CN103614424A

CN103614424A - 一种提高古龙酸发酵单位的方法

Info

Publication number: CN103614424A
Application number: CN201310593909.8A
Authority: CN
Inventors: 朱娜; 孙瑞君; 张志�; 董春宁; 夏旭东
Original assignee: QIYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd NINGXIA
Current assignee: QIYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd NINGXIA
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2014-03-05

Abstract

本发明涉及一种提高古龙酸发酵单位的方法，该方法是将维生素C二步发酵法中的第二步发酵过程中的大菌和小菌分开进行培养，然后将大菌发酵后的过滤液补入到小菌的发酵培养过程中。本发明将大小菌分别进行单独培养，既能实现大菌的最优化培养，也能实现小菌的最优化培养。由于大菌产生的能促进小菌产酸的营养物质为胞外产物，可使用膜过滤的方法分离大菌与大菌产生的促进小菌产酸的胞外的活性物质，将分离后的大菌活性营养物质直接作为小菌产酸时的补料使用，并通过控制此营养物质的补入量来控制小菌的生长产酸速度。通过本发明的方法可以使古龙酸发酵周期缩短了15%～25%，发酵水平提高了15%～20%。<u/>

Description

一种提高古龙酸发酵单位的方法

技术领域

本发明属于发酵医药技术领域，特别是涉及一种提高古龙酸发酵单位的方法。

背景技术

维生素C，又名抗坏血酸，作为人体必需的一种维生素和抗氧化剂，广泛应用于制药、食品、化妆品和饲料等工业中。

目前，维生素C主要是采用两步发酵法制备：

第一步是以山梨醇为原材料，以黑醋菌为产生菌将山梨醇转化为山梨糖的过程，其主要工艺过程如图1所示。

第二步是以第一步发酵所得的L－山梨糖为原料，一株氧化葡萄糖酸杆菌（“小菌”）和一株巨大芽孢杆菌（“大菌”），大小两种菌自然组合的混合菌株发酵生成2～酮基～L～古龙酸，再进行转化精制得到维生素C，主要工艺过程如图2所示。

VC的产量主要决定于第二步发酵中古龙酸的发酵水平。第二步发酵中的小菌为革兰氏阴性菌，主要功能是将山梨糖转化为古龙酸；大菌为革兰氏阳性菌，作为伴生菌，其主要功能是通过其在形成芽孢的过程中释放出来的活性物质为小菌提供营养，促进小菌产生古龙酸。但在混菌发酵过程中，大菌、小菌的生长既相辅相成又相互制约。而提高古龙酸的发酵水平，必须建立在两种菌均可最优化培养的前提下才能实现。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种提高古龙酸发酵单位的方法，该方法是通过减少大小菌生长时期相互的制约作用，提高小菌产酸时期大菌促进小菌产酸的作用，并使这种促进作用实现有效可控。

为此，本发明采用如下技术方案：

一种提高古龙酸发酵单位的方法，其特征是：将维生素C二步发酵法中的第二步发酵过程中的大菌和小菌分开进行培养，然后将大菌发酵后的过滤液补入到小菌的发酵培养过程中。

所述大菌发酵至大菌空胞明显、pH稳定在8.5～10.0时停罐过滤得到过滤液。

所述大菌培养过程为：首先将大菌接入大菌种子培养基中，在30℃～35℃、罐压0.04～0.08Mpa、空气流量：种子培养基体积=0.5:1～2.0:1条件下培养8～10h后移入发酵培养基中放大培养，控制发酵温度30℃～35℃、罐压0.04～0.08Mpa、空气流量：种子培养基体积=0.5:1～2.0:1条件下培养8～12h，至大菌空胞明显、pH稳定在8.5以上时停罐过滤。

所述大菌种子培养基组成为：玉米浆0.2～2.0%，硫酸镁0.01～0.1%，磷酸二氢钾0.01～0.1%，碳酸钙0.02～0.2%。

所述大菌发酵培养基组成为：玉米浆0.2～2.0%，硫酸镁0.01～0.1%，磷酸二氢钾0.02～0.2%，碳酸钙0.02～0.2%。

所述小菌培养过程为首先将小菌接入小菌种子罐中，在27～35℃、罐压0.03～0.08Mpa、空气流量：发酵液体积=0.5:1～3.0:1下培养10～12h，至菌浓达5%时移入小菌发酵培养基中进行发酵培养，控制发酵温度27～35℃、罐压0.03～0.08Mpa、空气流量：发酵液体积=0.5:1～3.0:1，在培养5～7h时补入山梨糖、碱及大菌发酵过滤液，放罐周期为38～44h。

所述大菌发酵过滤液补入量：山梨糖补入量=1/4～3/4，其中山梨糖的补入量发酵液体积的0.2～2%。

所述小菌种子培养基组成为玉米浆0.2～2.0%，酵母膏0.01～0.1%，尿素0.03～0.3%，硫酸镁0.01～0.1%，碳酸钙0.01～0.1%。

菌株：巨大芽孢杆菌，俗称大菌；氧化葡萄糖酸杆菌，俗称小菌。

本发明中大菌分开培养的培养基适合大菌快速生长并衰亡，小菌分开培养的培养基适合小菌快速生长增殖。

本发明的设计原理是：大菌在生长过程中产生的营养活性物质，能促进小菌产酸，但在对数生长期时大小菌共同生长会产生一定的制约作用：比如，小菌生长过快，前期产酸率较高，但大菌会过度衰老，中后期的产酸量就极为有限；前期工控条件偏向大菌，大菌数量增长较快，小菌增长相对较慢，前期产酸量就相对较少，会延长其发酵周期）。为此，本发明将大小菌分别进行单独培养，既能实现大菌的最优化培养，也能实现小菌的最优化培养。由于大菌产生的能促进小菌产酸的营养物质为胞外产物，可使用膜过滤的方法分离大菌与大菌产生的促进小菌产酸的胞外的活性物质，将分离后的大菌活性营养物质直接作为小菌产酸时的补料使用，并通过控制此营养物质的补入量来控制小菌的生长产酸速度。通过本发明的方法可以使古龙酸发酵周期缩短了15%～25%，发酵水平提高了15%～25%。

附图说明

图1为维生素两步发酵法中第一步工艺流程图；

图2为维生素两步发酵法中第二步工艺流程图。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

菌株：巨大芽孢杆菌俗称大菌，葡萄糖酸杆菌俗称小菌。

下列实施例中，大菌种子培养和发酵培养的接种量控制在15～25%，小菌种子培养和发酵培养接种量控制在15～35%。

对比实施例：

大、小菌混合培养，在31℃条件下种子培养26h时，然后移入发酵罐中放大培养，接种量为12%，温度31℃，空气流量：发酵液体积=1:1，10h左右补入山梨糖、补料碱，小菌开始逐步产酸，50h放罐，放罐单位100mg/ml。

对比实施例中种子、发酵罐的培养基比例

原材料名称	混菌培养种子培养基%	混菌培养发酵培养基%
			玉米浆	0.2～2.0	0.5～5.0
酵母膏	0.02～0.2	——
			尿素	0.03～0.3	0.06～0.6
硫酸镁	0.02～0.2	0.02～0.2
			磷酸二氢钾	0.01～0.1	0.05～0.5
碳酸钙	0.02～0.2	0.02～0.2

实施例1：

大小菌分开培养。

大菌培养：提前5h接入种子罐，30～32℃，罐压0.04Mpa，空气流量：种子液体积=1:1，培养9h后即可移入发酵罐中放大培养，接种量20%。发酵罐30～32℃，罐压0.04Mpa，空气流量：发酵液体积=1:1，培养10h，至大菌空胞明显，pH稳定在8.5～10.0时过滤供小菌补料。

小菌培养：接入小菌种子罐中，培养温度27～30℃，罐压0.08Mpa，空气流量：种子液体积=1.5:1，培养12h菌浓达5%时移种，移种量为18%。移入小菌发酵罐，培养温度27～30℃，罐压0.08Mpa，空气流量：发酵液体积=2:1，培养6h补入山梨糖、补料碱、同时补入大菌的营养因子，其中山梨糖采用流加法加入，其补入量为发酵液体积的0.2%，大菌营养物质补入量：山梨糖补入量=1:2，控制pH在6.2～6.5之间，培养39h，发酵单位已达118mg/ml。发酵时间缩短了22%，发酵单位提高了18%。

实施例1中大、小菌培养基比例为

实施例2：

大小菌分开培养。

大菌培养：提前5h接入，温度31～33℃，罐压0.06Mpa，空气流量：种子液体积=0.5:1，培养8h后即可移入发酵罐中放大培养，接种量20%。发酵罐32～33℃，罐压0.05Mpa，空气流量：发酵液体积=0.5:1，培养8h以后，至大菌空胞明显，pH稳定在8.5以上时停罐过滤供小菌补料使用。

小菌培养：接入小菌种子罐中，30～33℃、罐压0.03Mpa空气流量：种子液体积=0.5:1，培养10h，菌浓达5%时移种，移种量为20%。移入小菌发酵罐后31℃、罐压0.03Mpa，空气流量：发酵液体积=3：1，培养5h补入山梨糖、补料碱、同时补入大菌的营养因子。其中采用流加法补入山梨糖，其补入量为发酵液体积的1%，大菌营养物质补入量与山梨糖补入量的比值为1:4，控制Ph6.4～7.0，培养38h，发酵单位已达120mg/ml。放罐周期缩短了24%，发酵单位提高了20%。

实施例2中培养基比例

原材料名称	大菌种子培养基%	大菌发酵培养基%	小菌种子培养基%	小菌发酵培养基%
					玉米浆	0.6	2.0	0.8	3.0
酵母膏	——	——	0.05	0.1

[0042]

尿素	——	——	0.2	0.3
					硫酸镁	0.02	0.01	0.02	0.02
磷酸二氢钾	0.01	0.08	——	——
					碳酸钙	0.05	0.1	0.02	0.02

实施例3：

大小菌分开培养。

大菌培养：提前5h接入种子罐，温度33～35℃，罐压0.08Mpa，空气流量：种子液体积=2:1，培养10h后即可移入发酵罐中放大培养，接种量22%。发酵罐33～35℃，罐压0.08Mpa，空气流量：发酵液体积=2:1，培养10h，至大菌空胞明显，pH稳定在8.5以上时过滤供小菌补料。

小菌培养：接入小菌种子罐中，使用培养基比例为：32～35℃，罐压0.06Mpa，空气流量：种子液体积=3:1，培养12h菌浓达5%时移种，移种量为20%。移入小菌发酵罐，培养温度32～35℃，罐压0.06Mpa，空气流量：发酵液体积=0.5:1，培养6h补入山梨糖、补料碱、同时补入大菌的营养因子。其中采用流加法补入山梨糖，其补入量为发酵液体积的1%，大菌营养物质补入量与山梨糖补入量的比值为2:3，控制pH7.0～7.2，大菌营养物质补入量：山梨糖补入量=3:4，培养40h，发酵单位已达123mg/ml。发酵时间缩短了20%，发酵单位提高了23%。

实施例3中大、小菌培养基比例为

实施例4：

大小菌分开培养。

大菌培养：提前5h接入种子罐，34～35℃，罐压0.05Mpa，空气流量：种子液体积=1:1，培养9.5h后即可移入发酵罐中放大培养，接种量20%。发酵罐34～35℃，罐压0.05Mpa，空气流量：发酵液体积=1:1.5，培养10h，至大菌空胞明显，pH稳定在8.5以上时过滤供小菌补料。

小菌培养：接入小菌种子罐中，使用培养基比例为：28～30℃，罐压0.05Mpa，空气流量：种子液体积=1.5:1，培养12h菌浓达5%时移种，移种量为20%。移入小菌发酵罐，培养温度30～32℃，罐压0.07Mpa，空气流量：发酵液体积=2.5:1，培养6h补入山梨糖、补料碱、同时补入大菌的营养因子，大菌营养物质补入量：山梨糖补入量=3:4，培养41h，发酵单位已达121mg/ml。发酵时间缩短了18%，发酵单位提高了21%。

实施例4中大、小菌培养基比例为

Claims

1.一种提高古龙酸发酵单位的方法，其特征是：将维生素C二步发酵法中的第二步发酵过程中的大菌和小菌分开进行培养，然后将大菌发酵后的过滤液补入到小菌的发酵培养过程中。

2.按照权利要求1所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述大菌发酵至大菌空胞明显、pH稳定在8.5～10.0时停罐过滤得到过滤液。

3.按照权利要求1所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述大菌培养过程为：首先将大菌接入大菌种子培养基中，在30℃～35℃、罐压0.04～0.08Mpa、空气流量：种子培养基体积=0.5:1～2.0:1条件下培养8～10h后移入发酵培养基中放大培养，控制发酵温度30℃～35℃、罐压0.04～0.08Mpa、空气流量：种子培养基体积=0.5:1～2.0:1条件下培养8～12h，至大菌空胞明显、pH稳定在8.5以上时停罐过滤。

4.按照权利要求3所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述大菌种子培养基组成为：玉米浆0.2～2.0%，硫酸镁0.01～0.1%，磷酸二氢钾0.01～0.1%，碳酸钙0.02～0.2%。

5.按照权利要求3所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述大菌发酵培养基组成为：玉米浆0.2～2.0%，硫酸镁0.01～0.1%，磷酸二氢钾0.02～0.2%，碳酸钙0.02～0.2%。

6.按照权利要求1所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述小菌培养过程为：首先将小菌接入小菌种子罐中，在27～35℃、罐压0.03～0.08Mpa、空气流量：发酵液体积=0.5:1～3.0:1下培养10～12h，至菌浓达5%时移入小菌发酵培养基中进行发酵培养，控制发酵温度27～35℃、罐压0.03～0.08Mpa、空气流量：发酵液体积=0.5:1～3.0:1，在培养5～7h时补入山梨糖、碱及大菌发酵过滤液，放罐周期为38～44h。

7. 按照权利要求1或5所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述大菌发酵过滤液补入量：山梨糖补入量=1/4～3/4，其中山梨糖的补入量发酵液体积的0.2～2%。

8. 按照权利要求5所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述小菌种子

培养基组成为玉米浆0.2～2.0%，酵母膏0.01～0.1%，尿素0.03～0.3%，硫酸镁0.01～0.1%，碳酸钙0.01～0.1%。

9. 按照权利要求5所述的提高古龙酸发酵单位的方法，其特征在于所述小菌种子培养基组成为玉米浆0.2～2.0%，酵母膏0.01～0.1%，尿素0.03～0.3%，硫酸镁0.01～0.1%，碳酸钙0.01～0.1%。