(SA-1)、3种常规菌株(SA-2、SA-3和SA-4)、和2种MRSA菌株(SA-5和SA-6)。

图4：(a)rF1抗体对14种金黄色葡萄球菌菌株的结合。(b)rF1抗体结合表皮葡萄球菌但不结合枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和酿脓链球菌。

图5：(a)rF1抗体结合处于不同生长阶段的MRSA，Iso C：同种型对照，Med：培养基对照。(b)rF1抗体结合自受感染组织分离的MRSA。

图6：rF1抗体结合SDR蛋白。(a)商品化金黄色葡萄球菌(Wood 46株)磷壁酸制备物用rF1或同种型对照抗体进行的免疫沉淀(IP)，接着是用rF1抗体进行的Western印迹(左边)和来自WTA制备物的受到rF1抗体结合的片段的质谱术分析(右边)，(b)金黄色葡萄球菌(USA300株)细胞壁裂解物用rF1或对照抗体进行的免疫沉淀(IP)，接着是用rF1抗体进行的Western印迹(WB)(左边)和受到rF1抗体结合的细胞壁片段(USA300株)的质谱术分析(右边)，(c)表皮葡萄球菌细胞壁裂解物用rF1或同种型对照抗体进行的免疫沉淀，接着是用rF1抗体进行的Western印迹(左边)、受到rF1抗体结合的细胞壁片段的质谱术分析(右边)。

图7：rF1对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中表达的SDR蛋白的结合。(a)含有过表达的带His标签的ClfA的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌裂解物使用抗His(左边)和rF1(右边)抗体的Western印迹。(b)含有带his标签的ClfA、ClfB、SdrC、SdrD和SdrE的大肠杆菌细胞裂解物在与金黄色葡萄球菌裂解物一起温育后使用rF1(顶部)或抗His(底部)抗体的Western印迹。

图8：rF1结合由金黄色葡萄球菌表达的SDR域。构建物由金黄色葡萄球菌表达并测试rF1的结合(左边)，含有表达的构建物的金黄色葡萄球菌裂解物使用抗MBP(麦芽糖结合蛋白)、抗His和rF1抗体的Western印迹(右边)。

图9：抗体rF1的重链A114C(a)和轻链V205C(b)变体的序列。编号方式依照Kabat(1991)，框：CDR。

参考文献

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Shvarts A.et al.Genes Dev 16，681-686(2002)

Weidenmaier C.et al.Nat Rev Microbiol 6，276-287(2008)

Claims

1.一种抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物，其包含：

-重链CDR1序列，其包含与序列RFAMS具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-重链CDR2序列，其包含与序列SINNGNNPYYARSVQY具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-重链CDR3序列，其包含与序列DHPSSGWPTFDS具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-轻链CDR1序列，其包含与序列RASENVGDWLA具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-轻链CDR2序列，其包含与序列KTSILES具有至少70％序列同一性的序列，和/或

-轻链CDR3序列，其包含与序列QHYXRFPYT具有至少70％序列同一性的序列，其中X为I或M。

2.依照权利要求1的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

3.依照权利要求1的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

4.依照权利要求1的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS序列具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

5.依照权利要求1的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

6.依照权利要求1的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

7.依照权利要求1的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其具有重链序列和/或具有轻链序列，该重链序列包含与序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS具有至少70％序列同一性的序列，该轻链序列与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

8.依照权利要求1-7任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其中一个或多个天冬酰胺已被另一种氨基酸替换。

9.依照权利要求8的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其中所述天冬酰胺是重链第53位处的天冬酰胺，其中氨基酸编号方式依照Kabat(1991)。

10.依照权利要求8或9的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其中所述其它氨基酸是丝氨酸。

11.依照权利要求1-10任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其中至少一个半胱氨酸以外的氨基酸已用半胱氨酸替换。

12.依照权利要求11的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其中所述至少一个半胱氨酸以外的氨基酸是轻链第205位处的缬氨酸和/或轻链第110位处的缬氨酸，和/或重链第114位处的丙氨酸，其中氨基酸编号方式依照Kabat(1991)。

13.依照权利要求1-12任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其为人抗体。

14.一种分离的抗体，其结合体内生长的金黄色葡萄球菌(S.aureus)。

15.权利要求14的抗体，其中所述抗体是人的。

16.一种抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其能够结合SD重复依赖性表位。

17.一种抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其能够结合金黄色葡萄球菌CIfA、CIfB、SdrC、SdrD和SdrE。

18.一种抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物，其能够与依照权利要求1-13任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物竞争对葡萄球菌属物种的结合。

19.一种长度为至少15个核苷酸的分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其编码依照权利要求1-13任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物的至少一种CDR序列。

20.一种分离的合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其包含与选自下组的序列具有至少70％序列同一性的序列：cgctttgccatgagc，tcgatcaataatgggaataacccatactacgcacggtcggtacaatac，gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc，cgggccagtgaaaacgttggtgactggttggcc，aagacatctattctagaaagt和caacactatatacgtttcccgtacact。

21.依照权利要求20的核酸序列或功能性等同物，其中所述核酸序列或功能性等同物包含与图1所示核苷酸序列的至少部分具有至少70％序列同一性的序列，所述部分具有至少15个核苷酸且编码至少一种CDR区。

22.依照分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能性等同物，其包含编码下述氨基酸序列的序列，所示氨基酸序列与序列RFAMS具有至少70％序列同一性，和/或与序列SINNGNNPYYARSVQY具有至少70％序列同一性，和/或与序列DHPSSGWPTFDS具有至少70％序列同一性，和/或与序列RASENVGDWLA具有至少70％序列同一性，和/或与序列KTSILES具有至少70％序列同一性，和/或与序列QHYXRFPYT具有至少70％序列同一性，其中X为I或M ，和/或与序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS具有至少70％序列同一性，和/或与序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV具有至少70％序列同一性，其中X为I或M。

23.依照权利要求1-22任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物，其用作药物和/或预防剂。

24.依照权利要求1-22任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物，其用作药物和/或预防剂，该药物和/或预防剂用于至少部分治疗和/或预防***相关病症。

25.依照权利要求1-22任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物用于制备药物和/或预防剂的用途，该药物和/或预防剂用于至少部分治疗和/或预防***相关病症。

26.一种药物组合物，其包含依照权利要求1-22任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物和药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。

27.一种分离的或重组的抗体生成细胞，其能够生成依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。

28.一种用于生成依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物的方法，包括提供具有依照权利要求19-22任一项的核酸序列或功能性等同物的细胞并容许所述细胞翻译所述依照权利要求19-22任一项的核酸序列或功能性等同物，由此生成所述依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。

29.依照权利要求28的方法，进一步包括收获、纯化和/或分离所述依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或功能性等同物。

30.依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物用于诊断葡萄球菌感染的用途。

31.依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物用于检测金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的用途。

32.依照权利要求1-18任一项的抗体或其功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物用于诊断葡萄球菌感染的用途。

33.一种使用依照权利要求1-18任一项的抗体或功能性部分或免疫球蛋白链或其功能性等同物自溶液分离金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌细菌的方法。