CN106501512A - 一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种***抗体检测试剂盒,其能解决现有检测试剂盒灵敏度较低、特异性较差的技术问题。其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、***兔抗工作液、羊抗兔IgG‑HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物,其特征在于:所述包被板为链霉亲和素包被板,所述抗原为生物素化的***病毒抗原。本发明还提供了该检测试剂盒的检测方法及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
***(FMD)是猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病,易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和***皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快,曾多次在世界范围内暴发流行,造成巨大政治、经济损失。鉴于此,世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前,有三分之二的OIE成员国流行FMD,时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
***的防治一般通过注射疫苗来实现,但由于动物物种差异或个体差异,不同个体的免疫的效果不一致。为了检测免疫效果,需进行***抗体的检测。
现有的***抗体检测试剂盒检测灵敏度较低、特异性较差,无法满足高通量样本的检测需求。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种***抗体检测试剂盒,其能解决现有检测试剂盒灵敏度较低、特异性较差的技术问题。
其技术方案是这样的,其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、***兔抗工作液、羊抗兔IgG-HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物,其特征在于:所述包被板为链霉亲和素包被板,所述抗原为生物素化的***病毒抗原。
进一步的,所述链霉亲和素包被板由2~20μg/mL的链霉亲和素,100μl/孔,包被形成。
进一步的,所述***兔抗工作液为含有2~10μg/ml***兔多抗、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
进一步的,所述羊抗兔IgG-HRP工作液为含有0.5~2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
进一步的,所述阴性质控血清为未感染***病毒的偶蹄动物血清,抗体检测效价小于1:8;所述阳性质控血清为阴性质控血清添加20~50μg/mL的***多抗制得,抗体检测效价大于1:720。
进一步的,所述样本稀释液为含有1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
进一步的,所述洗液为20倍的浓缩洗液,所述20倍的浓缩洗液为含18wt%NaCl、1wt%Tween20和1wt%Proclin300的Tris-HCl缓冲液,pH为7.4~7.6。
进一步的,所述底物包括底物A和底物B;所述底物A为含有1.26wt%N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液,pH为8.8~9.0;所述底物B为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液,pH为4.8~5.0。
本发明还提供了上述***抗体检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
(1)在抗原抗体反应板中,使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释,50μl/孔,所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1:4~1:512)、(1:8~1:1024)、(1:2~1:4),抗原对照设置4孔,分别加入50μl样本稀释液;
(2)加入生物素化的***病毒抗原工作液(2μg/ml),50μl/孔,振荡,37℃温育60分钟;
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中,50μl/孔,37℃温育30分钟;
(4)洗板,甩干,向链霉亲和素包被板中加入***兔抗工作液,50μl/孔,37℃温育30分钟;
(5)洗板,甩干,向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液,50μl/孔,37℃温育30分钟;
(6)洗板,甩干,加入底物A和底物B,50μl/孔,测定相对光强度(RLU);
(7)判定待测血清的效价:抗原对照的4孔,弃去最高和最低RLU值,计算剩余2孔的平均RLU值,以55%~75%抗原对照平均值为临界值;待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔,小于等于临界值的孔为阳性孔;若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同,则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价;若临界值处于2个稀释孔RLU之间,抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
进一步的,检测认可标准为:病毒抗原对照RLU值应在8000000至15000000范围内,阳性质控血清抗体效价应大于1:720,阴性质控血清抗体效价应小于1:8。
本发明还提供了上述检测试剂盒在***抗体检测中的应用。
实验表明,本发明的上述检测试剂盒相较于现有的***抗体检测试剂盒、灵敏度较高、特异性较好,能够满足高通量样本的检测需求。
具体实施方式
主要试剂说明:
***病毒抗原,为O型,购自杭州启泰生物技术有限公司,编号为KT01。
羊抗兔IgG-HRP,购自杭州启泰生物技术有限公司,编号为HRP-GRI06。
阴性质控血清,来源于家猪养殖厂,为未感染***病毒的猪血清样本。
市售ELISA试剂盒,为瑞士Pronics公司的O型***抗体检测试剂盒。
干扰样本S1~S3,来源于家猪养殖厂,为注射加强双价***疫苗(包含O型***疫苗及亚洲I型***疫苗)的猪血清样本。
待测样本1~10,来源于家猪养殖场,为注射O型***疫苗的猪血清样本。
生物素化的***病毒抗原,制备过程如下:
1.样品准备
1.1Buffer配制
缓冲液A:PB缓冲液,pH 7.4;
缓冲液B:PBS缓冲液,pH 6.0。
1.2抗原配制
取1ml***病毒抗原(200μg/mL),用缓冲液A进行脱盐换液。
1.3NHS-LC-LC-Biotin溶液配制
称取1mg NHS-LC-LC-Biotin,加入200μl缓冲液A溶解,使质量浓度为5mg/ml。
2.标记纯化
2.1标记
取40μl的NHS-LC-LC-Biotin溶液加入到抗原溶液中,混匀,在20℃下反应1h,投料比(质量比)为1:1。
2.2纯化
待反应结束后,将反应溶液进行透析,透析缓冲液为缓冲液B,透析3次,每次3h,每次1000ml;透析环境为4℃,使用磁力搅拌器保证透析速率。
3.检测
利用考马斯亮蓝法测定抗原浓度。
3.1蛋白标准品的准备
取蛋白标准品(BSA)完全溶解于缓冲液B中,使终浓度为0.5mg/ml。
3.2蛋白浓度测定
a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液补足到20μl,相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中;
c.各孔加入200μl G250染色液,室温放置3~5min;
d.用酶标仪测定A595nm的吸光度;
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
实验布置如表1所示。
表1:
原始数据如表2所示。
表2:
扣除空白值后的数据如表3所示。
表3:
根据表3数据,测得蛋白定量标准曲线为y=0.0013x+0.0962,R2=0.970,计算所得生物素化的***病毒抗原浓度为117.5μg/ml。
***兔多抗,
1.其制备过程下:
免疫原,取灭活的O型***病毒与等量的佐剂混合成稳定乳状液,配制时,灭活的O型***病毒通过无菌生理盐水稀释;免疫动物,健康雄性新西兰大白兔2只;初免使用弗氏完全佐剂,二免及以后使用弗氏不完全佐剂,免疫剂量为300μg/只,皮下注射,初免2周后进行二免,二免及以后间隔均为2周。
2.兔子免疫效果监测:
参数:***抗原100ng/孔包被,兔多抗血清1:100稀释,HRP-GRI06 1:5000稀释。
监测数据如表4所示。
表4:
表4显示,1号兔子在第5周达到平台期,2号兔子在第6周也达到平台期,均可进行血清采集。
3.最终采集血清的滴度检测(4免后采集血清,第7周):
参数:***抗原100ng/孔包被,兔多抗血清梯度稀释,HRP-GRI06 1:5000稀释使用。
检测结果如表5所示。
表5:
表5显示:两只兔子血清滴度均达到1:100000,该多抗可用于后续试剂盒的研发。
实施例1:
一种***抗体检测试剂盒,其包括:
链霉亲和素包被板,由5μg/mL的链霉亲和素,100μl/孔,包被形成;
U型96孔抗原抗体反应板;
生物素化的***病毒抗原,工作浓度为2μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml,使用样品稀释液稀释得到);
***兔抗工作液,为含有4μg/ml***兔多抗、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2;
羊抗兔IgG-HRP工作液,为含有1.0μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.4;
阴性质控血清,抗体检测效价小于1:8;
阳性质控血清,为阴性质控血清添加30μg/mL的***兔多抗制得,抗体检测效价大于1:720;
样本稀释液,为含有1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.3;
20倍的浓缩洗液,为含18wt%NaCl、1wt%Tween20和1wt%Proclin300的Tris-HCl缓冲液,pH为7.6;
底物A,为含有1.26wt%N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液,pH为8.8;
底物B,为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液,pH为5.0。
实施例2:
一种***抗体检测试剂盒,其包括:
链霉亲和素包被板,由2μg/mL的链霉亲和素,100μl/孔,包被形成;
U型96孔抗原抗体反应板;
生物素化的***病毒抗原,工作浓度为0.5μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml,使用样品稀释液稀释得到);
***兔抗工作液,为含有2μg/ml***兔多抗、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.4;
羊抗兔IgG-HRP工作液,为含有0.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2;
阴性质控血清,抗体检测效价小于1:8;
阳性质控血清,为阴性质控血清添加20μg/mL的***兔多抗,抗体检测效价大于1:720;
样本稀释液,为含有1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.4;
20倍的浓缩洗液,为含18wt%NaCl、1wt%Tween20和1wt%Proclin300的Tris-HCl缓冲液,pH为7.5;
底物A,为含有1.26wt%N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液,pH为8.9;
底物B,为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液,pH为4.8。
实施例3:
一种***抗体检测试剂盒,其包括:
链霉亲和素包被板,由20μg/mL的链霉亲和素,100μl/孔,包被形成;
U型96孔抗原抗体反应板;
生物素化的***病毒抗原,工作浓度为5μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml,使用样品稀释液稀释得到);
***兔抗工作液,为含有10μg/ml***兔多抗、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.3;
羊抗兔IgG-HRP工作液,为含有2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.3;
阴性质控血清,抗体检测效价小于1:8;
阳性质控血清,为阴性质控血清添加50μg/mL的***兔多抗,抗体检测效价大于1:720;
样本稀释液,为含有1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2;
20倍的浓缩洗液,为含18wt%NaCl、1wt%Tween20和1wt%Proclin300的Tris-HCl缓冲液,pH为7.4;
底物A,为含有1.26wt%N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液,pH为9.0;
底物B,为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液,pH为4.9。
实施例4:
实施例1的试剂盒的使用方法:
(1)在抗原抗体反应板中,使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释,50μl/孔,所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1:4~1:512)、(1:8~1:1024)、(1:2~1:4),抗原对照设置4孔,分别加入50μl样本稀释液;
样品布局以及稀释倍数如表6所示。
表6:
S1~S10为待测血清样品,S2~S10的稀释倍数分布与S1相同。
(2)加入2μg/ml的生物素化的***病毒抗原,50μl/孔,封板,振荡,37℃温育60分钟。
添加***病毒抗原后的稀释倍数如表7所示。
表7:
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中,50μl/孔,封板,37℃温育30分钟;
(4)洗板5次,甩干,向链霉亲和素包被板中加入***兔抗工作液,50μl/孔,封板,37℃温育30分钟;
(5)洗板5次,甩干,向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液,50μl/孔,封板,37℃温育30分钟;
(6)洗板5次,甩干,加入底物A和底物B,50μl/孔,5分钟内使用化学发光免疫分析仪测定相对光强度(RLU);
(7)结果判定:
A、检测认可标准为:病毒抗原对照RLU值应在8000000至15000000范围内,阳性质控血清抗体效价应大于1:720,阴性质控血清抗体效价应小于1:8
B、血清抗体效价的判定:抗原对照的4孔,弃去最高和最低RLU值,计算剩余2孔的平均RLU值,以65%抗原对照平均值为临界值;待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔,小于等于临界值的孔为阳性孔;若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同,则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价;若临界值处于2个稀释孔RLU之间,抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
抗体效价计算对照如表8所示。
表8
此外,实施例2的试剂盒的使用方法采用75%抗原对照平均值为临界值;实施例3的试剂盒的使用方法采用55%抗原对照平均值为临界值。
实验例1:灵敏度实验。
按实施例4的方法,平行测定20孔阴性质控血清1:4稀释度时的相对发光强度RLU,计算RLU的标准差(SD)与RLU平均值(M),(M-2SD)对应的RLU对抗原对照平均RLU的抑制率作为衡量试剂盒灵敏度的指标。
灵敏度实验布局如表9所示。
表9:
灵敏度实验结果如表10所示。
表10:
表10显示,本试剂盒阴性质控血清1:4稀释度时的抑制率为7.49%,低于通用技术指标IC15(抑制率15%)的要求;而市售ELISA试剂盒的抑制率为25.37%,灵敏度较本试剂盒低。实验例2:特异性实验。
干扰样本说明:S1~S3为三份来自于不同猪个体的血清样本,抗体效价明显高于常规免疫猪血清效价,同时血清的基质效应及其他干扰因素也更显著。
按实施例2的方法,同时测定3份干扰样本的效价,观察不同稀释度与相对发光强度RLU的曲线变化趋势,以此判定试剂盒的特异性。
特异性试验布局如表11所示。
表11:
特异性实验结果如表12所示。
表12:
表12显示,随着干扰样本稀释度的升高,市售ELISA试剂盒检测的OD值有较明显的先下降后上升的趋势,而本发明试剂盒RLU值下降阶段不明显,抗干扰能力明显强于ELISA试剂盒,且检测血清效价较ELISA试剂盒高一个梯度等级,检测灵敏度高。
实验例3:稳定性实验。
市售ELISA试剂盒的有效期为6个月,取有效期满3个月内的市售ELISA试剂盒和本发明试剂盒,同时检测阴阳性质控血清,以此判定试剂盒的稳定性。
稳定性试验布局如表13所示。
表13:
稳定性实验结果如表14所示。
表14:
表14显示,随着试剂盒储藏时间的延长,市售ELISA试剂盒与本发明试剂盒在6个月的有效期内,检测阴阳性质控血清效价稳定,检测数据真实有效。
此外,经检测,实施例2、3相应试剂盒检测待测样本效价与实施例1相同,表明本申请的上述试剂盒及其检测方法具有较高的准确性和稳定性。
表15:
待测样本1~10为来自于不同猪个体的血清样本。
Claims (10)
1.一种***抗体检测试剂盒,其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、***兔抗工作液、羊抗兔IgG-HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物,其特征在于:所述包被板为链霉亲和素包被板,所述抗原为生物素化的***病毒抗原。
2.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:所述链霉亲和素包被板由2~20μg/mL的链霉亲和素,100μl/孔,包被形成。
3.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:所述***兔抗工作液为含有2~10μg/ml***兔多抗、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
4.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:所述羊抗兔IgG-HRP工作液为含有0.5~2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
5.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:所述阴性质控血清为未感染***病毒的偶蹄动物血清,抗体检测效价小于1:8;所述阳性质控血清为阴性质控血清添加***抗体制得,抗体检测效价大于1:720。
6.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:所述样本稀释液为含有1wt%酪蛋白的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
7.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:,所述洗液为20倍的浓缩洗液,所述20倍的浓缩洗液为含18wt%NaCl、1wt%Tween20和1wt%Proclin300的Tris-HCl缓冲液,pH为7.4~7.6。
8.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒,其特征在于:所述底物包括底物A和底物B;所述底物A为含有1.26wt%N,N-二甲基甲酰胺、5.85 mmol/L鲁米诺、9.86 mmol/L四苯硼钠和1.06 mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液,pH为8.8~9.0;所述底物B为含0.615 mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液,pH为4.8~5.0。
9.如权利要求1~8中任一所述的***抗体检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
(1)在抗原抗体反应板中,使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释,50μl/孔,所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1:4~1:512)、( 1:8~1:1024)、(1:2~1:4),抗原对照设置4孔,分别加入50μl样本稀释液;
(2)加入生物素化的***病毒抗原工作液,50μl/孔,振荡,37℃温育60分钟;
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中,50μl/孔,37℃温育30分钟;
(4)洗板,甩干,向链霉亲和素包被板中加入***兔抗工作液,50μl/孔,37℃温育30分钟;
(5)洗板,甩干,向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液,50μl/孔,37℃温育30分钟;
(6)洗板,甩干,加入底物A和底物B,50μl/孔,测定相对光强度(RLU);
(7)判定待测血清的效价:抗原对照的4孔,弃去最高和最低RLU值,计算剩余2孔的平均RLU值,以55%~75% 抗原对照平均值为临界值;待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔,小于等于临界值的孔为阳性孔;若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同,则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价;若临界值处于2个稀释孔RLU之间,抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
10.如权利要求1~9中任一所述的***抗体检测试剂盒在***抗体检测中的应用。
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