CN102586381A - 一种提高2-酮基-l-古龙酸发酵强度的生产工艺 - Google Patents

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杜尔凤
肖江锋
邵丽琴
王志伟
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Abstract

一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵强度的生产工艺，在利用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸的过程中，采用培养0～32小时期间，温度控制28～33℃；培养32小时至发酵结束，温度控制34～38℃；培养至16～20小时期间，补加0.2～0.5%玉米浆；培养至28～32小时期间，补加0.1～0.35%尿素。本发明通过分阶段和补料培养的研发调整2-酮基-L-古龙酸发酵中双菌生理关系，使得环境和营养条件更适合混菌系细胞生长，从而有效提高混菌系生物合成速率，本发明工艺菌种不变，工艺操作简便，成本低、节能环保、易于推广。

Description

一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵强度的生产工艺
技术领域：
    本发明涉及维生素C的制备方法，属于微生物发酵技术领域，特别是涉及到一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率的新工艺。
背景技术：
2－酮基－L－古龙酸(以下简称2-KLG)，是合成维生素C重要的组成部分。目前国内主要维生素C生产厂家均采用 “二步发酵法”生产工艺，这一技术的关键步骤是其第二步发酵过程：L-山梨糖在普通生酮基古龙酸菌（行业内俗称小菌）和巨大芽孢杆菌（行业内俗称大菌）组成的混合菌系作用下被生物氧化为2-KLG。国内的维生素C“二步发酵法”与国外“莱氏法”相比，简化了工艺，降低成本，减少了污染，但由于目前学术界还未完全透彻理解第二步发酵过程中的大小菌生理关系，在实际生产中仍存在周期长、能耗高等制约生产效率的技术问题，因此，改进原有发酵生产工艺，提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率是非常重要的。
发明内容：
   本发明通过分阶段和补料培养的研发来调整2-酮基-L-古龙酸发酵中双菌生理关系，使得环境和营养条件有利于促进巨大芽孢杆菌和普通生酮基古龙酸菌混菌系细胞生长，从而有效提高混菌系生物合成2-KLG的速率，达到提高发酵生产效率的目的。
一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率的新工艺，其特征在于：加工步骤如下
1）  ..菌种的选择
普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌；
2）. 培养基，以重量单位百分比配比如下，
固体培养基：山梨糖1.5 ， 酵母膏 0.2，玉米浆 0.5，尿素0.2 MgSO4·7H2O 0.03， KH2PO4 0.02 ，CaCO3 0.5，琼脂 2.5， pH 7.0 ；
液体种子培养基：山梨糖1.5 ， 酵母膏 0.3，玉米浆 0.5，尿素0.2 ，MgSO4·7H2O 0.01， KH2PO4 0.02 ，CaCO3 0.5， pH 7.0；
发酵初始培养基：山梨糖初始含量2 ，玉米浆 0.8～1.1，尿素0.1～0.2 ，MgSO4·7H2O 0.02， KH2PO4 0.05 ，初始 pH6.7～7.0 ，其中流加山梨糖浓度25%，初始山梨糖与其它培养基分开灭菌；
3）、摇瓶种子培养
培养温度29℃，培养时间为24小时，摇床转速190rpm；
4）、发酵罐分阶段补料和控制工艺
    培养0～32小时期间，温度控制28～33℃；培养32小时至发酵结束，温度控制34～38℃；培养至16～20小时期间，补加0.2～0.5%玉米浆 ；培养至28～32小时期间，补加0.1～0.35%尿素。
本发明通过发酵罐分阶段控制和补料工艺，发酵过程中 2-KLG的生物合成速率比原加工方法提高了22.17%，能有效提高2-KLG发酵生产效率，节约生产成本。简化了工艺，减少了污染，克服了生产周期长、能耗高的缺陷。
具体实施方式：
实施例1：
对照组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液1升，接入到3.5升含有2%的山梨糖、1.1%玉米浆、0.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾的发酵培养基中，发酵容器采用10升自动发酵罐，搅拌转速400rpm，通气比1:1vvm，培养基初始PH6.7，培养8小时开始用25%碳酸钠溶液控制发酵液PH7.0，培养10小时开始流加浓度为25%的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.2%，温度控制30℃；发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量99.26mg/ml，发酵周期52小时，产酸速率1.91mg/ml·h。
实验组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液1升，接入到3.5升含有2%的山梨糖、0.8%玉米浆、0.1%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾的发酵培养基中，发酵容器采用10升自动发酵罐，搅拌转速400rpm，通气比1:1vvm，培养基初始PH6.7，培养8小时开始用25%碳酸钠溶液控制发酵液PH7.0，培养10小时开始流加浓度为25%的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.2%，培养0～32小时期间，温度控制30℃；培养32小时以后，温度控制34℃；培养至20小时，补加0.25%玉米浆 ，培养至32小时，补加0.15%尿素；发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量100.18mg/ml，发酵周期44小时，产酸速率2.28mg/ml·h，较对照组产酸速率提高19.37%。
实施例2：
对照组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液10升，接入到35升含有2%的山梨糖、1.1%玉米浆、0.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾的发酵培养基中，发酵容器采用100升自动发酵罐，搅拌转速280rpm，通气比1: 0.8 (vvm)，培养基初始PH6.7，培养8小时开始用25%碳酸钠溶液控制发酵液PH7.0，培养10小时开始流加浓度为25%的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.5%，温度控制31℃；发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量101.46mg/ml，发酵周期50小时，产酸速率2.03 mg/ml·h。
实验组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液10升，接入到35升含有2%的山梨糖、0.8%玉米浆、0.1%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾的发酵培养基中，发酵容器采用10升自动发酵罐，搅拌转速400rpm，通气比1: 0.8 (vvm)，培养基初始PH6.7，培养8小时开始用25%碳酸钠溶液控制发酵液PH7.0，培养10小时开始流加浓度为25%的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.5%，培养0～32小时期间，温度控制31℃；培养32小时以后，温度控制35℃；培养至18小时，补加0.3%玉米浆 ，培养至30小时，补加0.25%尿素。发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量102.52mg/ml，发酵周期42.5小时，产酸速率2.48 mg/ml·h，较对照组产酸速率提高22.17%。
实施例3：
对照组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液6 m3，接入到18m3含有2%的山梨糖、1.1%玉米浆、0.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾的发酵培养基中，发酵容器采用50m3标准发酵罐，搅拌转速150rpm，通气比1: 0.4 (vvm)，培养基初始PH6.7，培养8小时开始用25%碳酸钠溶液控制发酵液PH7.0，培养10小时开始流加浓度为25%的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.8%，温度控制30℃；发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量102.19mg/ml，发酵周期49小时，产酸速率2.09 mg/ml·h。
实验组：将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液6 m3，接入到18m3含有2%的山梨糖、1.1%玉米浆、0.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾的发酵培养基中，发酵容器采用50m3标准发酵罐，搅拌转速150rpm，通气比1: 0.4 (vvm)，培养基初始PH6.7，培养8小时开始用25%碳酸钠溶液控制发酵液PH7.0，培养10小时开始流加浓度为25%的山梨糖溶液，控制发酵最终总糖浓度10.8%，培养0～32小时期间，温度控制32℃；培养32小时以后，温度控制36℃；培养至16小时，补加0.3%玉米浆 ，培养至28小时，补加0.3%尿素。发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量104.86mg/ml，发酵周期42小时，产酸速率2.50 mg/ml·h，较对照组产酸速率提高19.62%。

Claims (1)

1.一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵强度的生产工艺，其特征在于：加工步骤如下
1）.菌种的选择
普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌；
2）. 培养基，以重量单位百分比配比如下，
固体培养基：山梨糖1.5 ， 酵母膏 0.2，玉米浆 0.5，尿素0.2 MgSO4·7H2O 0.03， KH2PO4 0.02 ，CaCO3 0.5，琼脂 2.5， pH 7.0 ；
液体种子培养基：山梨糖1.5 ， 酵母膏 0.3，玉米浆 0.5，尿素0.2 ，MgSO4·7H2O 0.01， KH2PO4 0.02 ，CaCO3 0.5， pH 7.0；
发酵初始培养基：山梨糖初始含量2 ，玉米浆 0.8～1.1，尿素0.1～0.2 ，MgSO4·7H2O 0.02， KH2PO4 0.05 ，初始 pH6.7～7.0 ，其中流加山梨糖浓度25%，初始山梨糖与其它培养基分开灭菌；
3）、摇瓶种子培养
培养温度29℃，培养时间为24小时，摇床转速190rpm；
4）、发酵罐分阶段补料和控制工艺
    培养0～32小时期间，温度控制28～33℃；培养32小时至发酵结束，温度控制34～38℃；培养至16～20小时期间，补加0.2～0.5%玉米浆 ；培养至28～32小时期间，补加0.1～0.35%尿素。
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