发明内容
本发明提供了一种含有结核病***反应原CE的药物组合物,该组合物在较长的时间内和剧烈破坏条件下仍能维持药物组合物的物理和化学稳定性,并且具有非常适合于皮下施用的pH、粘度和渗透压。
本发明提供了一种含有结核病***反应原CE的药物组合物,其中包括:
a.结核病***反应原CE;
b.至少一种结构保护剂;
c.至少一种表面活性剂;
d.至少一种缓冲剂;
pH为4.0-8.0。
在一个优选的实施方案中,本发明所述药物组合物包括:
a.1μg/ml-10mg/ml的结核病***反应原CE;
b.1mg/ml-500mg/ml的结构保护剂;
c.0.01mg/ml-5mg/ml的表面活性剂;
d.1mM-100mM的缓冲液;
pH为4.0-8.0。
在一个优选的实施方案中,本发明所述结核病***反应原CE是选自a)或b)的蛋白:
a.SEQ ID No.2所示的蛋白质;
b.将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
本发明所述的结构保护剂选自糖类、多元醇、氨基酸或聚乙二醇类(PEG)。其中所述糖类选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖、葡聚糖、糊精、环糊精、羟乙基淀粉或其任意混合物;多元醇选自甘露醇、甘油、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、丙二醇或其任意混合物;氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或其任意混合物;聚乙二醇类选自PEG3000、PEG3500、PEG4000或PEG6000。
本发明所述的表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯21、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯61、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、聚山梨酯85或其任意混合物,以及泊洛沙姆、triton、十二烷基硫酸钠、月桂硫酸钠、辛基糖苷钠、月桂基-磺基甜菜碱、聚乙二醇、聚丙二醇或其任意混合物。
本发明所述的缓冲液选自乙酸/乙酸盐、琥珀酸/琥珀酸盐、葡萄酸/葡萄酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、酒石酸/酒石酸盐、顺丁烯二酸/顺丁烯二酸盐、乳酸/乳酸盐、碳酸/碳酸氢盐、苯甲酸/苯甲酸盐、咪唑、磷酸/磷酸盐、tris/tris盐酸盐,以及丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或混合物;或其任意混合物。
本发明所述的药物组合物可以进一步含有抗氧化剂,其中所述的抗氧化剂优选抗坏血酸、色氨酸、蛋氨酸、谷胱甘肽、硫代硫酸钠、过氧化氢酶及螯合剂等;其中螯合剂选自由氨基多羧酸,羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、柠檬酸、烟酰胺、 去铁胺和去氧胆酸盐及其混合物,优选乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)及它们的盐。本发明中使用的螯合剂可以化合物的游离酸或者游离碱或者盐的形式存在,也可以化合物或者相应盐的无水、水合或者其他溶剂化物的形式存在。
本发明所述的药物组合物可以进一步含有等渗调节剂,其中所述的等渗调节剂优选氯化钠、氯化钾、糖类、多元醇、氨基酸;其中糖类选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖、葡聚糖、糊精、环糊精、羟乙基淀粉或其任意混合物;多元醇选自甘露醇、甘油、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、丙二醇或者其任意混合物;氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或其任意混合物。
本发明的药物组合物可以进一步含有防腐剂,所述防腐剂优选间甲酚、苯酚、苯甲醇、苯扎氯铵、苯氧乙醇和对羟基苯甲酸甲酯的一种或多种。
在一个优选的实施方案中,本发明所述药物组合物包括:
a.5μg/ml-1mg/ml的结核病***反应原CE,
b.20mg/ml-200mg/ml的二糖或多元醇或其混合物,
c.0.05mg/ml-1mg/ml的聚山梨酯20,
d.5mM-40mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液,
pH为6.0-6.6。
在一个优选的实施方案中,本发明所述药物组合物包括:
a.10μg/ml-200μg/ml的结核病***反应原CE,
b.20mg/ml-100mg/ml的海藻糖或蔗糖或甘露醇或其任意混合物
c.0.1mg/ml-1mg/ml的聚山梨酯20,
d.5mM-40mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液,
pH为6.3。
本发明选择两种只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌)中,而不存在于所有卡介苗菌株及绝大部分环境分枝杆菌基因组中的CFP10抗原和ESAT6抗原,经基因工程方法构建融合表达载体pET-30a-CFP10-ESAT6,并在大肠杆菌工程菌中高效表达(表达产物简称重组融合蛋白CE),表达产物经破碎超滤浓缩,经离子交换DEAE-FF,AB-FF,和Q-HP纯化后,得到SEC-HPLC单体纯度>99%、RP-HPLC纯度>95%的结核病***反应原CE。由于选择的CFP10和ESAT6抗原是中国人群的优势抗原融合表达,含有较多的T细胞抗原决定簇,有较强的免疫原性, 能特异地诱导不同结核感染人群产生较强的迟发型***反应,而使检测的灵敏度提高,可鉴别结核感染者和卡介苗接种者,这对于广泛接种卡介苗的国家是非常有益的。
本发明所述的结核病***反应原CE的编码基因和氨基酸序列如下:
编码基因:
5’-CATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAG-3’(SEQ ID No.1)
氨基酸序列:
MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGGGSGGGMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ ID No.2)
本发明的药物组合物可以为水针制剂、冻干制剂或者由冻干粉末和注射用水通过双腔卡氏瓶(dual-chamber cartridge)配制得到的制剂形式。所得药物组合物的制剂优选通过皮下注射(s.c.)、皮内注射(i.d.)、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)或其它非肠胃(parenteral)形式给药实施。
本发明的药物组合物可用于制备诊断结核病的药物制剂,尤其适用于鉴别结核感染者和卡介苗接种者。
本发明还提供了所述药物组合物的制备方法,包括如下步骤:
a.将处方量的结构保护剂、表面活性剂、缓冲盐溶解于适量的注射用水中, 搅拌溶解,使用酸/碱调节至pH为4.0-8.0,优选pH为6.0-6.6,更优选6.3;所述的酸优选盐酸,所述的碱优选氢氧化钠;
b.将处方量的结核病***反应原CE加入至a步骤所得的缓冲液中,搅拌均匀;
c.将b步骤所得溶液过滤除菌,分装,加塞,轧盖得到液体制剂;或者将b步骤所得溶液过滤除菌,分装,半加塞,冷冻干燥,再加塞,轧盖得到冻干粉针制剂。
本发明的有益效果为:将所得高灵敏度、高度表达的结核病***反应原CE制成药物组合物,通过加入结构保护剂及其他辅料,改善了生物药物的微环境,大大提高了药物组合物的在高温、及长期储存时的稳定性,因此具有非常广阔的市场应用前景。
实施例1、重组融合蛋白CE的编码基因的克隆及重组融合蛋白CE的表达和纯化
一、两个蛋白抗原表位融合的设计
分析结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的基因序列和蛋白质结构,确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序,根据大肠杆菌的密码子使用频率,选择其中高频率的密码子即最佳密码子或偏爱密码子,去除一些稀有或利用率低的密码子,通过同义密码子替换原有密码子进行优化,以便所设计的基因在大肠杆菌中高水平地表达,提高蛋白产量,使蛋白生产更有效和经济。
设计得到SEQ ID No.1所示的序列。SEQ ID No.1中第1-6位为限制性核酸内切酶Nde I酶切识别位点5’-CATATG-3’(包括起始密码子5’-ATG-3’),第4-303位为CFP10蛋白抗原表位的编码基因(以下简称为C基因)序列,第304-327位为连接臂的编码基因序列5’-GGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGT-3’,第328-612位为优化后的ESAT6蛋白抗原表位的编码基因(以下简称为E基因)序列,第613-615位为终止密码子5’-TAA-3’,第617-622位为限制性核酸内切酶Xho I酶切识别位点5’-CTCGAG-3’。
根据SEQ ID No.1得到CFP10和ESAT6蛋白抗原表位依次连接形成的重组融合蛋白CE,CFP10蛋白的抗原表位位于重组融合蛋白CE的氨基端,ESAT6蛋白的抗原表位位于重组融合蛋白CE的羧基端。重组融合蛋白CE的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2中第1-100位为CFP10蛋白抗原表位序列,第101-108位为连接臂,第109-203位为ESAT6蛋白抗原表位序列。
重组融合蛋白CE的编码基因(以下简称为CE基因)序列如SEQ ID No.1中第4-612位所示。
5’-CATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAG-3’(SEQ ID No.1)
MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGGGSGGGMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ ID No.2)
二、通过基因工程技术克隆重组融合蛋白CE的编码基因
1、根据重组融合蛋白CE的编码基因序列,设计并合成表1所示的引物,用于扩增CE基因。
表1用于扩增CE基因的引物
2、含有C基因的片段KC的全基因合成PCR
(1)以表1中的C101F、C101R、C102F、C102R、C103F、C103R、C104F、C104R、C105F、C10BAMH这10条引物互相作为引物和模板,进行第一轮PCR扩增,得到第一轮PCR扩增产物。
具体原理如下:
引物C101F和C101R互相作为引物和模板扩增出片段1:5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATC-3’;
引物C102F和C102R互相作为引物和模板扩增出片段2:5’-GTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTAC-3’;
引物C103F和C103R互相作为引物和模板扩增出片段3:5’-GCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACA-3’;
引物C104F和C104R互相作为引物和模板扩增出片段4:5’-CTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGC-3’;
引物C105F和C10BAMH互相作为引物和模板扩增出片段5:5’-GCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCCTAATAAACTCGAGCGG-3’;
以片段1和片段2为模板,以C101F和C102R为引物,扩增出片段1+2:5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTAC-3’;
以片段1+2和扩增片段3为模板,以C101F和C103R为引物,扩增出片段1+2+3:
5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACA-3’;
以扩增片段1+2+3和扩增片段4为模板,以C101F和C104R为引物,扩增出片段1+2+3+4:
5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGC-3’;
以扩增片段1+2+3+4和扩增片段5为模板,以C101F和C10BAMH为引物,扩增出片段1+2+3+4+5(该片段含有C基因和部分连接臂):
5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATC-3’。
第一轮PCR的反应体系:10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物C101F 5μl、引物C101R 0.5μl、引物C102F 0.5μl、引物C102R 0.5μl、引物C103F 0.5μl、引物C103R 0.5μl、引物C104F 0.5μl、引物C104R 0.5μl、引物C105F 0.5μl、引物C10BAMH 5μl、PyrobestTMDNA聚合酶1μl、无菌水26μl,总计50μl。
第一轮PCR的反应条件:95℃预变性5min;94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸10min;16℃降温2min。
(2)以1μl第一轮PCR扩增产物作为模板,用表1中的C10FF和C10BAMRR为引物,进行第二轮PCR扩增,得到第二轮PCR扩增产物(即,含有C基因的片段KC),序列如下:
5’-CCAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCCTAATAAACTCGAGCGG-3’。
第二轮PCR的反应体系:第一轮PCR扩增产物1μl、10×PCR缓冲液
5μl、dNTPs 4μl、引物C10FF 5μl、引物C10BAMRR 5μl、DNA聚合酶
1μl、无菌水29μl,总计50μl。
(3)电泳回收目的片段
将步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图1所示。
图1中,1:DNA分子量标准(由上至下条带大小依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp);2:步骤(2)得到的第二轮PCR扩 增产物;箭头所指为含有C基因的片段KC。
在长波紫外线照射下,用干净的手术刀片在胶上切下要回收的含有C基因的片段KC的琼脂块,放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收该片段并进行测序,测序结果正确,定量后,将其贮存于-20℃备用。
3、含有E基因的片段KE的全基因合成PCR
(1)以表1中的E6BGLF、E61F、E61R、E62F、E62R、E63F、E63R、E64F、E64R、E65F、E65R这11条引物互相作为引物和模板,进行第一轮PCR扩增,得到第一轮PCR扩增产物。
具体原理如下:
引物E61F和E61R互相作为引物和模板扩增出片段6:
5’-AATTCCATATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTC-3’;
引物E62F和E62R互相作为引物和模板扩增出片段7:
5’-TATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGG-3’;
引物E63F和E63R互相作为引物和模板扩增出片段8:
5’-CTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCAC-3’;
引物E64F和E64R互相作为引物和模板扩增出片段9:
5’-AACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACT-3’;
引物E65F和E65R互相作为引物和模板扩增出片段10:
5’-TCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’;
以扩增片段6为模板,以E6BGLF和E61R为引物,扩增出片段11:
5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTC-3’;
以扩增片段11和扩增片段7为模板,以E6BGLF和E62R为引物,扩增出片段11+7:
5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGG-3’;
以扩增片段11+7和扩增片段8为模板,以E6BGLF和E63R为引物,扩增出片段11+7+8:
5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCAC-3’;
以扩增片段11+7+8和扩增片段9为模板,以E6BGLF和E64R为引物,扩增出片段11+7+8+9:
5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACT-3’;
以扩增片段11+7+8+9和扩增片段10为模板,以E6BGLF和E65R为引物,扩增出片段11+7+8+9+10(该片段含有E基因):
5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’。
第一轮PCR的反应体系:10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物E6BGLF 5μl、引物E61F 0.5μl、引物E61R 0.5μl、引物E62F 0.5μl、引物E62R 0.5μl、引物E63F 0.5μl、引物E63R 0.5μl、引物E64F 0.5μl、引物E64R 0.5μl、引物E65F 0.5μl、引物E65R 5μl、DNA聚合酶1μl、无菌水26μl,总计50μl。
第一轮PCR的反应条件:95℃预变性5min;94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸10min;16℃降温2min。
(2)以1μl第一轮PCR扩增产物作为模板,用表1中的E6BGLFF和E65R为引物,进行第二轮PCR扩增,得到第二轮PCR扩增产物(即,含有E基因的片段KE),序列如下:
5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’。
第二轮PCR的反应体系:第一轮PCR扩增产物1μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物E6BGLFF 5μl、引物E65R 5μl、DNA聚合酶1μl、无菌水29μl,总计50μl。
(3)电泳回收目的片段:
将步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示。
图2中,1:DNA分子量标准(由上至下条带大小依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp);2:步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物;箭头所指为含有E基因的片段KE。
在长波紫外线照射下,用干净的手术刀片在胶上切下要回收的含有E基因的片段KE的琼脂块,放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收该片段并进行测序,测序结果正确,定量后,将其贮存于-20℃备用。
4、含有C基因的片段KC与含有E基因的片段KE的连接
(1)用BamH I酶切步骤2得到的含有C基因的片段KC,得到酶切产物1。酶切体系如下:含有C基因的片段KC 15μl、10×K缓冲液3μl、BamH I 1μl、无菌水11μl,总计30μl。
(2)用BglII酶切步骤3得到的含有E基因的片段KE,得到酶切产物2。酶切体系如下:含有E基因的片段KE 15μl、10×H缓冲液3μl、Bgl II 1μl、无菌水11μl,总计30μl。
(3)将酶切产物1和酶切产物2用T4DNA连接酶连接,获得连接产物。 连接体系如下:酶切产物1 10μl、酶切产物2 10μl、10×连接缓冲液3μl、T4 DNA连接酶1μl、无菌水6μl,总计30μl。
(4)用步骤(3)得到的连接产物作为模板,用表1中的C101F和E65R为引物,进行PCR扩增,得到PCR扩增产物(含有CE基因的片段KCE)。PCR的反应体系:连接产物1μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物C101F 1μl、引物E65R 1μl、DNA聚合酶1μl、无菌水37μl,总计50μl。
含有CE基因的片段KCE序列如下:
5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’(SEQ ID No.3)
该片段也可直接人工合成。
(5)电泳回收目的片段
将步骤(4)得到的PCR扩增产物(含有CE基因的片段KCE)进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图3所示。
图3中,1:步骤(4)得到的PCR扩增产物(含有CE基因的片段KCE);2:DNA分子量标准(由上至下条带大小依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp)。
在长波紫外线照射下,用干净的手术刀片在胶上切下要回收的含有CE基因的片段KCE的琼脂块,放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收该片段并进行测序,测序结果正确,定量后,贮存于-20℃备用。
5、表达载体的构建
将步骤4获得的含有CE基因的片段KCE克隆至pET-30a(+)(invitrogen 公司产品)载体中,再将其转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(大连TaKaRa公司产品),经筛选获得表达重组融合蛋白CE的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌。
具体步骤如下:
(1)酶切
将步骤4获得的含有CE基因的片段KCE和pET-30a(+)表达载体分别用Nde I和XhoI进行双酶切。
两个酶切体系分别如下:
酶切体系1:含有CE基因的片段KCE 3μl、10×H缓冲液8μl、Nde I2μl、Xho I 2μl、无菌水65μl,总计80μl。
酶切体系2:pET-30a(+)3μl、10×H缓冲液8μl、Nde I 2μl、Xho I 2μl、无菌水65μl,总计80μl。
将两个酶切体系置于37℃孵育3h,分别得到含有CE基因的片段KCE的酶切产物和pET-30a(+)质粒的酶切产物。
(2)电泳回收目的片段
将步骤(1)得到的pET-30a(+)质粒的酶切产物和含有CE基因的片段KCE的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在长波紫外线照射下,用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块,放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书分别回收得到615bp的含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段和5234bp的pET-30a(+)质粒的酶切回收片段。
将pET-30a(+)质粒、pET-30a(+)质粒的酶切产物、pET-30a(+)质粒的酶切回收片段、含有CE基因的片段KCE、含有CE基因的片段KCE的酶切产物、含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图4所示。
图4中,1:DNA分子量标准;2:pET-30a(+)质粒;3:pET-30a(+)质粒的酶切产物;4:pET-30a(+)质粒的酶切回收片段;5:含有CE基因的片段KCE;6:含有CE基因的片段KCE的酶切产物;7:含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段。
图4表明,pET-30a(+)及含有CE基因的片段KCE的酶切产物均得到回收,且纯度较好。
(3)基因片段连接
将步骤(2)回收纯化的含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段与pET-30a(+)质粒的酶切回收片段定量后,按1:1的摩尔比混合,进行如下连接反应, 得到连接产物。
连接反应体系(10μl):2×连接缓冲液5μl、A/pET-30a(+)质粒的酶切回收片段1μl、B/含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段1μl、T4DNA连接酶1μl、无菌水补至10μl。混匀后置于16℃连接过夜,75℃灭活10min,冰浴后直接进行转化。
(4)连接产物的转化
次日取步骤(3)得到的连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的离心管中,冰浴0.5h;放入42℃水浴箱热休克90s,迅速取出冰浴2min;加入LB培养液400μl,37℃恒温摇床培养1h;加入X-Gal 60μl,IPTG4μl,混匀,取出200-400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板,放37℃恒温培养箱培育过夜至单菌落生长。
(5)质粒的提取
根据蓝白斑筛选,随机挑取2个白色单菌落,分别命名为pET-30a-CE-1菌落和pET-30a-CE-2菌落,并分别接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃恒温振荡培养过夜。根据《分子克隆》碱裂解方法,小量提取质粒,分别得到重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2。将重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2进行琼脂糖凝胶电泳分析,结果如图5所示。
图5中,1:DNA分子量标准;2:载体质粒pET-30a(+);3:重组质粒pET-30a-CE-1;4:重组质粒pET-30a-CE-2。
图5表明,重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2的大小均与预期相符。将重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2进一步测序,测序结果表明重组质粒的大小均为5857bp。
(6)重组质粒的鉴定
①酶切鉴定
分别以重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2为模板,用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。将酶切产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,结果如图6所示。
图6中,M:DL2000 DNA Marker;1:含有CE基因的片段KCE的Nde I+Xho I双酶切产物;2:重组质粒pET-30a-CE-1的Nde I+Xho I双酶切产物;3:重组质粒pET-30a-CE-2的NdeI+Xho I双酶切产物。
图6表明,重组质粒的酶切片段大小与预期相符(含有CE基因的片段大小为615bp),为阳性重组质粒。将该种质粒命名为CE/pET-30a,其来源的菌命名为CE/pET-30a大肠杆菌工程菌。
②序列测定
挑选一个CE/pET-30a大肠杆菌工程菌克隆送上海生工生物技术有限公司进行T7通用引物正向测序,测序图谱如图7所示。
测序结果如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.4中,第54-59位为限制性核酸内切酶Nde I酶切识别位点5’-CATATG-3’(包括起始密码子5’-ATG-3’),第57-356位为CFP10蛋白抗原表位的编码基因(C基因)序列,第357-380位为连接臂的编码基因序列5’-GGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGT-3’,第381-665位为优化后的ESAT6蛋白抗原表位的编码基因(E基因)序列,第666-668位为终止密码子5’-TAA-3’,第670-675位为限制性核酸内切酶XhoI酶切识别位点5’-CTCGAG-3’。结果表明,CE/pET-30a质粒中的CE基因序列(即SEQ ID No.4中第57-665位)与设计的序列(SEQ ID No.1中第4-612位)完全一致。
5’-GGGCGGAACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAGAGA TGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATC GATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGT TGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTG TTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGT GGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTC TATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAG CTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACC ATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATC-3’(SEQ ID No.4)
三、CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的诱导表达及鉴定
1、将CE/pET-30a大肠杆菌工程菌接种于6ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中,置37℃、200rpm恒温振荡器培养8h后,按体积百分含量1%转种到50ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中,置37℃、200rpm恒温振荡器培养至OD600为0.6-0.9时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,诱导1-4hr,得到菌液。
将1×载样缓冲液10μl加入来自40μl菌液的沉淀样本,混悬后,置100℃ 沸水浴5min,于10000rpm离心5min后,取上清液10μl进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%),电泳条件为:积层胶恒压80V,分离胶恒压120V,待溴酚蓝电泳至凝胶底部,停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h,用脱色液脱色至条带清晰。
CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后的SDS-PAGE结果如图8所示。
图8中,1:蛋白质分子量标准;2:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前;3:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导1小时;4:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导2小时;5:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导3小时;6:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导4小时;箭头所指为重组融合蛋白CE的条带。
图8表明,CE/pET-30a大肠杆菌工程菌菌体在相对分子质量21035Da位置附近有浓重的表达条带出现,IPTG诱导3-4小时表达量最多。
2、表达条件及表达形式鉴定
将CE/pET-30a大肠杆菌工程菌接种于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中,置37℃恒温振荡器过夜培养后,按体积百分含量1%转种到2瓶50ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中,置37℃恒温振荡器培养至OD600为0.6-0.8时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,分别于37℃与15℃进行诱导4hr,分别得到CE/pET-30a大肠杆菌工程菌37℃诱导后的菌液和15℃诱导后的菌液。分别将菌液中的菌体超声破碎,离心后,得到CE/pET-30a大肠杆菌工程菌37℃诱导后的上清和沉淀以及CE/pET-30a大肠杆菌工程菌15℃诱导后的上清和沉淀,将各上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析,部分结果如图9所示。
图9中,1:蛋白质分子量标准(TaKaRa-D530A:从上至下条带大小依次为97.2,66.4,44.3,29.0,20.1kDa);2:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌37℃诱导后的上清;3:CE/pET-30a大肠杆菌工程菌15℃诱导后的上清。
图9表明,CE/pET-30a大肠杆菌工程菌在37℃与15℃分泌表达的重组融合蛋白CE均存在于其菌液的上清中。
四、重组融合蛋白CE的高密度、高表达发酵
1、对CE/pET-30a大肠杆菌工程菌(重组菌)进行100L发酵罐的高密度发酵,在对数生长期进行IPTG诱导,诱导后4h放罐。
发酵过程如下:
(1)种子培养
以0.1%的接种量将甘油管中保存的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌接入装有 200mlLB培养基(含50μg/ml的卡那霉素)的500ml三角烧瓶中,200r/min,37℃培养8-12h至OD600达到3.0-6.0,得到种子液。
(2)发酵罐培养
①发酵培养基和补料培养基的配方如表2所示。
表2发酵培养基和补料培养基的配方
②将步骤(1)得到的种子液按照2%的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养,培养温度37℃、pH6.8、控制溶氧范围在30-80%,采用指数流加补料策略(以发酵培养的培养液的糖含量小于1g/L为标准调节补料补加速度)。OD600达到25-35时开始诱导表达,诱导剂IPTG终浓度为0.5mM,诱导4h后终止发酵培养。采用100L发酵罐连续培养5批,结果如表3所示。
表3发酵过程参数记录
2、分别取步骤1中CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导后1h、2h、3h和4h的发酵液和诱导前的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的发酵液进行菌体超声破碎,离心分别取CE/pET-30a大肠杆菌工程菌诱导1h、2h、3h和4h的发酵液的上清和诱导前的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的发酵液的上清进行SDS-PAGE分析,结果如图10所示。
图10中,1:蛋白分子量标准;2:诱导前的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的发酵液的上清;3-6分别代表CE/pET-30a大肠杆菌工程菌诱导1h、2h、3h和4h的发酵液的上清;箭头所指为重组融合蛋白CE的条带。
结果表明,IPTG诱导4h时,重组融合蛋白CE的表达量达到最大,目的蛋白表达量大于4g/L。
五、重组融合蛋白CE的纯化及鉴定
1、菌体收集及破碎
采用管式离心机收集CE/pET-30a大肠杆菌工程菌菌体,然后将菌体按体积比1∶5比例重悬于20mM Tris缓冲液(pH8.0)中,以12000psi均质压力破碎菌体2次。
2、上清液收集
采用10000rpm离心20min收集破碎后上清液。
3、超滤浓缩Ⅰ
大肠杆菌菌体破碎后,释放出大量杂质且料液的体积较大,不利于层析处理,因此首先采用超滤方法进行初步分离和浓缩。
重组融合蛋白CE蛋白理论分子量为21,035Da,因此首先选用300KD超滤膜进行透析,以截留离心残留的微量固形物及部分高分子杂质,然后采用5KD超滤膜进行浓缩以去除小分子杂质,浓缩至3-5倍体积时用3-5倍置换液Ⅰ(20mM Tris,pH8.0)进行缓冲液置换。
4、DEAE sepharose Fast Flow柱纯化
采用缓冲液C1A相(20mM Tris,pH8.0)和C1B相(20mM Tris,0.3M NaCl,pH8.0)。用C1A相平衡阴离子交换柱DEAE sepharose Fast Flow柱(柱的内径为200mm)2.0-4.0个柱体积,收集平衡液;将步骤3得到的浓缩液上柱,收集穿出液;采用0-70%B线性梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱体积为10个柱体积,流速为30L/h,检测波长为280nm。对洗脱液的主峰进行RP-HPLC分析,RP-HPLC分析条件为:C4分析柱(型号Kromasil C4 300-5C4),温度30℃,检测波长214nm,流速1mL/min。按表4进行梯度洗脱(其中流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液, 流动相B为0.08%三氟乙酸-乙腈溶液),得到主峰蛋白。结果如图11所示。
表4洗脱程序
5、Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱纯化
采用缓冲液C2A相(20mM Tris,pH8.0)和C2B相(20mM Tris,0.3M NaCl,pH8.0)。用C2A相平衡离子交换柱Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱(柱的内径为100mm)2.0-4.0个柱体积,将步骤4得到的主峰蛋白用C2A相稀释1-2倍上柱,采用20%C2B相预洗1.5-2.0个柱体积后20%B-70%B线性梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱体积为10个柱体积,流速为15L/h,检测波长为280nm。对洗脱液的主峰进行RP-HPLC分析,RP-HPLC分析条件为:C4分析柱(型号Kromasil C4 300-5C4),温度30℃,检测波长214nm,流速1mL/min。按表5进行梯度洗脱(其中流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液,流动相B为0.08%三氟乙酸-乙腈溶液),得到主峰蛋白。结果如图12所示。
表5洗脱程序
6、超滤浓缩Ⅱ
经步骤5的Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow层析后收集的主峰蛋白,采用5KD超滤膜进行缓冲液置换。首先将目的蛋白浓缩3-5倍体积后,然后用置换液Ⅱ(20mM Tris,pH8.0溶液)置换3-5倍体积至透过液电导至2.0以下。
7、Q Sepharose High Performance柱纯化
采用缓冲液C3A相(20mM Tris,pH8.0)和C3B相(20mM Tris,0.3M NaCl,pH8.0)。用C3A相平衡离子交换柱Q Sepharose High Performance柱(柱的内径 为50mm)2.0-4.0个柱体积,收集平衡液,将步骤6得到的浓缩液上柱,收集穿出液,采用0-70%B线性梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱体积为10个柱体积,流速为30L/h。检测波长为280nm。对洗脱液的主峰进行RP-HPLC分析,RP-HPLC分析条件为:C4分析柱(型号Kromasil C4 300-5C4),温度30℃,检测波长214nm,流速1mL/min。按表6进行梯度洗脱(其中流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液,流动相B为0.08%三氟乙酸-乙腈溶液),收集主峰蛋白。结果如图13所示。
表6洗脱程序
8、超滤浓缩Ⅲ
经步骤7的Q Sepharose High Performance层析后收集主峰蛋白,经5KD超滤膜浓缩至1.0-1.5L,用置换液III(5.488g/L柠檬酸钠(二水)、0.281g/L柠檬酸(一水)、0.4g/L聚山梨酯20,pH 6.3)置换12-15倍体积,控制最终浓缩液总体积为1-1.5L。按照设定体积加入终浓度94.5g/L海藻糖(二水)搅拌溶解,调节pH至6.3±0.1,最后用置换液III(5.488g/L柠檬酸钠(二水)、0.281g/L柠檬酸(一水)、0.4g/L聚山梨酯20,pH 6.3)补齐至设定体积。
9、除菌过滤
将步骤8得到的超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤器过滤于无菌PE瓶(Nalgene)中即为原液。于-70±10℃避光密封保存,有效期暂定为24个月。
六、重组融合蛋白CE的鉴定
1、步骤五最后纯化的重组融合蛋白CE的N端15个氨基酸分析结果为MAEMKTDAATLAQEA,与设计的重组融合蛋白CE(SEQ ID No.2所示的蛋白)N端的15个氨基酸序列完全一致。
2、纯化的重组融合蛋白CE的质谱测定分子量为21035Da,与理论计算的分子量21035Da(SEQ ID No.2所示的蛋白的分子量)非常接近。