CN106501512A - 一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents
一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106501512A CN106501512A CN201611044732.6A CN201611044732A CN106501512A CN 106501512 A CN106501512 A CN 106501512A CN 201611044732 A CN201611044732 A CN 201611044732A CN 106501512 A CN106501512 A CN 106501512A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- foot
- mouth disease
- serum
- antigen
- holes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 76
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 57
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 74
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 21
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 16
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 claims description 13
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 5
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 claims description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 241001493546 Suina Species 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 3
- -1 Sodium tetraphenylborate Chemical compound 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 6
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- MOOAHMCRPCTRLV-UHFFFAOYSA-N boron sodium Chemical compound [B].[Na] MOOAHMCRPCTRLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种***抗体检测试剂盒，其能解决现有检测试剂盒灵敏度较低、特异性较差的技术问题。其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、***兔抗工作液、羊抗兔IgG‑HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物，其特征在于：所述包被板为链霉亲和素包被板，所述抗原为生物素化的***病毒抗原。本发明还提供了该检测试剂盒的检测方法及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
***(FMD)是猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和***皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
***的防治一般通过注射疫苗来实现，但由于动物物种差异或个体差异，不同个体的免疫的效果不一致。为了检测免疫效果，需进行***抗体的检测。
现有的***抗体检测试剂盒检测灵敏度较低、特异性较差，无法满足高通量样本的检测需求。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种***抗体检测试剂盒，其能解决现有检测试剂盒灵敏度较低、特异性较差的技术问题。
其技术方案是这样的，其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、***兔抗工作液、羊抗兔IgG-HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物，其特征在于：所述包被板为链霉亲和素包被板，所述抗原为生物素化的***病毒抗原。
进一步的，所述链霉亲和素包被板由2～20μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成。
进一步的，所述***兔抗工作液为含有2～10μg/ml***兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
进一步的，所述羊抗兔IgG-HRP工作液为含有0.5～2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
进一步的，所述阴性质控血清为未感染***病毒的偶蹄动物血清，抗体检测效价小于1：8；所述阳性质控血清为阴性质控血清添加20～50μg/mL的***多抗制得，抗体检测效价大于1:720。
进一步的，所述样本稀释液为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
进一步的，所述洗液为20倍的浓缩洗液，所述20倍的浓缩洗液为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4～7.6。
进一步的，所述底物包括底物A和底物B；所述底物A为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.8～9.0；所述底物B为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.8～5.0。
本发明还提供了上述***抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)在抗原抗体反应板中，使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释，50μl/孔，所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1：4～1：512)、(1：8～1：1024)、(1：2～1：4)，抗原对照设置4孔，分别加入50μl样本稀释液；
(2)加入生物素化的***病毒抗原工作液(2μg/ml)，50μl/孔，振荡，37℃温育60分钟；
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中，50μl/孔，37℃温育30分钟；
(4)洗板，甩干，向链霉亲和素包被板中加入***兔抗工作液，50μl/孔，37℃温育30分钟；
(5)洗板，甩干，向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液，50μl/孔，37℃温育30分钟；
(6)洗板，甩干，加入底物A和底物B，50μl/孔，测定相对光强度(RLU)；
(7)判定待测血清的效价：抗原对照的4孔，弃去最高和最低RLU值，计算剩余2孔的平均RLU值，以55％～75％抗原对照平均值为临界值；待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同，则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价；若临界值处于2个稀释孔RLU之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
进一步的，检测认可标准为：病毒抗原对照RLU值应在8000000至15000000范围内，阳性质控血清抗体效价应大于1:720，阴性质控血清抗体效价应小于1:8。
本发明还提供了上述检测试剂盒在***抗体检测中的应用。
实验表明，本发明的上述检测试剂盒相较于现有的***抗体检测试剂盒、灵敏度较高、特异性较好，能够满足高通量样本的检测需求。
具体实施方式
主要试剂说明：
***病毒抗原，为O型，购自杭州启泰生物技术有限公司，编号为KT01。
羊抗兔IgG-HRP，购自杭州启泰生物技术有限公司，编号为HRP-GRI06。
阴性质控血清，来源于家猪养殖厂，为未感染***病毒的猪血清样本。
市售ELISA试剂盒，为瑞士Pronics公司的O型***抗体检测试剂盒。
干扰样本S1～S3，来源于家猪养殖厂，为注射加强双价***疫苗(包含O型***疫苗及亚洲I型***疫苗)的猪血清样本。
待测样本1～10，来源于家猪养殖场，为注射O型***疫苗的猪血清样本。
生物素化的***病毒抗原，制备过程如下：
1.样品准备
1.1Buffer配制
缓冲液A：PB缓冲液，pH 7.4；
缓冲液B：PBS缓冲液，pH 6.0。
1.2抗原配制
取1ml***病毒抗原(200μg/mL)，用缓冲液A进行脱盐换液。
1.3NHS-LC-LC-Biotin溶液配制
称取1mg NHS-LC-LC-Biotin，加入200μl缓冲液A溶解，使质量浓度为5mg/ml。
2.标记纯化
2.1标记
取40μl的NHS-LC-LC-Biotin溶液加入到抗原溶液中，混匀，在20℃下反应1h，投料比(质量比)为1：1。
2.2纯化
待反应结束后，将反应溶液进行透析，透析缓冲液为缓冲液B，透析3次，每次3h，每次1000ml；透析环境为4℃，使用磁力搅拌器保证透析速率。
3.检测
利用考马斯亮蓝法测定抗原浓度。
3.1蛋白标准品的准备
取蛋白标准品(BSA)完全溶解于缓冲液B中，使终浓度为0.5mg/ml。
3.2蛋白浓度测定
a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中；
c.各孔加入200μl G250染色液，室温放置3～5min；
d.用酶标仪测定A595nm的吸光度；
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
实验布置如表1所示。
表1：
原始数据如表2所示。
表2：
扣除空白值后的数据如表3所示。
表3：
根据表3数据，测得蛋白定量标准曲线为y＝0.0013x+0.0962，R2＝0.970，计算所得生物素化的***病毒抗原浓度为117.5μg/ml。
***兔多抗，
1.其制备过程下：
免疫原，取灭活的O型***病毒与等量的佐剂混合成稳定乳状液，配制时，灭活的O型***病毒通过无菌生理盐水稀释；免疫动物，健康雄性新西兰大白兔2只；初免使用弗氏完全佐剂，二免及以后使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为300μg/只，皮下注射，初免2周后进行二免，二免及以后间隔均为2周。
2.兔子免疫效果监测：
参数：***抗原100ng/孔包被，兔多抗血清1：100稀释，HRP-GRI06 1:5000稀释。
监测数据如表4所示。
表4：
表4显示，1号兔子在第5周达到平台期，2号兔子在第6周也达到平台期，均可进行血清采集。
3.最终采集血清的滴度检测(4免后采集血清，第7周)：
参数：***抗原100ng/孔包被，兔多抗血清梯度稀释，HRP-GRI06 1:5000稀释使用。
检测结果如表5所示。
表5：
表5显示：两只兔子血清滴度均达到1：100000，该多抗可用于后续试剂盒的研发。
实施例1：
一种***抗体检测试剂盒，其包括：
链霉亲和素包被板，由5μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成；
U型96孔抗原抗体反应板；
生物素化的***病毒抗原，工作浓度为2μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml，使用样品稀释液稀释得到)；
***兔抗工作液，为含有4μg/ml***兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2；
羊抗兔IgG-HRP工作液，为含有1.0μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.4；
阴性质控血清，抗体检测效价小于1：8；
阳性质控血清，为阴性质控血清添加30μg/mL的***兔多抗制得，抗体检测效价大于1:720；
样本稀释液，为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.3；
20倍的浓缩洗液，为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.6；
底物A，为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.8；
底物B，为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为5.0。
实施例2：
一种***抗体检测试剂盒，其包括：
链霉亲和素包被板，由2μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成；
U型96孔抗原抗体反应板；
生物素化的***病毒抗原，工作浓度为0.5μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml，使用样品稀释液稀释得到)；
***兔抗工作液，为含有2μg/ml***兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.4；
羊抗兔IgG-HRP工作液，为含有0.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2；
阴性质控血清，抗体检测效价小于1：8；
阳性质控血清，为阴性质控血清添加20μg/mL的***兔多抗，抗体检测效价大于1:720；
样本稀释液，为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.4；
20倍的浓缩洗液，为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5；
底物A，为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.9；
底物B，为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.8。
实施例3：
一种***抗体检测试剂盒，其包括：
链霉亲和素包被板，由20μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成；
U型96孔抗原抗体反应板；
生物素化的***病毒抗原，工作浓度为5μg/ml(原始浓度为117.5μg/ml，使用样品稀释液稀释得到)；
***兔抗工作液，为含有10μg/ml***兔多抗、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.3；
羊抗兔IgG-HRP工作液，为含有2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.3；
阴性质控血清，抗体检测效价小于1：8；
阳性质控血清，为阴性质控血清添加50μg/mL的***兔多抗，抗体检测效价大于1:720；
样本稀释液，为含有1wt％酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2；
20倍的浓缩洗液，为含18wt％NaCl、1wt％Tween20和1wt％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4；
底物A，为含有1.26wt％N,N-二甲基甲酰胺、5.85mmol/L鲁米诺、9.86mmol/L四苯硼钠和1.06mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为9.0；
底物B，为含0.615mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.9。
实施例4：
实施例1的试剂盒的使用方法：
(1)在抗原抗体反应板中，使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释，50μl/孔，所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为(1：4～1：512)、(1：8～1：1024)、(1：2～1：4)，抗原对照设置4孔，分别加入50μl样本稀释液；
样品布局以及稀释倍数如表6所示。
表6：
S1～S10为待测血清样品，S2～S10的稀释倍数分布与S1相同。
(2)加入2μg/ml的生物素化的***病毒抗原，50μl/孔，封板，振荡，37℃温育60分钟。
添加***病毒抗原后的稀释倍数如表7所示。
表7：
(3)将反应液转移至链霉亲和素包被板中，50μl/孔，封板，37℃温育30分钟；
(4)洗板5次，甩干，向链霉亲和素包被板中加入***兔抗工作液，50μl/孔，封板，37℃温育30分钟；
(5)洗板5次，甩干，向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液，50μl/孔，封板，37℃温育30分钟；
(6)洗板5次，甩干，加入底物A和底物B，50μl/孔，5分钟内使用化学发光免疫分析仪测定相对光强度(RLU)；
(7)结果判定：
A、检测认可标准为：病毒抗原对照RLU值应在8000000至15000000范围内，阳性质控血清抗体效价应大于1:720，阴性质控血清抗体效价应小于1:8
B、血清抗体效价的判定：抗原对照的4孔，弃去最高和最低RLU值，计算剩余2孔的平均RLU值，以65％抗原对照平均值为临界值；待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同，则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价；若临界值处于2个稀释孔RLU之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
抗体效价计算对照如表8所示。
表8
此外，实施例2的试剂盒的使用方法采用75％抗原对照平均值为临界值；实施例3的试剂盒的使用方法采用55％抗原对照平均值为临界值。
实验例1：灵敏度实验。
按实施例4的方法，平行测定20孔阴性质控血清1:4稀释度时的相对发光强度RLU，计算RLU的标准差(SD)与RLU平均值(M)，(M-2SD)对应的RLU对抗原对照平均RLU的抑制率作为衡量试剂盒灵敏度的指标。
灵敏度实验布局如表9所示。
表9：
灵敏度实验结果如表10所示。
表10：
表10显示，本试剂盒阴性质控血清1:4稀释度时的抑制率为7.49％，低于通用技术指标IC15(抑制率15％)的要求；而市售ELISA试剂盒的抑制率为25.37％，灵敏度较本试剂盒低。实验例2：特异性实验。
干扰样本说明：S1～S3为三份来自于不同猪个体的血清样本，抗体效价明显高于常规免疫猪血清效价，同时血清的基质效应及其他干扰因素也更显著。
按实施例2的方法，同时测定3份干扰样本的效价，观察不同稀释度与相对发光强度RLU的曲线变化趋势，以此判定试剂盒的特异性。
特异性试验布局如表11所示。
表11：
特异性实验结果如表12所示。
表12：
表12显示，随着干扰样本稀释度的升高，市售ELISA试剂盒检测的OD值有较明显的先下降后上升的趋势，而本发明试剂盒RLU值下降阶段不明显，抗干扰能力明显强于ELISA试剂盒，且检测血清效价较ELISA试剂盒高一个梯度等级，检测灵敏度高。
实验例3：稳定性实验。
市售ELISA试剂盒的有效期为6个月，取有效期满3个月内的市售ELISA试剂盒和本发明试剂盒，同时检测阴阳性质控血清，以此判定试剂盒的稳定性。
稳定性试验布局如表13所示。
表13：
稳定性实验结果如表14所示。
表14：
表14显示，随着试剂盒储藏时间的延长，市售ELISA试剂盒与本发明试剂盒在6个月的有效期内，检测阴阳性质控血清效价稳定，检测数据真实有效。
此外，经检测，实施例2、3相应试剂盒检测待测样本效价与实施例1相同，表明本申请的上述试剂盒及其检测方法具有较高的准确性和稳定性。
表15：
待测样本1～10为来自于不同猪个体的血清样本。
Claims (10)
1.一种***抗体检测试剂盒，其包括包被板、抗原抗体反应板、抗原、***兔抗工作液、羊抗兔IgG-HRP工作液、阳性质控血清、阴性质控血清、样本稀释液、洗液和底物，其特征在于：所述包被板为链霉亲和素包被板，所述抗原为生物素化的***病毒抗原。
2.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素包被板由2~20μg/mL的链霉亲和素，100μl/孔，包被形成。
3.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：所述***兔抗工作液为含有2~10μg/ml***兔多抗、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4。
4.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：所述羊抗兔IgG-HRP工作液为含有0.5~2.5μg/ml羊抗兔IgG-HRP、1wt%酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4。
5.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：所述阴性质控血清为未感染***病毒的偶蹄动物血清，抗体检测效价小于1：8；所述阳性质控血清为阴性质控血清添加***抗体制得，抗体检测效价大于1:720。
6.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为含有1wt%酪蛋白的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4。
7.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：，所述洗液为20倍的浓缩洗液，所述20倍的浓缩洗液为含18wt%NaCl、1wt%Tween20和1wt%Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH为7.4~7.6。
8.根据权利要求1所示的一种***抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物包括底物A和底物B；所述底物A为含有1.26wt%N,N-二甲基甲酰胺、5.85 mmol/L鲁米诺、9.86 mmol/L四苯硼钠和1.06 mg/L对乙酰氨基酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.8~9.0；所述底物B为含0.615 mg/mL过硼酸钠的Tris-HCl缓冲液，pH为4.8~5.0。
9.如权利要求1~8中任一所述的***抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）在抗原抗体反应板中，使用样本稀释液对待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清进行倍比稀释，50μl/孔，所述待测血清样本、阳性质控血清、阴性质控血清的稀释范围分别为（1：4~1：512）、（ 1：8~1：1024）、（1：2~1：4），抗原对照设置4孔，分别加入50μl样本稀释液；
（2）加入生物素化的***病毒抗原工作液，50μl/孔，振荡，37℃温育60分钟；
（3）将反应液转移至链霉亲和素包被板中，50μl/孔，37℃温育30分钟；
（4）洗板，甩干，向链霉亲和素包被板中加入***兔抗工作液，50μl/孔，37℃温育30分钟；
（5）洗板，甩干，向链霉亲和素包被板中加入羊抗兔IgG-HRP工作液，50μl/孔，37℃温育30分钟；
（6）洗板，甩干，加入底物A和底物B，50μl/孔，测定相对光强度（RLU）；
（7）判定待测血清的效价：抗原对照的4孔，弃去最高和最低RLU值，计算剩余2孔的平均RLU值，以55%~75% 抗原对照平均值为临界值；待检血清RLU值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔的RLU相同，则以待检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该血清的抗体效价；若临界值处于2个稀释孔RLU之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。
10.如权利要求1~9中任一所述的***抗体检测试剂盒在***抗体检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611044732.6A CN106501512A (zh) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | 一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611044732.6A CN106501512A (zh) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | 一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106501512A true CN106501512A (zh) | 2017-03-15 |
Family
ID=58328432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611044732.6A Pending CN106501512A (zh) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | 一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106501512A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108333352A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-07-27 | 江苏拜明生物技术有限公司 | 一种o型***抗体的高通量检测方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102435598A (zh) * | 2011-09-06 | 2012-05-02 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定的hrp酶促化学发光底物液 |
| CN102662062A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-09-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断elisa试剂盒及方法 |
| CN105067818A (zh) * | 2015-07-17 | 2015-11-18 | 洛阳莱普生信息科技有限公司 | 一种***o型病毒elisa抗体检测试剂盒及其检测方法 |
| CN105510571A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-04-20 | 中国兽医药品监察所 | 一种***灭活疫苗效力检验方法 |
| CN105675866A (zh) * | 2016-04-07 | 2016-06-15 | 郑州中道生物技术有限公司 | 用于检测o型fmdv抗体的固相阻断elisa试剂盒 |
| CN105675886A (zh) * | 2016-03-25 | 2016-06-15 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种***病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法 |
| CN105759058A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-07-13 | 中国科学院微生物研究所 | 一种检测猪o型***病毒抗体的方法及其专用试剂盒 |
| CN105807052A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-07-27 | 郑州中道生物技术有限公司 | O型fmdv抗体直接竞争elisa检测试剂盒 |
| CN105806830A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-07-27 | 北京联众泰克科技有限公司 | 一种稳定的hrp酶促化学发光底物液、其制备方法及应用 |
-
2016
- 2016-11-22 CN CN201611044732.6A patent/CN106501512A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102435598A (zh) * | 2011-09-06 | 2012-05-02 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定的hrp酶促化学发光底物液 |
| CN102662062A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-09-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测***病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断elisa试剂盒及方法 |
| CN105067818A (zh) * | 2015-07-17 | 2015-11-18 | 洛阳莱普生信息科技有限公司 | 一种***o型病毒elisa抗体检测试剂盒及其检测方法 |
| CN105806830A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-07-27 | 北京联众泰克科技有限公司 | 一种稳定的hrp酶促化学发光底物液、其制备方法及应用 |
| CN105510571A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-04-20 | 中国兽医药品监察所 | 一种***灭活疫苗效力检验方法 |
| CN105675886A (zh) * | 2016-03-25 | 2016-06-15 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种***病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法 |
| CN105675866A (zh) * | 2016-04-07 | 2016-06-15 | 郑州中道生物技术有限公司 | 用于检测o型fmdv抗体的固相阻断elisa试剂盒 |
| CN105759058A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-07-13 | 中国科学院微生物研究所 | 一种检测猪o型***病毒抗体的方法及其专用试剂盒 |
| CN105807052A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-07-27 | 郑州中道生物技术有限公司 | O型fmdv抗体直接竞争elisa检测试剂盒 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108333352A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-07-27 | 江苏拜明生物技术有限公司 | 一种o型***抗体的高通量检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103076451B (zh) | 一种o型***146s抗原定量elisa检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN105548565A (zh) | 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用 | |
| CN113009154B (zh) | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 | |
| CN108107220A (zh) | 一种荧光免疫磁微粒定量检测o型***抗体试剂盒 | |
| CN103864906B (zh) | ***病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN107894508A (zh) | 一种用于塞内卡病毒抗体检测的固相竞争elisa试剂盒及其应用 | |
| CN102323428A (zh) | 鸭疫里默氏杆菌抗体间接elisa方法检测试剂盒及其应用 | |
| CN105675866B (zh) | 用于检测o型fmdv抗体的固相阻断elisa试剂盒 | |
| CN104090101A (zh) | 人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN105807052B (zh) | O型fmdv抗体直接竞争elisa检测试剂盒 | |
| CN106556701B (zh) | 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒 | |
| CN104007261A (zh) | 禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用 | |
| CN106771182A (zh) | 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒 | |
| JP2015052613A (ja) | ワクチン製剤についての効力試験 | |
| CN107904209A (zh) | 一种h7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用 | |
| CN101581726A (zh) | 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 | |
| CN101592660B (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒 | |
| CN106771208A (zh) | 布鲁氏菌抗体检测试纸条 | |
| CN106405093A (zh) | 抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒 | |
| CN106501512A (zh) | 一种***抗体检测试剂盒、检测方法及其应用 | |
| CN104764887A (zh) | 一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争elisa检测方法 | |
| CN106771218B (zh) | 一种检测HIV-1 p24抗原的试剂盒及其应用 | |
| CN106990253A (zh) | 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法 | |
| CN104833804A (zh) | 一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒及其应用 | |
| CN107219365A (zh) | 一种基于***病毒3b表位蛋白的化学发光检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170315 |