CN102597221B - 使用化学品的游离重编程 - Google Patents

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Abstract

公开了用于诱导多能干细胞的方法和组合物。例如，在一些方面，描述了使用细胞信号传导调节子产生基本上不含载体的诱导的多能干细胞的方法。此外，本发明的一些方面提供了包含基本上不含异源逆转录病毒载体元件的诱导的多能干细胞、存在包含信号传导抑制剂的培养基的新的组合物。在一些方面，可以提供无饲养物的游离重编程方法。

Description

使用化学品的游离重编程
发明背景
本申请要求2009年11月4日提交的美国临时申请号61/258,120的优先权权益，其全部内容通过引用方式并入本文。
1.发明领域
本发明总体上涉及干细胞发育的领域。更具体地，其涉及多能干细胞的产生。
2.相关领域描述
人胚胎干（ES）细胞的无限增殖能力和多能潜力已经提供了对于人体的所有细胞类型的空前的可获得性。具有需要的遗传背景的、直接源自患者体细胞的人诱导的多能干（iPS）细胞具有人ES细胞的这两项重要特性，这使得这些细胞成为疾病模型、药物筛选、毒性测试和移植治疗的优良候选物。最初的人iPS细胞的衍生利用了基因组整合型逆转录病毒或慢病毒载体以递送重编程转基因(Lowry等人,2008;Park等人,2008;Takahashi等人,2007;Yu等人,2007)。此类载体可能产生***突变和残余转基因表达，***突变会干扰人iPS细胞及其衍生物的正常功能，残余转基因表达会影响向特定谱系的分化(Yu等人,2007)，或甚至导致肿瘤形成(Okita等人,2007)。
已经使用重复的质粒转染从小鼠胚胎成纤维细胞(Okita等人,2008)、使用非整合型腺病毒载体从小鼠肝细胞和人成纤维细胞(Stadtfeld等人,2008;Zhou and Freed,2009)、使用附连的（piggyback）转座子从体细胞(Woltjen等人,2009)、使用基于oriP/EBNA-1的游离载体从人成纤维细胞(Yu等人,2009)和蛋白质转导衍生了不含异源遗传元件的iPS细胞。虽然有这些迅速的进展，但是仍然存在大的障碍，阻止了产生高质量的不含异源遗传元件的人iPS细胞的任何单一技术的广泛应用。例如，所有目前的允许产生不含异源遗传元件的人iPS细胞的技术（除了附连的转位子方法以外）都具有非常低的重编程效率。这种低效率使得难以从多种可容易获得的人类体细胞类型持续获得、以及从具有不同遗传背景和供体年龄的细胞持续获得iPS细胞。附连的转位子方法提供了适宜的重编程效率。然而，当涉及很多供体细胞系时，从iPS细胞中除掉转位子会是相当费力的。
此外，虽然人iPS细胞与人ES细胞有高度相似性，但是，在人iPS细胞的基因表达/表观遗传学修饰和谱系特异性分化潜力上存在显著的克隆与克隆间的差异。特别地，与人ES细胞相比，多数人iPS细胞显示出显著较低的神经分化潜力，并且对于LIF（白血病抑制因子）无应答，LIF常规地支持小鼠ES细胞培养。此外，由于缺乏针对高质量人iPS细胞的良好的容易检验的标志物，高质量的人iPS细胞克隆的选择可能是费时费力的。
人类体细胞遗传重编程为诱导的多能干细胞(iPSC)可以提供用于移植治疗的可更新的细胞来源。为了实现它们的前途，理想的是，在不含饲养细胞、不含异源DNA(无印迹)的化学上确定的培养基中衍生并培养人iPSC。目前，没有用于产生无印迹的人iPSC的简单和有效的无饲养物的非病毒方法。之前的通过使用游离载体递送转基因而产生无印迹的人iPSC的尝试是低效率的，并且需要饲养细胞。
因此，需要解决在制备基本上不含异源遗传成分的诱导的多能干细胞时的效率低下的问题或其它问题。
发明内容
本发明的方面通过提供用于制备基本上不含异源载体元件的诱导的多能干细胞的新方法而客服了本领域中的主要缺陷，并由此提供了iPS细胞应用上的特别优点。
另外，使用小分子，本发明的某些示例性方面大大改进了游离重编程效率（>70倍；如果使用转化缺陷型MYC例如LMYC，则>300倍），并使用化学上确定的培养基建立了无饲养物的重编程条件，用于衍生无印迹的人iPSC。这些改进使得能够从皮肤成纤维细胞以及很多其它细胞类型常规衍生无痕迹的人iPSC，因此使得该技术容易地适用于临床级别的人iPSC的生产。
因此，在第一个实施方式中，提供了包含iPS细胞的群体和培养基的组合物，所述iPS细胞基本上不含异源逆转录病毒元件，所述培养基包含外部添加的信号传导抑制剂。在一些方面，这些iPS细胞可以实质上不含，或优选地，基本上不含异源载体或遗传元件。例如，这些iPS细胞可以衍生自一种或多种人类细胞。在另一个方面，该群体的细胞可以包含选择的人类个体例如人类患者的基因组。
在一些方面，所述人类细胞是原代人类细胞，其是从活体人类受试者直接获得的细胞，并且可以排除建立的或永生化的细胞系的使用。一些实施方式可以包括使用末端分化的人类细胞。原代人类细胞的非限制性实例包括成纤维细胞、角化细胞、造血细胞、间充质细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、肝细胞、肾细胞、皮肤细胞、消化道细胞、卵丘细胞、腺细胞或胰岛细胞。更具体地，原代人类细胞可以是造血祖细胞，例如CD34+细胞。原代人类细胞可以获自血液样品、毛发样品、皮肤样品或本领域普通技术人员已知的任何来源。
所述信号传导抑制剂可以是选自下列的一种或多种：糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂，有丝***原激活的蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂，转化生长因子β(TGF-β)受体抑制剂，白血病抑制因子(LIF)，以及它们的组合。特别地，所述组合物包含细胞群体和下列的组合：GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂和可选地LIF。所述培养基可以进一步包含外部添加的ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂。所述ROCK抑制剂可以是HA-100。所述培养基可以进一步包含外部添加的FGF。在一些方面，所述组合物可以进一步包含化学上确定的培养基。化学上确定的培养基的非限制性实例包括TeSR培养基、人胚胎细胞培养基、N2B27培养基以及它们的衍生物。
所述组合物还可以包含基质成分以替代饲养细胞，以支持细胞群体的培养。用于细胞粘附的基质成分可以是任何用于使干细胞或饲养细胞（如果使用）附着的物质。基质成分的非限制性实例包括胶原、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白以及它们的混合物，例如，MatrigelTM和裂解的细胞膜制剂。
在一些实施方式中，本发明涉及用于产生iPS细胞群体的方法，包括：a）获得包含表达一种或多种重编程因子的染色体外遗传元件的体细胞；和b）在重编程条件下培养所述体细胞和/或其子代细胞，所述重编程条件包括外部添加的一种或多种信号传导抑制剂，例如GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、和/或TGF-β受体抑制剂，从而产生iPS细胞的群体。在一些方面，重编程培养基可以包含下列的组合：GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂和可选地LIF。
在其它方面，重编程条件可以基本上不含饲养细胞，例如经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞。重编程条件可以包括基质成分，例如MatrigelTM。
所述体细胞可以是人类细胞或原代细胞，例如原代人细胞。体细胞的实例可以包括但不限于：成纤维细胞、角化细胞、造血细胞、间充质细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、肝细胞、肾细胞、皮肤细胞、消化道细胞、卵丘细胞、腺细胞、胰岛细胞。造血细胞可以包括任何血液细胞，例如造血祖细胞(例如CD34+细胞)、T细胞、B细胞，或它们的组合。
在一些方面，所述染色体外遗传元件可以进一步定义为游离载体。例如，游离载体可以包括复制起始点和一种或多种用于表达重编程因子的表达盒。此类一种或多种表达盒可以进一步包含编码反式作用因子的核苷酸序列，所述反式作用因子结合至复制起始点以复制染色体外的模板。备选地，体细胞可以表达此类反式作用因子。染色体外遗传元件可以是任何遗传物质或核酸，例如DNA或RNA。
此类游离载体可以基本上不含细菌元件。所述细菌元件可以是质粒在细菌中复制所需的载体骨架成分，例如细菌的复制起始点，例如pUC复制起始点，和细菌选择盒，例如氨比西林选择盒。
在示例性实施方式中，复制起始点可以是淋巴营养疱疹病毒或γ疱疹病毒、腺病毒、SV40、牛***瘤病毒或酵母的复制起始点，例如对应于EBV的oriP的淋巴营养疱疹病毒或γ疱疹病毒的复制起始点。在其它方面，淋巴营养疱疹病毒可以是EB病毒(EBV),卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV),松鼠猴疱疹病毒(HS)或马立克氏病病毒(MDV)。
对于染色体外遗传元件的复制和短暂维持，所述反式作用因子可以是对应于EBV的EBNA-1(EBV核抗原1)的野生型蛋白的多肽或EBV的EBNA-1(EBV核抗原1)的野生型蛋白的衍生物，优选是在存在对应于EBV的OriP的复制起始点的情况下。相对于野生型EBNA-1，所述衍生物可以具有降低的从整合的模板激活转录的能力，并因此具有降低的异位激活染色体基因以引起致癌转化的机会。同时，在衍生物结合复制起始点之后，衍生物可以激活至少为对应的野生型蛋白的5%的从染色体外的模板的转录。
对于体细胞的重编程，本方法的一些方面可以包括使用重编程因子，所述重编程因子可以包括选自下列的一种或多种：Sox,Oct,Nanog,Lin-28,Klf4,c-Myc和SV40LT，例如，“Sox,Oct,Nanog和可选的Lin-28”的组，“Sox,Oct,Klf4和可选的c-Myc”的组，或这6种因子的组合。在一些方面，为了降低c-Myc表达带来的可能的毒性效应，可以包括c-Myc与SV40大T基因(SV40LT)。在一些方面，为了进一步改善重编程效率，可以使用转化缺陷型Myc突变体、变体或同源物。非限制性实例包括Myc原癌基因家族成员，例如LMYC(NM_001033081),在N末端具有41个氨基酸删除的MYC(dN2MYC)或在136位氨基酸具有突变的MYC(W136E)(Nakagawa等人2010)。
在一些方面，可以在重编程条件下培养细胞至少或大约1,2,3,4,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20天，或其中的任意范围，所述重编程条件具有包含如上所述的信号传导抑制剂的重编程培养基。在将染色体外元件导入体细胞之后，重编程条件可以持续至少大约1天至5天的时间段。起始和终止时间点可以选自导入之后的1,2,3,4,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20天，或其中的任意范围，例如在遗传元件转染之后大约1天至15天。
重编程之后，可以将细胞转移至具有扩增培养基的扩增条件。扩增培养基可以基本上不含外部添加的GSK-3抑制剂、MEK抑制剂和TGF-β受体抑制剂。在一些方面，扩增培养基可以具有一种或多种信号传导抑制剂和/或LIF。在一些方面，通过使用该扩增条件，例如，正常的ES细胞培养基或TeSR培养基，可以获得类似于人ES细胞的人iPS细胞。
在一些方面，所述方法可以进一步包括选择iPS细胞，例如，基于一种或多种胚胎细胞特性，例如ES细胞样形态学。在其它方面，所述方法可以包括在扩增培养基中培养所选择的iPS细胞。
作为另外的优点，本文描述的培养条件，例如重编程条件或扩增条件，可以基本上不含饲养细胞。无饲养物的条件可以通过降低来自饲养细胞的差异性和副作用而改善工业和治疗应用。例如，可以使用基质成分替代饲养细胞。为了增加无饲养物条件下的游离重编程，可以向重编程培养基中加入信号传导抑制剂和/或FGF。
为了增加多能干细胞的克隆效率，重编程培养基、第一或第二扩增培养基可以进一步包含Rho相关激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白II抑制剂，例如HA-100或blebbistatin。为了进一步有利于游离重编程和/或增强经重编程的细胞的增殖，在一些方面，可以向重编程培养基中加入成纤维细胞生长因子（FGF）。外部添加的FGF或信号传导抑制剂可以是下列数量：至少、大约或至多0.1,1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,90,100,150,200ng/ml,至少、大约或至多0.05,0.1,0.2,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.5,2,2.5,3,4,5,6,7,8,9,10μM,或其中的任意范围，或有效改善游离重编程的任何浓度。在具体的实施方式中，可以使用高浓度的FGF，例如，大约40至200ng/ml，或更特别地，大约100ng/ml。
在一些方面，重编程培养基或扩增培养基可以是化学上确定的，例如TeSR培养基、人胚胎细胞培养基或N2B27培养基。在一些方面，重编程培养基可以是基本上不含TGFβ的培养基，例如N2B27培养基。扩增培养基可以是TeSR培养基或mTeSR培养基。
例如，GSK-3抑制剂可以是CHIR99021；MEK抑制剂可以是PD0325901；TGF-β受体抑制剂可以是A-83-01。还可以提供根据以上方法产生的iPS细胞的群体。
在一些方面，用于本方法的起始细胞可以包含至少或大约104,105,106,107,108,109,1010,1011,1012,1013个细胞或其中的任意范围。起始细胞群体可以具有至少或大约10,101,102,103,104,105,106,107,108个细胞/ml或其中任意范围的接种密度。
在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方式可以通过其中描述的任何其它方法或组合物实施。因此，涉及一种方法或组合物的实施方式也可以适用于本发明的其它方法和组合物。
就核酸而言，如本文使用的术语“编码”用于使本发明容易被技术人员理解；然而，这些术语可以与“包含”相互替代地使用。
如本文说明书中所使用的"一种(a)"或"一种(an)"可以意指一种或多种。如本文权利要求中与词语“包含”联合使用的词语"一种(a)"或"一种(an)"可以意指一种或一种以上。
除非明确指明是仅指备选物或者备选物相互排斥，否则权利要求中的术语“或”的使用是意指“和/或”，虽然本公开支持仅指替代和“和/或”的定义。如本文使用的“另一种”可以意指至少第二种或更多种。
在本申请通篇中，术语“大约”用于指某数值包括仪器误差、用于测定该数值的方法或存在于研究受试者中的差异的内在差异。
本发明的其它客体、特征和优点将通过以下详细描述而变得明显。然而，应该理解，虽然指明了本发明的优选实施方式，但是详细描述和具体实施方式仅是通过示例性方式给出，因为本发明的精神和范围内的多种变化和修饰将对于阅读了本详细描述的本领域技术人员变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，包括了它们是为了进一步说明本发明的一些方面。可以通过参考这些附图中的一个或多个以及本文给出的具体实施方式的详细描述而更好地理解本发明。
图1A-1C.使用小的化合物改善人***成纤维细胞的游离重编 程。图1A：游离重编程载体。pEF:真核延伸因子1α启动子；pCMV:巨细胞病毒立即早期启动子。载体的转基因和其它特征通过不同的颜色来表示，如图所示。图1B：化合物的不同组合对于游离重编程效率的影响。FF培养基：人***成纤维细胞培养基；CM：先前以经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞条件化的人ES细胞培养基。以100ng/ml的终浓度使用bFGF。B:BIX01294(1μM);P:PD0325901(0.5μM);C:CHIR99021(3μM);A:A-83-01(0.5μM)。总的(Total):碱性磷酸酶阳性的iPS细胞集落的总数目；大的(Large):大尺寸的好的未分化的碱性磷酸酶阳性的iPS细胞集落的数目。图1C：在存在化合物的情况下通过游离重编程获得的良好的iPS细胞集落的图像。左侧：亮视野；右侧：碱性磷酸酶染色。
图2A-2B.使用小的化合物改善人***成纤维细胞的游离重编 程。图2A：bFGF和不同组合的化合物对于游离重编程效率的影响。FF培养基：人***成纤维细胞培养基；CM：先前以经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞条件化的人ES细胞培养基。以100ng/ml的终浓度使用bFGF。H:HA-100(10μM);B:BIX01294(1μM);P:PD0325901(0.5μM);C:CHIR99021(3μM);A:A-83-01(0.5μM);L:hLIF(10ng/ml)。总的(Total):碱性磷酸酶阳性的iPS细胞集落的总数目；大的(Large):大尺寸的好的未分化的碱性磷酸酶阳性的iPS细胞集落的数目。图2B：对于游离重编程效率，化合物处理的时机选择。在重编程培养物中使用补充了bFGF(100ng/ml)和HA-100(10μM)的CM。
图3A-3D.可以从经化合物处理的游离重编程培养物获得不同的 iPS细胞。图3A：在补充了PD0325901(0.5μM),CHIR99021(3μM),A-83-01(0.5μM)和hLIF(10ng/ml)的CM(先前以经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞条件化的人ES细胞培养基)中培养5天之后，分化的人H1ES细胞（p44）和正常的人ES细胞样iPS细胞（p20，在不存在化学处理的情况下，通过游离重编程从人***成纤维细胞衍生）的图像。图3B：在存在PD0325901(0.5μM),CHIR99021(3μM)和A-83-01(0.5μM)的情况下通过游离重编程从42岁的成人皮肤活组织衍生的正常的人ES细胞样iPS细胞的亮视野图像。在挑取集落之前的3天（核转染后第23天）除去化合物。挑取iPS细胞集落并在补充了bFGF(100ng/ml)、不存在化合物的人ES细胞培养基中的经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞上扩增。图3C：在存在PD0325901(0.5μM),CHIR99021(3μM),A-83-01(0.5μM)和hLIF(10ng/ml)的情况下，通过游离重编程从人***成纤维细胞衍生的iPS细胞的中期（piPSC表示部分重编程的iPSC）的亮视野图像。在重编程培养物中始终存在化合物。挑取piPS细胞集落并在补充了PD0325901(0.5μM),CHIR99021(3μM),A-83-01(0.5μM)和hLIF(10ng/ml)的CM中的MEF饲养细胞上扩增。图3D：在除去化合物之后，来自于在补充了bFGF(100ng/ml)人ES细胞培养基中培养的piPS细胞的花结簇(rosette cluster)(神经分化)的亮视野图像。
图4A-4B.补充了化合物的确定的培养基中的游离重编程。图4A：在存在PD0325901(0.5μM),CHIR99021(3μM),A-83-01(0.5μM)和hLIF(10ng/ml)的情况下，不同的培养基对于游离重编程的影响。FF培养基：人***成纤维细胞培养基；CM：先前以经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞条件化的人ES细胞培养基。以100ng/ml的终浓度使用bFGF。H:HA-100(10μM);B:BIX01294(1μM);P:PD0325901(0.5μM);C:CHIR99021(3μM);A:A-83-01(0.5μM);L:hLIF(10ng/ml)。总的(Total):碱性磷酸酶阳性的iPS细胞集落的总数目；大的(Large):大尺寸的好的未分化的碱性磷酸酶阳性的iPS细胞集落的数目。图4B：用于衍生正常人ES细胞样iPS细胞和piPS细胞的三步重编程方法的略图。
图5A-5C.使用小分子改善游离重编程效率。图5A：PD0325901(P,0.5μM),CHIR99021(C,3μM),A-83-01(A,0.5μM),hLIF(L,1000U/ml)和HA-100(H,10μM)对于游离重编程的影响。图5B：用于改善游离重编程的小分子处理的时间上的要求。将经转染的人***成纤维细胞铺板至MEF饲养细胞。使用补充了100ng/ml bFGF(CM100)和小分子的MEF条件化的人ESC培养基来支持重编程。在转染后第22-23天计数碱性磷酸酶阳性的iPSC集落。iPSC集落的数目是~0.33x106个输入细胞。数据表示为平均值±标准误差(s.e.m.)(n=3)。图5C：在存在小分子的情况下，新衍生的iPSC的分化(p3)。当挑取并在补充了小分子的人ESC培养基或MEF条件化的人ESC培养基中在MEF饲养细胞上扩增时，在持续存在小分子的情况下衍生的iPSC显示出广泛分化。在培养基中加入bFGF无效应。黑色箭头：未分化的iPSC集落；白色箭头：分化的集落。比例尺：100μm。
图6A-6D.开发用于游离重编程的无饲养物的条件。图6A：MEF饲养细胞、MatrigelTM和培养基对于游离重编程的影响。将经转染的人***成纤维细胞(p6)铺板于接种了MEF饲养细胞的或涂覆了MatrigelTM的10-cm培养皿，并使其经历不同的重编程培养条件。在转染后第18-21天计数碱性磷酸酶阳性(AP+)集落。AP+集落的数目是~0.33x 106个输入细胞。数据表示为平均值±标准误差(s.e.m.)(n=3)。N2B27：补充了N-2和B-27的DMEM/F12培养基；N2B27-100：补充了100ng/ml bFGF的N2B27培养基。*标示出了piPSCs。图6B：来自测试2的piPSC集落和来自测试1、3和4的人ESC样iPSC集落的亮视野图像。比例尺：100μm。图6C：piPSC克隆1至4(p3)中的OCT4和NANOG的表达的定量RT-PCR分析。总的(Total)：内源性和转基因表达二者。人H1ESC(H1ESC,p32)用作对照。数据表示为平均值±s.e.m.(n=3)。图6D：使用确定的培养基，以小分子处理对于无饲养物的游离重编程的时间上的要求。将经转染的人***成纤维细胞(p7)铺板至涂覆了MatrigelTM的10-cm培养皿。使用补充了PCALH的N2B27-100培养基来支持重编程，持续不同的时间段(阶段2)，然后使用mTeSR1进行扩增。在转染后第22天计数碱性磷酸酶阳性的iPSC集落。iPSC集落的数目是~0.33x 106个输入细胞。数据表示为平均值±标准误差(s.e.m.)(n=3)。
图7A-7F.在无饲养物的条件下使用确定的培养基衍生的iPSC 的表征。图7A：衍生自成人皮肤成纤维细胞的iPSC的亮视野图像(iPS(SK46)克隆2)。比例尺：100μm.图7B：iPS(SK46)克隆2(p17)的G带染色体分析。图7C：iPSC中的重编程载体的PCR分析。E:游离DNA;G:基因组DNA;NF:新生儿***成纤维细胞(p5);iPSF7克隆1至3:衍生自新生儿***成纤维细胞的iPSC(p26);AF:成人皮肤成纤维细胞(p6);iPS(SK46)克隆1至3:衍生自成人皮肤成纤维细胞的iPSC(p22)。衍生自人***成纤维细胞的piPSC(p4)用作对照。T-OCT4:转基因OCT4;T-SOX2:转基因SOX2;T-NANOG:转基因NANOG；T-LIN28:转基因LIN28;T-c-MYC:转基因c-MYC；T1-KLF4:转基因KLF4(1);T2-KLF4:转基因KLF4(2);T-SV40LT:转基因SV40LT；OCT4:内源性OCT4。对于所有的引物组，使用32个PCR循环。图7D：iPSC克隆中的内源性OCT4,NANOG,SOX2和LIN28表达的定量RT-PCR分析。数据表示为平均值±s.e.m.(n=3)。图7E：iPSC克隆中的OCT4和NANOG启动子的甲基化状态的亚硫酸氢盐测序分析。空心圆圈代表未甲基化的，实心圆圈代表甲基化的CpG二核苷酸。图7F：iPSC(SK46)克隆2的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色。从所有的iPSC克隆获取畸胎瘤。左侧图板：神经组织(外胚层)；中间的图板：软骨(中胚层)；右侧图板：肠上皮(内胚层)。比例尺：100μm。
图8A-8C.不同的游离重编程载体组合对于在存在小分子的情 况下从不同的体细胞类型衍生iPSC的影响。图8A：使用游离载体重编程人***成纤维细胞。将经转染的人***成纤维细胞(HFF,p6)铺板于涂覆了MatrigelTM的10-cm培养皿中的***成纤维细胞培养基中。在转染后第1至第13天，使用补充了PD0325901(P,0.5μM),CHIR99021(C,3μM),A-83-01(A,0.5μM),hLIF(L,1000U/ml)和HA-100(H,10μM)(PCALH)的N2B27-100培养基来支持重编程，然后，在转染后第14天至第21天，使用mTeSR1。iPSC集落的数目是~0.33x106个输入细胞。数据表示为平均值±标准误差(s.e.m.)(n=3)。7F-1(pEP4EO2SCK2MEN2L和pEP4EO2SET2K);7F-2(pEP4EO2SEN2K,pCEP4-M2L和pEP4EO2SET2K);5F(pEP4EO2SEN2L和pEP4EO2SET2N)。所有的载体图谱显示于图12。图8B：使用游离载体重编程衍生自脂肪组织的干细胞(AdSC)。在补充了1xGlutamax(Invitrogen)的培养基(STEMCELL Technologies Inc.,Vancouver,BC,V5Z 1B3,Canada)中在涂覆了人I型胶原(60μg/10-cm培养皿,STEMCELLTechnologies Inc.)和纤连蛋白(18μg/10-cm培养皿,Invitrogen)的10-cm培养皿中培养AdSC(Zenbio,Research Triangle Park,NC)。将经转染的AdSC(p9,Amaxa VPE-1001，使用程序A-33)铺板于涂覆了MatrigelTM的10-cm培养皿中的AdSC培养基中。在转染后第2至第13天使用补充了PCALH的N2B27-100培养基来支持重编程，然后在转染后第13天至第21天，使用mTeSR1。iPSC集落的数目是~0.35x106个输入细胞。数据表示为平均值±标准误差(s.e.m.)(n=2)。图8C：使用游离载体重编程衍生自脐带血(CB)的CD34+细胞。在转染之前，在涂覆了纤连蛋白的6孔板中在CB CD34+细胞扩增培养基中培养衍生自CB的CD34+细胞(STEMCELL Technologies Inc.)4天，所述CB CD34+细胞扩增培养基为：补充了下列的StemSpan SFEM(STEMCELL Technologies Inc.)：1x ExCyte培养基补充物(Millipore,Billerica,MA),1xGlutamax,250ng/ml SCF(Peprotech,Rocky Hill,NJ),250ng/ml FLT3L(Peprotech),100ng/ml TPO(Peprotech),20ng/ml IL-3(Peprotech),50ng/ml IL-6(Peprotech)和10ng/ml sIL6-R(Peprotech)。将经转染的CB细胞(Amaxa VPA-1003，使用程序T-16)铺板于涂覆了纤连蛋白/MatrigelTM的6孔板中的CB CD34+细胞扩增培养基中。在转染后第2至第11天使用补充了PCALH的N2B27-100培养基来支持重编程，然后在转染后第11天至第17天，使用mTeSR1。iPSC集落的数目是~0.33x106个输入细胞(培养4天之后)。数据表示为平均值±标准误差(s.e.m.)(s.e.m.)(n=3)。
图9.在存在小分子的情况下使用转化缺陷型MYC的改善的游离 重编程。使用游离载体组合7F-2来进行iPSC衍生。将载体pCEP4-M2L中的c-Myc替换为转化缺陷型MYC：LMYC(NM_001033081)、在N末端具有41个氨基酸删除的MYC(dN2MYC)或在136位氨基酸具有突变的MYC(W136E)(Nakagawa等人,2010)。将经转染的人***成纤维细胞(HFF,p9)铺板于涂覆了MatrigelTM的10-cm培养皿中的***成纤维细胞培养基。在转染后第2天至第13天使用补充了PD0325901(P,0.5μM),CHIR99021(C,3μM),A-83-01(A,0.5μM),hLIF(L,1000U/ml)和HA-100(H,10μM)(PCALH)的N2B27-100培养基来支持重编程，然后在转染后第14至20天使用mTeSR1。iPSC集落的数目是~0.33x106个输入细胞。数据显示为平均值±标准误差(s.e.m.)(n=3)。
图10A-10C.开发用于游离重编程的无饲养物的条件。图10A：piPSCs(p6)中的人ESC特异性细胞表面标志物(SSEA-3,SSEA-4,Tra-1-60和Tra-1-81)以及成纤维细胞标志物CD44的流式细胞术表达分析。未填充的图：同种型对照；填充的图：抗原染色。图10B：分离自piPSCs(p7)的游离DNA中的重编程载体的PCR分析。泳道1：转基因OCT4(T-OCT4);泳道2:转基因NANOG(T-NANOG);泳道3:转基因KLF4(1)(T1-KLF4);泳道4:转基因KLF4(2)(T2-KLF4);泳道5:转基因SV40LT(T-SV40LT);泳道6:转基因SOX2(T-SOX2);泳道7:转基因LIN28(T-LIN28);泳道8:转基因c-MYC(T-c-MYC);泳道9:内源性OCT4(OCT4)。图10C：以小分子处理对于无饲养物的游离重编程(使用mTeSR1)的时间上的要求。将经转染的人***成纤维细胞(p7)铺板于涂覆了MatrigelTM的10-cm培养皿中。使用补充了小分子(PCALH)的mTeSR1来支持重编程，持续不同的时间段(阶段2)，然后使用不含小分子的mTeSR1进行扩增。在转染后第22天计数碱性磷酸酶阳性的iPSC集落。iPSC集落的数目是~0.33x106个输入细胞。数据表示为平均值±s.e.m.(n=3)。
图11A-11E.使用确定的培养基在无饲养物的条件下衍生的 iPSC的表征。图11A：衍生自人***成纤维细胞的iPSC(iPSF7克隆1)的亮视野图像。比例尺：100μm。图11B：iPSF7克隆1(p18)的G带染色体分析。图11C：iPSC克隆中的转基因表达的RT-PCR分析。NF:新生儿***成纤维细胞(p5);iPSF7克隆1至3:衍生自新生儿***成纤维细胞的iPSC(p26);AF:成人皮肤成纤维细胞(p6);iPS(SK46)克隆1至3:衍生自成人皮肤成纤维细胞的iPSC(p22)。衍生自人***成纤维细胞的H1ESC(p32)和piPSC(p4)用作对照。T-OCT4:转基因OCT4;T-SOX2:转基因SOX2;T-NANOG:转基因NANOG;T-LIN28:转基因LIN28;T-c-MYC:转基因c-MYC;T1-KLF4:转基因KLF4(1);T2-KLF4:转基因KLF4(2);T-SV40LT:转基因SV40LT;OCT4:内源性OCT4;GAPDH:内源性对照。除了T-OCT4之外(30个循环)，对于所有的引物组，使用32个PCR循环。图11D.人ESC特异性细胞表面标志物(SSEA-3,SSEA-4,Tra-1-60和Tra-1-81)和成纤维细胞富集标志物CD44的流式细胞术表达分析。未填充的图：同种型对照；填充的图：抗原染色。图11E：iPSF7克隆1的畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色。上面的图板：神经组织(外胚层)；中间的图板：软骨(中胚层)；下面的图板：肠上皮(内胚层)。比例尺：100μm。
图12.游离重编程载体。游离重编程载体的遗传成分的详述。pEF:真核延伸因子1α启动子；pCMV:巨细胞病毒立即早期启动子；IRES2:内部核糖体进入位点；SV40pA:猴空泡病毒40多腺苷化信号；oriP:EBV复制起始点；EBNA-1:EBV核抗原1；Amp:氨比西林细菌抗性选择盒；pUC起始点：细菌的复制起始点；Oct4:octamer4转录因子；Sox2:Sox2转录因子；c-Myc:c-Myc转录因子；Klf4:Kreuppel样因子转录调节子；SV40LT:SV40大T基因；Nanog:NANOG转录因子；Lin28:Lin28mRNA结合蛋白。
发明详述
I.简介
本发明部分地基于以下发现：通过在存在GSK-3抑制剂、MEK抑制剂和TGF-β抑制剂的情况下培养重编程的细胞，细胞内信号传导抑制剂可用于改善游离重编程效率和动力学。虽然已经报道了使用包含MEK抑制剂和TGF-β受体抑制剂的化学品混合物改善人成纤维细胞的逆转录病毒重编程(Lin等人,2009)，但是逆转录病毒(包括慢病毒)重编程与游离重编程是根本上不同的，因为逆转录病毒载体元件整合进入基因组，整合的载体元件持续转基因表达。例如，如实施例中所证明，相对于存在MEK抑制剂和TGF-β受体抑制剂的情况(相对于基线仅具有极小的增强)，在存在这三种抑制剂的组合的情况下的游离重编程产生了预料不到的高的重编程效率。
相对于整合进入基因组的载体，在本发明的一些方面中使用游离载体具有数个优点。第一，其降低了由于随机整合进入DNA而造成的非相关表型变化的背景。第二，游离体降低了***诱变的可能性，***诱变可能导致肿瘤形成。第三，游离载体的复制可以导致异源载体元件的逐渐丧失，这为细胞留下最小化的异源遗传修饰。然而，低的重编程效率阻碍了游离载体在重编程体细胞中的应用，这可以通过本发明的一些方面获得解决。
在其它方面，开发了产生具有改善的工业和临床应用的iPS细胞的方法。该方法可以包括使用无饲养物的条件来产生基本上不含异源遗传元件的iPS细胞，从而避免了由于异源遗传元件的持续性或诱变性效应和饲养细胞的差异性或不想要的效应而带来的问题。
以下也描述了用于产生iPS细胞群体的组合物和方法的其它进展。
II.定义
如本文使用的“原代细胞”是指从活生物体或其子代直接获得的、不建立或永生化为细胞系的细胞。“人原代细胞”是指获自活的人类受试者的原代细胞。
“胚胎干(ES)细胞”是源自早期胚胎的多能干细胞。ES细胞最初在1981年建立，从1989年开始，其已被用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人ES细胞，其目前正在逐渐用于再生医学。
“诱导的多能干细胞”，通常简写为iPS细胞或iPSC，是指从非多能细胞、通常为成年体细胞或末端分化的细胞、例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、上皮细胞等通过重编程而人工制备的多能干细胞。
“多能性”是指具有分化为构成一种或多种组织或器官或优选三个胚层的任意项的所有细胞的潜力的干细胞，所述三个胚层为：内胚层（胃内壁、胃肠道、肺）、中胚层（肌肉、骨、血液、泌尿和生殖***）或外胚层（上皮组织和神经***）。本文使用的“多能干细胞”是指能够分化为衍生自三个胚层的任意项的细胞的细胞，例如，全能细胞的直接后代、胚胎干细胞或诱导的多能细胞。
如本文使用的术语“体细胞”是指除了生殖细胞（例如卵、***等）之外的任意细胞，其不将其DNA直接传至下一代。通常而言，体细胞具有有限的或无多能性。本文使用的体细胞可以是天然产生的或遗传修饰的。
“重编程”是这样的过程：相对于在相同条件下无重编程而言，其赋予细胞可测的增强的形成至少一种新细胞类型的子代的能力，可以在培养物中或在体内。更具体地，重编程是这样的过程：其赋予体细胞多能潜力。这意味着：如果在重编程之前基本上不形成具有新细胞类型特征性表型的子代的话，在足够的增殖之后有可测的比例的此类子代；或者，具有新细胞类型特征性表型的比例可测地大于重编程之前。在一定条件下，具有新细胞类型特征的子代的比例可以是至少大约0.05%,0.1%,0.5%,1%,5%,25%或更高，越高越优选。
如本文所使用，当细胞具有小于10%的异源遗传元件或载体元件时，细胞为“实质上不含”所述元件；当细胞具有小于1%的异源遗传元件或载体元件时，细胞为“基本上上不含”所述元件。然而，更理想的是这样的细胞群体：其中小于0.5%或小于0.1%的总细胞群体包含异源遗传元件或载体元件。当介质具有低于可检测水平(使用本领域普通技术人员已知的常规检测方法)的某些试剂时(例如MEK抑制剂、GSK抑制剂、TGF-β受体抑制剂、LIF)，介质“基本上不含”这些试剂。
当与细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸、多核苷酸、遗传元件或载体元件相关联使用时，术语“异源”是指通过人工或天然方式被导入细胞或生物体的蛋白、基因、核酸、多核苷酸、遗传元件或载体元件；或者，与细胞相关时，是指被分离、随后通过人工或天然方式被导入其它细胞或导入生物体的细胞。异源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者其可以是天然存在于生物体或细胞中的核酸的一个或多个另外的拷贝。异源细胞可以来自不同的生物体，或者可以来自相同的生物体。通过非限制性举例而言，异源核酸在不同于天然细胞中的染色***置的位置，或者其两翼为不同于天然状态下的核酸序列。
"复制起始点"("ori")或“复制起点”是这样的DNA序列：例如，在淋巴营养疱疹病毒中，当存在于细胞中的质粒中时，能够将所连接的序列维持在质粒中，和/或DNA合成起始的位点处或附近。EBV的ori包括FR序列(30bp重复序列的20个不完美拷贝)和优选地包括DS序列；然而，EBV中的其它位点结合EBNA-1，例如Rep*序列能够取代DS，作为复制起始点(Kirchmaier and Sugden,1998)。因此，EBV的复制起始点包括FR,DS或Rep*序列或通过核酸修饰而产生的任何功能等同序列或源自其中的合成组合。例如，本发明也可以使用EBV的遗传工程化的复制起始点，例如通过***单一元件或单一元件的突变而产生的，如Lindner等人(2008)中所具体描述。
“淋巴营养”疱疹病毒是在成淋巴细胞(例如人B成淋巴细胞)或其它细胞类型中复制并在其天然生命周期的至少一部分中在染色体外复制的疱疹病毒。感染宿主之后，这些病毒通过维持其病毒基因组为质粒而潜伏地感染宿主。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养”疱疹病毒。示例性的淋巴营养疱疹病毒包括但不限于：EBV、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV),松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。
“载体”或“构建体”（有时称作基因递送或基因转移“媒介”）是指包含待向宿主细胞递送（体外或体内）的多核苷酸的大分子或分子复合物。
“质粒”是常见的载体类型，其是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA而复制。在一些情况下，其是环形的和双链的。
如本文使用的“模板”是包含复制起始点的DNA或RNA分子。“整合的模板”是稳定维持在细胞基因组中的模板，例如整合进入该细胞的染色体。“染色体外模板”是稳定维持在细胞内但是不整合进入染色体的模板。
“表达构建体”或“表达盒”意指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括启动子或功能上等同于启动子的结构。还可以包括另外的元件，例如增强子，和/或转录终止信号。核酸分子可以是DNA或RNA。
术语“对应于”在本文中意指多核苷酸序列对于参考多核酸序列的全部或一部分而言是同源的（即，是相同的，非严格的进化上相关），或者，多肽序列与参考多肽序列是相同的。与此不同，术语“互补于”在本文中用于指互补序列对于参考多核酸序列的全部或一部分而言是互补的。举例而言，核苷酸序列"TATAC"对应于参考序列"TATAC"，互补于参考序列"GTATA"。
III.iPS细胞
诱导的多能干细胞，通常简写为iPS细胞或iPSC，是一类从非多能细胞、通常为成年体细胞人工衍生而来的多能干细胞。相信诱导的多能干细胞与天然多能干细胞、例如胚胎干细胞在很多方面(例如表达某些干细胞基因和蛋白，染色质甲基化模式，倍增时间、类胚体形成、畸胎瘤形成、活的嵌合体形成和潜能(potency)和分化力)是类似的(如果不完全相同的话)，但是它们与天然多能干细胞的关系的完全程度仍待测定。
从除了胚胎来源之外的人类组织衍生诱导的干细胞是令人期望的，以便缓解涉及胚胎和胚胎组织的实验性使用的伦理学问题。已经提出了从诱导的多能细胞进行治疗性应用的前景。医学应用包括治疗阿尔茨海默病，糖尿病和脊髓损失(略举几例)。其它应用包括疾病模拟和药物筛选。
IPS细胞首先是于2006年从小鼠细胞(Takahashi等人,2006)以及在2007年从人类细胞(Takahashi等人,2007;Yu等人,2007)产生的。这被认为是干细胞研究上的重大进展，因为其可允许研究人员获得多能干细胞，其对于研究具有重要意义，并且潜在地具有治疗应用，无需有争议地使用胚胎。从小鼠或人类组织首次成功证明产生诱导的干细胞(iPS细胞)涉及使用表达特定组的转录因子的逆转录病毒载体。James Thomson和Shinya Yamanaka的实验室进行的研究已经证明：通过逆转录病毒载体将特定的转录因子导入小鼠或人成纤维细胞足以重编程那些细胞为未分化的多能干细胞。Thomson使用的因子包括Oct4,Sox2,Nanog和Lin28。Yamanaka使用的因子包括Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc。通过任一基因组合进行的重编程都是通过整合进入宿主细胞基因组并表达转录因子而实现的。Oct4和Sox2似乎是重编程必需的转录因子。重编程的效率是低下的，频率为起始细胞群体的0.01%–0.02%。
为了改进目前的重编程方法，在本发明的一些实施方式中，公开了通过下列方式重编程体细胞的方法：使用染色体外遗传元件将重编程因子导入体细胞中，然后在包含一种或多种如上所述的信号传导抑制剂的重编程培养基中培养。这些细胞的潜能在多个方面可以与胚胎干细胞相同，如下文所述，但是基本上不含异源遗传元件。
最初的胚胎干细胞(ES细胞)是衍生自胚泡(早期胚胎)的内细胞团的多能干细胞。ES细胞通过两个独特特征加以区分：它们的多能性和它们的无限自我更新能力。ES细胞是多能细胞，即，它们能够分化为三个原始胚层即外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物。另外，在确定的条件下，胚胎干细胞能够无限繁殖自身。这允许胚胎干细胞被用作研究和再生医学的有用工具，因为它们能够产生无限数目的自身以用于持续研究或临床应用。
然而，在小鼠与人类ES细胞之间存在显著差异。当被JamesThomson发现时，发现人类ES细胞与小鼠ES细胞在潜能和培养条件上是不同的，尤其是，对于LIF(培养小鼠ES细胞所需的要素)完全无应答，这是由人类ES细胞中的失活的白血病抑制因子途径造成的。现有的人类IPS细胞在这些方面类似于人类ES细胞，因此，它们可被称作人类ES细胞样iPS细胞。
IV.用于重编程的染色体外遗传元件
已经使用逆转录病毒或慢病毒载体通过异位表达重编程基因而实现了从人类体细胞诱导多能干细胞。重组逆转录病毒例如莫洛尼鼠白血病病毒具有以稳定方式整合进入宿主基因组的能力。它们包含逆转录酶，允许整合进入宿主基因组。慢病毒是逆转录病毒的亚类。由于它们整合进入非***细胞以及***细胞的基因组的能力，使它们广泛适合用作载体。当病毒进入细胞时，RNA形式的病毒基因组被逆转录以产生DNA，然后DNA通过病毒整合酶被***基因组的随机位置。因此，目前的成功重编程技术依赖于基于整合的病毒方法。
然而，使用目前的技术，靶向整合仍然不是常规的(Bode等人,2000)，惯常的备选方式，随机整合，可能在诱导的干细胞中导致***诱变，其具有不可预测的后果。由于相同的原因，转基因的表达不能被控制，因为其依赖于整合位点的染色质环境(Baer等人,2000)。只能在有利的基因座实现高水平表达，但是存在以下危险：整合进入高表达位点会干扰诱导的多能干细胞的生死攸关的细胞功能。
此外，越来越多的证据表明存在针对外源DNA的细胞防御机制，其通过伴随DNA甲基化的过程下调转基因而发挥作用(Bingham,1997,Garrick等人,1998)。此外，病毒成分可能与其它因子一起作用以转化细胞。伴随着从多个病毒基因的持续表达，至少部分病毒基因组在细胞中的持续存在可能引起细胞转化。这些基因可能干扰细胞的信号传导途径，导致所观察到的细胞的表型变化，产生转化的细胞，其显示出增加的细胞***，这对于病毒是有利的。
因此，在一些实施方式中，本发明开发了用于产生基本上不含异源遗传元件、例如来自之前方法中所使用的逆转录病毒或慢病毒载体的元件的诱导的多能干细胞的新方法。本发明的这些方法利用了染色体外复制载体，或能够游离复制的载体(见美国申请号12/478,154，通过引用方式并入本文)，并联合在存在细胞信号传导抑制剂的情况下培养重编程的细胞，以实现最佳的重编程效率和动力学。
有多种DNA病毒，例如腺病毒、猴空泡病毒40(SV40)、牛***瘤病毒(BPV)或包含出芽酵母ARS(自主复制序列)的质粒在哺乳动物细胞中染色体外复制。这些游离质粒内在地不具有与整合载体相关的所有这些缺点(Bode等人,2001)。基于淋巴营养疱疹病毒(包括EB病毒(EBV))的***也可在染色体外复制并辅助递送重编程基因至体细胞。
例如，用于本发明中的基于游离载体的方法利用了基于EBV元件的***的成功复制和维持所必需的有力元件，而不破坏该***在临床环境下的易处理性，如下文所详述。有用的EBV元件是OriP和EBNA-1，或它们的变体或功能等同物。该***的额外优点是这些异源元件在被导入细胞之后将随着时间丧失，产生自我持续的基本上不含这些元件的iPS细胞。
A.EB病毒
EB病毒(EBV)，也被称作人类疱疹病毒4(HHV-4)，是疱疹病毒家族(包括单纯疱疹病毒和巨细胞病毒)的病毒，是人类中最常见的病毒之一。EBV维持其基因组在染色体外并与宿主细胞机构合作进行有效复制和维持(Lindner and Sugden,2007)，在细胞***过程中仅依赖两个必不可少的特征以进行其复制和在细胞内的保留(Yates等人1985;Yates等人1984)。一个元件通常被称作oriP，以顺式存在并担当复制起始点。另一个因子EBNA-1，通过结合oriP内的序列而以反式发挥作用，以促进质粒DNA的复制和维持。作为非限制性实例，本发明的一些方面利用了这两个特征并在载体的环境下使用它们，以运送重编程体细胞必需的基因，以促进这些基因的复制和持续表达(相对于常规质粒)。
B.复制起始点
在一些方面，可以使用EBV的复制起始点OriP。OriP是DNA复制起始处或其附近的位点，通常由间隔大约1000碱基对的两个顺式作用序列组成：它们被称作重复家族(FR)和二重对称(DS)。
FR由21个不完美拷贝的30bp重复序列组成，并包含20个高亲和性的EBNA-1结合位点。当FR与EBNA-1结合时，其同时作为启动子的转录增强子(以顺式，相距至多10kb)(Reisman and Sugden,1986;Yates,1988;Sugden and Warren,1989;Wysokenski and Yates,1989;Gahn and Sugden,1995;Kennedy and Sugden,2003;Altmann等人,2006)并促成细胞核保持和包含FR的质粒的可靠的维持(Langle-Rouault等人,1998;Kirchmaier and Sugden,1995;Wang等人,2006;Nanbo and Sugden,2007)。oriP质粒的有效***也可能归因于FR。虽然病毒已经进化为在FR中维持20个EBNA-1结合位点，但是有效的质粒维持仅需要这些位点中的7个，并且可以被3个拷贝的DS的聚合物(总共具有12个EBNA-1结合位点)重构(Wysokenskiand Yates,1989)。
二重对称元件(DS)对于在存在EBNA-1的情况下启动DNA合成是足够的(Aiyar等人,1998;Yates等人,2000)，启动发生于DS处或其附近(Gahn and Schildkraut,1989;Niller等人,1995)。认为病毒DNA合成的终止发生于FR处，因为当FR被EBNA-1结合时，其发挥复制叉屏障的作用，如通过2D凝胶电泳所观察到的(Gahn andSchildkraut,1989;Ermakova等人,1996;Wang等人,2006)。从DS的DNA合成起始被限定为每个细胞周期一次(Adams,1987;Yates andGuan,1991)，并且被细胞复制***的成分调控(Chaudhuri等人,2001;Ritzi等人,2003;Dhar等人,2001;Schepers等人,2001;Zhou等人,2005;Julien等人,2004)。DS包含4个EBNA-1结合位点，虽然比FR中发现的那些亲和性低(Reisman等人,1985)。DS的拓扑学为：4个结合位点安排为2对位点，每对之间有21bp中心至中心的间隔，2个非配对内部结合位点之间有33bp的中心至中心的间隔(Baer等人,1984;Rawlins等人,1985)。
已经通过研究EBV基因组的另一区域(被称作Rep*)而确认了DS内的元件的功能性作用，Rep*被鉴定为可无效率地替代DS的元件(Kirchmaier and Sugden,1998)。使Rep*聚合8次产生在支持复制上如DS一样有效的元件(Wang等人,2006)。Rep*的生物化学解剖鉴定了一对EBNA-1结合位点，具有21bp的中心至中心间隔，这对于其复制功能具有关键意义(参考文献同上)。发现Rep*的最小复制子是这对EBNA-1结合位点，因为即使将聚合物中所有的两翼序列替换为衍生自λ噬菌体的序列之后仍然保持复制功能。DS与Rep*的对比已经揭示了共同的机理：这些复制子通过募集细胞复制机构(经由一对适当间隔的位点，被EBNA-1弯曲和结合)而支持DNA合成的起始。
还有其它的染色体外的、得到许可的在哺乳动物细胞内复制而与EBV无关的质粒，在一些方面表现得与EBV的Raji株系内的起始区域相似。Hans Lipps及其同事已经开发并研究了包含“细胞核支架/基质附着区域”(S/MAR)和有力的转录单元的质粒(Piechaczek等人,1999;Jenke等人,2004)。它们的S/MAR源自人类干扰素β基因，富含A/T，并通过其与细胞核基质的结合及其在低离子强度下或包埋在超螺旋DNA中时的优先解开而***作地定义(Bode等人,1992)。这些质粒半保留地复制，结合ORC蛋白，并有效地随机地贯穿它们的DNA支持DNA合成的起始(Schaarschmidt等人,2004)。它们被有效维持于增殖的仓鼠和人类细胞中，无需药物选择，当被导入猪胚胎时，能够支持GFP在动物胎儿的多数组织中的表达(Manzini等人,2006)。
C.反式作用因子
反式作用因子的具体实例可以是EB细胞核抗原1(EBNA-1)，其是DNA结合蛋白，与oriP的FR和DS或Rep*结合，以促进每次细胞***时基于EBV的载体的复制和可靠***至子代细胞，独立于细胞染色体，但与其相协调。
已经通过突变和缺失分析将EBNA-1的641个氨基酸(AA)归组为与其不同功能相关的结构域。AA40-89之间的区域和AA329-378之间的区域能够以顺式或反式连接2个DNA元件(当与EBNA-1结合时)，因此被称作连接区1和2(LR1,LR2)(Middleton and Sugden,1992;Frappier and O’Donnell,1991;Su等人,1991;Mackey等人,1995)。将EBNA-1的这些结构域与GFP融合会使GFP归巢至有丝***的染色体(Marechal等人,1999;Kanda等人,2001)。LR1和LR2对于复制是功能上冗余的；任一个的删除产生能够支持DNA复制的EBNA-1的衍生物(Mackey and Sugden,1999;Sears等人,2004)。LR1和LR2富含精氨酸和甘氨酸残基，并类似于与富含A/T的DNA结合的AT钩基序(AT-hook motif)(Aravind and Landsman,1998),(Sears等人,2004)。EBNA-1的LR1和LR2的体外分析已经证明了它们与富含A/T的DNA结合的能力(Sears等人,2004)。当LR1(包含一个此类AT钩)与EBNA-1的DNA结合和二聚化结构域融合时，发现其对于oriP质粒的DNA复制是足够的，虽然不如野生型EBNA-1效率高(参考文献同上)。
但是LR1和LR2确有不同。LR1的C末端的一半由除了N末端的一半的重复的Arg-Gly之外的氨基酸组成，被称作独特区域1(UR1)。UR1对于EBNA-1从转染和整合的报告子DNA(包含FR)有效激活转录是必需的(Wu等人,2002;Kennedy and Sugden,2003;Altmann等人,2006)。UR1对于被EBV感染的B细胞的有效转化也是必需的。当缺少该结构域的EBNA-1衍生物替代完整病毒环境下的野生型蛋白时，这些衍生病毒具有0.1%的野生型病毒的转化能力(Altmann等人,2006)。
LR2对于EBNA-1支持oirP复制不是必需的(Shire等人,1999;Mackey and Sugden,1999;Sears等人,2004)。另外，EBNA-1的N末端的一半可以被包含AT钩基序的细胞蛋白替代，例如HMGA1a，并且仍然保持复制功能(Hung等人,2001;Sears等人,2003;Altmann等人,2006)。这些发现表明：LR1和LR2的AT钩活性可能是人类细胞中oriP的维持所必需的。
EBNA-1第三结构域(AA91–328)由甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GGA)的重复序列组成，参与EBNA-1的规避宿主免疫应答的能力，其是通过抑制蛋白体降解和呈现(Levitskaya等人,1995;Levitskaya等人,1997)。已经发现这些重复序列在体外和体内抑制EBNA-1的翻译(Yin等人,2003)。然而，该结构域的大部分的删除对于EBNA-1在细胞培养中的功能无明显影响，这使得该结构域的功能难以被阐释。
AA379–386编码细胞核定位信号(NLS)，其也与细胞核输入机构相关(Kim等人,1997;Fischer等人,1997)。由于它们的高度碱性含量，LR1和LR2的富含Arg-Gly的区域内的序列也可以作为NLS发挥作用。
最后，C末端(AA458–607)编码EBNA-1的重叠的DNA结合和二聚化结构域。已经通过X-射线晶体学揭示了与DNA结合的这些结构域的结构，发现其类似于***瘤病毒的E2蛋白的DNA结合结构域(Hegde等人,1992;Kim等人,2000;Bochkarev等人,1996)。
在本发明的具体实施方式中，重编程载体将包含oriP和编码能支持质粒复制及其在细胞***过程中的正确维持的EBNA-1的形式的简短序列。野生型EBNA-1的氨基末端1/3内的高度重复序列和被证明在多种细胞中具有毒性的25个氨基酸的区域的删除对于EBNA-1的与oriP相关的反式作用功能是可有可无的(Yates等人1985;Kennedy等人2003)。因此，简短形式的EBNA-1(其被称作ΔUR1)可与oriP一起用于一个实施方式中的基于游离载体的***。
在一些方面，可用于本发明中的EBNA-1的衍生物是这样的多肽：相对于对应的野生型多肽，其具有修饰的氨基酸序列。所述修饰包括删除、***或替换对应于EBNA-1的LR1(大约40至大约89位的残基)的独特区域(大约65至大约89的残基)的区域中的至少一个氨基酸残基，并且可以包括删除、***和/或替换对应于EBNA-1的其它残基的区域[例如大约1位至大约40位的残基，大约90位至大约328位的残基("Gly-Gly-Ala"重复区域)，大约329至大约377位的残基(LR2)，大约379至大约386位的残基(NLS)，大约451至大约608位的残基(DNA结合和二聚化)或大约609至大约641位的残基]中的一个或多个氨基酸残基，只要得到的衍生物具有所需的性质，例如使包含对应于oriP的ori的DNA二聚化并与之结合，定位于细胞核，无毒性，从染色体外激活转录但不从整合的模板实质上激活转录。
D.无残余的特征
重要的是，基于oriP的游离载体的复制和维持是不完美的，并且在其被导入细胞的头2周内从细胞急剧地丧失(每次细胞***25%）；然而，保留质粒的那些细胞丧失较慢(每次细胞***3%)(Leight andSugden,2001;Nanbo and Sugden,2007)。一旦对于携带质粒的细胞的选择被除掉，质粒将在每次细胞***中丧失，直至它们随着时间全部被消除，在得到的子代细胞中不留下其之前存在的痕迹。本发明的一些方面利用了基于oriP的***的这种无痕迹特征，作为目前的与病毒相关的方法的替代，以递送基因以产生iPS细胞。其它的染色体外载体也将在宿主细胞复制和繁殖过程中丧失，也可用于本发明。
E.重编程因子
用于诱导的基因对于iPS细胞的产生具有关键意义。以下因子或其组合可用于本发明公开的载体***中。在一些方面，重编程载体中将包括编码Sox和Oct(优选Oct3/4)的核酸。例如，重编程载体可以包含编码Sox2、Oct4、Nanog和任选Lin-28的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Klf4和任选c-myc的表达盒。编码这些重编程因子的核酸可以包含在同一表达盒中、不同表达盒中、同一重编程载体中，或不同重编程载体中。
Oct-3/4和Sox基因家族的一些成员(Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)已经被鉴定为参与诱导过程的关键性转录调节子，其缺失会使诱导不能进行。另一方面，另外的基因，包括Klf家族的一些成员(Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的一些成员(C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog和LIN28已经被鉴定为增强诱导效率。
Oct-3/4(Pou5f1)是八聚合体(octamer，"Oct")家族转录因子之一，在维持多能性方面具有关键作用。Oct-3/4+细胞例如卵裂球和胚胎干细胞中Oct-3/4的缺失会导致自发的滋养层分化，因此Oct-3/4的存在产生胚胎干细胞的多能性和分化潜力。"Oct"家族中的多个其它基因，包括Oct-3/4的近亲Oct1和Oct6，不能引发诱导。
与Oct-3/4类似，Sox基因家族与维持多能性相关，虽然其与多潜能（multipotent）和单能干细胞相关，而Oct-3/4与此相反，Oct-3/4专有性地在多能干细胞中表达。虽然Sox2是用于诱导的最初基因(Takahashi等人(2006),Wernig等人(2007)和Yu等人(2007))，但是已经发现Sox家族中的其它基因也在诱导过程中同样起作用。Sox1以类似于Sox2的效率产生iPS细胞，基因Sox3、Sox15和Sox18也产生iPS细胞，虽然效率较低。
Nanog是在未分化的胚胎干细胞的自我更新中具有关键意义的转录因子。在人类中，该蛋白由NANOG基因编码。Nanog是胚胎干细胞(ESC)中表达的基因，被认为是维持多能性的关键因子。NANOG被认为与其它因子例如Oct4(POU5F1)和Sox2协调发挥作用以建立ESC的身份。
LIN28是一种mRNA结合蛋白，其在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达，与分化和增殖相关。Yu等人(2007)证明其是产生iPS的一个因子，虽然其不是必需的。
Klf基因家族的Klf4最初由Takahashi等人(2006)鉴定，并由Wernig等人(2007)确认为用于产生小鼠iPS细胞的因子，并由Takahashi等人(2007)证明是用于产生人类iPS细胞的因子。然而，Yu等人(2007)报道：Klf4对于人类iPS细胞的产生不是必需的。发现Klf2和Klf4是能够产生iPS细胞的因子，相关的基因Klf1和Klf5同样也是，虽然效率较低。
Myc基因家族是牵涉于癌症的原癌基因。Takahashi等人(2006)和Wernig等人(2007)证明c-myc是牵涉于小鼠iPS细胞之产生中的因子，Yamanaka等人证明其是牵涉于人类iPS细胞之产生中因子。然而，Yu等人(2007)和Takahashi等人(2007)报道c-myc对于产生人类iPS细胞不是必需的。将"myc"基因家族用于诱导iPS细胞对于iPS细胞最终作为临床治疗具有麻烦，因为25%的移植了c-myc诱导的iPS细胞的小鼠产生致命性畸胎瘤。N-myc和L-myc已经被鉴定为以类似的效率诱导功能性（替代c-myc）。在一些方面，可以使用Myc突变体、变体、同源物或衍生物，例如具有减少的细胞转化的突变体。其实例包括LMYC(NM_001033081),在N末端删除了41个氨基酸的MYC(dN2MYC)或在136位氨基酸具有突变的MYC(例如，W136E)。
V.细胞信号传导抑制剂
在本发明的一些方面，在至少一部分重编程过程中，可以在存在一种或多种信号传导抑制剂的情况下维持细胞，所述抑制剂抑制信号传导级联中的信号传导子，例如，在MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGF-β受体抑制剂、MEK抑制剂和GSK3抑制剂二者、GSK3抑制剂和TGF-β受体抑制剂二者、MEK抑制剂和TGF-β受体抑制剂二者、这三种抑制剂的组合，或这些相同途径内的其它信号传导子的抑制剂的存在下维持细胞。在一些方面，ROCK抑制剂、例如HA-100或肌球蛋白II抑制剂、例如blebbistatin，可用于促进重编程的细胞和得到的iPS细胞的克隆扩增。高浓度的FGF与特定重编程培养基、例如条件化的人ES细胞培养基或化学上确定的培养基例如无血清的确定的N2B27培养基的组合也可用于增大重编程效率。
在一些实施方式中，除了通过染色体外遗传元件向细胞中导入一种或多种重编程因子（例如2、3或更多种，如本文所描述）之外，以包含下列的重编程培养基处理细胞：MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂、GSK3抑制剂和可选的LIF，其优点在于，例如，改善重编程效率和动力学，促进原代重编程培养物中iPS细胞的鉴定，从而保持iPS细胞的克隆形成能力(clonality)。
应理解，在这些方面和实施方式中，可以视需要以其它信号传导抑制剂(其抑制相同信号传导途径(例如ERK1或ERK2级联)的信号传导组分)替换MEK抑制剂。这可以包括抑制MAPK途径的上游刺激剂，特别是通过FGF受体(Ying,2008)。同样，可以视需要替换GSK3抑制剂为GSK3相关的信号传导途径(例如胰岛素合成和Wnt/β-连环蛋白信号传导)的其它抑制剂；可以视需要替换LIF为Stat3或gp130信号传导的其它激活子。
可以以至少或大约0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,100,150,200,500至大约1000μM的有效浓度或其中任意范围的浓度使用此类信号传导抑制剂，例如MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGF-β受体抑制剂。
本领域技术人员可以通过常规方式或从常规来源提供或获得抑制剂(另见WO2007113505)。
A.糖原合酶激酶3抑制剂
糖原合酶激酶3(GSK-3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导将磷酸分子添加至特定细胞底物中的某些丝氨酸和苏氨酸氨基酸上。通过GSK-3进行的这些其它蛋白的磷酸化通常会抑制靶蛋白（也称作“底物”）。如所提及的，已知GSK-3磷酸化糖原合酶并因此使其灭活。其还被指参与控制针对受损DNA的细胞应答和Wnt信号传导。GSK-3还在Hedgehog(Hh)途径中使Ci磷酸化，将其靶向蛋白水解为无活性的形式。除了糖原合酶之外，GSK-3具有很多其它底物。然而，GSK-3在激酶中与众不同之处在于，其通常需要“引发激酶”(priming kinase)以首先使底物磷酸化。
GSK-3磷酸化的后果通常是抑制底物。例如，当GSK-3使其另一底物，转录因子的NFAT家族，磷酸化时，这些转录因子不能转位至细胞核，因此被抑制。除了其在Wnt信号传导途径中的重要作用以外(这对于在发育过程中建立组织式样是必需的)，GSK-3对于在诸如骨骼肌肥大环境中被诱导的蛋白的合成也是关键性的。其作为NFAT激酶的作用也使其成为分化和细胞增殖的重要调节者。
GSK3抑制可以指一种或多种GSK3酶的抑制。GSK3酶家族是熟知的，已经描述了多个变体(见，例如Schaffer等人,2003)。在具体的实施方式中，GSK3-β被抑制。GSK3-α抑制剂也是合适的，在一些方面，用于本发明的抑制剂抑制GSK3-α和GSK3-β二者。
GSK3的抑制剂可以包括：结合GSK3的抗体，GSK3的显性阴性变体，靶向GSK3的siRNA和反义核酸。GSK3抑制剂的实例描述于Bennett等人(2002)和Ring等人(2003)。
GSK3抑制剂的具体实例包括但不限于：Kenpaullone,l-Azakenpaullone,CHIR99021,CHIR98014,AR-A014418(见，例如，Gould等人,2004),CT 99021(见，例如，Wagman,2004),CT 20026(见，Wagman，见上文),SB415286,SB216763(见，例如，Martin等人,2005),AR-A014418(见，例如，Noble等人,2005),锂(见，例如，Gould等人,2003),SB 415286(见，例如，Frame等人,2001)和TDZD-8(见，例如，Chin等人,2005)。另外的示例性的GSK3抑制剂可从Calbiochem获得(见，例如，Dalton等人,WO2008/094597,通过引用方式并入本文)，包括但不限于：BIO(2'Z,3'￡)-6-Bromomdirubm-3'-肟(GSK3抑制剂IX);BIO-丙酮肟(2'Z,3'E)-6-溴代靛玉红-3'-丙酮肟(GSK3抑制剂X);(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制剂XIII);吡啶卡巴唑-环戊二烯钌复合物(GSK3抑制剂XV);TDZD-84-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮(GSK3β抑制剂I);2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑(GSK3β抑制剂II);OTDZT 2,4-二苯基-5-氧代噻二唑-3-硫酮(GSK3β抑制剂III);α-4-二溴乙酰苯(GSK3β抑制剂VII);AR-AO 14418N-(4-甲氧基苄基)-N'-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲(GSK-3β抑制剂VIII);3-(1-(3-羟基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮(GSK-3β抑制剂XI);TWSl19吡咯并嘧啶化合物(GSK3β抑制剂XII);L803H-KEAPP APPQSpP-NH2或其豆蔻酰化形式(GSK3β抑制剂XIII);2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3β抑制剂VI);AR-AO144-18;SB216763;和SB415286。
GSK3抑制剂能够激活例如Wnt/β-连环蛋白途径。很多β-连环蛋白下游基因共调节多能性基因网络。例如，GSK抑制剂激活cMyc表达并增强其蛋白稳定性和转录活性。因此，在一些实施方式中，GSK3抑制剂可用于刺激细胞中的内源性Myc多肽的表达，从而消除诱导多能性对于Myc表达的需求。
另外，已经表征了GSK3-β的活性位点的结构，并鉴定了与特异性和非特异性抑制剂相互作用的关键残基(Bertrand等人,2003)。这种结构表征允许容易地鉴定另外的GSK抑制剂。
本文使用的抑制剂优选为特异于所靶向的激酶。某些实施方式的抑制剂特异于GSK3-β和GSK3-α，基本上不抑制erk2，基本上不抑制cdc2。优选地，相对于小鼠erk2和/或人cdc2，所述抑制剂对于人GSK3具有至少100倍、更优选至少200倍、非常优选至少400倍的选择性(通过IC50值的比例测定)；此处，提及GSK3IC50值是指对于人GSK3-β和GSK3-α的平均值。已经使用CHIR99021获得了良好的结果，其特异于GSK3。使用CHIR99021的合适的浓度是0.01至100、优选0.1至20、更优选0.3至10μM。
B.MEK抑制剂
MEK抑制剂，包括有丝***原激活的蛋白激酶激酶(MAPK/ERK激酶或MEK)或其相关信号传导途径例如MAPK级联的抑制剂，可用于本发明的一些方面。有丝***原激活的蛋白激酶激酶(sic)是这样的激酶：其使有丝***原激活的蛋白激酶磷酸化。其也被称作MAP2K。细胞外刺激物导致MAP激酶通过信号传导级联("MAPK级联")被激活，所述级联由下列组成：MAP激酶、MAP激酶激酶(MEK,MKK,MEKK,或MAP2K)和MAP激酶激酶激酶(MKKK或MAP3K)。
本文中的MEK抑制剂一般是指MEK的抑制剂。因此，MEK抑制剂是指蛋白激酶的MEK家族的成员(包括MEK1、MEK2和MEK5)的任意抑制剂。还提及了MEK1、MEK2和MEK5抑制剂。适宜的MEK抑制剂的本领域已知的实例包括：MEK1抑制剂PD184352和PD98059，MEK1和MEK2的抑制剂U0126和SL327，以及如Davies等人(2000)中所讨论。
特别地，已经发现PD184352和PD0325901与其它已知的MEK抑制剂相比，具有高度的特异性和效力(Bain等人,2007)。其它的MEK抑制剂和MEK抑制剂的类别描述于Zhang等人(2000)。
MEK的抑制剂可以包括：MEK的抗体、MEK的显性阴性变体，抑制MEK表达的siRNA和反义核酸。MEK抑制剂的具体实例包括但不限于：PD0325901(见，例如，Rinehart等人,2004),PD98059(可以获自例如Cell Signaling Technology),U0126(可以获自例如CellSignaling Technology),SL327(可以获自例如Sigma-Aldrich),ARRY-162(可以获自例如Array Biopharma),PD184161(见，例如，Klein等人,2006),PD184352(CI-1040)(见，例如，Mattingly等人,2006),sunitinib(见，例如，Voss,等人,US2008004287，通过引用方式并入本文),sorafenib(见，Voss，见上文),Vandetanib(见，Voss见上文),pazopanib(见，例如，Voss，见上文),Axitinib(见，Voss见上文)和PTK787(见，Voss，见上文)。
目前，有几种MEK抑制剂正进行临床试验评估。CI-1040已进行了针对癌症的临床I期和II期评估(见，例如Rinehart等人,2004)。处于临床试验评估的其它MEK抑制剂抑制剂包括PD 184352(见，例如English等人,2002),BAY 43-9006(见，例如Chow等人,2001),PD-325901(也叫PD0325901),GSK1120212,ARRY-438162,RDEA119,AZD6244(也叫ARRY-142886或ARRY-886),RO5126766,XL518和AZD8330(也叫ARRY-704)。
可以使用RNA介导的干扰(RNAi)方便地实现MEK的抑制。通常而言，将互补于全部或部分MEK基因的双链RNA分子导入多能细胞，从而促进编码MEK的mRNA分子的特异性降解。这种转录后机制导致所靶向的MEK基因的减少的表达或表达被消除。使用RNAi实现MEK抑制的适当的技术和程序是已知的。
用于鉴定激酶抑制剂、包括GSK3抑制剂和MEK抑制剂的多种测定法是已知的。例如，Davies等人(2000)描述了这样的激酶测定法：其中将激酶在存在肽底物和放射标记的ATP的情况下温育。激酶引起的底物磷酸化导致标记物被掺入底物。每个反应的等份被固定于磷酸纤维素纸上并在磷酸中洗涤以除掉游离的ATP。然后测定温育之后的底物活性并提供激酶活性的指示。可以使用此类测定法容易地确定在存在和不存在候选激酶抑制剂的情况下的相对激酶活性。Downey等人(1996)也描述了用于激酶活性的测定法，其可用于鉴定激酶抑制剂。
C.TGF-β受体抑制剂
TGF-β受体抑制剂可以包括一般性的TGF信号传导的任何抑制剂或特异于TGF-β受体(例如ALK5)的抑制剂，其可以包括：TGF-β受体(例如ALK5)的抗体、TGF-β受体的显性阴性变体，和抑制TGF-β受体表达的siRNA和反义核酸。示例性的TGFβ受体/ALK5抑制剂包括但不限于：SB431542(见，例如，Inman等人,2002),A-83-01,也被称作3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(见，例如，Tojo等人,2005，可从例如Toicris Bioscience通过商业途径获得);2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶,Wnt3a/BIO(见，例如，Dalton,等人,WO2008/094597,通过引用方式并入本文),BMP4(见，Dalton，见上文),GW788388(-(4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(见，例如，Gellibert等人,2006),SM16(见，例如，Suzuki等人,2007),IN-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹噁啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(见，例如，Kim等人,2008),GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-lH-吡唑-4-基)吡啶)(见，例如，de Gouville等人,2006),SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二噁-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸)(见，例如，DaCosta等人,2004)和嘧啶衍生物(见，例如，Stiefl等人,WO2008/006583中列举的那些,通过引用方式并入本文)。
另外，虽然"ALK5抑制剂"不是意在包括非特异性激酶抑制剂，但是"ALK5抑制剂"应理解为包括：除了ALK5之外，还抑制ALK4和/或ALK7的抑制剂，例如SB-431542(见，例如Inman等人,2002)。不是意在限制本发明的范围，相信ALK5抑制剂会影响间充质至上皮的转化/转变(MET)过程。TGFβ/活化素途径是上皮至间充质转变(EMT)的驱动者。本发明人想到：抑制TGFβ/活化素途径能够促进MET(即重编程)过程。
相信抑制TGFβ/活化素途径将具有相似的效应。因此，TGFβ/活化素途径的任何抑制剂(例如，上游或下游)可与如本文描述的TGF-β/ALK5抑制剂联合使用或替代之。示例性的TGFβ/活化素途径的抑制剂包括但不限于：TGF-β受体抑制剂，SMAD 2/3磷酸化抑制剂，SMAD 2/3和SMAD 4相互作用的抑制剂，SMAD 6和SMAD 7的激活剂/激动剂。此外，本文描述的类别仅是为了组编目的，本领域技术人员将知晓化合物能够影响途径内的一个或多个点，因此，化合物可能按照不止一个所定义的类别来发挥作用。
TGF-β受体抑制剂可以包括：TGF-β受体的抗体、TGF-β受体的显性阴性变体，靶向TGF-β受体的siRNA或反义核酸。抑制剂的具体实例包括但不限于：SU5416;2-(5-苯并[1,3]二噁-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸(SB-505124);lerdelimumb(CAT-152);metelimumab(CAT-192);GC-1008;IDl 1;AP-12009;AP-11014;LY550410;LY580276;LY364947;LY2109761;SB-505124;SB-431542;SD-208;SM16;NPC-30345;Ki26894;SB-203580;SD-093;Gleevec;3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(Morin);活化素-M108A;P144;可溶性的TBR2-Fc;靶向TGF-β受体的反义转染的肿瘤细胞(见，例如Wrzesinski等人,2007;Kaminska等人,2005;和Chang等人,2007)。
D.ROCK抑制剂和肌球蛋白II ATPase抑制剂
多能干细胞，尤其是人ES细胞和iPS细胞，在细胞分离和解离之后易于发生凋亡，这对于克隆分离或扩增和分化诱导具有重要意义。最近发现了一类小分子增加解离的多能干细胞的克隆效率和存活，例如Rho相关的激酶(ROCK)抑制剂，其为ROCK相关的信号传导途径的抑制剂，例如Rho特异性抑制剂，ROCK特异性抑制剂，或肌球蛋白II特异性抑制剂。在本发明的一些方面，ROCK抑制剂可用于多能干细胞的培养和传代和/或干细胞的分化。因此，ROCK抑制剂可存在于多能干细胞生长、解离、形成聚集物或经历分化的任意细胞培养基中，例如粘附培养或悬浮培养。除非本文另有指明，否则肌球蛋白II抑制剂，例如blebbistatin，可替代ROCK抑制剂的实验性使用。
ROCK信号传导途径可以包括Rho家族GTPase；ROCK，Rho下游的主要的效应子激酶；肌球蛋白II，ROCK下游的主导效应子(Harb等人,2008)；以及任何中间体、上游或下游信号处理者。ROCK能够使肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)磷酸化和失活，其是ROCK的主要下游靶物之一，通过肌球蛋白调节轻链(MRLC)的去磷酸化阴性地调节肌球蛋白功能。
ROCK是丝氨酸/苏氨酸激酶，其作为Rho(其有三种同种型--RhoA,RhoB和RhoC)的靶蛋白。这些激酶最初被表征为RhoA诱导的应激纤维和局灶性粘连的形成的介导子。两种ROCK同种型—ROCK1(p160ROCK，也称作ROKβ)和ROCK2(ROKα)—由N-末端激酶结构域、后跟卷曲螺旋结构域(包含Rho结合结构域和pleckstrin-同源性结构域(PH))组成。这两种ROCK都是细胞支架的调节者，介导RhoA对于应激纤维形成、平滑肌收缩、细胞粘附、膜起皱和细胞运动的效应。ROCK可以通过靶向下游分子、例如肌球蛋白II、肌球蛋白轻链(MLC)、MLC磷酸酶(MLCP)和磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)而发挥它们的生物学活性。
ROCK抑制剂的非限制性实例包括：HA-100,Y-27632,H-1152,Fasudil(也称作HA1077),Y-30141(描述于美国专利5,478,838),Wf-536,HA-1077,羟基-HA-1077,GSK269962A,SB-772077-B,以及它们的衍生物，和针对ROCK的反义核酸，RNA干扰诱导核酸(例如，siRNA)，竞争性肽，拮抗剂肽，抑制性抗体，抗体-ScFV片段，其显性阴性变体和表达载体。此外，由于其它小分子化合物已知为ROCK抑制剂，这些化合物或其衍生物也可用于实施方式中(例如，见美国专利公开号20050209261,20050192304,20040014755,20040002508,20040002507,20030125344和20030087919，以及国际专利公开号2003/062227,2003/059913,2003/062225,2002/076976和2004/039796，通过引用方式并入本文)。在本发明的一些方面，也可以使用两种或更多种ROCK抑制剂的组合。
Rho特异性抑制剂，例如梭菌肉毒杆菌C3外酶，和/或肌球蛋白II特异性抑制剂，也可在本发明的一些方面中用作ROCK抑制剂。
VI.重编程的细胞的培养
就培养基和条件而言，起始细胞和最后的重编程的细胞一般具有不同的要求。为了实现此要求，同时也允许细胞发生重编程，通常进行至少最初阶段的培养：在导入重编程因子之后，在存在已知适合于起始细胞生长的培养基和培养条件下。然后是在存在已知适合多能细胞的重编程培养基和条件下的培养阶段——在饲养物上使用血清或使用化学上确定的培养基或无饲养物的条件。合适的饲养物包括原代或永生化的成纤维细胞系，通常是灭活的，所以它们的生长不超过被重编程的细胞的生长。在足够的重编程时间之后，可以进一步在扩增培养基中培养重编程的细胞以扩增iPS细胞，可以在选择iPS细胞之前或之后进行。此类扩增培养基可以包括一种或多种如上文所述的信号传导抑制剂或包含基本上不含这些抑制剂的培养基。
培养的最初阶段优选持续至多6天，更优选至多4天，在具体实施方式中，如下文所述，不超过3天，更特别是至多或大约1天。在包含一种或多种信号传导抑制剂的重编程培养基中的随后的培养阶段适宜地持续至少或大约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33天，或其中的任意范围，并且可以持续至多70天，优选至多56天，或直至检测到iPS细胞。在下文描述的用于产生重编程的人类细胞的具体实施方式中，培养的最初阶段持续大约1天，随后的阶段持续大约9-28天：在重编程条件下在包含MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂和GSK3抑制剂的重编程培养基中培养。重编程条件可以基本上不含饲养细胞。在其它方面，重编程培养基可以是化学上确定的。为了改善重编程，重编程培养基还可以包含高浓度的FGF并且可以基本上不含TGFβ。
MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂和GSK3抑制剂的组合可以促进重编程过程，包括：增加重编程效率和缩短重编程时间。LIF是gp130信号传导的激活剂的实例，另一个是IL-6联合可溶性IL-6受体，并在细胞处于被重编程的过程中时促进细胞的生长和存活。在重编程过程中，可以在存在LIF的情况下培养细胞；使用LIF可以在本发明的一些方面辅助重编程细胞，以改善细胞存活和集落生成(clonogenicity)。
A.一般性的干细胞培养条件
根据本发明的培养条件将根据所用的培养基和干细胞而适当地确定。根据本发明的一些方面的培养基可以这样制备：使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基，例如下列任意项：TeSR,BME,BGJb,CMRL 1066,Glasgow MEM,Improved MEM Zinc Option,IMDM,Medium 199,Eagle MEM,αMEM,DMEM,Ham,RPMI 1640和Fischer培养基，以及它们的任意组合，但是培养基不特别限定于这些，只要其能够用于培养动物细胞。
根据本发明的培养基可以是含血清或不含血清的培养基。不含血清的培养基是指不含未经处理的或未经纯化的血清的培养基，因此，可以包括含有纯化的源自血液的成分或源自动物组织的成分（例如生长因子）的培养基。从防止被异质的源自动物的成分污染的角度而言，血清可以源自与干细胞相同的动物。
根据本发明的培养基可以包含或不含任意血清替代品。血清替代品可以包括这样的物质：其适当的包括白蛋白（例如富脂白蛋白，白蛋白替代品例如重组白蛋白，植物淀粉，葡聚糖和蛋白水解产物），转铁蛋白（或其它铁转运子），脂肪酸，胰岛素，胶原前体，痕量元素，2-巯基乙醇，3’硫代甘油，或其等同物。血清替代品可以通过国际公开号98/30679中公开的方法来制备。或者，更方便地，可以使用任何商售的物质。商售物质包括：敲除血清替代物(knockout SerumReplacement)(KSR),化学上确定的浓缩脂(Chemically-defined Lipidconcentrated)(Gibco)和Glutamax(Gibco)。
本发明的培养基也可以包含脂肪酸或脂，氨基酸（例如非必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以是例如大约0.05至1.0mM，特别是大约0.1至0.5mM，但是浓度不特别限定于这些，只要其适合于培养干细胞。
用于培养干细胞的培养容器可以包括但不限于：瓶，组织培养瓶，皿，皮氏培养皿，组织培养皿，多皿(multi dish)，微量板，微孔板，多板(multi plate)，多孔板，微玻片，腔室玻片，管，盘，Chambers,培养袋和转瓶，只要其能够培养其中的干细胞。可以在至少或大约0.2,0.5,1,2,5,10,20,30,40,50ml,100ml,150ml,200ml,250ml,300ml,350ml,400ml,450ml,500ml,550ml,600ml,800ml,1000ml,1500ml或其中任意范围的体积培养干细胞，取决于培养需求。在一些实施方式中，培养容器可以是生物反应器，其可以指支持生物活性环境的任何装置或***。生物反应器可以具有至少或大约2,4,5,6,8,10,15,20,25,50,75,100,150,200,500升,1,2,4,6,8,10,15立方米或其中任意范围的体积。
培养容器可以是细胞粘附性的或非粘附性的，根据目的来选择。可以使用任何用于细胞粘附的基底例如细胞外基质(ECM)来涂覆细胞粘附性培养容器以改善容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的基底可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何材料。用于细胞粘附的基底包括胶原、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白及其混合物，例如MatrigelTM，和裂解的细胞膜制备物(Klimanskaya等人,2005)。
其它培养条件可以适当地确定。例如，培养温度可以是大约30°C至40°C，例如，至少或大约31,32,33,34,35,36,37,38,39°C，但不特别限定于这些。CO2的浓度可以是大约1%至10%，例如大约2%至5%，或其中的任意范围。氧压可以是至少或大约1%,5%,8%,10%,20%，或其中的任意范围。
在一些方面，本发明的方法可用于干细胞的粘附培养。在此情况下，可以在存在饲养细胞的情况下培养细胞。在本发明的方法使用饲养细胞的情况下，可以使用***例如胎儿成纤维细胞作为饲养细胞(例如，见：Hogan等人,Manipulating the Mouse Embryo,ALaboratory Manual(1994);Gene Targeting,A Practical Approach(1993);Martin(1981);Evans and Kaufman(1981);Jainchill等人,(1969);Nakano等人(1996);Kodama等人(1982);和国际公开号01/088100和2005/080554)。
在一些方面，本发明的方法也可用于干细胞的悬浮培养，包括在载体上的悬浮培养(Fernandes等人,2004)或凝胶/生物聚合物封装的悬浮培养(美国公开号2007/0116680)。术语“干细胞的悬浮培养”意思是：就培养容器或培养基中的饲养细胞(如果使用的话)而言，在非粘附条件下培养干细胞。干细胞的悬浮培养包括干细胞的解离培养和干细胞的聚集悬浮培养。术语“干细胞的解离培养”意思是：培养悬浮的干细胞，干细胞的解离培养包括单一干细胞或由多个干细胞组成的小的细胞聚集物(例如，大约2至400个细胞)的解离培养。当上述解离培养继续进行时，培养的、解离的细胞形成干细胞的较大的聚集体，此后可以进行聚集物悬浮培养。聚集物悬浮培养包括类胚体培养方法(见Keller等人,1995)和SFEB方法(Watanabe等人,2005;国际公开号2005/123902)。
B.多能干细胞的培养
取决于培养条件，多能干细胞能产生分化的细胞或未分化的细胞的集落。术语“分化”意思是细胞向发育途径的进展。术语“分化的”是描述细胞向发育途径进展的相对术语(与另一细胞相比)。例如，多能细胞能产生身体的任意细胞，而更分化的细胞例如造血细胞将产生少数细胞类型。
当群体中的大多数比例的干细胞及其衍生物显示出未分化的细胞的形态学特性时，多能干细胞的培养物被描述为“未分化的”，与胚胎或成体来源的分化的细胞清楚地区分开。本领域技术人员可识别未分化的ES或iPS细胞，在显微镜下通常二维显示为具有高核质比和突出的核仁的细胞集落。要理解：未分化的细胞的集落可以具有分化的邻近细胞。
可以通过在存在血清和饲养层的情况下（通常是小鼠胚胎成纤维细胞）培养细胞而将ES细胞维持在未分化的状态。用于将干细胞维持在未分化的状态的其它方法也是已知的。例如，可以通过在存在LIF、不存在饲养层的情况下培养而将小鼠ES细胞维持在未分化的状态。然而，与小鼠ES细胞不同，已存在的人ES细胞对于LIF无应答。可以通过在存在碱性成纤维细胞生长因子的情况下将ES细胞培养于成纤维细胞的饲养层而将人ES细胞维持在未分化的状态(Amit等人,2000)，或通过在蛋白质基质例如MatrigelTM或层粘连蛋白上培养、无饲养层、存在成纤维细胞条件化的培养基+碱性成纤维细胞生长因子来进行(Xu等人,2001;美国专利No.6,833,269)。
用于制备和培养ES细胞的方法可以见细胞生物学、组织培养和胚胎学的标准教科书和综述，包括：Teratocarcinomas and embryonicstem cells:A practical approach(1987);Guide to Techniques inMouse Development(1993);Embryonic Stem Cell Differentiation invitro(1993);Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy(1998),全部通过引用方式并入本文。组织培养中使用的标准方法一般性地描述于Animal Cell Culture(1987);Gene Transfer Vectors for MammalianCells(1987);和Current Protocols in Molecular Biology and ShortProtocols in Molecular Biology(1987 & 1995)。
将重编程因子导入体细胞或与体细胞接触之后，可以将这些细胞在足以维持多能性和未分化状态的培养基中培养。可以使用为了培养灵长类多能干细胞（更具体而言胚胎干细胞）而开发的多种培养基和技术来培养本发明中产生的诱导的多能干（iPS）细胞，如美国专利公开20070238170和美国专利公开20030211603和美国专利公开20080171385中所描述，通过引用方式并入本文。认识到，在本发明中可以使用如本领域技术人员已知的用于培养和维持多能干细胞的另外的方法。
在一些实施方式中，可以使用非确定条件，例如，多能细胞可以培养于成纤维细胞饲养细胞上或已经暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基中，以维持干细胞在未分化状态。
备选地，可以使用确定的、饲养物非依赖性培养***，例如TeSR培养基(Ludwig等人,2006a;Ludwig等人,2006b)将多能细胞培养并维持于基本上未分化状态。饲养物非依赖性培养***和培养基可用于培养并维持多能细胞。这些方法允许衍生的人iPS细胞以及人胚胎干细胞保持为基本上未分化的状态，而无需小鼠成纤维细胞“饲养层”。如本文所描述，可以视需要对这些方法进行多种改变以降低所需的成本。
多种基质成分可用于培养和维持人多能干细胞。例如，MatrigelTM、胶原IV、纤连蛋白、层连蛋白和玻连蛋白的组合可用于涂覆培养表面，作为提供用于多能细胞生长的固体支持物的方法，如Ludwig等人(2006a;2006b)所描述，其通过引用方式全文并入本文。特别地，MatrigelTM可用于提供用于细胞培养和维持人多能干细胞的基底。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的胶样蛋白混合物，并且可以通过商业途径从BD Biosciences(New Jersey,USA)获得。该混合物类似于存在于很多组织中的复杂的细胞外环境，并且被细胞生物学家用作细胞培养的基底。
C.细胞传代
本发明的一些方面可以进一步包括解离干细胞的步骤。可以使用任何已知的程序进行干细胞解离。这些程序包括：使用螯合剂(例如EDTA)、酶(例如胰蛋白酶、胶原酶)等进行处理，以及诸如机械解离(例如吸液)的操作。可以在解离之前和/或之后使用ROCK抑制剂处理干细胞。例如，可以仅在解离后处理干细胞。
在多能干细胞培养的一些其他实施方式中，一旦培养容器满了，可以通过任何适合用于解离的方法将集落分开为聚集的细胞，甚至是单一细胞，然后将细胞置于新的培养容器中以进行传代。细胞传代技术使得能够保持细胞存活并在培养条件下生长，持续延长的时间段。通常当细胞是大约70%至100%汇合度时传代细胞。
多能干细胞的单一细胞解离、然后进行单一细胞传代可用于本发明的方法中，其具有多个优点，例如促进细胞扩增、细胞分选和用于分化的确定的接种，并使得能够自动化进行培养程序和克隆扩增。例如，从单一细胞克隆性衍生的子代细胞在遗传结构上可以是匀质的和/或在细胞周期上是同步的，这可以增加靶向的分化。用于单一细胞传代的示例性方法描述于美国专利号20080171385，通过引用方式并入本文。
在一些实施方式中，多能干细胞可以被解离为单一的单个细胞，或单一的单个细胞的组合和包含2,3,4,5,6,7,8,9,10个细胞或更多个细胞的小的细胞簇。可以通过机械力或通过细胞解离剂、例如NaCitrate或酶、例如胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、TrypLE Select等进行解离。
基于多能干细胞的来源和扩增需求，可以将解离的细胞单一地或以小的聚簇的形式转移至新的培养容器中，以下列分传比进行：例如至少或大约1:2,1:4,1:5,1:6,1:8,1:10,1:20,1:40,1:50,1:100,1:150,1:200或其中的任意范围。悬浮细胞系分传比可以根据培养细胞悬浮液的体积进行。传代间隔可以是至少或大约每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20天或其中的任意范围。例如，用于不同的酶促传代程序的可实现的分传比可以是1:2每3–7天，1:3每4–7天，和1:5至1:10大约每7天，1:50至1:100每7天。当使用高分传比时，传代间隔可以延长至至少12–14天或不会由于过量的自发分化或细胞死亡而导致细胞损失的任意时间段。
在一些方面，可以在存在有效增加克隆效率和细胞存活的小分子的存在下进行单一细胞传代，例如如上文所述的ROCK抑制剂。此类ROCK抑制剂，例如Y-27632,HA-1077,H-1152或blebbistatin，可以以有效浓度使用，例如，至少或大约0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50至大约100μM，或其中的任意范围。
VII.iPS细胞的选择
在本发明的一些方面，在将一种或多种染色体外遗传元件导入体细胞之后，可以培养这些细胞以进行扩增(任选地，就载体元件、例如阳性选择或可筛选标志物的存在而进行选择，以浓缩转染的细胞)，这些遗传元件将在这些细胞中表达重编程因子，并随着细胞***而复制和分割。这些表达的重编程因子将重编程体细胞基因组，以建立自我持续的多能状态，同时或在除掉存在的载体的阳性选择之后，外源遗传元件将逐渐丧失。可以基于胚胎干细胞特性从源自这些体细胞的子代选择这些诱导的多能干细胞，因为预期它们与多能胚胎干细胞是实质上相同的。也可以使用另外的阴性选择步骤以加速或辅助选择基本上不含外源遗传元件的iPS细胞：其是通过测试重编程载体DNA的不存在，或使用选择标志物。
A.就胚胎干细胞特性进行选择
之前的研究中成功产生的iPSC在以下方面与天然分离的多能干细胞（例如小鼠和人胚胎干细胞，分别是mESC和hESC）是显著相似的，由此确认了iPSC相对于天然分离的多能干细胞的身份、真实性和多能性。因此，可以基于下列一个或多个胚胎干细胞特征来选择根据本发明公开的方法产生的诱导的多能干细胞。
i.细胞生物学特征
形态学：iPSC在形态上类似于ESC。每个细胞可以具有圆形、大的核仁和贫乏的细胞质。iPSC的集落也可以与ESC类似。人类iPSC形成具有明显边界的、平坦的、紧密聚集的集落，这与hESC类似；小鼠iPSC形成与mESC类似的集落，不如hESC的集落平坦，比hESC的集落聚集度更高。在一些实施方式中，本发明的方法可以产生大的人iPS细胞，其可以具有至少或大约1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5mm或其中任意范围的直径，并可以与非iPS细胞容易地区分开。
生长特征：加倍时间和有丝***活性是ESC的要素，因为干细胞必须自我更新（作为其定义的一部分）。iPSC在有丝***活性、自我更新活性、增殖和***速率方面可以与ESC相同。
干细胞标志物：iPSC可以表达在ESC上表达的细胞表面抗原性标志物。人类iPSC表达hESC特异性的标志物，包括但不限于SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E和Nanog。小鼠iPSC表达SSEA-1但不表达SSEA-3也不表达SSEA-4，这与mESCs是类似的。
干细胞基因：iPSC可以表达在未分化的ESC中表达的基因，包括Oct-3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。
端粒酶活性：端粒酶是维持细胞***不受Hayfick极限（～50次细胞***）限制所必需的。人ESC表达高端粒酶活性，以维持自我更新和增殖，iPSC也显示出高端粒酶活性并表达hTERT（人端粒酶逆转录酶），其为端粒酶蛋白复合物中的必要成分。
多能性：iPSC将能够以类似于ESC的方式分化为完全分化的组织。
神经的分化：iPSC可以分化成神经元，表达βIII-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、AADC、DAT、ChAT、LMX1B和MAP2。儿茶酚胺相关的酶的存在可以指示iPSC（类似于hESC）可以分化成为多巴胺能神经元。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。
心脏的分化：iPSC可以分化为心肌细胞，其自发开始跳动。心肌细胞表达TnTc、MEF2C、MYL2A、MYHCβ和NKX2.5。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。
畸胎瘤形成：注射进入免疫缺陷型小鼠的iPSC可以在一定时间之后（例如9周）自发形成畸胎瘤。畸胎瘤是含有源自三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的组织的多谱系肿瘤；这与其它肿瘤不同，其它肿瘤通常仅是一种细胞类型。畸胎瘤的形成是测定多能性的标志。
类胚体：培养物中的hESC自发形成球状胚胎样结构，其被称作“类胚体”，其由具有有丝***活性的和分化中的hESC的核心和来自所有三个胚层的完全分化的细胞的***组成。iPSC也可以形成类胚体并具有外周分化的细胞。
胚泡注射：人ESC天然地驻留于胚泡的内细胞群（成胚区）内，在成胚区中分化为胚胎；而胚泡的壳（滋养层）分化为胚胎外的组织。中空的滋养层不能形成活的胚胎，因此，成胚区中的胚胎干细胞必须分化并形成胚胎。通过微量吸液将iPSC注射进入滋养层以产生被转移进入雌性受体的胚泡，这可能导致产生嵌合的活的小鼠幼崽：具有10%-90%的嵌合性，遍布其全身掺入了iPSC衍生物的小鼠。
ii.表观遗传学的重编程
启动子去甲基化：甲基化是甲基被转移至DNA碱基，通常是甲基被转移至CpG位点（邻近的胞嘧啶/鸟嘌呤序列）中的胞嘧啶分子。基因的广泛甲基化会通过抑制表达蛋白的活性或募集干扰表达的酶而对表达产生干扰。因此，基因的甲基化会通过阻止转录而有效地使其沉默。多能性相关的基因（包括Oct-3/4、Rex1和Nanog）的启动子可能在iPSC中被去甲基化，显示出其启动子活性以及与多能性相关的基因在iPSC中的活性启动和表达。
组蛋白去甲基化：组蛋白是在结构上定位于DNA序列的紧凑的蛋白，其可以通过多种染色质相关的修饰发挥其活性。与Oct-3/4、Sox2和Nanog相关的H3组蛋白可以被去甲基化以激活Oct-3/4、Sox2和Nanog的表达。
B.就“无残余”特征进行选择
本发明中的重编程载体例如基于oriP的载体可以在染色体外复制，在数代之后在宿主细胞中不再存在。然而，针对基本上不含异源载体元件的子代细胞的另外的选择步骤可以促进该过程。例如，可以提取子代细胞样品以测试异源载体元件的存在或丧失，如本领域已知(Leight and Sugden,2001)。
重编程载体还可以包含选择标记物，更具体为阴性选择标记物，例如编码胸苷激酶的基因，以选择基本上不含此类选择标记物的子代细胞。人单纯疱疹病毒胸苷激酶1型基因(HSVtk)作为哺乳动物中的条件化致死标记物。HSVtk编码的酶能够将一些核苷类似物(例如更昔洛韦,一种抗疱疹药物)磷酸化，从而将它们转化为毒性的DNA复制抑制剂。备选的或互补的方法是测试异源遗传元件在子代细胞中的不存在，使用常规方法进行，例如RT-PCR,PCR,FISH(荧光原位杂交),基因阵列或杂交(例如Southern印迹)。
VIII.载体构建和递送
在一些实施方式中，重编程载体可以被构建为包含除了如上所述的编码重编程因子的核酸序列之外的另外的元件，以在细胞中表达这些重编程因子。这些方法的一个特征是使用染色体外的复制载体，其将不整合进入宿主细胞基因组并且可以在复制世代中丧失。以下公开了这些载体成分和递送方法的详细信息。
A.载体
基于质粒或基于脂质体的染色体外载体，例如基于oriP的载体和/或编码EBNA-1的衍生物的载体的使用允许将大的DNA片段导入细胞并维持在染色体外，每个细胞周期复制一次，在子细胞间有效分配，并基本上不引发免疫应答。特别地，EBNA-1，负责基于oriP的表达载体的复制的病毒蛋白，不引发细胞免疫应答，因为其已产生了绕过将其抗原呈递于I类MHC分子所需的过程的有效机制(Levitskaya等人,1997)。此外，EBNA-1能够反式作用以增强克隆的基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆的基因之表达高达100倍(Langle-Rouault等人,1998;Evans等人,1997)。最后，此类基于oriP的表达载体的制备是便宜的。
其它的染色体外载体包括：其它的基于淋巴营养疱疹病毒的载体。淋巴营养疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如人类B淋巴母细胞)中复制的疱疹病毒，其在其天然生命周期的一部分中变为质粒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养”疱疹病毒。示例性的淋巴营养疱疹病毒包括但不限于：EBV、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV),松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。还考虑到基于游离体的载体的其它来源，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。
本领域技术人员将完全具备通过标准重组技术构建载体的能力(参见，例如Maniatis等人,1988and Ausubel等人,1994，二者通过引用方式并入本文)。
载体还可以包含其它成分或功能，它们进一步调节基因递送和/或基因表达，或为靶向的细胞提供有益特征。此类其它成分包括例如，影响与细胞的结合或影响靶向细胞的成分（包括调节细胞类型或组织特异性结合的成分）；影响细胞对载体核酸的摄取的成分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的成分（例如调节细胞核定位的试剂）；以及影响多核苷酸表达的成分。
此类成分也可以包括标志物，例如可检测和/或选择标志物，其可用于检测或选择那些已经摄取并表达由载体递送的核酸的细胞。此类成分可以作为载体的天然特征提供(例如使用某些病毒载体，其具有介导结合和摄取的成分或功能)，或者可以修饰载体以提供此类功能。大量的此类载体是本领域已知的，并且一般是可获得的。当载体被维持在宿主细胞中时，载体可以作为自主结构在有丝***过程中由细胞稳定复制，并入宿主细胞的基因组中，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
B.调节元件
载体中包括的真核细胞表达盒特别包含（以5’至3’的方向）：与蛋白编码序列可操作地连接的真核细胞转录启动子、剪接信号（包括***序列）以及转录终止/多腺苷化序列。
i.启动子/增强子
“启动子”是控制序列，其为核酸序列的区域，在该区域控制转录的起始和速率。其可以包含可与调节性蛋白和分子例如RNA聚合酶和其它转录因子结合的遗传元件，以起始核酸序列的特定转录。词语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在……控制下”和“在……转录控制下”意思是启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录起始和/或表达。
适合用于本发明的编码EBNA-1的载体中的启动子是这样的启动子：其指导编码EBNA-1蛋白的表达盒之表达，以产生足够的稳定水平的EBNA-1蛋白，以稳定维持含有EBV oriP的载体。也可使用用于有效表达编码重编程因子的表达盒的启动子。
启动子一般包含这样的序列：其作用是定位RNA合成的起始位点。这样的序列的最有名的实例是TATA盒，但是一些启动子缺少TATA盒，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸基转移酶基因的启动子，以及SV40晚期基因的启动子，起始位点本身之上的离散元件辅助固定起始位置。另外的启动子元件调节转录启动的频率。通常而言，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，虽然已经表明很多启动子也包含位于起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制之下”，人们将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选的启动子的下游（即置于其3’端）。处于上游的“启动子”刺激DNA的转录并促进所编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是灵活可变的，所以，当元件被倒置或彼此相对发生移动时，能够保持启动子的功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增至相隔50bp，此后发生活性的下降。取决于启动子，似乎单个元件可以协调发挥作用或独立地激活转录。启动子可以与增强子联用或者不与之联用，增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然结合的启动子，其可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列来获得。此类启动子可以被称作“内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然结合的增强子，位于该序列的下游或上游。可替代地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子（即在其天然环境中通常不与核酸序列结合的启动子）控制下将会产生某些益处。重组或异源增强子是指在其天然环境中通常不与核酸序列结合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及分离自任意其它病毒或原核或真核细胞的启动子或增强子，以及“天然不存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在构建重组DNA时最常使用的启动子包括β-内酰胺酶（青霉素酶）、乳糖和色氨酸（trp）启动子***。除了通过合成方式产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术来产生序列，包括PCRTM，并联合本文公开的成份(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，每篇通过引用并入本文)。此外考虑到，也可以使用非细胞核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的指导序列转录和/或表达的控制序列。
通常而言，使用有效指导DNA区段在所选的用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中的表达的启动子和/或增强子具有重要意义。分子生物学领域技术人员一般知晓用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型的组合之使用（参见例如Sambrook等人1989，通过引用并入本文）。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或可用于在合适条件下指导所导入的DNA区段的高水平表达的启动子，这在大规模生产重组蛋白和/或肽中具有优势。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合（按照例如真核细胞启动子数据库EPDB,通过epd.isb-sib.ch/访问互联网)也可用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达***是另一个可能的实施方式。如果提供合适的细菌聚合酶（作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体），真核细胞可以支持从某些细菌启动子进行细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子，细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子(Ng,1989;Quitsche等人,1989)、GADPH启动子(Alexander等人,1988,Ercolani等人,1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等人,1989;Richards等人,1984)；以及级联应答元件启动子，例如环式AMP应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最简TATA盒附近的应答元件启动子(tre)。还可以使用人类生长激素启动子序列(例如，描述于Genbank的人类生长激素最简启动子，登记号X05244的核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可以从ATCC,Cat.No.ATCC 45007获得)。具体实例可以是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
ii.起始信号和内部核糖体结合位点
特定的起始信号可能是编码序列的有效翻译所需的。这些信号包括：ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供异源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将容易地能够确定这一点并提供必要的信号。熟知的是，起始密码子必须与所需的编码序列的读卡框在同一框内，以确保整体***序列的翻译。异源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过加入合适的转录增强元件来增强表达效率。
在本发明的一些实施方式中，内部核糖体进入位点(IRES)元件用于产生多基因的或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模式，并在内部位点启动翻译(Pelletier andSonenberg,1988)。已经描述了来自微小核醣核酸病毒家族的两个成员(灰质和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier and Sonenberg,1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak and Sarnow,1991)。IRES元件可以连接于异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每个由IRES分开，产生多顺反子信息。通过IRES元件，每个开放阅读框可靠近核糖体以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子可以有效表达多个基因，以转录单一信息(见，例如美国专利号5,925,565和5,935,819，各自通过引用方式并入本文)。
iii.多克隆位点
载体可以包括多克隆位点（MCS），其是包含多个限制性酶位点的核酸区域，所述酶中的任意种可用于根据标准重组技术来消化该载体（参见，例如Carbonelli等人,1999,Levenson等人,1998,和Cocea,1997,通过引用并入本文）。“限制性酶消化”是指以仅在核酸分子的特定位置发挥作用的酶催化性切割核酸分子。很多这样的限制性酶是商业上可以获得的。本领域技术人员普遍理解此类酶的使用。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列连接进入载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是彼此连续的或不连续的。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员熟知的。
iv.剪接位点
多数经转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录本中除掉内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保转录本的正确加工以表达蛋白(参见，例如Chandler等人,1997,通过引用并入本文)。
v.终止信号
本发明的载体或构建体一般将包括至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包含参与通过RNA聚合酶特异性终止RNA转录本的DNA序列。因此，在一些实施方式中涉及结束RNA转录本产生的终止信号。终止子可能是体内所必需的以实现想要的信使水平。
在真核***中，终止子区域还可以包含特定的DNA序列，其允许新转录本的位点特异性切割，从而暴露多腺苷化位点。这会向专职的内源聚合酶发出信号，使其将一串大约200个残基A（多聚A）添加到转录本的3’末端。经此多聚A尾巴修饰的RNA分子表现得更加稳定并且更有效地被翻译。因此，在其它涉及真核细胞的实施方式中，优选地，终止子包含用于RNA切割信号，更优选地，终止子信号促进信使的多聚腺苷化。终止子和/或多聚腺苷化位点元件可用于增强信使水平，并使从盒读入其它序列的读取最小化。
考虑到用于本发明的终止子包括如本文描述的或本领域普通技术人员已知的任意已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在一些实施方式中，终止信号可以是可转录或可翻译序列的缺失，例如由于序列截短所造成的。
vi.多腺苷化信号
在表达时，尤其是真核表达时，通常会包括多腺苷化信号以进行转录本的正确的多腺苷化。人们认为多腺苷化信号的性质对于本发明的成功实施不是关键性的，可以使用任意此类序列。优选的实施方式包括SV40多腺苷化信号或牛生长激素多腺苷化信号，它们在多种靶细胞中是方便的且已知它们的作用是很好的。多腺苷化可以增强转录本的稳定性或者可以促进细胞质转运。
vii.复制起始点
为了在宿主细胞中繁殖载体，载体可以包括一个或多个复制起始位点(通常称作“ori”)，例如，对应于如上文描述的EBV的oriP的核酸序列，其为特定的核酸序列，在该核酸序列处，复制被起始。备选地，可以使用如上所述的其它染色体外复制性病毒的复制起始点或自主复制序列(ARS)。
viii.选择和可筛选标志物
在本发明的一些实施方式中，可以通过在表达载体中加入标志物而在体外或体内鉴定含有本发明的核酸构建体的细胞。此类标志物将赋予细胞可鉴定的变化，允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。一般地，选择标志物是赋予允许进行选择的性质的标志物。阳性选择标志物是这样的标志物：它的存在允许就其进行选择，而阴性选择标志物是这样的标志物：它的存在阻止其被选择。阳性选择标志物的实例是药物抗性标志物。
通常，加入药物选择标志物会辅助转化子的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的施用来区分转化子的表型的标志物以外，也考虑到其它类型的标志物，包括可筛选标志物，例如GFP，其基础是显色反应。备选地，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将知晓如何使用免疫标志物，可能联合FACS分析。所用的标志物不被认为是重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择和可筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员熟知的。
C.载体递送
在本发明中，将重编程载体导入体细胞中可以使用任何合适的用于核酸递送以转化细胞的方法，如本文所描述或如本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于，DNA的直接递送，例如通过离体转染(Wilson等人,1989,Nabel等人,1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每篇通过引用并入本文)，包括微注射(Harland and Weintraub,1985;美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文;Tur-Kaspa等人,1986;Potter等人,1984)；通过磷酸钙沉淀(Grahamand Van Der Eb,1973;Chen and Okayama,1987;Rippe等人,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，然后通过聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接的声波载入(sonic loading)(Fechheimer等人,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982;Fraley等人,1979;Nicolau等人,1987;Wong等人,1980;Kaneda等人,1989;Kato等人,1991)和受体介导的转染(Wu and Wu,1987;Wu and Wu,1988)；通过微弹轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128;美国专利号5,610,042;5,322,783,5,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，每篇通过引用并入本文)；通过以碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等人,1990;美国专利号5,302,523和5,464,765，每篇通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人,1985)，以及任意此类方法的组合。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬间地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
i.脂质体介导的转染
在本发明的一些实施方式中，核酸可以包载在脂复合物例如脂质体中。脂质体是囊泡结构，其特征在于磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。在形成封闭结构并将水和溶解的溶质包载在脂双层之间以前，脂成分会经历自我重排(Ghosh and Bachhawat,1991)。还考虑到核酸与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)的复合。所使用的脂质体的量可以根据脂质体的性质以及所使用的细胞而变化，例如，考虑到大约5μg至大约20μg载体DNA/1-10x106个细胞。
在体外进行脂质体介导的核酸递送和外源DNA的表达已经是非常成功的(Nicolau and Sene,1982;Fraley等人,1979;Nicolau等人,1987)。也已经证明了脂质体介导的外源DNA递送和在培养的鸡胚胎、HeLa和肝细胞瘤细胞中表达的可行性(Wong等人,1980)。
在本发明的一些实施方式中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。已经表明这会促进与细胞膜的融合并促进脂质体包载的DNA进入细胞(Kaneda等人,1989)。在其它实施方式中，脂质体可以与细胞核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与之结合使用(Kato等人,1991)。在其它实施方式中，脂质体可以与HVJ和HMG-1二者复合或与之结合使用。在其它实施方式中，递送介质可以包含配体和脂质体。
ii.电穿孔
在本发明的一些实施方式中，通过电穿孔法将核酸导入细胞器、细胞、组织或生物体。电穿孔包括将细胞悬浮液和DNA暴露于高压放电。可以通过机械击伤使受体细胞变得更加易于转化。同样，所使用的载体数量可以根据所使用的细胞的性质而变化，例如，考虑到大约5μg至大约20μg载体DNA/1-10x106个细胞。
通过电穿孔法转染真核细胞已经是相当成功的做法。已经以人类κ-免疫球蛋白基因转染了小鼠pre-B淋巴细胞(Potter等人,1984)，也已经按照这种方式以氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(TurKaspa等人,1986)。
iii.磷酸钙
在本发明的其它实施方式中，使用磷酸钙沉淀法将核酸导入细胞中。已经使用该技术以腺病毒5DNA转染了人类KB细胞(Grahamand Van Der Eb,1973)。同样，按照这种方式，已经以新霉素标志物基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(Chen and Okayama,1987)，并且以多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(Rippe等人,1990)。
iv.DEAE-葡聚糖
在其它实施方式中，使用DEAE-葡聚糖、然后以聚乙二醇将核酸递送进入细胞中。按照这种方式，将报告分子质粒导入了小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(Gopal,1985)。
v.声波载入
本发明的另外的实施方式包括通过直接声波载入法来导入核酸。已经通过声波载入法以胸苷激酶基因转染了LTK-成纤维细胞(Fechheimer等人,1987)。
vi.受体介导的转染
另外，可以通过受体介导的递送介质将核酸递送进入靶细胞。这利用了“靶细胞内发生的受体介导的细胞内吞作用选择性摄取大分子”这一优势。鉴于多种受体的细胞类型特异性分布，该递送方法增加了本发明的另外的特异性程度。
一些受体介导的基因靶向囊泡包括细胞受体特异性的配体和核酸结合试剂。其它的包括细胞受体特异性配体，待递送的核酸与之可操作地连接。有数种配体已被用于受体介导的基因转移(Wu and Wu,1987;Wagner等人,1990;Perales等人,1994;Myers,EPO 0273085)，其建立起了该技术的可行性。已经描述了另一种哺乳动物细胞类型情况下的特异性递送(Wu and Wu,1993;通过引用并入本文)。在本发明的一些方面，将配体选择为对应于在靶细胞群体上特异性表达的受体。
在其它实施方式中，细胞特异性核酸靶向囊泡的核酸递送介质成分可以包括与脂质体联合的特异性结合配体。待递送的核酸装在所述脂质体内，并且所述特异性结合配体官能地掺入所述脂质体的膜中。因此脂质体将特异性与靶细胞的受体结合并将内容物递送进入细胞。已经表明此类***是功能性的，使用了这样的***：例如，其中表皮生长因子（EGF）用于通过受体介导的核酸递送，递送进入显示出EGF受体上调的细胞中。
在其它实施方式中，靶向递送介质的核酸递送介质成分可以是脂质体本身，其特别包含一种或多种指导细胞特异性结合的脂或糖蛋白。例如，已经将乳糖酰基神经酰胺，半乳糖末端神经节苷脂，掺入脂质体，并且观察到肝细胞对胰岛素基因摄取的增加(Nicolau等人,1987)。考虑到可以按照类似方式将本发明的组织特异性转化构建体特异性递送进入靶细胞中。
vii.微弹轰击
微弹轰击技术可用于将核酸导入至少一个细胞器、细胞、组织或生物体(美国专利号5,550,318;美国专利号5,538,880;美国专利号5,610,042;和PCT申请WO 94/09699；每篇通过引用并入本文)。该方法依赖于将DNA包被的微弹加速至高速的能力，以允许它们穿过细胞膜并进入细胞而不杀死细胞(Klein等人,1987)。本领域已知有多种微弹轰击技术，其中很多可用于本发明。
在这种微弹轰击方法中，可以使用至少一个核酸包被一个或多个颗粒并通过推进力将其递送进入细胞。已经开发了数种用于加速小颗粒的装置。一种此类装置利用高压放电以产生电流，继而提供驱动力(Yang等人,1990)。所使用的微弹由生物惰性物质组成，例如钨或金颗粒或珠子。示例性的颗粒包括那些包含钨、铂、特别是金的颗粒。考虑到在一些情况下DNA沉淀到金属颗粒上对于通过微弹轰击将DNA递送进入受体细胞而言不是必需的。另一方面，也考虑到颗粒可以包含DNA而不是被DNA包被。DNA包被的颗粒可以增强通过颗粒轰击递送的DNA的水平，但是就其本身而言不是必需的。
为了进行轰击，将悬浮液中的细胞浓缩于纤维或固体培养基上。可替代地，可以将未成熟的胚胎或其它靶细胞排列于固体培养基上。将待轰击的细胞置于微弹阻停板下面合适的距离。
IX.实施例
包括了以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明时效果良好的技术，因此可以被认为是构成其实施的优选模式。但是，根据本公开文本，本领域技术人员应该认识到，可以不脱离本发明的精神和范围而对所公开的具体实施方式作出很多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1
使用小化合物游离重编程人***成纤维细胞
通过筛选已知的影响iPS细胞衍生的化合物，本发明人已经鉴定了数种显著改善人***成纤维细胞的游离重编程效率的化合物。BIX01294(B)是G9a组蛋白甲基转移酶的选择性抑制剂。与BayK8644联合，其最初被鉴定为能够重编程仅以Oct4和Klf4转导的小鼠胚胎成纤维细胞的小分子(Shi等人,2008)。PD0325901(P)是有丝***原激活的蛋白激酶激酶(MAPK/ERK激酶或MEK)的抑制剂。CHIR99021(C)是GSK3β的最有选择性的抑制剂，而A-83-01(A)是TGF-βI型受体ALK5、活化素/Nodal受体ALK4和nodal受体ALK7的强有力的抑制剂。PD0325901与CHIR99021的组合(2i)允许从顽固性株系有效衍生小鼠ES细胞(Ying等人,2008)。在该2i条件下，白血病抑制因子(LIF)(常规地被用于小鼠ES细胞培养，虽然是可有可无的)促进了小鼠ES细胞的集落生成和衍生(Ying等人,2008)。显示了该2i/LIF条件促进小鼠神经干细胞重编程为真正的多能性(Silva等人,2008)。有趣的是，虽然在该2i/LIF条件下可以容易地从早期胚胎衍生出真正的大鼠ES细胞(Buehr等人,2008;Li等人,2008)，但是显示A-83-01的加入对于维持大鼠iPS细胞的长期培养是必需的(Li等人,2009)。PD0325901,CHIR99021,A-83-01和LIF的组合也显示能够从慢病毒介导的重编程培养物中选择并稳定化非典型性小鼠ES细胞样人iPS细胞(Li等人,2009)；然而，这些抑制剂的组合对于重编程、尤其是游离重编程的影响尚无人报道。
对于细胞培养，将人ES细胞和iPS细胞维持在补充了20%敲除血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、1mM Glutamax(均来自Invitrogen,Carlsbad,CA)、0.1mM β-巯基乙醇和100ng/ml斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子(zbFGF)的DMEM/F12培养基中的经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上(Amit等人,2000;Ludwig等人,2006a;Thomson等人,1998)。按照之前的描述(Xu等人,2001)，使用条件化培养基，在MatrigelTM(BD Biosciences,Bedford,MA)上进行无饲养物的培养，只不过使用的是100ng/ml zbFGF。在补充了10%确定的胎牛血清(FBS,Hyclone Laboratories,Logan,UT),0.1mM非必需氨基酸,2mM Glutamax(all from Invitrogen),0.1mM β-巯基乙醇和4ng/ml zbFGF的DMEM(Invitrogen)中培养人新生儿***成纤维细胞(Cat#CRL-2097TM,ATCC,Manassas,VA)和来自42岁的皮肤活组织检查的成人成纤维细胞。mTeSRTM1获自Stem Cell Technologies Inc.(Vancouver,Canada)。N2B27培养基按照如下制备：DMEM/F12培养基补充1xN2补充物,1xB-27补充物,0.1mM非必需氨基酸,1mMGlutamax(均来自Invitrogen),0.1mM β-巯基乙醇。
为了游离重编程人的体细胞，将人***成纤维细胞、游离载体(图1A,7.3μgpEP4EO2SCK2MEN2L和3.2μgpEP4EO2SET2K)(Yu等人,2009)通过核转染法共转染进入1x106个细胞(NHDF-VPD-1001，使用程序U-20,Amaxa,Walkersville,MD)。将来自每个核转染的经转染的***成纤维细胞直接铺板于3x 10-cm接种了MEF的培养皿中的成纤维细胞培养基中。对于成人皮肤成纤维细胞，将7.3μgpEP4EO2SCK2MEN2L和6.4μgpEP4EO2SET2K通过核转染法共转染进入1x106个细胞(NHDF-VPD-1001，使用程序U-20,Amaxa)。将来自每个核转染的经转染的成人皮肤成纤维细胞直接铺板于1x10-cm接种了MEF的培养皿中的成纤维细胞培养基中(因为细胞存活较低)。次日，将成纤维细胞培养基替换为新鲜的成纤维细胞培养基或多种重编程培养基(例如，之前经过MEF–条件化的人ES细胞培养基CM，人ES细胞培养基，mTeSRTM1,N2B27)，所述培养基补充或不补充zbFGF(100ng/ml)，含有或不含有下列化合物：H-HA-100(10μM);B-BIX01294(1μM);P-PD0325901(0.5μM);C-CHIR99021(3μM);A-A-83-01(0.5μM)和L-hLIF(10ng/ml)。为了获得人ES细胞样iPS细胞，在转染后第13-20天将重编程培养基替换为补充了100ng/ml zbFGF的CM或mTeSRTM1。为了获得独特类型的iPS(piPSC代表部分重编程的iPSC)细胞，将重编程培养基替换为补充了PCAL的CM或N2B27培养基。在转染后第18至24天进行碱性磷酸酶染色(Cat#SCR004,Millipore,Billerica,MA)，以检查重编程效率。
BIX01294，虽然其自己能够改善游离载体的重编程(图1A)，但是与PD0325901,CHIR99021和A-83-01组合时显示出无益处或仅有微小益处(图1B和2A)。与小鼠神经干细胞重编程(Silva等人,2008)(其中PD0325901和CHIR99021单独是足够的)不同，需要所有3种化合物(PD0325901,CHIR99021和A-83-01)以实现最佳重编程效率(图1B)。在存在所有3种化合物的情况下，所获得的iPS细胞集落可以容易地与非iPS细胞集落区分开(图1C)。这将允许在挑取和扩增过程中维持iPS细胞的克隆形成能力，相对于以前的程序(Yu等人,2009)是巨大的改进，在以前的程序中，需要进行原代重编程培养物的传代以从非iPS细胞鉴别iPS细胞。显示HA-100能改善人ES细胞克隆效率。在实验的子集中包括了它。人LIF(hLIF或L)的加入进一步促进了使用PD0325901,CHIR99021和A-83-01的游离重编程(图2A)。此外，在加入了LIF的情况下，iPS细胞的第一次出现早了大约3-4天(大约在转染后第14天)，并且存在更多大的iPS细胞集落(图2A)。
由于PD0325901有效抑制MEK活性(MEK是bFGF信号传导的下游靶标)，所以还测定了bFGF对于重编程的影响。如图2A所示，在该特定的重编程条件下，高浓度的bFGF(100ng/ml)是有益的。该效应最有可能是来源于高水平的bFGF的非MEK介导的效应。高水平的bFGF的效应显示出依赖于特定的重编程培养基。例如，当使用条件化人ES细胞培养基(CM)和无血清的确定的N2B27培养基时，bFGF显示出有益效应(图2A和4A)，而当测试非条件化的人ES细胞培养基时，观察到相反的效应(图4A)。如图2B所示，化合物的早期加入增大了重编程效率，并且需要较长的化学处理以实现最佳的重编程效率。
人ES细胞和人ES细胞样iPS细胞的增殖需要FGF和TGFβ/活化素信号传导途径的激活，类似于从移植后小鼠外胚层衍生的小鼠EpiSC。PD0325901抑制MEK，MEK是FGF信号传导的下游靶标，A-83-01抑制TGFβ/活化素信号传导。这两种药物增加重编程，该发现是相当令人吃惊的。如图3A所示，在存在重编程化学混合物(PD0325901,CHIR99021,A-83-01和hLIF)的情况下，人ES细胞和人ES细胞样iPS细胞都进行有效的分化。为了确认在存在化学混合物的情况下衍生的iPS细胞的身份，挑取iPS细胞在正常人ES细胞培养条件下进行扩增。最初的测试产生了很多分化的集落，具有未分化的细胞的小的簇集，这与在不存在化学混合物的情况下衍生的iPS细胞是非常不一样的，在后一种情况下，多数集落保持未分化。该结果说明：在存在化学混合物的情况下衍生的多数iPS细胞与正常的人ES细胞样iPS细胞是不同的。
在存在化学混合物的情况下，可以挑取iPS细胞并在小鼠胚胎成纤维细胞饲养物上扩增(图3C)，虽然具有很多分化；这说明需要培养的优化。除掉化学混合物(通过在正常人ES细胞培养条件下培养这些iPS细胞)产生了显著的分化，其中很多形成花结(rosette)结构(图3D)，这说明这些细胞能够有效在体外神经分化，与之前衍生的多数人iPS细胞不同。这些数据和关于hLIF改善重编程的观察说明这种类型的人iPS细胞不同于正常的人ES细胞样iPS细胞，后来发现是中间阶段的重编程的细胞。
当挑取化学衍生的iPS细胞并在正常人ES细胞培养条件下扩增时，存在未分化细胞的小的簇集，这提出了下列可能性：也可以从化学处理的重编程培养物衍生正常的人ES细胞样iPS细胞。确实，当在最小10天的处理之后从重编程培养物除掉化学混合物时，在正常人ES细胞培养条件下容易地扩增了正常的人ES细胞样iPS细胞(图3B)。这些iPS细胞的来源仍然是有趣的问题。它们可能从先前存在的正常人ES细胞样iPS细胞扩增而来，或者它们可能从piPS细胞衍生而来，因为piPS细胞在正常人ES细胞培养条件下能容易地产生正常人ES细胞样iPS细胞。
人的体细胞的重编程一般是在MEF饲养物上使用之前以MEF条件化的人ES细胞培养基(CM)进行的。MEF的质量在不同的批次之间差别很大，这会大大影响重编程效率的一致性。MEF和CM的制备是非常耗费人力的。另外，MEF饲养物和CM都支持多种细胞类型的生长，这可能对重编程效率造成显著限制，因为重编程过程中非iPS细胞的增殖可能对重编程造成不利影响。为了克服该问题，测试了不同的培养基。如图4A所示，TeSR、未条件化的无bFGF补充物的人ES细胞培养基和N2B27培养基支持有力的游离重编程，比补充了bFGF的CM更高。
此外，不同的重编程培养基(步骤2，图4B)以不同效率产生了两种类型的iPS细胞。取决于所使用的重编程培养基，获得两种类型的iPS细胞的效率是不同的，如图4A所示。例如，当hESC培养基(+PCALH)用于重编程时，可以使用CM+bFGF或TeSR扩增培养基从重编程培养物容易地获得人ES细胞样iPS细胞，当使用N2B27+PCAL扩增培养基时，则为piPS细胞。然而，当使用N2B27培养基(+PCALH)作为重编程培养基时，未获得或获得极少的人ES细胞样iPS细胞。
这说明重编程培养基(步骤2，图4B)和扩增培养基(步骤3，图4B)的组合可能影响重编程培养物中的iPS细胞异质性水平。可以选择用于衍生每个iPS细胞类型的最佳培养基组合以使iPS细胞克隆与克隆间的差异最小化。
实施例2
使用小分子的无饲养物的游离重编程
人iPSC，类似于人胚胎干细胞(ESC)，能够无限增殖并具有分化为身体的所有细胞类型的潜力。因此，这些细胞在基础生物学、疾病模拟、药物开发和移植治疗中具有应用。通过表达重编程因子的确定的组合，已经从不同物种的很多细胞类型产生了iPSC(Takahashi等人,2007;Yu等人,2007;Takahashi and Yamanaka,2006;Liu等人,2008;Esteban等人,2009;Loh等人,2009;Sun等人,2009;Shimada等人,2010)。最初的用于产生iPSC的方法使用基因组整合型逆转录病毒或慢病毒载体(Yu等人,2007;Takahashi and Yamanaka,2006)。这些方法可能产生致肿瘤形成性***突变，并且iPSC分化过程中转基因表达的残余或重激活可能影响谱系选择和iPSC衍生物的功能(Yu等人,2007;Okita等人,2007)。为了克服这些问题，开发了多种方法以产生无印迹的iPSC，包括使用重编程因子(质粒、微环DNA、非整合腺病毒载体和蛋白)、转位子和RNA病毒载体反复处理(Okita等人,2008;Stadtfeld等人,2008;Fusaki等人,2009;Kaji等人,2009;Woltjen等人,2009;Zhou等人,2009;Jia等人,2010)。然而，这些方法具有下列一项或多项局限性：不可接受的低的重编程效率；费力地从iPSC除掉重编程因子；需要病毒包装或饲养细胞。因此，需要开发一种简单的且有效的无饲养物的能够从很多人供体样品常规衍生无印迹的iPSC并最终衍生临床级别的人iPSC的方法。
之前使用oriP/EBNA-1(Epstein-Barr核抗原-1)游离载体递送重编程基因(OCT4,SOX2,NANOG,LIN28,c-MYC,KLF4和SV40LT)产生了无印迹的人iPSC(Yu等人,2009)。与其他方法相比，该方法具有几个优点。第一，oriP/EBNA-1载体具有宽的宿主细胞范围，使得能够应用该方法至很多人类细胞类型。第二，其不需要病毒包装。第三，无需使用重编程因子反复处理。单次转染游离载体足以衍生人iPSC。此外，使用这些载体可实现较高的转染效率，因为oriP/EBNA-1介导载体DNA的细胞核输入和保持(Middleton and Sugden,1994)。第四，oriP/EBNA-1载体每个细胞周期复制一次，一般以低拷贝数/细胞存在，因此使DNA重排和基因组整合最小化(Yates and Guan,1991)。最后，可以通过简单的细胞培养从人iPSC除掉游离载体，无需任何额外操作，因为驱动EBNA-1在iPSC中表达的病毒启动子沉默，以及，oriP/EBNA-1游离状态的内在不稳定性——稳定建立的游离体以大约5%/细胞世代的速度从细胞中丧失，这是由于载体合成和分割上的缺陷(Nanbo等人,2007)。虽然有这些优点，但是我们的最初的oriP/EBNA-1游离方法给出的重编程效率低下(从~1x106个输入人***成纤维细胞产生~3个iPSC集落)，并且使用了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞，其严重限制了该方法在工业和治疗上的应用。
为了克服这些局限性，我们首先就改善的游离重编程效率筛选了小分子。oriP/EBNA-1载体仅能在1%-10%的转染的细胞中建立稳定的游离体(Leight and Sugden,2001)。在转染后的头2周内，转染的细胞以>25%/细胞世代的速率丧失oriP/EBNA-1，伴有可能是通过DNA甲基化介导的转基因沉默(Kameda等人,2006)。转染后头两周内的转基因表达的丧失(由于载体丧失或转基因沉默)，是造成低游离重编程效率的主要因素。因此预期：能加速重编程过程或减少转基因沉默或增加稳定游离体建立效率的小分子会改善重编程。通过测试之前已知会促进重编程的小分子，我们发现通过加入MEK抑制剂PD0325901、GSK3β抑制剂CHIR99021和TGF-β/活化素/Nodal受体抑制剂A-83-01可大大增强游离重编程效率(图5A)。之前的研究表明：TGF-β信号传导抑制剂与MEK抑制剂PD0325901一起引起病毒重编程效率超过100倍的增加(Lin等人,2009)。如图1a所示，TGF-β信号传导抑制剂A-83-01，无论是其自己还是与MEK抑制剂PD0325901一起，对于游离重编程影响极小。需要所有三种抑制剂PD0325901、CHIR99021和A-83-01以实现重编程效率的最大化增加。人类白血病抑制因子(hLIF)，虽然不显著改善游离重编程效率，但是增加了重编程中间体的增殖。ROCK抑制剂HA-100，虽然其自己的作用极小，但是在存在PD0325901、CHIR99021、A-83-01和hLIF的情况下进一步增加了游离重编程效率。HA-100的效应可能不是通过其在促进个体化的人iPSC的细胞存活中的作用而介导的，因为其不能被具有相似功能的其它抑制剂例如H-1152和blebbistatin代替(Watanabe等人,2007;Chen等人,2010)。游离重编程效率的增加与小分子处理的持续时间相关联(图5B)。特别地，在转染后第1天至第5天处理显示出对于它们的最大效应具有重要意义。
人ESC显示出与小鼠外胚层衍生的干细胞(EpiSC)相似的基因表达和培养要求，与衍生于较早的胚泡期的小鼠ESC不同。之前的研究证明了PD0325901,CHIR99021,A-83-01和hLIF从先前未暴露于这些抑制剂的重编程培养物扩增小鼠ESC样人iPSC的能力(Li等人,2009)。在除掉这些小分子之后，这些小鼠ESC样人iPSC容易分化。与此相反，在存在这些小分子的情况下，人ESC迅速分化。令人惊奇的是，在持续存在小分子的情况下获得的人游离iPSC显示出良好的增殖，在针对人ESC（无小分子）的条件下极少分化，但是当在用于其衍生的相同条件(即存在小分子)下挑取和扩增时，发生广泛分化(图5C)，这说明这些iPSC可能处于与人ESC、而非小鼠ESC相似的多能状态。看起来矛盾的结果可以这样解释：存在这样的活性，其降低小分子在用于重编程的MEF条件化的人ESC培养基中的有效性(例如bFGF和TGF-β信号传导受体)，这可能使得能够在存在小分子的情况下产生人ESC样多能状态。
由于在人ESC培养基中使用的KnockOutTM血清替代物含有可能干扰重编程的未知因子，为了确定我们是否能够通过使用不含降低小分子活性的培养基有效产生小鼠ESC样iPSC，并且为了鉴定确定的重编程条件，进行了实验以寻找可以支持游离重编程的确定的培养基。具体地，测试了确定的N2B27培养基，其具有简单的配方，并且当补充细胞因子时，能够支持人ESC的增殖(Liu等人,2006)。如图6A所示，补充了小分子的N2B27培养基产生接近6倍数目的碱性磷酸酶(人多能干细胞标志物)阳性染色的集落(测试2相对于测试1)。这些集落(piPSC代表部分重编程的iPSC)具有小鼠ESC样半球形的形态，与人ESC样iPSC集落的典型的平坦形态不同(图6B)。可以在补充了小分子的N2B27培养基中挑取并扩增它们，持续7个传代以上。然而，这些细胞的流式细胞术分析未检测到人多能干细胞特异性抗原(SSEA-3,SSEA-4,Tra-1-60和Tra-1-81)的表达，但是存在成纤维细胞标志物CD44的表达(图10A)。定量RT-PCR分析也未检测到内源性OCT4和NANOG的任何表达，它们是人多能干细胞的两个必不可少的标志物(图6C)。这些结果说明：集落是部分重编程的iPSC，不是如使用MEF条件化的人ESC培养基衍生的人ESC样iPSC(测试1)或在存在PD0325901,CHIR99021和LIF的情况下通过病毒衍生的小鼠ESC样iPSC，因此说明了重编程培养条件对于iPSC的多能状态的重要影响(Hanna等人,2010;Buecker等人,2010)。有趣的是，即使是在补充了小分子的N2B27培养基中经过多次传代之后，piPSC仍然包含足够的游离载体并维持高水平的转基因表达(图6C和图10B)，这说明小分子可能参与游离载体和转基因的保持。小分子的除去导致在确定的人ESC培养基mTeSR1中培养piPSC两周之后，在广泛分化中偶然出现人ESC样iPSC。因此，虽然目前的重编程条件未能产生小鼠ESC样人游离iPSC，但是可以修改重编程程序以使得能够在N2B27培养基中衍生人ESC样iPSC。
为此，在使用mTeSR1时，本发明人将重编程过程分为3个阶段：转染(阶段1)，重编程(阶段2)和扩增(阶段3)(图6A)。当在阶段2中使用补充了小分子的N2B27培养基以支持重编程时，仅可观察到极少的piPSC转化为人ESC样iPSC，这说明在mTeSR1中的扩增过程中转基因表达不足以重新激活多数piPSC中内源性多能基因的表达。因此，本发明人测定了是否可能通过在补充了小分子的N2B27培养基中加入额外的细胞因子来改善游离重编程(阶段2)。在人ESC增殖中牵涉的因子中，bFGF和TGF-β/活化素/Nodal信号传导具有特别重要的意义。由于A-83-01对于TGF-β/活化素/Nodal信号传导的抑制会促进重编程(图5A)，本发明人测试了bFGF对于游离重编程的影响。的确，向N2B27培养基中加入高浓度的bFGF产生了合理数目的人ESC样iPSC集落(测试3)(图6A)。该结果与之前的观察即“高浓度的bFGF通过除了MEK之外的多个途径支持人ESC的生长”是一致的。重要的是，MatrigelTM能够替代MEF饲养细胞，重编程效率甚至更高(测试4)(图6A)。时间进程实验显示出对于小分子处理的最佳时间窗口的需要(图6D)。不令人吃惊的是，在阶段2以含有TGF-β的mTeSR1替代N2B27培养基显著降低了游离重编程效率(图10C)。因此，使用小分子和确定的培养基，我们建立了无饲养物的游离重编程方法，其具有显著改善的效率(从1x106个输入人***成纤维细胞产生>220个iPSC集落，增加70倍以上)(图6D)。
使用新开发的无饲养物的重编程条件，我们已经从成人***成纤维细胞成功衍生了人ESC样iPSC。当在mTeSR1中挑取并扩增时，这些iPSC显示出典型的人ESC形态(例如致密的集落，高核质比和突出的核仁)，并具有正常的核型(图7A-7F和图11A-11E)。多数iPSC集落显示出无转基因表达或基因组整合，并且在多次传代(>14)之后完全丧失游离载体，如通过PCR和RT-PCR分析所证明(图7C和图11C)。它们表达典型的人ESC特异性抗原(SSEA-3,SSEA-4,Tra-1-60和Tra-1-81)，成纤维细胞标志物CD44的下调的表达(图11D)和内源性多能基因(OCT4,NANOG,SOX2和LIN28)表达的重新激活(图7D)。OCT4和NANOG启动子在这些iPSC中都去甲基化，与人ESC相似，与亲代成纤维细胞和piPSC情况相反(图7E)。当注射进入免疫缺陷小鼠时，它们形成由所有三个胚层的衍生物组成的畸胎瘤，这证明了这些iPSC的多能性(图7F和图11E)。
小分子对于无饲养物的游离重编程的效应不是细胞类型特异性的，而是适用于不同的体细胞类型(图8A-8C)。另外，该数据例示了鉴定游离载体的正确组合(不同的重编程转基因组合和不同的转基因表达水平)的重要性，以实现对于每种细胞类型的最佳的重编程效率。
使用转化缺陷型MYC实现了显著改善的游离重编程效率(图9)，例如，LMYC产生了~1000个iPSC集落/1x106个输入人***成纤维细胞。
总之，使用组合的遗传和化学方法，我们成功地建立了非病毒的无饲养物的具有大大改善的效率的游离重编程方法。虽然是通过成纤维细胞开发的，但是该方法适用于可以从活人供体容易获得的组织的细胞类型，例如脂肪组织和外周血。由于不同的细胞类型显示出对于重编程因子的特定组合和表达水平具有优选性，所以可能需要就最佳的效率测试不同的游离重编程因子。可以向游离载体中导入另外的特征以进一步改善重编程效率。例如，目前的游离载体具有细菌繁殖必需的元件，其包含已知的促成转基因沉默的很多CpG岛(Chen等人,2004)。可以使用位点特异性重组除掉细菌载体成分而使转基因沉默最小化，以产生微环oriP/EBNA-1游离载体。新的方法是简单的，对于从大量的人供体样品常规衍生无印迹的iPSC是足够有效的，通过支持供体细胞附着和iPSC生长的确定的基质，该方法可容易地适用于产生临床级别的人iPSC。
细胞培养人ESC和iPSC维持于补充了20%KnockOutTM血清替代物,0.1mM非必需氨基酸,1mM GlutaMAX(均来自Invitrogen,Carlsbad,CA),0.1mM β-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)和100ng/ml斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子(zbFGF)的DMEM/F12培养基中的经辐射的MEF上(Yu等人,2009)。按照之前的描述(Xu等人,2001)制备MEF条件化的人ESC培养基。人新生儿***成纤维细胞(Cat#CRL-2097TM,ATCC,Manassas,MA)和成人皮肤成纤维细胞(Cat#CRL-2106TM,ATCC)培养于补充了下列物质的DMEM(Invitrogen)中：10%热灭活的胎牛血清(FBS,HyClone Laboratories,Loan,UT),0.1mM非必需氨基酸，1mM GlutaMAX,0.1mM β-巯基乙醇和4ng/ml zbFGF。
按照之前的描述(Ludwig等人,2006c)，通过修改传代程序，在mTeSRTM1(STEMCELL Technologies,Vancouver,BC,C anada)中的MatrigelTM(BD Biosciences,Bedford,MA)上进行人ESC和iPSC的无饲养物的培养。简而言之，使用EDTA拆分方法。当人ESC和iPSC达到汇合时，使用不含Ca2+和Mg2+的PBS将细胞洗涤1次，与0.5mMEDTA在37°C温育8分钟(2ml/孔，6孔板)。温育之后，除去EDTA溶液，向每个孔中逐滴加入新鲜的mTeSR1(2ml/孔，6孔板)，以进行细胞脱离。通过轻微摇动，多数细胞与板脱离。然后立即将脱离的细胞等份加入预先注入了mTeSR1的新鲜制备的MatrigelTM平板。为了改善细胞附着和存活，在传代过程中向mTeSR1加入ROCK抑制剂HA-100(10μM,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)，持续1天。通过该方法，以1:8的分传比每3至4天传代人ESC和iPSC，以实现最佳生长。
重编程人成纤维细胞包含人OCT4,SOX2,NANOG,LIN28,c-MYC,KLF4和SV40LT转基因的表达盒的游离重编程载体如之前所描述(Yu等人,2009)。具体地，使用载体pEP4EO2SCK2MEN2L和pEP4EO2SET2K(组合4)进行重编程优化。将大约7.3μg载体pEP4EO2SCK2MEN2L和3.2μg pEP4EO2SET2K通过核转染(NHDF–VPD-1001，使用U-20程序,Amaxa,Walkersville,MD)共转染进入人新生儿***成纤维细胞。将转染的成纤维细胞(~1.0x106个细胞/核转染)直接铺板于3x10-cm接种了MEF的培养皿或3x10-cm涂覆了MatrigelTM的培养皿中的成纤维细胞培养基中。转染后次日，将成纤维细胞培养基替换为补充了100ng/ml zbFGF的MEF条件化的人ESC培养基(CM100)，或化学上确定的N2B27培养基(N2B27)，或补充了100ng/ml zbFGF的N2B27培养基(N2B27-100)，或mTeSR1。N2B27培养基由补充了下列的DMEM/F12培养基组成：N-2补充物(1x,Invitrogen),B-27补充物(1x,Invitrogen),0.1mM非必需氨基酸,1mM GlutaMAX和0.1mM β-巯基乙醇。当施用时，将小分子PD0325901(P,0.5μM),CHIR99021(C,3μM),A-83-01(A,0.5μM)(均来自Stemgent,San Diego,CA),hLIF(L,1000U/ml,Millipore,Billerica,MA)和HA-100(H,10μM)加入到重编程培养物中。每2天更换培养基。在重编程实验的子集中进行碱性磷酸酶染色(Cat#SCR004,Millipore)，以促进iPSC的鉴别。以类似于***成纤维细胞的方式，使用确定的培养基进行成人皮肤成纤维细胞的无饲养物的游离重编程：对程序进行极小的改动——将转染的成人成纤维细胞铺板于1个而非3个10-cm MatrigelTM培养皿，因为核转染后细胞存活率较低。为了表征在无饲养物条件下衍生的iPSC，挑取具有典型的iPSC形态的集落直接放入涂覆了MatrigelTM的12孔板中的mTeSR1中。使用EDTA拆分方法以促进iPSC扩增，同时使传代过程中分化的细胞的继续最小化。对于从人***成纤维细胞和成人皮肤成纤维细胞衍生的所有iPSC克隆而言，一般在大约第14次传代实现游离重编程载体的完全丧失。
RT-PCR表达分析、游离载体的PCR分析、亚硫酸氢盐测序分析、流式细胞术分析和核型分析按照之前的描述进行PCR,RT-PCR,流式细胞术分析(Yu等人,2007;Yu等人,2009)。使用甲基CodeTMBisulfite Conversion Kit(Invitrogen)，通过亚硫酸氢盐测序分析OCT4和NANOG启动子的甲基化状态(Yu等人,2009)。所有引物见表1，抗体见表2。在WiCell Research Institute(Madison,WI)的Cytogenetics实验室进行标准的G带染色体分析。
表1.用于PCR、RT-PCR和亚硫酸氢盐测序PCR的引物
表2.用于流式细胞术分析的抗体
  抗原   荧光团   克隆  同种型   公司
  SSEA-3   PE   MC631  Rat IgM   BD Biosciences
  SSEA-4   PE   MC813-70  小鼠IgG3   BD Biosciences
  TRA-1-60   FITC   TRA-1-60  小鼠IgM   BD Biosciences
  TRA-1-81   FITC   TRA-1-81  小鼠IgM   BD Biosciences
  CD44   APC   G44-26  小鼠IgG2b   BD Biosciences
畸胎瘤形成为了测定在无饲养物条件下衍生的人iPSC的体内发育多能性，将生长于mTeSR1中的MatrigelTM上的iPSC转移至MEF饲养细胞以进行一次传代。通过胶原酶处理而收集细胞，并注射进入6周龄免疫缺陷的SCID-beige小鼠(Harlan,Madison,WI)的后肢肌肉中(每只小鼠大约1个10-cm的培养皿，具有50%-80%汇合度)。6-8周后，解剖畸胎瘤并固定于10%的***(Fisher,Pittsburgh,PA)。将样品包埋于石蜡并在威斯康星州的威斯康星大学麦迪逊分校的实验病理学系的癌症研究McArdle实验室进行苏木精和伊红染色处理。
***
根据本公开文本，无需过量实验即可实现并执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经以优选实施方式的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员明显的是，可以不脱离本发明的概念、精神和范围而对如本文描述的方法、方法的步骤或步骤的次序进行改变。更具体而言，明显的是，某些化学和生理学上均相关的试剂可以替换如本文描述的试剂，但仍然获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有的此类相似的替换和修饰都被认为是在如随附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
通过引用的方式将以下参考文献特别并入本文，达到它们提供示例性的程序上的或其它的细节以补充本文所示的那些内容的程度。
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Claims (19)

1.用于产生iPS细胞的群体的方法，包括：
a)获得包含表达一种或多种重编程因子的染色体外遗传元件的体细胞；
b)在包含外部添加的MEK抑制剂和/或TGF-β受体抑制剂，和GSK-3抑制剂的重编程培养基中培养所述体细胞及其子代细胞，从而产生iPS细胞的群体；和
c)在不含所述添加的GSK-3抑制剂、MEK抑制剂和TGF-β受体抑制剂的扩增培养基中扩增iPS细胞的群体；其中所述iPS细胞形成具有明显边界的、平坦的、紧密聚集的与hESC类似的集落，并且其中所述iPS细胞不含异源遗传元件；
其中所述体细胞是人类细胞；并且
其中所述培养在不含血清和饲养细胞的确定的条件下进行。
2.权利要求1的方法，其中所述重编程条件不含饲养细胞。
3.权利要求1的方法，其中重编程条件包括基质成分。
4.权利要求3的方法，其中所述基质成分包括MatrigelTM。
5.权利要求1的方法，其中所述染色体外遗传元件包含复制起始点和用于表达重编程因子的一个或多个表达盒，其中一个或多个所述表达盒还包含编码与复制起始点结合以复制染色体外模板的反式作用因子的核苷酸序列，和/或其中所述体细胞表达此类反式作用因子，其中所述复制起始点是淋巴营养疱疹病毒的复制起始点并对应于EB病毒(EBV)的oriP；并且其中所述反式作用因子是EBV核抗原1(EBNA-1)。
6.权利要求1的方法，其中所述重编程因子包括选自下列的一项或多项：Sox,Oct,Nanog,Lin-28,Klf4,c-Myc,和SV40LT。
7.权利要求1的方法，其中所述重编程因子包括LMYC,在N末端具有41个氨基酸删除的MYC或在136位氨基酸具有突变的MYC。
8.权利要求1的方法，其中在重编程条件下培养所述细胞至少5天。
9.权利要求1的方法，其中在将染色体外遗传元件导入体细胞之后，在重编程条件下培养细胞1天至5天的时间段。
10.权利要求1的方法，其中在将染色体外遗传元件导入体细胞之后，在重编程条件下培养细胞1天至15天的时间段。
11.权利要求1的方法，其中所述扩增培养基是TeSR或mTeSR培养基。
12.权利要求1的方法，还包括选择iPS细胞。
13.权利要求12的方法，其中基于一种或多种胚胎细胞特性选择iPS细胞。
14.权利要求1的方法，其中所述重编程培养基还包含外部添加的LIF。
15.权利要求1的方法，其中所述重编程培养基还包含外部添加的Rho相关激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白II抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中ROCK抑制剂是HA-100。
17.权利要求1的方法，其中所述重编程培养基还包含外部添加的成纤维细胞生长因子(FGF)。
18.权利要求1的方法，其中所述重编程培养基是TeSR培养基、人胚胎细胞培养基或N2B27培养基。
19.权利要求1的方法，其中所述重编程培养基不含外部添加的TGFβ。
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