JP2016135771A - グラム陽性菌特異的結合化合物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】黄色ブドウ球菌、フェカリス菌、化膿連鎖球菌、表皮ブドウ球菌、及びバチルス・リケニフォルミスから選択される全グラム陽性細菌に結合する能力を有するが、肺炎球菌又はミュータンス菌には結合しない単離された抗体。前記抗体がヒト型であり、黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)、又はバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)である抗体。
【選択図】なし
Description
−配列RFAMS(配列番号1)に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む重鎖CDR1配列、及び/又は
−配列SINNGNNPYYARSVQY(配列番号2)に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む重鎖CDR2配列、及び/又は
−配列DHPSSGWPTFDS(配列番号3)に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む重鎖CDR3配列
を含む。
−配列RASENVGDWLA(配列番号4))に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖CDR1配列、及び/又は
−配列KTSILES(配列番号5)に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖CDR2配列、及び/又は
−XがI又はMである、配列QHYXRFPYT(配列番号6)に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖CDR3配列
を含む。
−配列RFAMS(配列番号1)を含む重鎖CDR1、及び/又は
−配列SINNGNNPYYARSVQY(配列番号2)を含む重鎖CDR2、及び/又は
−配列DHPSSGWPTFDS(配列番号3)を含む重鎖CDR3、及び/又は
−配列RASENVGDWLA(配列番号4)を含む軽鎖CDR1、及び/又は
−配列KTSILES(配列番号5)を含む軽鎖CDR2、及び/又は
−XがI又はMである配列QHYXRFPYT(配列番号6)を含む軽鎖CDR3
を含む。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号7)に少なくとも70%の配列同一性を持つ配列を含む重鎖配列を持ち、及び/又は
XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV(配列番号8)に少なくとも70%の配列同一性を持つ軽鎖配列を有する。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号9)、及び/又は、配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号7)を含む重鎖配列、及びXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA(配列番号10)、及び/又はXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV(配列番号11)、及び/又はXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV(配列番号8)を含む軽鎖配列を含む。
cgctttgccatgagc(配列番号12)、
tcgatcaataatgggaataacccatactacgcacggtcggtacaatac(配列番号13)、
gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc(配列番号14)、
cgggccagtgaaaacgttggtgactggttggcc(配列番号15)、
aagacatctattctagaaagt(配列番号16)、及び
caacactatatacgtttcccgtacact(配列番号17)
からなる群から選択される配列に対して少なくとも70%配列同一性を有する配列を含む、単離、合成又は組換え核酸配列、又はその機能的等価物である。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号7)に対して少なくとも70%の配列同一性を有するか、及び/又はXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV(配列番号8)に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、アミノ酸配列をコードする配列を含む単離、合成又は組換え核酸配列又は機能的等価物を提供する。同様に提供されるのは、本発明によるF1抗体の変異体をコードする核酸配列又はその機能性部分である。本発明によって提供されるのは、例えば、配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号9)、及び/又は配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号7)を含む重鎖配列をコードし、かつ
及びXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA(配列番号10)、及び/又はXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV(配列番号11)、及び/又はXがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV(配列番号8)を含む軽鎖配列をコードする核酸配列である。
B細胞の単離
B−細胞はフィコール分離、及び製造業者(Miltenyi Biotech)により説明された通りにMACSマイクロビーズによるCD4/CD8の負の選択により成人の新鮮な血液から得た。記憶B細胞を得るために、細胞はFACSaria(Becton Dickinson)上でCD19+CD3CD27+IgD IgAによって分類された。これらの組織の使用は機関の医療倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントを条件とした。ドナーは遺伝子型クラスター109及び16を持つ院内感染MRSA株の保菌に基づいて選択された。
IMDM(Gibco)、8%のFBS(HyClone)及びペニシリン/ストレプトマイシン(ロッシュ)を含む標準培地中で維持されたB−細胞が、γ−照射(50Gy)マウスL細胞繊維芽細胞を安定に発現するCD40L(CD40L−L細胞、105細胞/ml)及び組換えマウスIL−21(25ng/ml、R&Dsystems)上で共培養された。rhIL−4(R&D)は50ng/mlで使用した。細胞は、日常的にPCRにより試験され、マイコプラズマ及びEBVの存在について否定的であることが分かった(データ非表示)。
BCL6レトロウイルスコンストラクトは以前説明されている(Shvarts A.等、Genes Dev16、681-686(2002))。ヒトBcl−xLをコードするcDNAはStanley Korsmeyer博士により好意的に提供された。BCL6及びBcl−xLは別個にBCL6−NGFR及びBcIxL−GFPコンストラクトにクローニングした。これらのコンストラクトは、前述したようにLZRSレトロウイルスパッケージング細胞のフェニックスに形質移入した(Jaleco A.C.等、Blood 94,2637-2646(1999);Scheeren F.A.等、Nat Immunol 6,303-313(2005))。記憶B細胞は、前述のように36時間rmIL−21の存在下でCD40L−L細胞の活性化の後にレトロウイルスを含むBCL6及びBcl−xLにより二重形質導入された(Diehl S.A.等、J Immunol 180,4805-4815(2008);Kwakkenbos M.等、Nat Med印刷中(2009))。形質導入細胞はrmIL−21によりCD40L−L細胞で維持された。
抗体含有量を決定するためにELISAプレートは5μg/mlのPBS中の抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)により1時間37℃又は4℃で一晩コーティングし、ELISA洗浄バッファー(PBS、0.5%のTween20)で洗浄した。細胞培養上清の連続希釈前及び酵素標識検出抗体が添加される前に、PBS中の4%のミルクを遮断薬として使用した(HRP標識抗IgG(Jackson)において希釈は1:2500)。TMB基質/停止液(Biosource)がELISAの構築に使用された。
Newmanの黄色ブドウ球菌及び肺炎球菌株(セロタイプ3)を用いた。NewmanはTSH 50ml中で一晩培養し、次いで1mlを100ml中にOD:1になるまで2から2.5時間再懸濁し、細菌が回収された。肺炎球菌は、酵母培地と混合したトッドヒューイット(Todd Hewiit)培地で培養した。細菌がF1抗体、コントロールのIgG(D25、ヒト抗RSV抗体)と共に、又は2次抗体(IgG−PEのみ)のみと共にインキュベートされる前に、細胞はバックグランド染色を防ぐために100%完全なマウス血清で前処理された。洗浄後2次抗体が添加された(IgG−PE)。抗体インキュベーションは氷上で20分間行った。
我々は全RNAをTrizol(インビトロジェン)を用いて単離し、superscript RTを用いてcDNAを生成し、重鎖及び軽鎖の可変領域をpCR2.1 TAクローニングベクター(インビトロジェン)へクローニングした。逆転写酵素又はDNAポリメラーゼの誘発変異を除外するために、我々は複数の独立したクローニング実験を行った。組換え型F1モノクローナル抗体を産生するために、我々は、ヒトIgG1及びカッパ(κ)定常領域を持つフレーム中のF1重鎖及び軽鎖可変領域をpcDNA3.1(インビトロジェン)をベースとしたベクターへクローニングし、一過性に293T細胞に形質移入した。我々は、プロテインAにより培養上清から組換えF1を精製した。
F1クローンの生成
MRSA陽性と判定されたが病気ではない3人の患者から、フィコール精製工程の後にヘパリン血液50−60mlを回収し、末梢B細胞が単離された。複数のB細胞集団由来のB細胞はBCL6−NGFR及びBcl−XL−GFP(Diehl等及びKwakkenbos等)を含むレトロウイルスで二重に形質導入した。IgG、CD27陽性細胞集団から、B−細胞培養ポリクローナル小規模培養のB細胞培養が、500細胞/ウェルの細胞密度で96穴プレートで開始された。これらの小規模培養の上清が回収され、黄色ブドウ球菌特異的IgG抗体のスクリーニングのためELISAに用いられた(これらのELISAではコーティングはSH1000及びNewmanの2種の黄色ブドウ球菌株の細胞ライセートであった)。SH1000並びにNewman黄色ブドウ球菌の両方で陽性とスクリーニングされた小規模培養は、10細胞/ウェルの密度で新たな小規模培養に播種した。再び、これらの小規模培養の上清が回収され、SH1000及びNewmanELISAでスクリーニングされた。両方のELISAで陽性とスクリーニングされたクローンをモノクロナール培養(すなわち、1細胞/ウェル)に播種した。これらのモノクローナル培養の上清を試験した後、1つのクローン(F1と命名)が黄色ブドウ球菌に特異的なモノクローナルIgG抗体を産生することが見いだされた。
F1のクローンを産生し、我々は、F1の上清が2種の黄色ブドウ球菌株、SH1000及びNewmanの細菌の細胞ライセートに結合することを既に見いだした。グラム陽性菌の主要な細胞壁化合物はLTAであり、従って我々は、ELISAにおいて、F1上清の黄色ブドウ球菌のLTA調製物への結合を試験することを決めた。表1に示した通り、F1クローンの上清はSH1000及びNewmanの黄色ブドウ球菌株だけでなく商業的に購入した精製黄色ブドウ球菌のLTA調製物にも結合する。しかし我々は、LTA調製物への結合は全細菌で観察されたものより著しく低かったことに気がついた。
抗体遺伝子を発現ベクター中にクローニングし、発現系において組換えF1(rF1)抗体を産生した後、rF1抗体が複数の細菌由来の精製LTA調製物で試験された。図2Aに示すように、rF1抗体は、黄色ブドウ球菌及び枯草菌から得た商用LTA試料に良く結合し、フェカリス菌(S.faecalis)及び化膿レンサ球菌(S.pyogenes)由来のLTA試料にもそれに劣らず良く結合した。rF1抗体は、肺炎球菌由来のLTA試料には結合しなかった(データ非表示)。更にrF1は、枯草菌、B.licheniformis及び黄色ブドウ球菌の2つの分離株から高度に精製されたLTA試料を認識した(図2b)。rF1はミュータンス(S.mutans)菌由来のLTA調製物(図2b)、又はラクトコッカス・ラクティス(L.lactis)、L.garvieae、ビフズス菌(B.bifidum)、ミクロコッカス・ルテウス(M.luteus)、カゼイ菌(L.casei)、リゥコノストック・メゼンテロイデス(L.mesenteroides)、リステリア‐ウェルシメリ(L.welshimeri)、エンテロコッカス・ヒラエ(E.hirae)、ラクトコッカス・ラフィノラクティス(L.raffinolactis)、ミュータンス菌(S.mutans)、肺炎球菌(S.pneumoniae)に結合しなかった(結果非表示)。
rF1抗体が生きているグラム陽性細菌をも認識するかどうかを検討するために、F1抗体の黄色ブドウ球菌及び肺炎球菌に対する結合をフローサイトメトリーを用いて試験した。図3Aに示すように、rF1抗体は、生きている黄色ブドウ球菌の細菌(Newman株)に結合するが、肺炎球菌には結合しない。さらに、我々はrF1が6つの臨床的黄色ブドウ球菌分離株を認識することを示した;一つは、PVL陽性である病原性株であり、3つは通常株、及び2つはMRSA株である(図3b)。
方法
細菌株及び培養。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株USA300(1114)、USA400、N315、USA100、USA1000、COL、MRSA252、並びにメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)株のReynolds、Becker、Smith Diffuse、MN8、及びバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)株のMu50は全て黄色ブドウ球菌の抗生物質抵抗性に関するネットワーク(NARSA)から入手した;MSSA株のNewman及びRosenbachはATCCから得た。表皮ブドウ球菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、フェカリス菌(Enterococcus faecalis)、及び化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)は、Ward’s Natural Scienceから得た;リステリア菌(Listeria monocytogenes)はATCCから得た。細菌は37℃で18時間、5%ヒツジ血液を補充されたトリプシン大豆寒天(TSA)プレート上で増殖させた。液体培養に対しては、TSAプレートからの単一コロニーをトリプシン大豆ブロス(TSB)に接種し、37℃で18時間200rpmで振とうしながら培養した。新鮮なTSB中でこれらの培養物の新鮮な100倍希釈液が更に何回も継代培養された。
全細胞の抗体染色のために、細菌はTSAプレート又はTSB培養物から回収され、0.1%BSA(IgGフリー、シグマ社)、及び10mMのHepespH7.4(HBバッファー)を添加したフェノールレッド無しで、ハンクス緩衝塩溶液(HBSS)で20分間1700×gでの遠心分離により洗浄した。細菌の濃度は、630nmで光学密度を読み取ることにより見積もられた。HBバッファ−内の20×108CFU/mLの細菌懸濁液が等量の300μg/mlのウサギIgG(シグマ)と混合され、非特異的IgG結合をブロックするために室温(RT)で1時間インキュベートした。rF1及びヒトIgG1アイソタイプコントロールを含む一次抗体は、2μg/mLの最終濃度になるように追加され、これらの混合物は15分間室温でインキュベートされた。HBで2回洗浄した後、細菌ペレットを蛍光抗ヒトIgG二次抗体(ジャクソンイムノ)の溶液に再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。細菌はPBSで2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒドを含むPBSに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
感染組織由来の細菌に結合する抗体の解析のために、TSB中のUSA300の4時間継代培養細胞をPBSで洗浄した。マウスは、PBS中のUSA300の懸濁液100μLを推定濃度10×108CFU/mLにて静脈内注射された。三日後、腎臓、肝臓、肺を採取し円錐形の組織グラインダーチューブ(VWR)を使用してホモジナイズした。必要あらば、臓器は感染の異なる時点で採取された。マウスの細胞を溶解するために、ホモジネートは、0.1%トリトン−X100(Thermo社)、10μg/mLのDNaseI(ロシュ)及び完全なミニプロテアーゼインヒビターカクテル(ロッシュ)を含むPBSで室温で10分間インキュベートされ、40μmのフィルター(ファルコン)を通された。細胞懸濁液をPBSで2回洗浄し、HB緩衝液に再懸濁させ、等量の600μg/mLのヒトIgG(シグマ)と混合され、室温で1時間インキュベートした。rF1及びヒトIgG1アイソタイプコントロールを含む一次抗体が、最終濃度2μg/mLまで追加された。マウス臓器の破片由良の細菌を区別するために、ウサギIgG抗黄色ブドウ球菌(Abeam)が濃度20μg/mLまで追加された。室温で15分間インキュベーション後、細胞をHB緩衝液で2回洗浄し、各々異なる蛍光色素(Jackson Immunoresearch)で標識された、抗ヒトIgG及び抗ウサギIgG二次抗体の混合物に再懸濁させた。PBSで2回洗浄後、細胞を2%パラホルムアルデヒドを含むPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。ウサギIgG抗黄色ブドウ球菌による陽性染色のためのゲーティングにより二重蛍光のプロットから細菌を選択した後、rF1及びアイソタイプコントロールの蛍光強度の重ね描きヒストグラムプロットが生成された。
rF1は14種の黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌に強く結合する。
7つのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株、6つのメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)株、1つのバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)株、表皮ブドウ球菌及び他の複数のグラム陽性菌種がrF1抗体への結合について試験された。図4に示すように、rF1は全14種の黄色ブドウ球菌株(図4A)及び表皮ブドウ球菌(図4B)に強く結合したが、他の試験されたグラム陽性種(図4B)には結合しなかった。
我々は、細菌に結合するモノクローナル抗体rF1の能力を、異なる組織において及び感染経過に関しての両方で試験した。我々はrF1はマウスの腎臓、肝臓、肺組織から単離した細菌に感染後2日で結合し、及び感染した腎臓から単離した細菌への結合は安定であり、感染後2、3及び8日後の結合細菌であることを見いだした。
更なる実験が、抗体rF1が結合したエピトープを同定するために行われた。LTA調製物への結合は観察されていたが(例えば、実施例1)、その結合は全細菌に結合するほど強力ではなく、別のエピトープがrF1結合に関与する可能性を示唆している。
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌及び商用WTA調製物の細胞壁ライセートの免疫沈降、ウェスタンブロット法及び質量分析
Wood46黄色ブドウ球菌株(バイオデザイン/メリディアンライフサイエンス社、メイン州)からの商用のタイコ酸(WTA)調製物40マイクログラムを2つの部分に分割し、1ug/mlのrF1又はアイソタイプコントロールヒト抗体で免疫沈降した。抗体は、プロテインA/G Ultralink Resin(Pierce)で捕捉された。次に、試料を50mMのジチオスレイトール、10mMの2−ヨードアセトアミドで処理し、8%トリス−グリシンゲル上で流し、続いてrF1でウェスタンブロットを行った。
Hisタグ付きClfAの黄色ブドウ球菌発現:クランピング因子A(ClfA)遺伝子は、シグナル配列をコードする配列からUSA300ゲノムDNA由来のLPXTGモチーフ中のグリシンをコードする配列へと増幅された。C末端HisタグはLPXTGモチーフの終わりに設計され、pTet黄色ブドウ球菌発現ベクター(ジェネンテック社のpSASlO)に連結された。得られたコンストラクトは次いで黄色ブドウ球菌WT RN4220へ電気穿孔された。電気穿孔されたRN4220、又はRN4220無し(pTet発現ベクターを持たない)の何れかの20mlの培養は、一晩培養物(OD600が0.15から開始)から播種され、1時間トリプシン大豆ブロス(TSB)中で成長させ、次いでアンヒドロテトラサイクリン(200ng/ml)で2時間タンパク質発現を誘導した。誘導期間の終了時に、黄色ブドウ球菌の培養は、リゾスタフィン(50ug/ml)であらかじめ溶解した後、更に溶解バッファー(150mMのNaCl、20mMのトリス(pH7.5)、1%トリトン−X、及びロシュプロテアーゼ阻害剤EDTA−フリー錠)でビーズ破砕により溶解した。清澄化ライセートがその後10mMイミダゾールの存在下で4℃で1時間NiNta樹脂(Qiagen社)と共にインキュベートされ、組換えClfAタンパク質をプルダウンした。
黄色ブドウ球菌の細胞表面SDRタンパク質ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrEの大腸菌における発現及び精製:ClfA、ClfB、SdrC、SdrD及びSdrE遺伝子は、タンパク質の成熟したスタートをコードする配列から、USA300ゲノムDNA由来C末端LPXTGモチーフ中のグリシンをコードする配列へとPCR増幅され、ST239ベクター(ジェネンテック)へN末端Unizymeタグと共にインフレームで連結した。コンストラクトは、大腸菌58F3(ジェネンテック社)に形質転換され、タンパク質の発現が誘導され、続いて精製された。
MBP−SDコンストラクトの黄色ブドウ球菌の発現:マルトース結合タンパク質(MBP)遺伝子は、成熟タンパク質の開始をコードする配列からファクターXa開裂部位の終点をコードする配列まで、pMal−c5xベクター(New England Biolabs社[NEB]、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国)からPCR増幅された。C末端にHisタグが付いた様々な長さのSD(SD、SDS、DSD、SDSD、SDSDS、SDSDSD)は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成され、二本鎖DNAを作るために一緒にアニールされた。ClfA遺伝子のSdr領域は、Sdr領域の先頭(560D)をコードする配列からPCR増幅され、プラスミドpTet.ClfA.SD618A又はpTet.ClfA.SD709S(ジェネンテック)のそれぞれに由来のHisタグをコードする配列が続くSD領域の618A又は709Sの何れかをコードする配列まで包含された。コントロールとして、成熟タンパク質の開始からAドメインの終点までコードする配列(538G)にHisタグをコードする配列が続くClfA遺伝子のAドメインをコードする配列が、プラスミドpTet.ClfA.Adom.538G(ジェネンテック)からPCR増幅された。様々なSD挿入の一つと共にMBP挿入又はClfAドメインが、pTet黄色ブドウ球菌発現ベクター(ジェネンテックのpSASlO)に結合された。得られたコンストラクトは次いで、黄色ブドウ球菌RN4220のΔsortase(RN4220バックグラウンド中のsortase欠失変異株)に電気穿孔された。
rF1は黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌のSDR(Ser−Aspリピート)タンパク質のユニークなファミリーに反応する。
市販のタイコ酸調製物及び黄色ブドウ球菌の細胞壁ライセート(WTA)(USA300株)が、免疫沈降後にrF1に対する結合について試験された。rF1は、市販のタイコ酸調製物(図6A、左パネル)及び黄色ブドウ球菌(図6b、左パネル)の細胞壁溶解物の複数の成分に結合する。質量分析法を使用してこれらのWTA調製物及び細胞壁溶解液の成分をClfA(SdrA)、ClfB(SdrB)、SdrC、SdrD及びSdrE(図6Aの右パネル及び図6Bの右パネル)として同定された。
黄色ブドウ球菌で発現される外因性のClfAは、rF1に対し反応性であるが、大腸菌で発現させたClfAは(図7a)反応性ではなかった。しかしながら、大腸菌で発現させたSdrタンパク質ClfA(SdrA)、ClfB(SdrB)、SdrC、SdrD及びSdrEを黄色ブドウ球菌のライセートとともにインキュベーションするとrF1反応性を取り戻した(図7b)。
rF1抗体は黄色ブドウ球菌で発現されたClfA560D−618S及びClfA560D−709S(図8)から成るClfA Sdr領域に結合する。rF1はClfAのAドメイン又は最大3つのSDリピートから成る小さなペプチド配列には結合しない。
方法
rF1の可変領域のpRKベクターへのクローニング
Phusion DNAポリメラーゼ、制限酵素EcoRV、KpnI、PvuII、Apal、Agel,及びAhdl、T4 DNAリガーゼは、New England Biolabs社、イプスウィッチ、米国マサチューセッツ州から購入した。Pfu DNAポリメラーゼ、クイックチェンジII部位特異的突然変異誘発キットはStratagene社/アジレント・テクノロジー、サンタクララ、カリフォルニア州、米国から購入した。2%アガロースゲルは、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国から購入した。pRKベクターのpRK.LPG3.HuKappa及びpRK.LPG4.HumanHCはジェネンテック/ロシュ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国から得た。
抗体の一次配列データを実験的に観察された分解事象と比較することによって、所定の配列モチーフが劣化しやすい可能性がある(すなわち、DD、DG及びDS配列でのアスパラギン酸異性化、及びNG配列でのアスパラギンの脱アミド)ことが明らかになった。そのような劣化による「ホットスポット」が抗体のCDRに現れる場合、結合及び効力が負の影響を及ぼされる可能性がある。ホットスポットを含む分子において化学ストレス試験は、抗体をプラットフォームフォーミュレーションバッファーに入れ、コントロール試料を40℃で2週間ストレスを受けたものと比較することにより、劣化に対するこれらのモチーフの感受性を評価する方法を提供する。もし劣化が観察される場合、一次配列はホットスポットを除去するために再設計することができる。
rF1のpRKプラスミドはrF1モノクロナール抗体を安定させるためにQuik change II部位特異的キットを介して、FHV5’−GGT GGC CAG CAT CAA CAG CGG CAA CAA CCC CTA CTA CG−3’(配列番号22)及びRHV5’−CGT AGT AGG GGT TGT TGC CGC TGT TGA TGC TGG CCA CC−3’(配列番号23)(変異生成部位は下線が引かれる)を使用することにより、重鎖CDR2のN(AAC)53S(AGC)により一連の部位特異的突然変異誘発を受けた。突然変異誘発変異体は配列決定された。
抗体rF1の一次配列は、軽鎖CDR2に1つの潜在的なアスパラギン脱アミド部位をを含有した:NNGNN(配列番号24)。ストレステストでは、N53(Kabatによる番号付け、1991)においてストレスをかけた試料における脱アミド化の増加を明らかにした。部位特異的突然変異誘発が、重鎖CDR2のN(AAC、(配列番号25))を53S(AGC、(配列番号26))へ置換することでrF1モノクロナール抗体を安定化させるために実施された。突然変異誘発変異体の配列はN53S変異を確認した。
抗体−薬物複合体(ADC)適用のためのCys変異体の開発
rFl pRKプラスミドはStratagene社の部位特異的方法により、rF1チオモノクロナール抗体の軽鎖リンカーを生成するために、rFlpRK.LC(205/210)VCF(468075)5’−GGG CCT GAG CTC GCC CTG CAC AAA GAG CTT CAA CAG−3’(配列番号27)及びrFlpRK.LC(205/210)VCR(468076)5’−CTG TTG AAG CTC TTT GTG CAG GGC GAG CTC AGG CCC−3
’(配列番号28)(Cys変異は下線)、及びrF1チオモノクロナール抗体の重鎖リンカーを作成するために、rFlpRK.HCN53S.Al2lCF(468464)5’−CTG GTC ACA GTC TCG AGT TGC AGC ACC AAG GGC CCA TC−3’(配列番号29)及びrFlpRK.HCN53S.Al2lCR(468465)5’−GAT GGG CCC TTG GTG CTG CAA CTC GAG ACT GTG ACC AG−3’(配列番号30)(Cys変異は下線)のオリゴによる一連の部位特異的変異誘発をうけた。軽鎖V205Cと重鎖のA114Cは、変異体(図9)シーケンシングにより確認した。
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Claims (54)
- 黄色ブドウ球菌(S.aureus)、フェカリス菌(S.faecalis)、化膿連鎖球菌(S.pyrogen)、表皮ブドウ球菌(S.epidermidis)、及びバチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)からなる群から選択される全グラム陽性細菌に結合する能力を有するが、肺炎球菌(S.pneumonia)又はミュータンス菌(S.mutans)には結合しない単離された抗体。
- 前記抗体がヒト型である、請求項1に記載の抗体。
- 黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)である、請求項1に記載の抗体。
- 黄色ブドウ球菌がメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)である、請求項1に記載の抗体。
- 黄色ブドウ球菌が、バンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体がラクトコッカス・ラクティス(L.lactis)、溶血性レンサ球菌(L.garvieae)、ビフィズス菌(B.bifidum)、ルテウス菌(M.luteus)、カゼイ菌(L.casei)、リゥコノストック・メゼンテロイデス(L.mesenteroides)、リステリア‐ウェルシメリ(L.welshimeri)、エンテロコッカス・ヒラエ(E.hirae)、ラクトコッカス・ラフィノラクティス(L.raffinolactis)、ミュータンス菌(S.mutans)又は肺炎球菌(S.pneumoniae)に結合しない、請求項1に記載の抗体。
- a)重鎖CDR1配列RFAMS(配列番号1)、及び
b)重鎖CDR2配列SINNGNNPYYARSVQY(配列番号2)、及び
c)重鎖CDR3配列DHPSSGWPTFDS(配列番号3)
を含む単離された抗体。 - 更に可変軽鎖を含む、請求項7に記載の抗体。
- a)軽鎖CDR1配列RASENVGDWLA(配列番号4)、及び
b)軽鎖CDR2配列KTSILES(配列番号5)、及び
c)XがI又はMである軽鎖CDR3配列QHYXRFPYT(配列番号6)
を含む単離された抗体。 - 更に可変重鎖を含む、請求項9に記載の抗体。
- a)軽鎖CDR1配列RASENVGDWLA(配列番号4)、及び
b)軽鎖CDR2配列KTSILES(配列番号5)、及び
c)XがI又はMである軽鎖CDR3配列QHYXRFPYT(配列番号6)
を更に含む請求項7に記載の抗体。 - 軽鎖CDR3配列がQHYIRFPYT(配列番号6)である請求項9又は11に記載の抗体。
- 軽鎖CDR3配列がQHYMRFPYT(配列番号6)である請求項9又は11に記載の抗体。
- 抗体が、
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLS(配列番号37)に対して少なくとも90%同一であるフレームワーク1(FW1);
b)WVRQAPGRGLEWVA(配列番号39)に対して少なくとも90%同一であるフレームワーク2(FW2);
c)RFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAK(配列番号41)に対して少なくとも90%同一であるフレームワーク3(FW3);及び
d)WGPGTLVTVSS(配列番号43)に対して少なくとも90%同一であるフレームワーク4(FW4)
を含む可変重鎖配列を含む、請求項7に記載の抗体。 - 抗体が、
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLS(配列番号37)の配列を有するフレームワーク1(FW1);
b)WVRQAPGRGLEWVA(配列番号39)の配列を有するフレームワーク2(FW2);
c)RFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAK(配列番号41)の配列を有するフレームワーク3(FW3);及び
d)WGPGTLVTVSS(配列番号43)の配列を有するフレームワーク4(FW4)
を含む可変重鎖配列を有する、請求項14に記載の抗体。 - 抗体が、配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (配列番号7)
に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖配列を含む、請求項7に記載の抗体。 - 抗体が、配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS (配列番号7)
を有する可変重鎖配列を含む、請求項16に記載の抗体。 - 抗体が、
a)DIQLTQSPSALPASVGDRVSITC(配列番号47)に対して少なくとも90%同一性を有するフレームワーク1(FW1);
b)WYRQKPGKAPNLLIY(配列番号49)に対して少なくとも90%同一性を有するフレームワーク2(FW2);
c)GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(配列番号51)に対して少なくとも90%同一性を有するフレームワーク3(FW3);及び
d)FGQGTKLEIKRTV(配列番号53)に対して少なくとも90%同一性を有するフレームワーク4(FW4)
を含む可変軽鎖配列を有する、請求項9に記載の抗体。 - 抗体が、
a)DIQLTQSPSALPASVGDRVSITC(配列番号47)の配列を有するフレームワーク1(FW1);
b)WYRQKPGKAPNLLIY(配列番号49)の配列を有するフレームワーク2(FW2);
c)GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(配列番号51)の配列を有するフレームワーク3(FW3);及び
d)FGQGTKLEIKRTV(配列番号53)の配列を有するフレームワーク4(FW4)
を含む可変軽鎖配列を有する、請求項18に記載の抗体。 - 抗体が、
a)DIQLTQSPSALPASVGDRVSITC(配列番号47)の配列を有するフレームワーク1(FW1);
b)WYRQKPGKAPNLLIY(配列番号49)の配列を有するフレームワーク2(FW2);
c)GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(配列番号51)の配列を有するフレームワーク3(FW3);及び
d)FGQGTKVEIKRTV(配列番号59)の配列を有するフレームワーク4(FW4)
を含む可変軽鎖配列を有する、請求項18に記載の抗体。 - 抗体が、XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV(配列番号11)
に対して少なくとも90%配列同一性を有する可変軽鎖配列を含む、請求項9に記載の抗体。 - 抗体が、XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV(配列番号11)
を有する可変軽鎖配列を含む、請求項21に記載の抗体。 - 抗体が、
a)配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS
(配列番号7)を含む可変重鎖、及び
b)XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV(配列番号11)を含む可変軽鎖
を含む、請求項1に記載の抗体。 - 抗体が、
a)配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号9)を含む可変重鎖、
b)XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV(配列番号8)を含む可変軽鎖
を含む、請求項1に記載の抗体。 - 抗体が、
a)配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号9)を含む可変重鎖、
b)XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA(配列番号10)を含む可変軽鎖
を含む、請求項1に記載の抗体。 - 抗体が、
a)配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号9)を含む可変重鎖、及び
b)XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVEIKRTV(配列番号11)を含む可変軽鎖
を含む、請求項1に記載の抗体。 - 抗体が、
a)配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号7)を含む可変重鎖、及び
b)XがI又はMである配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV(配列番号8)を含む可変軽鎖
を含む、請求項1に記載の抗体。 - 抗体が、
a)配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS(配列番号7)を含む可変重鎖、及び
b)配列
DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKT
c)XがI又はMである、SILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRA(配列番号10)を含む可変軽鎖
を含む、請求項1に記載の抗体。 - a)配列番号55の配列を含む重鎖、及び
b)配列番号57の配列を含む軽鎖
を含む、単離された抗体。 - a)配列番号56の配列を含む重鎖、及び
b)配列番号58の配列を含む軽鎖
を含む、単離された抗体。 - Kabat(1991)のアミノ酸番号付けによる可変重鎖の位置53のアスパラギンが他のアミノ酸に置換された、請求項11に記載の抗体。
- Kabat(1991)のアミノ酸番号付けによる位置53の前記アスパラギンがセリンに置換され、位置114のアラニンがシステインに置換され、位置222のアルギニンがリジンに置換された、請求項31に記載の抗体。
- Kabat(1991)のアミノ酸番号付けによる可変軽鎖の位置205のバリンがシステインに置換され、可変軽鎖の位置110のアラニンがバリンに置換され、可変軽鎖の位置104のロイシンがバリンに置換された、請求項11に記載の抗体。
- 抗体の機能部分が単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ナノボディ(nanobody)、ユニボディ(unibody)、単鎖可変断片(scFv)、Fab断片及びF(ab’)2断片からなる群から選択される、請求項1、7、9、又は11の何れか一項に記載の抗体の機能部分を含む組成物。
- インビボで増殖した黄色ブドウ球菌に結合する単離された抗体。
- 前記抗体がヒト型である、請求項35に記載の抗体。
- SDリピート依存性エピトープに結合する能力を持つ抗体。
- 黄色ブドウ球菌ClfA、ClfB、SdrC、SdrD及びSdrEに結合する能力を持つ抗体。
- 請求項11に記載の抗体とブドウ球菌属への結合に関して拮抗する能力を持つ抗体。
- 請求項1から33及び35から39に記載の抗体の何れかをコードする、単離された、合成された又は組換え型核酸配列。
- 配列が、重鎖CDR1配列cgctttgccatgagc(配列番号12)、重鎖CDR2配列tcgatcaataatgggaataacccatactacgcacggtcggtacaatac(配列番号13)、重鎖CDR3配列gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc(配列番号14),軽鎖CDR1配列cgggccagtgaaaacgttggtgactggttggcc(配列番号15),軽鎖CDR2配列aagacatctattctagaaagt(配列番号16)及び軽鎖CDR3配列caacactatatacgtttcccgtacact(配列番号17)からなる群から選択される、重鎖CDR1、CDR2、又はCDR3又は軽鎖CDR1、CDR2、又はCDR3をコードする単離された、合成された又は組換え型の核酸配列。
- 請求項40に記載の核酸を含む単離された細胞。
- 請求項41に記載の核酸を含む単離された細胞。
- 医薬として及び/又は予防薬として使用のための、請求項1から33又は35から41の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列。
- グラム陽性細菌関連疾患の治療及び/又は予防のための医薬及び/又は予防薬として使用のための、請求項1から33又は35から41の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列。
- グラム陽性細菌関連疾患の治療及び/又は予防のための医薬及び/又は予防薬の調製ための、請求項1から33又は35から41の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列の使用。
- 請求項1から33又は35から41の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項1から33又は35から39の何れか一項に記載の抗体を産生することが可能な、単離された又は組換え型抗体を産生する細胞。
- 請求項40から41の何れか一項に記載の核酸配列を持つ細胞を提供し、前記細胞に請求項40から41の何れか一項に記載の前記核酸配列を翻訳させ、請求項1から33又は35から39の何れか一項に記載の抗体を産生することを含む、請求項1から33又は35から39の何れか一項に記載の抗体を産生する方法。
- 請求項1から33又は35から39の何れか一項に記載の前記抗体を回収し、精製し及び/又は単離することを更に含む、請求項49に記載の方法。
- ブドウ球菌感染症の診断のための請求項1から33又は35から41の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列の使用。
- 黄色ブドウ球菌及び/又は表皮ブドウ球菌を検出するための請求項1から33又は35から41の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列の使用。
- ブドウ球菌感染症の診断における使用のための請求項1から33又は35から39の何れか一項に記載の抗体。
- 請求項1から33又は35から39の何れか一項に記載の抗体を使用して、溶液から黄色ブドウ球菌及び/又は表皮ブドウ球菌を単離する方法。
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