CN106198973A - 一种简便快速检测布氏杆菌抗体的直接阻断elisa方法 - Google Patents

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Abstract

一种简便快速检测布氏杆菌抗体的直接阻断ELISA方法，属于生物技术检测领域，是用布氏杆菌血清直接阻断酶标记的特异单克隆抗体的一种ELISA方法。该方法简便快速，比常规间接竞争ELISA方法减少了一个步骤，降低了非特异性，提高了敏感性，且时间上缩短了1个小时。具有操作简单，简便快捷的特点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明制备的ELISA检测试剂盒检测布氏杆菌抗体，成本低，有利于推广使用。

Description

一种简便快速检测布氏杆菌抗体的直接阻断ELISA方法
技术领域
本发明属于生物技术检测技术领域。
技术背景
布氏杆菌病(Brucellaellosis) 又称布鲁菌病，也称地中海弛张热、马尔他热、波浪热，简称布病，是由布氏杆菌(Brucella)侵入机体引起的急性或慢性***共患传染病。根据抗原性的差异和宿主性的差异，目前已经确认布氏杆菌有9个种，其中对陆生动物具有致病性的有7个种，即B.abortus、B.melitensis、B.suis、B.ovis、B.canis、B.neotomae、B.microti。对海洋动物具有致病性的有2个布氏杆菌种，即B.ceti和B.pinnipedialis。除了少数根除布病的国家，该病广泛地分布于世界各地，特别是该病在地中海盆地、中东、亚洲、非洲和拉丁美洲等地仍然流行，目前布病在世界范围内呈反弹趋势，每年新增病例约50余万人，我国也是该病严重流行的国家之一。目前应对布病的感染对策还是本着以“预防为主”的原则，在实验室检测的情况下配合隔离治疗或直接淘汰等辅助的措施。因此检测手段的准确性和可靠性在一定程度上决定了经济损失的多少。无论是利用抗LPS 的O链上的A、M抗原或者外膜蛋白的单克隆抗体建立的ELISA检测方法，因其存在各自的优缺点，对于布氏杆菌病的准确检测都需要更全面深入的研究。
布氏杆菌病的诊断一直是对该病研究的重点和难点，对布氏杆菌的分离是确诊该病的金标准，但鉴于病原的分离率较低并且需要确诊的时间较长，加之对实验室的条件要求较高，因此该检测方法没有得到普遍应用。相比较而言，血清学检测方法有着快速、敏感、特异性强、操作简便、适用于大批量检测等特点，因而血清学检测方法对布氏杆菌感染的筛查和确诊有着不可替代的优势，也是相关实验室在检测技术方面的研究重点。
目前血清学检查是实验室检测布氏杆菌抗体的常用方法，传统的血清学检测方法包括凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析检测技术、荧光偏振试验等。
凝集试验是检测布氏杆菌感染的一种常用方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验。其中经典的凝集试验包括试管凝集试验( SAT)、平板凝集试验( PAT)，可用于患病动物的早期检测，同时可用于人畜接种布氏杆菌疫苗后血清抗体的检测，但不适用于绵羊种布氏杆菌病的检测。虽然其结果判断容易，但由于耗时较长，特异性较差等原因在发达国家已经基本停止使用。
缓冲布氏杆菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验（RBPT）是国际贸易中对牛、羊、猪种布氏杆菌病的指定检测方法。该方法灵敏度高，操作方便，成本低廉，适于动物群体布氏杆菌病的普查。对RBPT阳性样品的确诊往往还需要借助特异性更强的补体结合试验（CFT）。
补体结合试验是目前认为最有效的血清学检测布氏杆菌病方法。其基本原理是当抗原与相应的抗体结合形成抗原抗体复合物时，抗体的分子发生构象变化，导致Fc片段上的补体结合位点暴露，补体与之结合，加入溶血素和红细胞后，补体不能与溶血素和红细胞形成的复合物相结合，因此就不会导致溶血现象。反之，如果待检血清中没有抗布氏杆菌的抗体存在，则补体就以游离的形式存在，当加入红细胞和溶血素后，补体与之结合便会导致溶血现象。
目前，通常认为补体结合试验在特异性上优于其他血清学检测方法，因此常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的样品进行定性检测。
酶联免疫吸附试验是利用抗原与抗体的特异性结合配合酶催化底物显示不同可见的颜色变化的试验。该方法操作方便，灵敏度和特异性均较好，可完成批量检测，既可作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为对疑似样品的确诊试验。目前用于布氏杆菌感染检测的主要有间接ELISA和阻断ELISA，两者都检测待检血清中的抗体，再通过比较阈值判定样品的阴阳性。目前市面上已有几种商品化的试剂盒，其中间接ELISA试剂盒的生产厂商包括IDEXX公司、平河公司及武汉华美生物工程有限公司等；阻断ELISA试剂盒的生产厂商包括Svanova公司、平河公司、北京天之泰生物科技有限公司等，其中应用最为广泛的试剂盒来自Svanova公司。
布氏杆菌病作为近几年反弹最严重的人畜共患病之一，对畜牧业造成十分严重的经济损失，同时对从事畜牧业的人员具有极高健康威胁。由于布氏杆菌属于胞内寄生菌且可以通过多种途径感染易感动物，一旦侵入机体并在体内存活则有可能转为慢性感染，目前没有比较理想的药物治疗方法，患病动物一般采取淘汰处理。虽然布氏杆菌病可以通过已存在的多种传统或新型疫苗进行保护，但实际的保护效果和安全性并没有那么理想，尤其对人布氏杆菌病的预防。因此，对布氏杆菌病的预防成为相关研究的重点，准确检测后进行隔离或淘汰处理是避免更大经济损失的有效方式。其中，血清学的检测方法以方便快捷、操作简单的特点广泛应用于临床布氏杆菌感染检测，而阻断ELISA相比较其他血清学方法拥有较高的特异性和敏感度，另外由于酶联免疫球蛋白无种属差异性，因此适用于检测不同动物的布氏杆菌感染，但另外一些革兰氏阴性菌的交叉反应会对检测结果造成假阳性干扰。国外对阻断ELISA检测方法研究较早，已经成功研制出检测布氏杆菌病商品化竞争ELISA试剂盒，而国内在该方面的相关研究起步相对较晚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更加敏感和简便的快速检测布氏杆菌抗体的直接阻断ELISA方法。
本发明具体包括以下步骤：
1）对单克隆抗体Bru-5C10进行HRP标记；
2）将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；
将包被抗原用pH=9.6的碳酸盐包被缓冲液充分溶解，0.3μg/孔包被于酶标板，37℃恒温孵育2h；
用洗涤缓冲液PBST (含0.05%Tween-20的PBS，pH7.2)洗涤酶标板2次，每次约1min，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，每孔加入封闭液，37℃恒温封闭2h；
用洗涤缓冲液PBST 洗涤酶标板3次，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，取得包被布鲁氏菌抗原的ELISA酶标板；
3）按50μL/孔加入20倍稀释好的待检血清，对照血清按同比例稀释，孵育30min，再加入工作浓度的Bru-5C10酶标单克隆抗体溶液50μL，混匀，室温孵育30min；
4）孵育完成后用洗涤缓冲液PBST 洗涤酶标板6次，甩去洗涤液，用吸水纸拍干；100μL/孔加入TMB底物显色液，37℃避光显色15min；
5）最后加入100μL /孔终止液，用酶标仪测定波长OD650nm读取值；
6）由公式100×（1-OD阴性对照/OD待检样品）%分别计算各板孔的抑制率；
7）判定待检血清样品：抑制率≥34%，则判定待检血清样品为阳性。
本发明采用酶标记的单克隆抗体Bru-5C10建立的直接阻断ELISA通过检测已知50份阴性样本，计算出阴性样本判定标准。
本发明的单克隆抗体bru-5C10为杂交瘤细胞株 bru-5C10分泌获得。
本发明以待检测样本中的抗体与包被板孔中的抗原表位首先结合，这样结合了的抗体可以阻止酶标记的抗布氏杆菌单克隆抗体的再结合，酶标抗体的结合率与样本中抗体的多少成反比。
本发明建立的检测牛布氏杆菌病的直接阻断ELISA方法，通过对50份临床牛血清样品的检测并与商品化布病竞争ELISA试剂盒（Svanova公司）比较，结果显示两者的符合率为96%，比商品化试剂盒多检测出2份。其意义在于本方法对布氏杆菌病的血清学检测特异性更强，敏感性更高。该方法简便快速，比常规间接竞争ELISA方法减少了一个步骤，降低了非特异性，提高了敏感性，且时间上缩短了1个小时。具有操作简单，简便快捷的特点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明制备的ELISA检测试剂盒检测布氏杆菌抗体，成本低，有利于推广使用。
本发明阻断ELISA的临床应用：用该试剂盒与进口ELISA试剂盒对已知背景的85份阴性血清和15份阳性牛、羊血清样品进行检测比较，结果显示，本研究建立的检测布氏杆菌病血清抗体直接阻断ELISA方法的特异性和敏感性好，且结果稳定。
所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是：用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称：TSA，由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/ml；然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3～4次，15min/次。
附图说明
图1为采用本发明直接阻断ELISA检测50份阴性临床血清样品的结果。
图2图2直接阻断ELISA检测15份阳性血清样品结果。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、通过细胞融合技术获得对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体Bru-5C10：取经过常规免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照标准程序进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用间接酶联免疫吸附实验法(iELISA)筛选与牛种布鲁氏菌A99粗提的LPS具有强反应，而与小肠结肠炎耶尔森菌O9粗提的LPS无反应的阳性杂交瘤细胞株。按照有限稀释法进行2次亚克隆获得单克隆抗体Bru-5C10。
单克隆抗体Bru-5C10的保藏证明信息：
分类命名：杂交瘤细胞株，保存号为：CGMCC No.9219，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为：2014年5月7日。
二、抗布氏杆菌单克隆抗体Bru-5C10的HRP标记：
使用Thermo公司的EZ-LinkTM Plμs Activated Peroxidase 试剂盒对单克隆抗体Bru-5C10进行HRP标记；或用化学方法进行标记均可。
三、制作布鲁氏菌包被ELISA酶标板：
超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是：用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基（简称：TSA，由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成）上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/ml；然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3～4次，15min/次。
1、 将包被抗原用pH=9.6的碳酸盐包被缓冲液充分溶解，0.3μg/孔包被于酶标板，37℃恒温孵育2h。
2、用洗涤缓冲液PBST (含0.05%Tween-20的PBS，pH7.2)洗涤酶标板2次，每次约1min，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，每孔加入封闭液（3%BSA），37℃恒温封闭2h。
3、用洗涤缓冲液PBST 洗涤酶标板3次，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，取得包被布鲁氏菌抗原的ELISA酶标板。
四、检测试验：
以PBST为缓冲液，将待检样本稀释20倍，待用。
以PBST为缓冲液，分别将牛的阴性血清和阳性血清稀释20倍，待用。
取阴性血清和阳性血清作为阴阳对照组，向包被布鲁氏菌抗原的ELISA酶标板的A1-A2孔中分别加入50µL稀释后的阴性血清，向包被布鲁氏菌抗原的ELISA酶标板的A3-A4孔中分别加入50µL稀释后的阳性血清。
向包被布鲁氏菌抗原的ELISA酶标板的各孔分别加入50µL稀释后的待检样品。
分别经过室温作用30分钟。
向各孔加入50µL工作浓度的酶标记单克隆抗体Bru-5C10。
PBST洗涤5次。然后加入底物显色液室温作用15min，以0.1%SDS终止反应。
分别读取各孔的OD650值。
并根据公式100×（1-OD阴性对照/OD待检样品）%分别计算抑制率(PI)。
计算结果：已知的阳性血清相应的抑制率(PI)≥34%，已知的阴性血清相应的抑制率(PI)＜34%。
以此为标准，将待检样本各孔的抑制率(PI)进行加合后求平均值，如抑制率(PI)平均值为≥34%，则待检样本为阳性；如抑制率(PI)平均值为＜34%，则待检样本为阴性。
五、试剂盒中的单克隆抗体与小肠结肠炎耶尔森菌O9、大肠杆菌O157没有交叉反应。
六、利用上述构建阻断ELISA检测50份阴性临床样品的结果见图1，利用上述构建阻断ELISA检测15份阳性临床样品的结果见图2。
可以看出，阳性样本的抑制率均大于34%，而阴性样品的抑制率均低于34%。表明，检测结果正确。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种简便快速检测布氏杆菌抗体的直接阻断ELISA方法，其特征在于先用酶标记抗布氏杆菌特异性单克隆抗体，用布氏杆菌血清抗体直接阻断进行ELISA检测。
2.根据权利要求1所述的直接阻断ELISA方法，其特征在于包括以下步骤：
1）对单克隆抗体Bru-5C10进行HRP标记；
2）将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；
将包被抗原用pH=9.6的碳酸盐包被缓冲液充分溶解，0.3μg/孔包被于酶标板，37℃恒温孵育2h；
用洗涤缓冲液PBST洗涤酶标板2次，每次约1min，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，每孔加入封闭液，37℃恒温封闭2h；
用洗涤缓冲液PBST 洗涤酶标板3次，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，取得包被布鲁氏菌抗原的ELISA酶标板；
3）按50μL/孔加入20倍稀释好的待检血清，对照血清按同比例稀释，室温孵育30min，再加入工作浓度的Bru-5C10酶标单克隆抗体溶液50μL，混匀，室温孵育30min；
4）孵育完成后用洗涤缓冲液PBST 洗涤酶标板6次，甩去洗涤液，用吸水纸拍干；100μL/孔加入TMB底物显色液，37℃避光显色15min；
5）最后加入100μL /孔终止液，用酶标仪测定波长OD650nm读取值；
6）分别计算各板孔的抑制率；
7）判定待检血清样品：抑制率≥34%，则判定待检血清样品为阳性。
3.根据权利要求2所述的直接阻断ELISA方法，其特征在于所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是：用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80℃水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为1×1010CFU/ml；然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3～4次，15min/次。
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