CN103429615B - 用于生产高亲和力抗体的方式和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于使用稳定的B细胞培养物产生抗目标抗原的高亲和力抗体的方式和方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域。更具体地，本发明涉及抗体生产领域。
背景技术
体外B细胞培养是当前生物学和医学应用中的重要工具。一个重要应用是培养产生抗体的细胞以获得抗体，优选获得单克隆抗体。单克隆抗体(mAb)代表单个抗体分子的多个相同拷贝。其中mAb的益处是它们对抗原上的相同表位的特异性。该特异性赋予mAb比更传统的治疗好的某些临床优势，同时为患者提供了一种有效、耐受良好且通常具有低副作用的治疗选择。另外，mAb可用于生物学和医学研究。
在模拟生发中心(GC)反应的一些关键方面的条件下(即使用CD40配体(L)激活B细胞，和在细胞因子如白介素(IL)-4、IL-10或IL-21的存在下)可以体外培养成熟的B细胞。同时用CD40L、IL-2和IL-4培养的B细胞产生非常少量的Ig，添加IL-21导致B细胞分化为浆细胞，且伴随高Ig的分泌。虽然已经证明该体外***可用于研究B细胞分化的一些方面，但初始IgD+的B细胞和切换的(switched)IgD-记忆B细胞最终分化为末端分化的浆细胞(terminally differentiated plasma cell)，该末端分化的浆细胞伴随着妨碍长期抗原特异性的BCR阳性细胞系的产生的细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。
最近的进展已经深入了解了多个转录因子(包括B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(BLIMP1)和B细胞淋巴瘤因子(BCL)6)如何控制GC B细胞发育成终末阻滞的产生抗体的浆细胞。研究显示出转录阻遏蛋白BCL6阻止浆细胞分化。BCL6在GC B细胞中高度表达，在该GCB细胞中BCL6通过下调p53促进B细胞扩张，且通过负调节BLIMP1阻止GC细胞过早分化为浆细胞。
最近，在WO2007/067046中描述了一种用于生成产生抗体的成浆细胞样B细胞的改进方法，据此通过引用将WO2007/067046并入本文。根据该方法，在B细胞(优选记忆B细胞)中调节BCL6和Bcl-2家族成员(优选Bcl-xL)的量以生成产生抗体的成浆细胞样B细胞。在WO2007/067046中，直接或间接地影响BCL6和/或Bcl-xL表达产物的量。优选地，因为BCL6和Bcl-xL表达产物均参与产生抗体的B细胞的稳定，因此该两种表达产物的量在所述产生抗体的细胞中升高。所述Bcl-xL是抗凋亡Bcl-2家族的成员。由Bcl-2家族控制的过程涉及凋亡的线粒体途径，其中Bcl-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。当隔绝在线粒体外膜和内膜之间的分子通过线粒体外膜透化被释放至细胞质中时，该途径推进。促凋亡家族成员可以被分为两类。效应因子Bax和Bak通过形成蛋白脂质孔来参与透化线粒体外膜，其中效应因子Bax和Bak包含所谓的Bcl-2同源结构域3(BH3)的结构域；促凋亡的唯BH3域蛋白(Bad、Bik、Bim、Bid、Hrk、Bmf、bNIP3、Puma和Noxa)通过与其他(抗凋亡)Bcl-2家族成员的蛋白-蛋白相互作用而作用于不同的细胞应激。
抗凋亡的Bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1和Mcl-1通常与线粒体外膜整合。他们直接结合且抑制促凋亡的Bcl-2蛋白以保护线粒体膜的完整。
在所述方法中，进一步优选地是所述产生抗体的成浆细胞样B细胞用IL21和CD40L培养。优选地，在CD40L的存在下培养B细胞(诸如产生抗体的成浆细胞样B细胞)，因为CD40L有助于大部分B细胞的复制。进一步优选地，在所述产生抗体的B细胞中激活STAT3。可以通过多种方式实现STAT3的激活。优选地，通过向产生抗体的细胞提供细胞因子来激活STAT3。天然参与B细胞分化的细胞因子对调节STAT3蛋白是非常有效的。STAT3的非常有效的激活因子是IL 2、IL 10、IL 21和IL 6，但是已知IL 7、IL 9、IL 15、IL 23和IL 27也能够激活STAT3。另外或可选择地，通过将编码STAT3突变体的核酸转移至B细胞中实现STAT3的激活，其中该STAT3突变体赋予STAT3的组成性激活(Sean A Diehl，Heike Schmidlin，MahoNagasawa，Simon D van Haren，Mark J Kwakkenbos，Etsuko Yasuda，Tim Beaumont，Ferenc A Scheeren，Hergen Spits STAT3-mediated up-regulation of BLIMP1 iscoordinated with BCL6 down-regulation to control human plasma celldifferentiation J Immunol 2008 vol.180(7)pp.4805-15)。
最优选的是使用IL 21，因为IL 21特别适用于影响产生抗体的成浆细胞样B细胞的稳定。除了上调STAT3之外，IL 21即使在Blimp1的表达被BCL6抵消时仍然能够上调Blimp1的表达。通过在WO 2007/067046中公开的方法，延长产生抗体的细胞的复制寿命成为可能，因为可以将B细胞保持在发生复制的发育阶段。在早期体外B细胞培养中，复制寿命仅有几个星期至两个月。在这段时间内，培养的细胞丧生了他们的复制能力而死亡。但是通过如在WO 2007/067046中公开的方法，延长产生抗体的记忆B细胞的复制寿命成为可能，以便发生包括能够复制且产生抗体的成浆细胞样B细胞的体外培养。
虽然这些方法能够产生有效靶定目标抗原(antigen of interest)的抗体，但是经常想获得抗体特性(诸如结合亲和力)的改善。因此通常通过在编码的核酸(encodingnucleic acid)(优选在CDR编码区)中引入突变且检验所产生的抗体来改变结合特性。但是该方法耗费时间。因此想得到用于获得高亲和力抗体的替代方法。
发明内容
本发明的目的是提供用于产生和/或选择高亲和力抗体的方法。
本发明提供了用于从给定的B细胞培养物起始以获得B细胞群的方式和方法，该B细胞群比最初的B细胞培养物具有更高的平均结合能力。优选地，从单克隆B细胞培养物产生单克隆B细胞群。本发明提供了一种简单精确的方法，用于获得具有增强的平均结合能力的B细胞群，且不需要辛苦的突变技术。
本发明提供了一种用于产生对目标抗原特异性的抗体的方法，所述方法包括：
a)选择能够产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞，或者
选择B细胞，该B细胞能够分化成能产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞；
b)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的BCL6的表达；
c)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的抗凋亡核酸的表达；
d)允许所述B细胞扩张(expansion)成为所述B细胞的群；
e)从所述B细胞的群中选择至少一个B细胞，所述至少一个B细胞产生对所述目标抗原具有比所述B细胞的群的平均结合能力高的结合能力的B细胞受体和/或抗体；
f)将所述至少一个B细胞培养成为B细胞的群；以及
g)获得由所述B细胞的培养物产生的抗体。
在能够产生对目标抗原特异性的抗体的单克隆B细胞的群内，在根据本发明的方法的步骤e)中可以选择至少一个、可选的多于一个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、25个或50个)的B细胞，该B细胞对所述目标抗原具有结合能力，且该结合能力高于所述B细胞的群对所述目标抗原的平均结合能力。本文中将这样的B细胞称为“高亲和力B细胞”，其中与B细胞群对所述目标抗原的平均结合能力相比，该B细胞对目标抗原具有更高的结合能力。在B细胞的单克隆群中的多个B细胞之间存在结合能力的差异的可能原因是：在所述群中，B细胞之间BCR的表达不同。具有相对高的BCR表达的B细胞要比具有相对低的BCR表达的B细胞结合更多的目标抗原。但是预期具有不同BCR表达的B细胞所产生的抗体具有相同的结合亲和力。本发明人令人惊讶地发现除相对高的BCR表达之外，高亲和力B细胞的集合产生对目标抗原特异性的抗体，且该抗体通过比所述B细胞群产生的抗体的平均亲和力更高的亲和力与所述抗原结合。更加令人惊讶的是本发明人发现通过根据本发明的方法获得的B细胞培养物包含如下的细胞：该细胞通过比最初培养物中的平均B细胞更高的亲和力与抗原结合。因此可以通过本领域已知的方法，根据它们更高的结合能力从给定的B细胞的群中分离单种B细胞，且在至少三个星期中扩张为新的B细胞群。这些新的B细胞产生比最初的B细胞群产生的抗体具有更高亲和力的抗体，其中该新的B细胞来源于该最初的B细胞群。这一发现与预期相反，因为本领域的技术人员预期在从已经是所述B细胞单克隆群中分离一个B细胞(亚克隆)之后，所述已经是单克隆的B细胞群的亚克隆的后代所产生的抗体对抗原的亲和力将恢复为对该抗原的平均亲和力，与从其中选择至少一个B细胞的B细胞群的平均亲和力相当。
因此，在一个实施方式中，在根据本发明的方法的步骤a)中，优选地例如从B细胞的多克隆群中选择单个B细胞。随后，在步骤b)至步骤d)中该单个B细胞扩张成B细胞的单克隆群。例如使用上文中所讨论的WO2007/067046中描述的方法实现该过程。由此在步骤d)中，获得对目标抗原特异性的单克隆B细胞系。原则上，虽然所述单克隆B细胞系的细胞之间对所述抗原的亲和力可能存在小的差异(即单克隆群中的一些B细胞产生亲和力略高于平均亲和力的抗体，且单克隆群中的一些B细胞产生具有略低亲和力的抗体)，但在单克隆B细胞系中的所有B细胞基本产生对所述抗原特异性的相同的抗体。B细胞群再次稍微变的非均质(heterogeneous)。在步骤e)中，从单克隆B细胞系中选择至少一个具有亲和力高于平均亲和力的B细胞。随后在步骤f)中，将B细胞或在步骤e)中选择的B细胞培养成优选为单克隆的第二B细胞系。本发明深入了解到该优选为单克隆的第二B细胞系具有比在步骤d)中获得的最初单克隆B细胞群的平均亲和力更高的平均亲和力。如上所述，令人惊奇地发现在培养之后(即使培养发生在较长的时间段内)仍然保持所选择的B细胞的高亲和力，而不是恢复为最初细胞群的平均亲和力。因此，在步骤f)中培养的B细胞第二单克隆群对上述抗原具有比在步骤d)中培养的B细胞单克隆群更高的平均亲和力。类似地，步骤f)的第二单克隆群中的大部分B细胞的亲和力高于步骤d)的单克隆群中的大部分B细胞的亲和力。
因此在一个实施方式中，本发明提供了一种用于获得B细胞群的方法，与对目标抗原具有给定平均亲和力的最初单克隆B细胞群相比，获得的该B细胞群对所述目标抗原具有增高的平均亲和力。所述方法包括：
提供对所述目标抗原特异性的单克隆B细胞群；
从所述B细胞群中选择至少一个B细胞，所述至少一个B细胞产生对目标所述抗原具有结合能力比所述B细胞群的平均结合能力更高的B细胞受体和/或抗体；以及
将所述至少一个B细胞培养成为B细胞群。
本发明进一步提供了一种用于产生对目标抗原特异性的抗体的方法，所述方法包括：
a)选择能够产生对所述目标抗原特异性的抗体的单个B细胞；或者选择能够分化成能产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞的B细胞；
b)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的BCL6的表达；
c)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的抗凋亡核酸的表达；
d)允许所述B细胞扩张成第一单克隆B细胞系；
e)从所述第一单克隆B细胞系中选择至少一个B细胞，所述至少一个B细胞产生对所述抗原目标具有的结合能力比所述第一单克隆B细胞系的平均结合能力更高的B细胞受体和/或抗体；
f)将在步骤e)中选择出的所述至少一个B细胞培养成第二、优选为单克隆的B细胞系；以及
g)获得通过所述第二、优选为单克隆的B细胞系产生的抗体。获得抗体，该抗体对所述目标抗原的亲和力高于所述第一单克隆B细胞系产生的抗体对所述目标抗原的平均亲和力。
在另一实施方式中，在本发明的方法的步骤a)中选择多于一个的B细胞，例如2、3、4、5、10、15、25、50或100个B细胞。例如从B细胞的多克隆群或生物样品中选择B细胞。随后例如使用WO2007/067046中描述的方法，在步骤b)至步骤d)中使所选择的B细胞扩张成为B细胞群。由此获得的B细胞群是(第二)多克隆B细胞群。之后，且在进行本发明的方法的步骤e)之前，优选产生B细胞的单克隆群。这一过程例如通过使用荧光激活细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting)或有限稀释(limiting dilution)(将在下文进行解释)从所述B细胞的(第二)多克隆群中选择单个B细胞，且将所选择的单个B细胞扩张成为B细胞的单克隆群。然后，进行本发明方法的步骤e)，在步骤e)中，选择至少一个具有的亲和力比单克隆B细胞群的平均亲和力更高的B细胞。随后，在步骤f)中将在步骤e)中选择的单个B细胞或多个B细胞培养成第二单克隆B细胞系，之后在步骤g)中获得所述第二单克隆B细胞系产生的抗体。
本文所描述的方法允许在不使用重组技术的情况下，获得改善的、高亲和力的抗体，优选为单克隆抗体。在本发明之前，使用这样的重组技术增强(单克隆)抗体的亲和力。首先需要确定编码抗体的核酸序列。随后将一个或多个突变引入编码抗体的核酸序列中。然后需要在细胞中表达包含一个或多个突变的基因，随后在生产细胞(producer cell)中生产抗体。最后，必需检验突变的抗体对目标抗原的结合能力，以确定与未突变的抗体相比是否获得了对所述抗原具有改善的亲和力的抗体。为了改善抗体亲和力的这样的过程是复杂且耗时的。根据本发明的方法允许以直接且不太复杂的过程，在不需要分子工程的情况下产生高亲和力的抗体。
在本发明的一个实施方式中，在从所述已经是B细胞单克隆群中选择至少一个高亲和力的B细胞的步骤之后(如上所述的本发明的方法的步骤e))，可使所述至少一个高亲和力的B细胞再次扩张成B细胞群，优选为单克隆B细胞系，之后进行从所述新的B细胞群、优选从所述新的单克隆B细胞系中选择至少一个高亲和力的B细胞的另一步骤。通过重复使选择的B细胞扩张成群，且根据B细胞对抗原的结合能力选择至少一个B细胞的步骤(即重复步骤d)和步骤e))，可以生成产生高亲和力抗体的B细胞。优选地，通过重复如上所述地扩张和选择步骤，可以通过每一次的选择周期增强所得到的B细胞群产生的抗体对目标抗原的亲和力。
由此所提供的方法包括：在根据本发明的方法的步骤e)之后，使选择的至少一个高亲和力的B细胞扩张成B细胞群、优选为单克隆B细胞系，以及再次选择至少一个高亲和力的B细胞的步骤；即至少重复一次本发明的方法的步骤d)和步骤e)。例如重复一次所述步骤，但是优选地重复两次、三次、四次、五次或更多次所述步骤。
在一个实施方式中，提供了本发明的方法，其中，将在步骤e)中选择的所述至少一个B细胞培养达至少四个星期。优选地，将在步骤e)中选择的所述至少一个B细胞培养达至少六个星期，更优选地达至少九个星期，更优选地达至少三个月，更优选地达至少六个月。
在不受任何理论的限制下，认为在一个单克隆B细胞群内出现抗体对目标抗原的不同亲和力可能源于由活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(Activation Induced CytidineDeaminase，AID)介导的过程。在生发中心中的抗原激活的初始B细胞和记忆B细胞经历广泛的增殖，并伴随由AID介导的Ig基因的体细胞高频突变(somatic hypermutation，SHM)和类别转换重组(class-switch recombination，CSR)。AID使免疫球蛋白基因中的脱氧胞苷残基脱去氨基，其中免疫球蛋白基因引发抗体的多样性。专利申请US2008305076中证明IL21诱导BLIMP、BCL6和AID的表达，但是并不直接诱导体细胞高频突变。然而，本发明人发现在根据本文所描述的方法培养的B细胞中表达AID。AID在产生抗体的B细胞(会发育成产生抗体的B细胞的B细胞)内的表达使得能够生成新的免疫球蛋白，该新的免疫球蛋白含有初始B细胞在使用BCL6和抗凋亡核酸转导之前没有的突变。由此，培养其中通过AID表达诱导体细胞超频突变的B细胞允许生成免疫球蛋白变体，该免疫球蛋白变体例如对目标抗原具有较高或较低的亲和力，或者例如在水溶液中或在盐增加的条件下更加稳定，或上述的任意组合。
从所述B细胞群中选择出至少一个高亲和力的B细胞时，AID仍然在所述选择的至少一个B细胞内表达。因此，在选择这样的B细胞之后，所述B细胞中的AID仍然能够在所述B细胞后代的免疫球蛋白基因中引入突变。免疫球蛋白基因中的体细胞高频突变优选出现在Ig基因的CDR3区域中。与导致增强的结合亲和力相比，免疫球蛋白CDR3区域中引入的突变更有可能导致所述免疫球蛋白对抗原的结合亲和力减弱或丧失。但是本发明确实发现了增强的结合亲和力。
如本文所使用的，术语“抗凋亡核酸”指能够延迟和/或防止B细胞中的凋亡的核酸。优选地，所述抗凋亡核酸能够延迟和/或防止产生抗体的B细胞中的凋亡。优选地，使用包括外源核酸的抗凋亡核酸。这样意味着使用在B细胞中非自然表达的核酸序列，或者使用自然出现的核酸的额外拷贝，以便与自然B细胞相比，在得到的B细胞中的表达得以提高。本领域已知多种抗凋亡核酸，这样可获得多种实施方式。优选地，使用编码抗凋亡分子的基因。更优选地，使用为Bcl-2家族的抗凋亡成员的核酸，因为抗凋亡的Bcl-2蛋白是很好的凋亡抑制因子。由Bcl-2家族(该家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白)控制的很多过程涉及凋亡的线粒体途径，如在下文更详细概述的那样。优选抗凋亡的Bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1和Mcl-1，因为他们通常与线粒体外膜整合。他们直接结合且抑制属于Bcl-2家族的促凋亡蛋白，以保护线粒体膜的完整性。
在特别优选的实施方式中，所述抗凋亡核酸编码Bcl-xL和/或Mcl-1，和/或Bcl-xL的功能部分和/或Mcl-1的功能部分。BCL-6和Bcl-xL核酸的组合，以及BCL-6和Mcl-1核酸的组合特别适用于使B细胞永生化及得到的成浆细胞样B细胞的长期培养。最优选地，所述抗凋亡的核酸编码Bcl-xL或其功能部分，因为BCL-6和Bcl-xL的组合特别好地使B细胞稳定。
本文中将Bcl-xL的功能部分和Mcl-1的功能部分分别定义为Bcl-xL的片段和Mcl-1的片段，该Bcl-xL的片段和Mcl-1的片段已经分别在性质上(但不一定在数量上)保持了与全长Bcl-xL和Mcl-1相同的抗凋亡特性。Bcl-xL和Mcl-1的功能片段典型地是能够延迟和/或防止B细胞中凋亡的Bcl-xL和Mcl-1的较短片段。这样的功能片段例如缺少不会有利于Bcl-xL或Mcl-1的抗凋亡活性的序列。
根据本发明的B细胞群优选是B细胞的单克隆群。根据本发明的B细胞群的实施例是B细胞的细胞系，优选是单克隆B细胞。因此，根据本发明的B细胞群最优选地是单克隆B细胞系。例如通过培养所述B细胞直至获得所述B细胞群来实现使所述B细胞扩张成所述B细胞群。
在B细胞群内，甚至在单克隆B细胞群中，所述群的B细胞的BCR的结合能力与所述群的B细胞所产生的抗体的结合能力并不相同，而是在所述结合能力上存在变化。本文中，将B细胞群的平均结合能力定义为在所述群中的所有单个B细胞的BCR和/或抗体的结合能力的平均值或平均亲和力。本文中，将由B细胞或B细胞群产生的抗体对目标抗原的平均亲和力定义为由在所述群中的所有单个B细胞产生的抗体对所述目标抗原的亲和力的平均值。根据本发明，来自B细胞群、优选来自单克隆B细胞系的高亲和力B细胞选自群、优选单克隆B细胞系中的结合能力和/或亲和力为前(upper)40％的B细胞，优选地选自所述群或单克隆B细胞系中的前30％的B细胞，更优选地来自所述群或单克隆B细胞系中的前25％的B细胞，更优选地来自所述群或单克隆B细胞系中的前20％的B细胞，更优选地来自所述群或单克隆B细胞系中的前15％的B细胞，更优选地来自所述群或单克隆B细胞系中的前10％的B细胞，更优选地来自所述群或单克隆B细胞系中的前1％的B细胞。在一个实施方式中，一个高亲和力的B细胞选自群或单克隆B细胞系中的结合能力和/或亲和力为前1％的B细胞。
根据本发明，由从至少一个高亲和力的B细胞培养的B细胞群、优选单克隆B细胞系所产生的抗体对目标抗原的平均亲和力优选地为从其中选择该至少一个高亲和力的B细胞的B细胞群对所述目标抗原的平均亲和力的至少1.1倍，更优选地对所述目标抗原的平均亲和力为至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、10.0、20、50、100倍，或更高。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法确定抗体的亲和力。例如使用酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、表面等离子体共振(SurfacePlasmon Resonance)(诸如Biacore)或Octet(ForteBio)。表面等离子体共振(SPR)和Octet是在没有标记的环境中实时测量生物分子相互作用的技术。对于SPR，其中一个反应物(例如抗体)被固定至传感器表面，另一个反应物(例如抗原)游离在溶液中且通过该表面。以任意单位测量关联和分离，且优选地显示为传感图。结合至生物传感器尖端的分子数量的任何变化均导致干扰图像(interference pattern)上的变化，可以实时测量该干扰图像。使用Octet，分析从两个表面反射的白光的干扰图像、生物传感器尖端上固定的蛋白层及内参考层。固定在生物传感器尖端表面上的配体(例如抗体)和溶液中的蛋白(例如目标抗原)之间的结合产生在生物传感器尖端上的光学厚度的增加，这导致为生物层厚度变化的直接测量的波长变化。ELISA包括将蛋白(例如目标抗原)固定在固体承载物(例如96孔板)的表面上，且将要检测或定量的样品涂覆在固体承载物上。可选择地，将捕获抗体(captureantibody)固定在固体承载物的表面上，之后将包含要检测或定量的蛋白样品涂覆在固定的捕获抗体上以允许目标蛋白结合。然后洗去未结合的蛋白。随后将缀合至标记物或酶的特异性抗体(或一抗，然后是缀合至标记物或酶的二抗)添加至固体承载物。优选地，确定由根据本发明的B细胞产生的抗体的亲和常数(KD)。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法测量根据本发明的B细胞与目标抗原的结合。例如，使用例如荧光标记物标记目标抗原。随后可以通过各种技术(其中有荧光显微镜和荧光激活细胞分选(FACS))确定结合的检测。FACS可以根据针对表面抗原的缀合的抗体大小和荧光分离悬浮液中的细胞。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法从B细胞群、优选从单克隆B细胞系中选择至少一个高亲和力的B细胞。例如使用FACS(见上文)或有限稀释，通过细胞分选进行根据本发明的至少一个高亲和力的B细胞的选择。有限稀释包括细胞(例如B细胞)悬浮液的系列稀释，直至在给定体积中存在单个细胞。随后，测试每个B细胞(在单个细胞扩张成群之后)的结合能力，以能够选择产生对抗原具有高亲和力的抗体的B细胞。
能够产生抗体的B细胞被定义为：能够产生和/或分泌抗体或其功能部分的B细胞；和/或，能够发育为能够产生和/或分泌抗体或其功能部分的细胞的B细胞。
抗体的功能部分被定义为在性质上(而不需要在量上)与所述抗体具有至少一种相同的性质。所述功能部分优选能够结合与所述抗体一样的抗原，但不一定是以相同的程度。抗体的功能部分优选包括单域抗体、单链抗体、FAB片段、纳米抗体(nanobody)、单抗体(unibody)、单链可变区片段(scFv)或F(ab’)2片段。
在根据本发明的方法中，使用或选择的B细胞的非限制性实例包括来源于人类个体、啮齿动物、兔、美洲驼(llama)、猪、奶牛(cow)、山羊、马、猿、黑猩猩、猕猴和大猩猩的B细胞。优选地，所述B细胞是人类细胞、小鼠细胞、兔细胞、猿细胞、黑猩猩细胞、猕猴细胞和/或美洲驼细胞。最优选地，所述B细胞是人类B细胞。
在优选的实施方式中，在如本文所述的方法的步骤a)中选择记忆B细胞，例如人类记忆B细胞。在特别优选的实施方式中，所述记忆B细胞是外周血的记忆B细胞。在不会使来源的个体太过不舒适的情况下容易获得外周血记忆B细胞，且该外周血记忆B细胞似乎非常适于在根据本发明的方法中使用。
使用根据本发明的方法获得的B细胞或B细胞群、优选单克隆B细胞系优选稳定至少四个星期、更优选至少六个星期、更优选至少九个星期、更优选至少三个月、更优选至少六个月，这意味着这样的B细胞在所述时间段内能够复制且产生抗体，或能够复制且发育成产生抗体的细胞。根据本发明的B细胞优选包括：产生IgM的细胞；或产生其他免疫球蛋白同种型(isotype)如IgG、或IgA、或IgE，优选IgG的细胞。根据本发明的B细胞特别适于在生成产生抗体的细胞系中使用。优选在体外培养根据本发明的高亲和力的B细胞或高亲和力的B细胞群或单克隆B细胞系，且优选收集抗体用于进一步的使用。通过根据本发明的方法产生的抗体或其功能部分可用于多种应用，例如治疗、预防(prophylactic)和诊断应用，以及研究目的和体外实验。例如进行筛选检测，其中根据本发明的抗体或功能部分与样品孵育以确定是否存在目标抗原。
在一个实施方式中，根据本发明的高亲和力的B细胞或高亲和力的B细胞群或单克隆B细胞系包括人类B细胞，能够产生人类抗体，因为人类抗体特别适于人类个体中的治疗和/或预防应用。
通过多种方式诱导、增加和/或保持B细胞中的BCL6的表达。在一个实施方式中，向B细胞提供编码BCL6或同源物的核酸。在另一实施方式中，向B细胞提供能够直接或间接增强BCL6表达的化合物。这样的化合物包括激活和转录的信号转导因子(Signal Transducerof Activation and Transcription)5蛋白或其功能部分、衍生物和/或类似物，和/或编码它们的核酸序列。STAT5是能够增强BCL6表达的信号转导因子。存在两种已知的STAT5形式：STAT5a和STAT5b，该两种形式是由两个不同的串联连接的基因编码的。STAT5的给予和/或激活使BCL6水平升高。因此，由STAT5或其功能部分、衍生物和/或类似物引起的BCL6表达上调至少部分补偿了由Blimp-1引起的BCL6的下调。因此，STAT5或其功能部分、衍生物和/或类似物能够直接影响BCL6的表达。其还可以间接影响BCL6的表达。这例如通过调节反过来能够直接或间接激活STAT5和/或调节STAT5表达的化合物的量来实现。因此，在一个实施方式中，升高了内源和/或外源STAT5的表达和/或活性。例如，可以通过在能够激活STAT5的白介素(IL)2和/或IL4或其他细胞因子的存在下培养产生抗体的细胞，能间接增强BCL6的表达。
进一步优选地，在根据本发明的方法中，所述B细胞至少在某一阶段用IL21和CD40L孵育。优选在CD40L的存在下培养B细胞(诸如产生抗体的成浆细胞样B细胞)，因为CD40L有助于大部分B细胞的复制。进一步优选地，在所述B细胞中激活STAT3。最优选地，IL21用于上调STAT3，因为IL21特别适于影响根据本发明的B细胞的稳定。除了上调STAT3之外，IL21即使在Blimp1的表达被BCL6阻抑时仍然能够上调Blimp1的表达。
在另一实施方式中，直接或间接控制在根据本发明的方法的步骤a)中选择的所述B细胞中的Blimp-1表达产物的量。可以通过多种方式，例如通过调节STAT3或其功能部分、衍生物或类似物控制Blimp-1表达产物的量。通过多种方式激活STAT3。优选地，向根据本发明的B细胞提供细胞因子来激活STAT3。天然参与B细胞分化的细胞因子对调节STAT蛋白非常有效。STAT3的非常有效的激活因子是IL-21和IL-6，并且还已知IL-2、IL-7、IL-10、IL-15和IL-27也能够激活STAT3。此外，参与固有免疫(innate immunity)的Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)也能够激活STAT3。最优选使用IL-21。IL-21即使在Blimp1的表达被BCL6阻抑时仍然能够上调Blimp1的表达。
STAT5或STAT3的功能部分意味着分别具有与STAT5蛋白或STAT3蛋白相比在性质上(而不一定在量上)相同的影响产生抗体的细胞的稳定性的能力。STAT5蛋白或STAT3蛋白的功能部分例如缺少没有或仅非常少地涉及所述能力的氨基酸。STAT5或STAT3的衍生物被定为如下的蛋白：已经被改变，以便所述蛋白影响产生抗体的细胞稳定性的能力在性质上(而不一定在量上)基本相同。以很多方式、例如通过保守氨基酸取代来提供衍生物，其中一个氨基酸被另一个具有大体类似性质(大小、疏水性等)的氨基酸所取代，以便可能不会严重影响整体功能。例如衍生物包括融合蛋白，诸如STAT5-ER融合蛋白，该STAT5-ER融合蛋白的活性依赖于4-羟基三苯氧胺(4HT)的存在。STAT5或STAT3的类似物(analogue)被定义为在性质上(而不一定在量上)具有相同的影响产生抗体的细胞稳定性的能力。所述类似物不一定来源于所述STAT5或STAT3蛋白。
根据本发明的方法优选用于高亲和力的B细胞的细胞系，该高亲和力的B细胞的细胞系能够稳定达至少一个星期、优选至少一个月、更优选至少三个月、更优选至少六个月，以便使商业高亲和力的抗体生产变为可能。优选地，产生能够产生单克隆高亲和力的抗体的稳定细胞系。这优选通过使用记忆B细胞来实现，例如通过选择CD19(B细胞标识物)和细胞表面IgG和/或CD27(用于标识记忆细胞)从样品中分离该记忆B细胞。进一步地，例如使用目标抗原在结合检测中选择能够特异性结合所述目标抗原的记忆B细胞。随后，BCL6和抗凋亡的核酸(优选Bcl-XL或Mcl-1)优选地在所述B细胞中共表达，产生对所述目标抗原特异性的细胞群。优选地，在本文所描述的方法的步骤a)中仅选择一个记忆细胞，以便获得产生单克隆抗体的根据本发明的B细胞群(单克隆B细胞系)。
在一个实施方式中，在根据本发明的方法中优选使用B细胞(但不一定是记忆B细胞)，该B细胞源自之前已经暴露于目标抗原的个体。但是这并不是必需的。还可以使用来自还未暴露于所述目标抗原的个体的B细胞。例如，使用对另一抗原特异性、但显示出与目标抗原具有交叉反应活性的B细胞。作为另一实例，使用从个体的初始B细胞群中选择的B细胞。个体的初始B细胞群即使在该个体还未暴露于所述目标抗原的情况下，仍然可能包含显示出与所述目标抗原具有反应活性的B细胞。例如使用标记的目标抗原从初始B细胞群中选择这样的B细胞。
本发明进一步提供了通过根据本发明的方法获得的分离或重组的B细胞和B细胞群、优选为单克隆B细胞系。这样的高亲和力的B细胞优选稳定达至少一个星期、优选达至少一个月、更优选达至少三个月、更优选达至少六个月，这意味着在所述时间段内B细胞即能够复制也能够产生抗体，或者能够复制和发育成产生抗体的细胞。根据本发明的B细胞优选包括产生IgM的细胞或产生其他免疫球蛋白同种型如IgG、或IgA、或IgE、优选IgG的细胞。根据本发明的B细胞特别适于在生产产生抗体的细胞系中使用。优选在体外培养根据本发明的高亲和力的B细胞，且优选收集抗体用于进一步使用。还提供了从根据本发明的B细胞或B细胞群或单克隆细胞系获得的抗体。通过根据本发明的方法产生的高亲和力的抗体或其功能部分可用于多种应用，例如治疗、预防和诊断应用，以及研究目的和体外实验。例如进行筛选检测，其中根据本发明的抗体或功能部分与样品孵育以确定是否存在目标抗原。
由根据本发明的方法生成的B细胞特别适于产生抗目标抗原的高亲和力的抗体。但是在一个优选实施方式中，从所述细胞中分离编码Ig重链和/或轻链的基因且在第二细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的细胞)中表达该基因。所述第二细胞(本文还称为生产细胞)优选适合于商业抗体生产。所述生产细胞的增殖产生能够产生抗体的生产细胞。优选地，所述生产细胞适于生产在人类中使用的化合物。因此，所述生产细胞系优选没有诸如致病微生物的病原体。
通过下面非限制性的实施例进一步解释本发明。
附图说明
图1：(A)在多克隆B细胞群内将标记出的HA H3蛋白结合至H3特异性细胞的BCR。通过单细胞分选克隆具有高亲和力的与H3蛋白结合的B细胞。在培养2～3星期之后，筛选培养物上清液中的H3特异性抗体。(B)以选择H3特异性克隆所进行的筛选实施例。(左图)通过ELISA进行的筛选。将重组的H3蛋白覆盖在平板上，然后用培养物上清液孵育。使用抗-人-IgG-HRP检测抗体结合。(右图)在表达HA的细胞表面上的筛选。H3N2侵染的细胞用B细胞培养物上清液孵育。使用PE标记的山羊抗-人F(ab’)2检测抗体结合。
图2：(左)与23 BCL6-和Bcl-xL-转导的单克隆细胞系相比，在CD19+CD38+CD20+IgD-扁桃体的GC B细胞和CD19+IgG+CD27+外周血记忆B细胞中AICDA的mRNA水平。(右)在H3特异性克隆中高或低的结合亚克隆的选择。通过细胞分选和进一步扩张选择方框中的群。
图3：A)在细胞选择之后13天使用FACS分析标记出的HA H3与所选择的细胞的结合，以分析克隆细胞中较高或较低的H3BCR结合。进行亚克隆之后，增强或减弱的H3结合得以保持并且是稳定的。B)对不同的选择的亚群的BCR进行FACS染色(FACS staining)。H3结合至所选择的群的增强或减弱的水平与在这些群的细胞表面上的BCR表达相关联。浅灰色线：选择的高H3结合的B细胞；填充的曲线：没有选择的B细胞(亲代细胞(parental cell))；深灰色线：选择的低H3结合的B细胞。
图4：不同(亚)群的培养物上清液的H3 ELISA。与来自非分选的亲代细胞系(parental line)的IgG相比，来自选择的与H3-APC蛋白结合较高的细胞的分泌的IgG在H3ELISA中显示出增强的结合。顶线：选择的高H3结合的B细胞；中间线：没有选择的B细胞(亲代细胞)；底线：选择的低H3结合的B细胞。
图5：在H3特异性克隆(AT10_004)内高或低亲和力的亚克隆的选择。使用Alexa-647标记的HA H3抗原与IgG-PE抗体一起对细胞进行染色。通过细胞分选选择被圈住的群并进行进一步扩张。
图6：在第三选择周期之后的两个星期，对选择的细胞及亲代AT10_004进行标记HAH3的结合以及BCR染色(用于重链，IgG-PE，或用于轻链，κ-PE)以用于较高或较低的H3BCR结合的FACS分析。
图7：在具有增强或减弱的亲和力的所选亚群中所发现的氨基酸变化的概观。将AT10_004序列中与增强的H3抗原结合相关的突变并入AT10_004序列，且产生在293T细胞中重组的这些抗体，纯化这些抗体用于进一步的分析(AT10_004突变体B和AT10_004突变体C)。
图8：AT10_004抗体与HA H3结合的SPR分析。抗体AT10_004、AT10_004突变体A、AT10_004突变体B和AT10_004突变体C的关联曲线。
图9：在FACS检测中，AT10_004抗体的变异体与H3N2侵染的细胞结合的平均荧光强度(MFI)。不同浓度的重组AT10_004、AT10_004突变体B、AT10_004突变体C和利妥昔单抗(Rituximab)(阴性对照)与H3N2侵染的细胞孵育。使用PE标记的山羊抗-人F(ab’)2检测抗体结合。曲线图是得到的PE信号的MFI的平均值和SEM。
具体实施方式
实施例
实施例1
抗流感血凝素(HA)H3特异性单克隆人抗体的生成。
使用Kwakkenbos等人(Generation of stable monoclonal antibody-producingB cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming.NatureMedicine(2010)vol.16(1)pp.123-8和专利申请MEANS AND METHODS FOR INFLUENCINGTHE STABILITY OF ANTIBODY PRODUCING CELLS[WO 2007/067046])描述的BCL6/Bcl-xL技术使人记忆B细胞永生化。简单地说，在使用荧光激活细胞分选(FACS)分选HA H3结合的细胞之前，BCL6和Bcl-xL转导的细胞(GFP阳性)用表达CD40配体的L-细胞和白介素(IL)-21培养。流感HA蛋白(蛋白科学(Protein Sciences))使用Alexa Fluor 647(分子探针(Molecular Probes))标记，且用多克隆培养的B细胞孵育。将HA阳性细胞分选为每孔一个细胞且在培养基中保持二至三个星期，然后通过1)ELISA或2)与H3侵染的细胞结合来筛选HA结合的克隆(图1B)。
实施例2
较高亲和力和较低亲和力的B细胞克隆的选择。
由于如Kwakkenbos等人描述的BCL6Bcl-XL转导的B细胞表达酶活化诱导脱氨酶(AID，基因名称为AICDA)(图2左图，及“Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by geneticprogramming”Nature Medicine(2010)vol.16(1)pp.123-8)，个体B细胞可以使得免疫球蛋白重链和轻链中的核苷酸发生变化。这些变化可能进一步影响克隆与它的抗原的结合亲和力。为了确定HA H3结合的克隆的亚克隆确实可以具有不同的结合属性，再次用标记出的HAH3抗原孵育H3特异性克隆。在收集B细胞上清液且进行测试之前，使用FACS分选HA H3结合高的细胞群和HA H3结合低的细胞群(图2，右图)且在培养基中保持至少13天。
实施例3
HAH3高亲和力和低亲和力的分选的B细胞表达稳定但水平可变的表面免疫球蛋白。
首先，我们通过FACS分析B细胞受体(BCR)与标记出的HA H3的结合能力来表征分选的细胞的稳定性(图3A)。由于HA H3高分选的细胞仍然显示出较高的结合能力，因此接下来我们通过FACS确定表面免疫球蛋白的表达水平(图3B)。我们观察到：与分选的较高HA结合的细胞相比，分选的与HA H3具有相对低结合能力的细胞确实在表面上表达了较少的免疫球蛋白。该较高或较低的BCR表达及BCR与HAH3蛋白的结合保持一段时间，且甚至在第二轮分选之后变得更加明显(数据未示出)。
实施例4
对源自初始及高亲和力和低亲和力的HA H3结合细胞的抗体的HA H3的亲和力。
为了确定不同HA H3识别的B细胞产生的抗体的结合亲和力，我们通过ELISA分析初始HA H3结合的细胞及高亲和力和低亲和力的HA H3结合的细胞的第13天培养物的培养物上清液。在各个孔用不同的B细胞悬浮液孵育之前，将HA H3(1ug/ml，Protein Sciences)直接覆盖在平板上。使用HRP标记的抗-人多克隆山羊抗体检测人IgG与HA H3蛋白的结合。与来自非分选的亲代细胞系的IgG相比，来自因与H3-APC蛋白具有较高结合而选择的细胞的分泌的IgG在H3ELISA中显示出增强的结合(图4)。
实施例5
用于选择高亲和力和低亲和力克隆的组合的BCR-抗原染色。
在实施例2和实施例3中，显示出在单克隆B细胞克隆的异质亚群内具有最高水平的H3结合的B细胞的选择可选择为具有升高水平的BCR表达的细胞。因此，当选择仅基于H3结合水平进行时，可能排除了具有增强的抗原亲和力但具有低水平BCR表达的细胞。为了排除免疫球蛋白表达水平对高亲和力克隆选择的影响，使用抗原染色(H3-Alexa-647)和BCR染色的组合进行新一组的选择循环(图5)。使用结合至BCR的重链或轻链的抗体进行BCR染色。高H3染色和低BCR染色表明高抗原亲和力，而低H3染色和高BCR染色表明低抗原亲和力。
在进行抗原-BCR染色之前，将HA H3特异的B细胞克隆(AT10_004)培养2～3星期以产生数百万的细胞。选择显示出偏离的抗原亲和力的细胞(阳性和阴性)，且在细胞分选仪上进行分选。在三轮分选和生长之后，对这些细胞进行FACS分析以确定抗原结合的差异。与未选择的细胞相比，对增强或减弱的抗原结合进行三次分选之后的细胞显示出抗原结合的明显变化(图6)。图6证实在选择之后增强或减弱的H3结合得到保持并且是稳定的。
实施例6
对来自所选细胞的BCR的测序。
我们使用RNeasy小试剂盒(Qiagen)从AT10_004和选择的具有高亲和力或低亲和力的AT10_004突变体B细胞培养物中分离总RNA，从该RNA生成cDNA，进行PCR且分析BCR重链和轻链的序列。在分选的具有减弱亲和力的细胞中发现导致第38位氨基酸(CDR1)发生变化从而使重链中的甘氨酸变换为丙氨酸的突变(后面命名为突变体A)。在具有增强亲和力的分选的细胞中发现导致轻链中的氨基酸变化的突变(与亲代AT10_004序列相比)。序列分析显示出κ轻链中的第108位氨基酸(CDR3)从丝氨酸变为酪氨酸(后面命名为突变体B)。在一些序列中发现导致酪氨酸替换为苯丙氨酸的第38位的额外突变(后面命名为突变体C)(图7和表1)。为了产生重组的AT10_004和增强亲和力的突变体B和C的mAb，我们将人IgG1和κ恒定区域中的重链和轻链的可变区域克隆至基于pcDNA3.1(Invitrogen)的载体中且瞬时转染的293T细胞。我们使用(GE医疗)从培养物上清液中纯化重组的mAb。
实施例7
如所描述的(Lokate等，2007，J.Am.Chem.Soc.129：14013-140318)在IBISMX96SPR成像***上(IBIS Technologies BV.，恩斯赫德，荷兰)进行表面等离子体共振(SPR)分析。简单地说，一个SPR分析循环由一个或更多个孵育步骤组成，其中在包覆的传感器上冲洗分析物，然后进行再生步骤，其中从传感器上移除所结合的分析物。一次实验中可以进行多个循环。使用持续流微点样装置(continuous flow microspotter device)(WasatchMicrofluidics，盐湖城，犹他州，美国)，在99分钟内将在偶联缓冲液(PBS+0.03％吐温20+0.01mg/ml BSA)中的AT10_004和AT10_004突变抗体的稀释系列(浓度范围从0.30μg/ml至10μg/ml)固定至人-IgG-特异性金膜凝胶类型的SPR-芯片(Ssens，恩斯赫德，荷兰)上。点样之后，使用PBS+0.03％吐温20(PBST)将传感器冲洗三次。
为了封闭抗IgG包覆的SPR芯片中所有未被占据的位点，首先向芯片注入非特异性的人IgG(rituximab，在PBST中10μg/ml)且孵育45分钟，然后用PBST孵育100分钟。在该封闭步骤之后，进行两个空白的注入循环，每个循环由空检测缓冲液(1x PBST+0.01％BSA)注入45分钟、然后用PBST孵育100分钟组成。接着向传感器注入在检测缓冲液中的1μg/ml的重组流感HA3-蛋白(来自H3N2，怀俄明州，03/2003，Sino Biological inc.，北京，中国)，且孵育45分钟。随后，用PBST冲洗传感器且孵育100分钟(用于测量复杂的分离)。使用Sprint软件(版本1.6.8.0，IBIS Technologies BV.，恩斯赫德，荷兰)分析获得的数据。使用Scrubber2软件(生物软件，坎贝尔，澳大利亚)适配(fit)结合常数。图8显示出重组的HA3与AT10_004突变体A不相关联。与未突变的AT10_004相比，看到HA3与AT10_004突变体B和C增强的关联率。表2中示出了对AT10_004和每一种突变体获得的结合常数。
实施例8
结合至病毒侵染的细胞的抗体
为了测试AT10_004和AT10_004突变体与病毒侵染的细胞的结合能力，我们在流感H3N2(A/荷兰/177/2008)侵染的细胞上进行了FACS分析。MDCK-SIAT细胞在T175培养瓶中生长至DMEM/FCS/PS/G418中的80～100％融合。使用10ml PBS冲洗2x细胞层，然后加入15mlOptimem/PS/G418/胰蛋白酶。随后将0.5ml的100.000 TCID50流感病毒加入培养瓶中，且在37℃培养细胞。在24～48小时后，使用10ml PBS冲洗2x细胞，且使用胰蛋白酶-EDTA从塑料上分离细胞。对细胞进行计数，且将在-150℃下冷冻细胞直至使用。解冻侵染的细胞，且用多个浓度的AT10_004(突变体)抗体或Rituximab(作为阴性对照)在4℃孵育上述细胞30分钟，然后使用150μl PBS/2％FCS冲洗2x。使用抗-人的IgG-PE(Southern Biotech)检测抗体结合，且在Guava easyCyte(8HT，密理博(Millipore))上分析该抗体结合。与亲代AT10_004抗体相比，AT10_004突变体B和C均在H3N2侵染的细胞上显示出增强的染色强度(图9)。
Claims (14)
1.一种用于产生对目标抗原特异性的高亲和力抗体的方法，所述方法包括：
a)选择能够产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞，或者
选择B细胞，该B细胞能够分化成能产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞；
b)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的BCL6的表达；
c)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的抗凋亡核酸的表达；
d)允许所述B细胞扩张成第一单克隆B细胞群；
e)对来自所述第一单克隆B细胞群的B细胞进行抗原染色和BCR染色，并且选择B细胞，该B细胞具有指示高抗原亲和力的抗原染色和BCR染色的组合；
f)允许所选择的B细胞扩张成为第二B细胞群；
g)测量由所述第二B细胞群的至少一个B细胞所产生的抗体的抗原关联率和分离率；以及
h)选择对所述目标抗原的亲和力比所述第一单克隆B细胞群所产生的抗体对所述目标抗原的平均亲和力高的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，在步骤f)之后进一步包括：重复至少一次步骤e)和步骤f)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤g)中的所述抗原关联率和分离率使用表面等离子体共振来测量。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将所述至少一个B细胞培养达至少四个星期。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)中所选择的B细胞是记忆B细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤a)中所选择的B细胞是人记忆B细胞。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述抗凋亡核酸包括编码BCL2家族的抗凋亡分子，或所述抗凋亡分子的功能部分的基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述抗凋亡分子为Bcl-xL或Mcl-1。
9.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：向所述B细胞提供生长因子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述生长因子为IL21和CD40L。
11.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：直接或间接控制在步骤a)中所选择的B细胞中的Blimp-1表达产物的量。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)中所选择的B细胞源自预先已经暴露于所述目标抗原的个体。
13.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：在第二细胞中表达来自所述至少一个B细胞的编码Ig重链和/或Ig轻链的基因。
14.一种用于产生对目标抗原特异性的低亲和力抗体的方法，所述方法包括：
a)选择能够产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞，或者
选择B细胞，该B细胞能够分化成能产生对所述目标抗原特异性的抗体的B细胞；
b)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的BCL6的表达；
c)诱导、增强和/或保持所述B细胞中的抗凋亡核酸的表达；
d)允许所述B细胞扩张成第一单克隆B细胞群；
e)对来自所述第一单克隆B细胞群的B细胞进行抗原染色和BCR染色，并且选择B细胞，该B细胞具有指示低抗原亲和力的抗原染色和BCR染色组合的B细胞；
f)允许所选择的B细胞扩张成为第二B细胞群；
g)测量由所述第二B细胞群的至少一个B细胞所产生的抗体的抗原关联率和分离率；以及
h)选择对所述目标抗原的亲和力比所述第一单克隆B细胞群所产生的抗体对所述目标抗原的平均亲和力低的抗体。
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