CN101921337A - 间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其是对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，较佳地，单克隆抗体或多克隆抗体是采用SEQID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的，单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.3897或No.3898的杂交瘤细胞株产生，还提供了产生上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体的杂交瘤细胞株、上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体的制备方法、用途、与其相关的免疫测定法及由其制成的试剂盒等，本发明的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体能特异性检测间日疟原虫乳酸脱氢酶，可用于间日疟感染的特异性检测，特异性高，反应灵敏，成本低，适于高通量检测。

Description

间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和免疫学技术领域，更具体地，涉及单克隆抗体和多克隆抗体技术领域，特别是指一种间日疟原虫乳酸脱氢酶(Pv-LDH)抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用。

背景技术

疟疾(malaria)是由疟原虫感染引起的危害严重的寄生虫病。感染人类的疟原虫有四种：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，P.f)、间日疟原虫(P.vivax，P.v)、三日疟原虫(P.malariae，P.m)和卵形疟原虫(P.ovale，P.o)。据WHO统计，全球107个国家和地区有疟疾的流行和传播，32亿人受疟疾威胁。每年有3～5亿人发病，死亡人数达100多万。

快速和准确地诊断是有效开展疟疾防治的关键，也是全球疟疾控制策略的主要干预措施之一。但是，目前最广泛应用的临床诊断法是基于疟疾的临床症状进行诊断，由于疟疾症状特异性不强并不可靠；显微镜检查具有敏感性高、获得信息量多(可确定虫种、虫期、形态变化和定量)、费用低、血片可永久保存便于质量控制等优点被认为是目前疟原虫感染检查和鉴定的“金标准”，但镜检耗时费力，其准确性很大程度上取决于镜检设备、血片制作和镜检人员的技术和经验。不幸的是，这些条件在现场或基层的卫生机构中通常得不到满足，导致镜检结果不可信。

近年来，疟疾的快速诊断方法有了长足的发展，应用免疫层析方法检测指尖血滴中疟原虫特异性抗原的试验可在15分钟内完成，且操作人员仅需短时间的培训，无需电力和特殊的仪器设备。快速诊断试验在缺乏镜检条件的边远地区和紧急情况下，无疑是对镜检诊断方法的重要补充。

然而，国内外目前已开发的商品化检测试剂盒都只能检测恶性疟原虫和非恶性疟原虫感染，对于以间日疟感染为主的我国大部分流行区，尚缺乏种特异性。因此，急需提供间日疟感染的种特异性检测，弥补目前尚无间日疟特异性检测方法之不足。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用。间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体能特异性检测间日疟原虫乳酸脱氢酶，可用于间日疟感染的特异性检测。特异性高，反应灵敏，成本低，适于高通量检测。

为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特点是，所述间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体是对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中所述“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。因此，上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体能够特异性识别和结合SEQ ID NO：2所示的蛋白。SEQ ID NO：2所示的蛋白可以直接合成，也可以通过基因工程方法制备。在本发明的一具体实施例中，SEQ ID NO：2所示的蛋白可以是由SEQ ID NO：1第1至951位核苷酸编码产生。

制备本发明的单克隆抗体所用的抗原是通过基因工程的方法获得，利用在原核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列SEQ ID NO：1。本领域的技术人员通常熟知适用于表达本发明的抗原的载体。可根据所选用的适当启动子和待表达的目的基因序列来选择适当的载体。可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。适当宿主的例子包括：原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以是化学物质或环境刺激。在本发明的一个优选具体实施例中，采用的诱导物为IPTG(异丙基β-D硫代半乳糖苷)。

在本发明的一具体实施例中，应用特异引物进行PCR扩增以及质粒水平上的核苷酸序列重组得到了Pv-LDH基因读码框的全长序列；并通过EcoRI和XhoI酶切、连接等步骤将包含Pv-LDH基因全部开放读码框的951bp核苷酸序列克隆到原核表达载体pET28a中，构建成原核表达质粒，转化大肠杆菌，在IPTG的诱导下，表达为分子量约Mr41000的融合蛋白rePv-LDH。

较佳地，所述单克隆抗体或多克隆抗体是采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的。

更佳地，所述已知标签是，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽S-转移酶(GST标签)、Trx标签、S-tag标签、HA标签、HSV标签、Myc标签或VSV-G标签。在本发明的一具体实施例中，所述已知标签是His标签，与SEQ ID NO：2所示的蛋白形成His·Pv-LDH融合蛋白。

更佳地，所述单克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，所述多克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫兔得到的。

更进一步地，所述单克隆抗体对His·Pv-LDH融合蛋白有特异性，对His·Pf-LDH融合蛋白没有特异性。

较佳地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.3897或No.3898的杂交瘤细胞株产生。

在本发明的一具体实施例中，本发明获得的杂交瘤细胞株Pv3和Pv24分泌的单克隆抗体的抗体亚类均为IgG1，相对亲和常数分别为9.02×10⁹L·mol^-1和6.01×10⁸L·mol^-1，对His·Pv-LDH融合蛋白有特异性，对His·Pf-LDH融合蛋白无特异性(Pv24)或仅有弱反应性(Pv3)。且两单抗的识别抗原位点不相同。

在本发明的第二方面，提供了一种杂交瘤细胞株，其特点是，所述杂交瘤细胞株用于产生上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.3897或No.3898。

上述杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期：2010年6月12日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞(Mouse hybridoma)。

在本发明的第三方面，提供了一种上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体的制备方法，其特点是，采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原来制备的。

较佳地，所述已知标签是，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽S-转移酶(GST标签)、Trx标签、S-tag标签、HA标签、HSV标签、Myc标签或VSV-G标签。在本发明的一具体实施例中，所述已知标签是His标签，与SEQ ID NO：2所示的蛋白形成His·Pv-LDH融合蛋白。

较佳地，所述融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从所述杂交瘤细胞的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。

更佳地，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.3897或No.3898。

在本发明的一优选具体实施例中，以rePv-LDH融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行。

筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞进行单克隆化。得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法。

在本发明的第四方面，提供了上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体在检测和/或辅助诊断间日疟原虫感染疾病中的应用。

在本发明的一具体实施例中，提供了所述单克隆抗体在检测人血液中存在的Pv-LDH抗原蛋白中的应用。本发明的单克隆抗体具有高度的抗原结合特异性，将本发明建立的检测***用于病人血样的检测，与正常人血样反应均为阴性，与具有相似抗原结构的恶性疟感染患者血样也无交叉反应(Pv24特异性100％)或极低(Pv3交叉反应仅为15.38％，特异性为90.47％)，因此，可以用于间日疟感染的特异性检测。

在本发明的第五方面，提供了上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体在制备检测和/或辅助诊断间日疟原虫感染的诊断试剂盒中的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种免疫测定法，其特点是，所述免疫测定法采用上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体。

较佳地，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法或者免疫层析测定法。

在本发明的一具体实施例中，通过对检测方法进行优选，建立了多抗加单抗的检测***，对rePv-LDH标准抗原的检测灵敏度可以达到ng级水平。检测的线性范围较大、灵敏度高。其中，Pv3单抗检测标准抗原的灵敏度为3.13ng/ml，Pv24单抗为6.25ng/ml。在病人血样的检测中，Pv3单抗的敏感性为93.51％，Pv24单抗为85.71％。

在本发明的第七方面，提供了一种试剂盒，其特点是，所述试剂盒包括上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体。

在本发明的第八方面，提供了一种上述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体的标准抗原，其特点是，所述标准抗原是rePv-LDH重组蛋白。

本发明建立的双抗体夹心ELISA检测***，含有本发明的单克隆抗体、多克隆抗体和用于与单克隆抗体结合的标记物(标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等物质)，以及用于检测的其他试剂和缓冲液。本发明提供的标准抗原可以用于对整个检测***进行标定。因此，本发明的检测***完全可以直接或进一步优化后转化为ELISA检测试剂盒。对于本领域的技术人员而言，根据本发明的内容，利用上述单克隆抗体，制备相应的检测产品，例如酶标试剂盒和/或快速检测试纸条等，是显而易见的。因此，也是本发明所要求保护的内容。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体是对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，可以特异性地结合SEQ ID NO：2所示的蛋白，从而可用于间日疟感染的特异性检测，特异性高。

2、本发明的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体对His·Pv-LDH融合蛋白有特异性，对His·Pf-LDH融合蛋白没有特异性，从而可以进行间日疟感染的种特异性检测，弥补目前尚无间日疟特异性检测方法之不足，特异性高，反应灵敏。

3、本发明的免疫测定法和试剂盒可用于间日疟感染的种特异性检测，弥补目前尚无间日疟特异性检测方法之不足，特异性高，反应灵敏，成本低，适于高通量检测和大规模推广应用。

附图说明

图1是疟原虫乳酸脱氢酶基因的PCR扩增产物电泳图。M：DNA marker，Pv：间日疟原虫，Pf：恶性疟原虫。

图2是Pv-LDH重组质粒的限制性内切酶酶切鉴定。M：DNA marker，1：pET28a空质粒，2：重组质粒双酶切，3：Pv-LDH的PCR产物。

图3是rePv-LDH重组抗原的可溶性分析与纯化。M：蛋白marker，1：诱导前，2：诱导后，3：菌体裂解液上清，4：菌体裂解液沉淀，5：纯化柱流出液，6：纯化蛋白。

图4是rePv-LDH重组抗原蛋白质印迹分析。M：蛋白marker，1：rePv-LDH兔免疫血清，2：健康兔血清，3：间日疟患者混合血清，4：恶性疟患者混合血清，5：健康人混合血清。

图5是Pv3单抗不同稀释度的结合反应曲线。

图6是Pv24单抗不同稀释度的结合反应曲线。

图7是Pv3和Pv24单抗检测rePv-LDH重组抗原的标准曲线与检测灵敏度。

图8是Pv3单抗检测血样稀释滴度曲线。

图9是Pv24单抗检测血样稀释滴度曲线。

图10是单抗检测不同类别血样的吸光值比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，该间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体对间日疟原虫乳酸脱氢酶具有优异的特异性结合作用。在此基础上完成了本发明。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1抗原(SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)的制备

1.1疟原虫基因组DNA的提取

采用DNA提取试剂盒(Omega)从来源于上海地区间日疟患者的血液样本中提取疟原虫的基因组DNA，参照使用说明书进行，提取的DNA于-20℃保存。

1.2引物设计和PCR扩增

根据GenBank中的目标基因序列(登录号为DQ060151)设计特异性引物。上游引物的序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，下游引物的序列为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。在两个引物的5′端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以提取的基因组DNA为模板，反应条件为95℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图1所示。测序结果显示，扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据上述结果，经PCR扩增获得了所需的目标片段。

1.3重组质粒的构建

PCR扩增产物经DNA凝胶纯化试剂盒(Axygen)纯化后，用EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切(New England Biolabs)，1％琼脂糖电泳分离并再次纯化，回收的DNA片段按5∶1比例与同样经过双酶切处理的pET28a表达载体连接并转化JM109菌株。经卡那霉素抗性筛选，从生长出的菌落中随机挑选数个增菌培养，提取质粒做双酶切分析(图2)，选择有正确***片段的克隆测序(Invitrogen)。

1.4rePv-LDH重组抗原的表达和纯化

将含有正确***片段的表达质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，经过夜培养后，随机挑选菌落，于含有卡那霉素的LB培养基中培养至吸光度(A₆₀₀值)＝0.6时，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG，1mmol/L)诱导4～5h。将诱导后的菌悬液离心，收集菌体，重悬于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)中，超声裂解后，12000×g离心30min，分别收集上清和沉淀作可溶性分析。利用pET28a表达载体携带的聚组氨酸(6×His-tag)标签，用NI-NTA琼脂糖树脂亲和纯化重组蛋白。洗脱液经Ultrafree-15离心超滤(Millipore)装置浓缩，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(分离胶15％、浓缩胶5％)鉴定纯化重组抗原的纯度(图3)。

1.5多克隆抗体的制备和纯化

纯化的rePv-LDH重组抗原与等体积的福氏完全佐剂充分乳化制成油包水抗原乳剂，颈后皮下多点注射免疫兔(300μg/只)。4周后再用相同的抗原乳剂免疫1次，此后每2周重复免疫1次，共计免疫5次。分别在免疫前和免疫后每隔2周收集兔耳静脉血液，ELISA测定血清抗体效价。待免疫程序结束后心脏采血，收集免疫血清，常规ELISA测免疫血清效价。多克隆抗体的纯化采用盐析法，取抗体2ml加入洁净的离心管中，加2ml生理盐水混匀；逐滴加入4ml饱和硫酸铵，4℃静置2h或过夜；5000g离心30min，沉淀再用50％饱和硫酸铵洗涤2次；用2ml PBS使沉淀溶解，将此蛋白质溶液加入透析袋中，对PBS缓冲液4℃透析过夜，期间换液2-3次。

1.6Western Blot检测

重组抗原rePv-LDH在约M_r 41000处与兔免疫血清多克隆抗体有强反应，与间日疟和恶性疟患者血清也有特异性反应条带，如图4所示。表明重组抗原能够很好的模拟天然抗原的结构。

实施例2、单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

2.1.1动物：雌性，6～8W龄Balb/c小鼠5只(购自上海斯莱刻实验动物有限责任公司(沪)2007-0005)。

2.1.2抗原：实施例1中制备的纯化rePv-LDH重组抗原，50μg/只/次。

2.1.3免疫途径及程序：初次免疫：rePv-LDH抗原与等体积完全弗氏佐剂充分混匀，形成油包水，于鼠背部皮内多点注射。3周后第二次免疫，rePv-LDH抗原与不完全弗氏佐剂等体积混匀，背部皮内多点注射。之后隔3周免疫一次(腹腔内不含佐剂)，并于免疫后第5-7天取尾血20μl，用ELISA法测抗体效价。待抗体效价达到要求时，尾静脉加强免疫(不含佐剂))，于三天后取脾，进行细胞融合。

2.2细胞融合

2.2.1饲养细胞的制备：Balb/c小鼠拉颈处死，75％酒精中浸泡消毒5min。剖开腹外皮肤，用5ml无血清1640培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心计数。用20％小牛血清1640调整细胞浓度至0.5～2×10⁵/ml，立即种植于96孔培养板内，0.1ml/孔。

2.2.2脾细胞的制备：最后一次加强免疫后第3天，无菌取小鼠的脾脏，置于无血清的1640培养液中，用注射器内栓将脾脏撵碎，通过尼龙网过滤，制备细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清后重悬于5ml无血清1640培养液中，计数细胞浓度。

2.2.3骨髓瘤细胞的准备：选用小鼠骨髓瘤株SP 2/0(购自中科院上海细胞生物所)，收集对数生长期的骨髓瘤细胞，洗涤记数，调整浓度为4～5×10⁵/ml，悬浮于无血清1640培养液中备用。

2.2.4细胞融合：将脾细胞与SP 2/0细胞以10∶1(细胞数比)混合，1000rpm离心5min，倾去上清，轻弹沉降下来的细胞团块，使之完全松散。以1ml移液管吸取0.7ml的50％PEG-4000在1min内边搅拌边加入，加完后静置90s。之后以无血清1640培养液终止融合，开始时须缓慢加入(1ml/min)，而后逐渐加快，边加边搅，共加入30ml终止液。整个融合过程须在37℃水浴下进行。800rpm离心5min，去除上清，继续下一步操作。

2.2.5细胞培养：将离心后的细胞团块轻轻弹散。待细胞完全松散后用HAT培养基重悬，加入到已用饲养细胞铺好的96孔板中，每孔200μl。置于37℃，5％(体积百分比)CO₂的培养箱中培养。一周后，在倒置显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。待细胞生长至占培养孔底1/3面积时即可吸取培养液上清进行ELISA检测。

2.3阳性克隆的筛选和亚克隆

2.3.1ELISA检测：用包被液将检测抗原rePv-LDH和re-Pf-LDH(恶性疟乳酸脱氢酶重组抗原)(50ng/ml)每孔100μl包被酶标板，置于4℃过夜；用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次3min，然后用1％BSA-PBS封闭，每孔200μl，室温放置2h；倾去封闭液，同上洗涤，每孔加入100μl待检杂交瘤细胞培养上清，于37℃孵育1h；倾去培养上清，洗涤后每孔加入1∶3000(工作浓度)稀释的羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)结合物100μl，于37℃孵育1h。将多余的酶结合物弃去，同上洗涤。每孔加入100μl的TMB底物反应液，室温显色10-30min后，每孔加入50μl的终止液(2mol/L H₂SO₄)终止反应。用酶标仪450nm测吸光值，吸光值大于阴性孔2倍以上者为阳性，选择rePv-LDH抗原反应为阳性，且re-Pf-LDH抗原反应为阴性的细胞孔进行亚克隆。

2.3.2杂交瘤细胞的亚克隆(单个细胞培养)：采用有限稀释法进行克隆化。饲养细胞的准备同2.2.1，将ELISA检测阳性孔中的细胞从培养板内轻轻洗脱计数。用培养液连续稀释细胞悬液成30个细胞/ml接种在铺有饲养细胞的96孔板内，0.1ml/孔。培养10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。对有抗体活性的阳性细胞孔再克隆，共进行3次。

经上述重复进行ELISA筛选及亚克隆，最后筛选出2株能稳定分泌抗rePv-LDH抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为Pv3和Pv24。保藏号分别为CGMCCNo.3897或No.3898。

2.4单克隆抗体大量制备和初步纯化

2.4.1小鼠腹水的制备及收集：将杂交瘤细胞扩大培养，选取20～22g Balb/c雌性小鼠，腹腔注射杂交瘤细胞2×10⁷/只，10～14d后待小鼠腹部明显膨胀后，收集腹水。将收集的腹水3000g离心5min，取上清，-20℃储存。

2.4.2腹水的初步纯化：采用盐析法，取腹水2ml加入洁净的离心管中，加2ml生理盐水混匀；逐滴加入4ml饱和硫酸铵，4℃静置2h或过夜；5000g离心30min，沉淀再用50％饱和硫酸铵洗涤2次；用2ml PBS使沉淀溶解，将此蛋白质溶液加入透析袋中，对PBS缓冲液4℃透析过夜，期间换液2-3次。

实施例3、单克隆抗体的鉴定

3.1抗体亚类

使用鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒(Sigma)测定。将羊抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA和IgM分别用包被液1∶2000稀释，100μl/孔包被，4℃过夜或37℃孵育2h；用洗涤液PBST洗涤3次，3分钟/次，每孔加入100μl待检测的单抗细胞培养上清，37℃孵育1小时；同上洗涤3次，加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多价免疫球蛋白(G、A、M)抗体，每孔100μl，37℃孵育1h；同上洗涤三次，每孔加入新鲜配置的TMB底物溶液100μl，37℃避光孵育20分钟；每孔加入50μl 2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀吸光值，以阳性反应孔包被的亚类类别为待测上清的抗体类别。鉴定结果表明，本发明制备的Pv-LDH单克隆抗体细胞株Pv3和Pv24分泌的抗体亚类均为IgG1。

3.2抗体的识别位点

3.2.1位点竞争ELISA：将Pv3和Pv24单抗1∶200稀释，取100μl/孔包被酶标板，4℃过夜；用PBS(含0.05％Tween-20)洗板3次，1％BSA封闭1h；同上洗涤，分别加入经Pv-LDH重组抗原(抗原终浓度1∶1000)分别与1∶500稀释Pv3和Pv24单抗37℃作用1h后的混合液各100μl。同时，以不加单抗的Pv-LDH重组抗原(1∶1000)为基点对照，37℃反应1h；同上洗板3次，加入Pv-LDH兔多克隆抗体(1∶500)，37℃反应1h；同上洗板3次，加入羊抗兔IgG-HRP，37℃反应1h；洗板3次，TMB底物显色。计算抗原经饱和量的不同单克隆抗体竞争反应后，剩余位点与包被抗体反应的抑制率。抑制率计算公式：抑制率＝(基点对照吸光度-竞争后吸光度)/基点对照吸光度×100％。以抑制率＞50％为判定标准。

位点竞争ELISA结果显示，Pv3和Pv24单抗对自身的竞争抑制率分别是75.58％和58.18％，均大于50％；而两者相互竞争的抑制率分别是12.79％和45.45％，均小于50％，表明两个单抗识别的抗原表位不同。

表1.竞争ELISA测定单克隆抗体的结合位点

3.2.2位点阻断ELISA：将1∶1000稀释的Pv-LDH重组抗原100μl/孔包被酶标板，4℃过夜；用PBS(含0.05％Tween-20)洗板3次，1％BSA封闭1h；同上洗涤，分别加入1∶100稀释Pv3和Pv24单抗，同时设正常鼠血清和PBS对照，37℃作用1h；同上洗板3次，加入Pv3单抗的HRP标记物(工作浓度1∶3000)，37℃反应1h；洗板3次，TMB底物显色。分别以正常鼠血清和PBS为基点对照，计算包被抗原分别经Pv3和Pv24单抗的阻断作用后，对标记的Pv3单抗反应的抑制率。抑制率计算公式：抑制率＝(基点对照吸光度-阻断后吸光度)/基点对照吸光度×100％。以抑制率＞50％为判定标准。

Pv3单抗对标记的Pv3单抗的抑制率分别是77.85％(以正常鼠血清为基点对照)和80.12％(以PBS为基点对照)，均大于50％；而Pv24单抗对标记的Pv3单抗的抑制率分别是8.72％和18.07％，均小于50％，即Pv24不能阻断Pv3单抗与抗原的结合。位点阻断ELISA结果也显示，两个单抗识别的抗原表位是不同的。

表2.阻断ELISA测定单克隆抗体的结合位点

3.3抗体的相对亲和力测定

参照Beatty等(Journal of Immunological Methods，1987，100：173-179)建立的非竞争ELISA方法测定。首先确定Pv-LDH重组抗原的最适包被量，绘制用4个浓度(浓度比为1∶2∶4∶8)的Pv-LDH重组抗原包被时，单抗的不同稀释度与A₄₅₀nm的结合反应曲线(图5、图6)，分别求出其最大吸光度A值一半(即A_50％)处对应的抗体浓度。按公式Kaff＝(n-1)/2(n Ab′-Ab)计算亲和常数。式中Ab和Ab′分别表示任意2条曲线的抗原包被浓度为Ag和Ag′时A_50％的抗体浓度，注意计算时保证Ag＞Ag′，n＝Ag/Ag′，每个抗原包被量就能计算出1个Kaff值，然后两两比较，当n＝2时，可得3个K值；n＝4时，可得2个K值；n＝8时，可得1个K值，求出6个K值的均数作为最终结果。表3结果显示，本发明获得的2个单抗的相对亲和常数分别为9.02×10⁹L·mol-1和6.01×10⁸L·mol^-1。

表3.非竞争ELISA方法测定单克隆抗体的相对亲和常数

3.4抗体的特异性

将rePv-LDH抗原和rePf-LDH抗原用包被液稀释至1μg/ml的浓度100μl/孔包被酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h；用洗涤液PBST洗涤3次，3分钟/次；拍干后用含1％BSA的PBST封闭，37℃湿盒作用1h；同上洗涤3次，加入倍比稀释的单抗腹水，稀释度为1∶1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000，37℃孵育1h；同上洗涤3次，加入1∶3000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；同上洗涤3次，加入TMB底物显色，以正常Balb/c小鼠的血清为阴性对照。

表4结果显示，本发明制备的单抗腹水与rePf-LDH抗原无反应性(Pv24)或仅有弱反应性(Pv3)，与正常Balb/c鼠血清的反应为阴性，而与rePv-LDH抗原有强反应性，抗体稀释度的平台区间跨越4个稀释度，表明抗体的特异性和亲和性较好。

表4.间接ELISA检测结果

实施例4、检测rePv-LDH标准品的灵敏度

4.1双抗体夹心ELISA的建立

将已知浓度的rePv-LDH抗原保存液倍比稀释，将Pv-LDH兔源多克隆抗体及Pv3和Pv24两个单克隆共3个抗体自由组合进行双抗体夹心ELISA试验，以测定不同株的单抗和多抗配对或组合的双抗体夹心ELISA方法所能检测到的抗原量。选择检出抗原量最敏感的一种配对或组合建立双抗体夹心ELISA方法来检测疟疾病人和正常人血样中的Pv-LDH抗原。判定标准：多份正常人血清平均吸光值(A₄₅₀)为阴性参考值，病人血样检测值/阴性参考值(P/N)≥2.0为阳性临界值。结果表明，以多抗加单抗的双夹心间接ELISA方法检测rePv-LDH重组抗原的灵敏度最高。因此，我们选择该方法建立了检测体系。

4.2标准曲线绘制方法

将Pv-LDH兔源多克隆抗体作为包被抗体(浓度10μg/L))，单抗Pv3和Pv24分别作为检测抗体(浓度为10μg/L)。具体操作如下：将Pv-LDH兔源多克隆抗体100μl/孔包板，4℃过夜或37℃孵育2h；pH7.4PBST洗板3次，每孔加入2％BSA，37℃温度下封闭1h，PBST洗板1次；每孔加入100μl用正常人全血(1∶5)稀释的标准rePv-LDH抗原系列稀释溶液，37℃孵育1h；使用PBST洗板6次后，每孔加入100μl Pv3或Pv24抗体，37℃孵育1h；同上洗板3次，加入1∶3000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；同上洗板3次，加入TMB底物液，37℃避光显色15-20分钟；每孔加入50μl，2mol/L硫酸终止反应，检测A₄₅₀值，根据所获得的A₄₅₀值作rePv-LDH抗原浓度标准曲线。

4.3rePv-LDH重组抗原标准曲线与检测灵敏度

以1∶5的正常人全血样本为稀释液，将rePv-LDH重组抗原(400μg/ml)从1∶500倍比稀释至1∶512000，以不含抗原的全血稀释液为阴性对照；然后采用4.2的方法分别测定A₄₅₀值，根据测定结果，绘制rePv-LDH重组抗原对A₄₅₀值的标准曲线(图7)。根据图7的结果，重组抗原标准反应曲线在3.13～800ng/ml之间呈线性，在6.25～200ng/ml范围内的线性关系最好，且与阴性对照的吸光度比值大于2.0。因此，标准曲线可在6.25～200ng/ml范围内用于重组蛋白浓度的标定。以阴性对照吸光值的2.0倍为阳性临界值，两个单抗的检测灵敏度分别是Pv3为3.13ng/ml和Pv24为6.25ng/ml。

4.4血样稀释滴度曲线绘制

分别用多份不同感染强度的疟疾病人血液标本制成强阳性、阳性和弱阳性混合血样，将混合样本从1∶1开始倍比稀释至1∶512，然后采用4.2的方法分别测定不同稀释倍数的病人血样的A₄₅₀值。根据测定结果，绘制血样中抗原对A₄₅₀值的滴度曲线(图8和图9)。图8和图9的结果，不同感染强度的混合血清在1∶2～8范围内线性关系良好，且与阴性对照吸光度的比值大于2.0。因此，血液样本可在1∶2～8范围内稀释，用于血样中Pv-LDH抗原的检测，但血样的稀释度越小，检测反应的敏感性越高。

实施例5、应用Pv-LDH单克隆抗体检测病人血样

用上述建立的双抗体夹心ELISA方法对161份全血样本(其中，间日疟77份、恶性疟52份和正常人32份)进行检测，检测结果见表5。结果显示，Pv3单抗的敏感性和特异性分别是93.51％和90.47％，与恶性疟的交叉反应为15.38％，Pv24单抗的敏感性略低于Pv3为85.71％，但特异性为100％，与恶性疟血样无交叉反应。两个单抗均能较好地区分不同类别的血样(图10)。本实施例使用的双抗体夹心ELISA检测***中，多克隆抗体和单克隆抗体仅为用盐析法初步纯化的抗体，如果将上述抗体通过如亲和层析等方法进行进一步纯化，可能会获得更为理想的敏感性和特异性。

表5.双抗体夹心ELISA检测病人血样结果

疟原虫乳酸脱氢酶(Plasmodium lactate dehydrogenase，pLDH)仅由活虫体产生，血液中pLDH的水平与原虫血症平行相关，检测pLDH可鉴别虫体的存活状态，用于监测和判定药物的疗效，因而可以成为疟疾检测较为理想的靶抗原。

本发明通过提供一种间日疟原虫乳酸脱氢酶(Pv-LDH)的特异性单克隆抗体，用于间日疟感染的特异性检测，弥补目前尚无间日疟特异性检测方法之不足。

综上所述，本发明的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体能特异性检测间日疟原虫乳酸脱氢酶，可用于间日疟感染的特异性检测，特异性高，反应灵敏，成本低，且适于高通量检测。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (15)

1.一种间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特征在于，所述间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体是对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特征在于，所述单克隆抗体或多克隆抗体是采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的。

3.根据权利要求2所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，所述多克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫兔得到的。

4.根据权利要求3所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特征在于，所述单克隆抗体对His·Pv-LDH融合蛋白有特异性，对His·Pf-LDH融合蛋白没有特异性。

5.根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.3897或No.3898的杂交瘤细胞株产生。

6.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株用于产生根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.3897或No.3898。

7.一种根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体的制备方法，其特征在于，采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原来制备的。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从所述杂交瘤细胞的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.3897或No.3898。

10.根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体在检测和/或辅助诊断间日疟原虫感染疾病中的应用。

11.根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体在制备检测和/或辅助诊断间日疟原虫感染的诊断试剂盒中的应用。

12.一种免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定法采用根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体。

13.根据权利要求12所述的免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法或者免疫层析测定法。

14.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体。

15.一种根据权利要求1所述的间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体的标准抗原，其特征在于，所述标准抗原是rePv-LDH重组蛋白。

Images