CN108118073B

CN108118073B - 一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法

Info

Publication number: CN108118073B
Application number: CN201611072953.4A
Authority: CN
Inventors: 廖莎; 王鹏翔; 师文静; 孙启梅; 樊亚超; 张霖; 李晓姝; 高大成; 王领民
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2036-11-29
Also published as: CN108118073A

Abstract

本发明涉及一种以微藻为原料生产2,3‑丁二醇的方法，包括（1）将微藻种子液接入富含N元素的微藻培养基中，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的微藻培养基继续培养，同时在培养基中添加AGPase激活剂和ACCase抑制剂，培养至稳定期获得微藻培养液；（2）在上述微藻培养液中加入蜗牛酶进行破壁处理，随后按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%‑5.0wt%加入无机强酸，升温至100‑150℃进行水解，获得微藻水解液；（3）以得到的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，发酵生产2,3‑丁二醇。本发明通过对微藻培养过程和水解过程的调控，提高了微藻淀粉含量及水解液中可发酵糖含量，最终获得了高浓度的2,3‑BDO，具有处理工艺简单、成本低、产率高等特点。

Description

一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法。

背景技术

由于世界石油资源的枯竭和价格逐渐走高、环保问题日益严峻，以及全球气候变化引发一系列的影响，20世纪70年代以来，许多国家日益重视生物能源、生物基化学品和生物材料的发展。2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BDO），是一种非常重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于食品、医药、建材、燃料以及航空航天等领域。目前合成2,3-丁二醇的方法有两种，化学法和生物法。化学法合成2,3-丁二醇主要以石油裂解时产生的四类碳氢化合物在高温、高压下水解得到，同生物发酵法相比，化学合成成本高、过程繁琐、不易操作，一直难以实现大规模工业化生产。利用生物法生产2,3-BDO，即符合绿色化工的工业化要求，又可缓解能源危机符合国家的能源发展战略，成为近年来生物领域的新热点。

目前生物法生产2,3-BDO报道较多的以葡萄糖为碳源发酵，如果以传统玉米为原料存在与人争粮、与人争地的问题。CN1710086A公开一种利用糖蜜、淀粉或甘蔗汁为碳源发酵生产2,3-BDO的方法，但最终产物2,3-BDO浓度不高。CN101225408 A提供一种用纤维物质生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法，最大的瓶颈就是纤维素酶成本高。因此，寻求高效、低成本的2,3-丁二醇生物制造技术一直是人们研究的目标，特别是高效利用廉价的生物质原料生产2,3-丁二醇，不仅有助于进一步拓展2,3-丁二醇的应用领域，还有助于解决生物基化学品生物制造技术中的共性瓶颈问题。

近年来，微藻因其结构简单、整个生物体都能进行光合作用，具有光合效率高、生长周期短、速度快的特点，同时通过调控可在细胞内能积累大量油脂、蛋白、淀粉等高附加值产品，迅速成为研究热点。但目前的研究主要集中于利用微藻生产生物柴油，如CN103571612A公开了一种利用微藻制备生物柴油的方法，CN103451101A公开了一种生产高品质微藻生物柴油的方法，CN102433362A公开了一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法。而在其它生物产品方面的应用鲜有报道。

微藻生长周期短，能有效地耦合光合作用和糖类生产，光合作用效率明显高于普通植物，淀粉累计可达细胞干重30%以上，同时还可将部分碳元素转化为其它化学品；微藻的培养不与农作物争地争水，可以利用废水中N、P等营养，从而降低水体的富营养化，节约水资源和营养盐成本。因此，利用非粮且可再生的微藻为原料发酵生产2,3-BDO，与其它生物质2,3-BDO相比，一定程度上能够降低成本，同时也为微藻下游产品的开发提供了一个新的途径。

CN200810228100.4公开了一种以富含淀粉中药材为原料发酵生产2,3-丁二醇的方法，是以富含淀粉中药材为原料，经液化、糖化得到糖化液，以糖化液为碳源，与灭菌后的无机盐营养成分混合，接入产2,3-丁二醇的菌种，进行摇瓶发酵、批式发酵或通过补加固体葡萄糖，进行批式流加发酵，得到较高浓度2,3-丁二醇。该发明的原料预处理复杂，且需要流加葡萄糖不具有经济性。

CN200910015400.9公开了一种利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，是将淀粉类原料经过Α-淀粉酶和糖化酶处理，以糖化液或者液化液作为发酵底物，用肺炎克雷伯氏菌作为发酵菌株，在无菌条件下通过分步糖化发酵或者同步糖化发酵来生产2,3-丁二醇，最终2,3-丁二醇的浓度达到43～112g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的最终浓度达到45～121g/L。该专利所述的淀粉类原料为玉米粉、玉米淀粉等粮食类原料，存在“与人争粮”的问题。

发明内容

针对微藻淀粉含量低、水解糖量低及其他原料生产2,3-丁二醇成本高的问题，本发明提供了一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法。本发明通过对微藻培养过程和水解过程的调控，提高了微藻淀粉含量及水解液中可发酵糖含量，最终获得了高浓度的2,3-BDO，具有处理工艺简单、成本低、产率高等特点。

本发明以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法，包括如下内容：

（1）微藻培养：将微藻种子液接入富含N元素的微藻培养基中，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的微藻培养基继续培养，同时在培养基中添加ADP葡萄糖焦磷酸酶（AGPase）激活剂和乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂，培养至稳定期获得微藻培养液；

（2）水解处理：在上述微藻培养液中加入蜗牛酶进行破壁处理，随后按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%-5.0wt%加入无机强酸，升温至100-150℃进行水解，获得微藻水解液；

（3）发酵培养：以得到的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，并采用克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇。

本发明中，步骤（1）所述AGPase激活剂优选为3-磷酸甘油酸，加入量为1-50mmol/L，优选为5-30mmol/L。所述ACCase抑制剂为芳氧苯氧丙酸类、环己二酮类、苯基吡唑类或植物香料提取物等中的一种或几种，优选为芳氧苯氧丙酸类中的禾草灵、环己二酮类中的苯草酮或植物香料提取物中的松针油，加入量为1-100μmol/L，优选为30-50μmol/L。

本发明中，步骤（1）所述的微藻选用淀粉含量较高的微藻，如小球藻(Chlorella)、衣藻(Chlamydomonas)、栅藻(Scenedesmus)、单针藻（Monoraphidium sp.）等，如可以采用单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，该藻株已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10765，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，已经于CN201510503226.8中申请公开。

本发明中，步骤（1）所述微藻的培养基为常规培养微藻的培养基，如可以采用SE、TAP或BG11培养基。微藻种子液的是指将微藻接入培养基后培养至对数生长期获得的藻液，具体条件如下：温度25-30℃，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为1v%-5v%，搅拌转速50-200rpm，pH 6.0-9.0，光照强度为1000-10000lux，光暗比10:14 -14:10。微藻培养时，控制微藻种子液的接种量为培养基体积的2%-10%。

本发明中，步骤（1）所述的富含N元素的微藻培养基是指在常规微藻培养基中加入过量无机氮，如可以是NaNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl等，加入量为2.0-5.0g/L。所述的含微量N元素的微藻培养基是指降低常规微藻培养基中氮源的含量，加入量为0-0.5g/L。

本发明中，步骤（1）所述的微藻培养可以采用常规的培养方式，如可以在通入CO₂含量为1v%-3v%，光暗比为10:14-14:10的条件下进行富含N元素的微藻培养和微含N元素的微藻培养。本发明优选采用以下方式培养：在富含N元素的微藻培养基中培养时，通入的CO₂含量为1v%-3v%，光暗比为10:14-14:10，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，同时将CO₂的含量提高到3v%-5v%，光暗比为18:6-24:0，培养至稳定期。通过上述培养，有助于加速微藻对环境的适应性和快速增殖，从而有助于提高藻液中淀粉含量。

本发明中，将微藻培养至稳定期获得淀粉含量较高的藻液，按照5-50mg/g藻液加入蜗牛酶对细胞进行破壁处理，控制破壁处理的pH5.0-8.0，温度为30-45℃。对藻细胞进行破壁处理，不仅可以将藻细胞内部的淀粉释放出来，提高淀粉水解的可及度，而且可以水解部分淀粉和细胞壁组分，显著降低后续水解难度。随后按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%-5.0wt%加入无机强酸，升温至100-120℃，保温10-60min。无机强酸选用硫酸或盐酸。微藻除了胞内含有大量淀粉以外，细胞壁中还含有纤维素、半纤维素等物质。采用蜗牛酶组合稀酸水解即能够将胞内淀粉水解成可发酵糖，还能将细胞壁中纤维素、半纤维素等一同水解成可发酵糖，提高了水解液中的可发酵糖含量。

本发明中，以步骤（2）制备的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，同时还包括：氮源(NH₄)₂HPO₄ 2.0-6.0 g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.0-8.0 g/L；无机盐 K₂HPO₄•3H₂O 10.0-20.0 g/L，KH₂PO₄1.0-5.0 g/L；微量元素MgSO₄•7H₂O 0-1.0g/L，FeSO₄•7H₂O 0-1.0g/L，ZnSO₄•7H₂O 0-0.5 g/L，MnSO₄•H₂O 0-0.5 g/L，CaCl₂ 0-1.0g/L，EDTA 0-1.0 g/L，pH控制在6.0-8.0。

本发明中，以克雷伯氏菌为发酵菌种制备2,3-丁二醇，优选克雷伯氏杆菌和产酸克雷伯氏菌。发酵菌种子液的制备方法如下：取活化的克雷伯氏菌，接种到含葡萄糖5-50g/L，酵母浸膏 2-6g/L，蛋白胨 5-15g/L，氯化钠 5-10g/L的培养基中，在温度35-40℃，转速150-250rpm，pH 为6.0-7.5下培养12-24h。

本发明中，将克雷伯氏菌种子液以2v%-10v%的接种量接种到所述发酵培养基中，在温度30-40℃，转速150-300rpm，通气量0.1-1.0 vvm，pH为6.0-8.0的条件下进行发酵产2,3-丁二醇。

本发明方法中2,3-丁二醇发酵可以采用批次发酵或者批式流加发酵。当残糖浓度到10-20g/L时开始补加微藻水解液，发酵48-96h结束。其中流加的微藻水解液为微藻多次培养的藻液，经静置沉淀后排出上清液，得到的藻泥利用蜗牛酶和稀酸组合水解后得到可发酵糖液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）通过对微藻培养过程中氮含量的分段控制及在培养基中添加AGPase激活剂和ACCase抑制剂，有助于微藻细胞的增殖和淀粉积累，可获得高淀粉含量的藻细胞。

（2）利用新选育的单针藻SS-06在特定条件下培养，淀粉含量高，通过蜗牛酶组合稀酸水解过程，可以显著提高水解液中可发酵糖含量，从而有助于提高最终发酵产物浓度，解决了利用微藻为底物生产2,3-BDO产率低成本高的问题。

（3）本发明所用原料不存在与人争粮、与粮争地等问题，能够有效减低生物转化生产2,3-丁二醇的成本；直接采用藻泥带渣发酵，省去微藻离心和干燥过程，节能能耗，同时还能充分利用微藻中的蛋白质作为2,3-丁二醇发酵N源。本发明工艺为微藻下游产业开辟了一种新途径。

具体实施方式

本发明利用含淀粉微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法，首先将微藻种子液接入富含N元素的微藻培养基中，培养到对数生长期停止，使微藻快速增殖；静置沉降后排出上清液，添加微含N元素的微藻培养基继续培养，同时在培养基中添加ADP葡萄糖焦磷酸酶（AGPase）激活剂和乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂，有助于微藻胞内淀粉的稳定积累，培养至稳定期获得含淀粉的藻液。在上述培养好的藻液中，加入蜗牛酶进行破壁处理，随后按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%-5.0wt%加入无机强酸，升温至100-150℃进行水解，获得微藻水解液。最后以得到的微藻水解液作为碳源制备发酵培养基，剩余部分作为后续发酵的流加液，采用克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇。

本发明中微藻培养反应器为通气搅拌式封闭反应器，带有可控光照***，可以通入二氧化碳气体，并设置二氧化碳和溶解氧的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的培养效果。搅拌桨具有可收缩性，当微藻沉淀时收起搅拌桨，不影响沉降效果。微藻培养反应器能精确控制pH和搅拌转数，保证微藻培养和2,3-丁二醇发酵过程的稳定。

本发明中pH控制酸中和剂为HCl、H₂SO₄、HNO₃等常用的无机酸，碱中和剂为NaOH、NaHCO₃、KOH、Ca(OH)₂、氨水等常用的无机碱。

下面结合实施例对本发明方案和效果作进一步说明。本发明中，wt%为质量分数，v%为体积分数。

本发明实施例使用的微藻培养基为BG11培养基，具体配方见表1、表2。

表1 BG11培养基

成分	Working solution(g/L)
		NaNO<sub>3</sub>	1.5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O	0.04
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.075
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.036
		Citric acid	0.006
Ferric ammonium citrate	0.006
		EDTA	0.001
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>	0.02
		A5+Co solution*	1mL
Distilled water	919

*表2表1中A5+Co solution的组成

成分	含量（g/L）
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	2.86
MnCl<sub>2</sub>·H<sub>2</sub>O	1.81
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.222
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.079
		Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.390
Co(NO<sub>3</sub>) ·6H<sub>2</sub>O	0.049

实施例1

微藻种子液的制备：将小球藻(Chlorella vulgaris)种子接入BG11微藻培养基，在温度30°C，通气量0.25vvm，CO₂含量为1v%，搅拌转速100rpm，pH为7.0，光暗比10:14的条件下培养至对数生长期。

（1）微藻培养：将微藻种子液按照接种量5v%接入富含N元素的微藻培养基中，富含N元素是指在培养基中按照2.5g/L加入NaNO₃，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的培养基继续培养，NaNO₃的加入量为0.05 g/L，同时在培养基中加入30mmol/L 的3-磷酸甘油酸和50μmol/L的松针油。上述微藻培养是在温度30℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为1v%，搅拌转速100rpm，pH为7.0，光暗比14:10的条件下培养至稳定期，收获藻液，其中淀粉含量达53%以上。淀粉含量检测方法：取两份10mL(V)藻液，离心去离子水洗2次，加入10mL去离子水重悬。其中一份80℃烘干至恒重得到藻干重W，另一份600W超声破碎，超声时间1 s，间歇时间2 s，超声60次，得到完全破碎的藻液。调节pH到6.5，分别加入0.20μl Liquozyme Supra 85-95℃保温液化1 h；调节pH到4.5，分别加入0.4μl Dextrozyme DX 60℃保温液化10h，水解完全后离心弃沉淀，上清液定容100mL，检测水解液中葡萄糖含量C。以去离子水加等量酶水解为对照。淀粉含量(g/g)=C(g/L)×V(L)×0.9/W(g)。

（2）藻液处理：在步骤（1）的藻液中，按照20mg蜗牛酶/g藻液加入蜗牛酶进行破壁处理，控制破壁处理的pH6.0，温度为40℃；随后按照最终水解体系中酸浓度为2.5wt%加入硫酸，升温至115℃进行水解，保温30min，获得微藻水解液。水解处理后，水解液中的糖浓度约为86g/L。

（3）发酵培养：以微藻水解液为碳源制备发酵培养基，采用克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇。

以步骤（2）制备的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，并加入以下物质：氮源(NH₄)₂HPO₄ 3.3g/L，(NH₄)₂SO₄ 6.6g/L；无机盐 K₂HPO₄·3H₂O 13.7g/L，KH₂PO₄2.0g/L；微量元素MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.002 g/L，MnSO₄·H₂O0.001g/L，CaCl₂0.01 g/L，EDTA0.05 g/L，pH控制在7.0，初始糖浓度约86g/L。

以克雷伯氏菌为发酵菌种制备2,3-丁二醇，发酵菌种子液的制备方法如下：取活化的克雷伯氏杆菌，是由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的，编号为克雷伯氏菌CICC10011。接种到含葡萄糖20g/L，酵母浸膏 3g/L，蛋白胨 8g/L，氯化钠 5g/L的培养基中，在温度37℃，转速200rpm，pH 为7.0条件下培养12h，细胞干重3.0 g/L左右。

将上述克雷伯氏菌种子液以5v%的接种量接种到发酵培养基中，在温度35°C，转速150rpm，通气量0.25vvm，pH7.0的条件下进行发酵产2,3-丁二醇。发酵16 h后残糖浓度低于20g/L，流加微藻水解液使发酵体系糖浓度为200g/L，发酵共进行48 h，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和为76.0g/L。

实施例2

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（1）同时在培养基中加入30mmol/L的3-磷酸甘油酸和50μmol/L的禾草灵。微藻培养至稳定期，收获藻液，其中淀粉含量达50%以上。经水解处理后，水解液中的糖浓度约80g/L。发酵48h后，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和75.23g/L。

实施例3

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（1）同时在培养基中加入30mmol/L 的3-磷酸甘油酸和50μmol/L的苯草酮。微藻培养至稳定期，收获藻液，其中淀粉含量达50%以上，经水解处理后，水解液中的糖浓度约80g/L。发酵48 h后，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和75.78 g/L。

实施例4

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：（1）微藻采用莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，微藻培养基采用TAP培养基；（2）N源为NH₄Cl，富N培养时加入量为3g/L，含微量N培养时加入量为0.02g/L；（4）按照20mg蜗牛酶/g藻液加入蜗牛酶进行破壁处理，控制破壁处理的pH 8.0，温度为30℃。

TAP培养基配方为(以每升计)：H₂NC(CH₂OH)₃ 2.42 g，TAP盐 25 mL(NH₄Cl 15 g/L，MgSO₄·7H₂O 4 g/L，CaCl·2H₂O 2 g/L) ，磷酸溶液1 mL(K₂HPO₄ 28.8 g /100 mL，KH₂PO₄14.4 g/100 mL)，微量元素1 mL(Na₂EDTA·2H₂O 5.00 g/100 mL，ZnSO₄ ·7H₂O2.20 g/100 mL，H₃BO₃ 1.14 g/100 mL，MnCl₂ ·4H₂O 0.50 g/100 mL，FeSO₄·7H₂O 0.50g/100 mL，CoCl₂ ·6H₂O 0.16 g/100 mL，CuSO₄ ·5H₂O 0.16 g/100 mL，(NH₄)₆Mo₇O₂₄ ·4H₂O 0.11 g/100mL)，乙酸 1 mL。

微藻培养结束后，收获藻液，其中淀粉含量达48%。水解处理后，水解液中的糖浓度约80g/L。发酵14h残糖低于20g/L，流加微藻水解液使发酵体系的糖浓度为200g/L，发酵共进行48 h，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和为71.19g/L。

实施例5

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：（1）微藻采用四尾珊藻(Scenedesmus quadricanda)；（2）N源为NH₄NO₃，加入量为4g/L；（4）按照30mg蜗牛酶/g藻液加入蜗牛酶进行破壁处理，控制破壁处理的pH7.0，温度为35℃。

微藻培养结束后，收获藻液，其中淀粉含量达54%以上。水解处理后，水解液中的糖浓度约86g/L。发酵17h残糖低于20g/L，流加微藻水解液使发酵体系的糖浓度为200g/L，发酵共进行48h，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和为76.61 g/L。

实施例6

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：微藻采用单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，保藏编号为CGMCC No. 10765。

微藻培养结束后，收获藻液，其中淀粉含量达45%以上。水解处理后，水解液中的糖浓度约78g/L。发酵17h残糖低于20 g/L，流加微藻水解液使发酵体系的糖浓度为200g/L，发酵共进行48 h，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和为70.01 g/L。

实施例7

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：微藻培养在富含N元素的微藻培养基中培养时，首先通入的CO₂含量为2v%，光暗比为10:14，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，同时将CO₂的含量提高到5v%，光暗比为18:6，培养至稳定期。培养结束后，收获藻液，其中淀粉含量为48%。水解处理后，水解液中的糖浓度约80g/L。

比较例1

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（1）在培养基中只加入30mmol/L 的3-磷酸甘油酸。微藻培养至稳定期其中淀粉含量达43%。经水解处理后，水解液中的糖浓度约76g/L。发酵48h后，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和69.13g/L。

比较例2

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：步骤（1）在培养基中只加入50μmol/L的松针油。微藻培养至稳定期，其中淀粉含量达38%。经水解处理后，水解液中的糖浓度约72g/L。发酵48h后，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和65.56 g/L。

比较例3

处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：微藻培养时，不采用氮源含量分段控制，整个过程按照常规方式加入氮源，即加入NaNO₃1.5g/L。培养结束后，收获藻液，其中淀粉含量达25%左右。

比较例4

发酵部分的处理工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：不采用微藻水解液发酵，直接采用葡萄糖作为碳源，葡萄糖初始浓度为86g/L。采用批式流加发酵方式，当残糖浓度低于20g/L时，补加葡萄糖液使发酵体系的糖浓度为200g/L，发酵共进行48h，发酵液中2,3-丁二醇和乙偶姻最终浓度之和为76.41g/L。采用葡萄糖发酵水平差距不大，说明本发明含淀粉的微藻可替代粮食原料或作为粮食原料的补充生产2,3-丁二醇。

Claims

1.一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于包括如下内容：

（1）微藻培养：将微藻种子液接入富含N元素的微藻培养基中，培养到对数期停止；静置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的微藻培养基继续培养，同时在培养基中添加ADP葡萄糖焦磷酸酶激活剂和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，培养至稳定期获得微藻培养液；所述的微藻采用单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，保藏编号为CGMCC No. 10765；所述ADP葡萄糖焦磷酸酶激活剂为3-磷酸甘油酸；所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂为禾草灵、苯草酮或松针油中的一种或几种；所述的富含N元素的微藻培养基是指在常规微藻培养基中加入无机氮，加入量为2.0-5.0g/L；所述的含微量N元素的微藻培养基是指降低常规微藻培养基中氮源的含量，加入量为0.05-0.5g/L；

（3）发酵培养：以得到的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，并采用克雷伯氏菌CICC10011发酵生产2,3-丁二醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述ADP葡萄糖焦磷酸酶激活剂加入量为1-50mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂加入量为1-100μmol/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂加入量为30-50μmol/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的微藻培养基采用SE、TAP或BG11培养基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述微藻种子液是指将微藻接入培养基后培养至对数生长期获得的藻液，微藻培养时控制微藻种子液的接种量为培养基体积的2%-10%。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述微藻种子液和微藻培养的具体条件如下：温度25-30℃，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为1v%-5v%，搅拌转速50-200rpm，pH 6.0-9.0，光照强度为1000-10000lux，光暗比10:14 -14:10。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的富含N元素的微藻培养基加入的无机氮为NaNO₃、NH₄NO₃或NH₄Cl。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的微藻培养采用以下方式培养：在富含N元素的微藻培养基中培养时，通入的CO₂含量为1v%-3v%，光暗比为10:14-14:10，培养到对数生长期停止；静置沉降后排出上清液，同时将CO₂的含量提高到3v%-5v%，光暗比为18:6-24:0，培养至稳定期。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）按照5-50mg/g藻液加入蜗牛酶对细胞进行破壁处理，控制破壁处理的pH5.0-8.0，温度为30-45℃。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）按照最终水解体系中酸浓度为0.5wt%-5.0wt%加入无机强酸，升温至100-120℃，保温10-60min。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以步骤（2）制备的微藻水解液为碳源制备发酵培养基，同时还包括：氮源(NH₄)₂HPO₄ 2.0-6.0 g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.0-8.0 g/L；无机盐K₂HPO₄•3H₂O 10.0-20.0 g/L，KH₂PO₄1.0-5.0 g/L；微量元素MgSO₄•7H₂O 0-1.0g/L，FeSO₄•7H₂O 0-1.0g/L，ZnSO₄•7H₂O 0-0.5 g/L，MnSO₄•H₂O 0-0.5 g/L，CaCl₂ 0-1.0g/L，EDTA 0-1.0 g/L，pH控制在6.0-8.0。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）以克雷伯氏菌为发酵菌种制备2,3-丁二醇，发酵菌种子液的制备方法如下：取活化的克雷伯氏菌，接种到含葡萄糖5-50g/L，酵母浸膏 2-6g/L，蛋白胨 5-15g/L，氯化钠 5-10g/L的培养基中，在温度35-40℃，转速150-250rpm，pH 为6.0-7.5下培养12-24h。

14.根据权利要求1或13所述的方法，其特征在于：步骤（3）将克雷伯氏菌种子液以2v%-10v%的接种量接种到所述发酵培养基中，在温度30-40℃，转速150-300rpm，通气量0.1-1.0vvm，pH为6.0-8.0的条件下进行发酵产2,3-丁二醇。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中2,3-丁二醇发酵采用批次发酵或者批式流加发酵，当残糖浓度到10-20g/L时开始补加微藻水解液，发酵48-96h结束。