CN102586110A

CN102586110A - 兼性厌氧微生物复合菌剂及其制备方法和其在降解秸秆中的应用

Info

Publication number: CN102586110A
Application number: CN2012100408238A
Authority: CN
Inventors: 赵雪峰; 俞建中; 樊婷婷; 刘思颖; 龙涛
Original assignee: WUXI FENGLU ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: WUXI FENGLU ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明提供了一种兼性厌氧微生物复合菌剂，由纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌组成；纤维单胞菌是从牛瘤胃液中筛选分离得到的。本发明还提供该兼性厌氧微生物复合菌剂的制备方法，将纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌分别扩大培养后按配比混合接种于混合发酵培养基中，初始pH7.0，通气量0.5v/v·min，转速200r/min，37℃培养24~48h，使其菌液的活菌数量达到25亿个每毫升，完成兼性厌氧微生物复合菌剂的制备。本发明还提供兼性厌氧微生物复合菌剂在降解秸秆中的应用。本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂能很好的降解农作物秸秆，并提高农作物秸秆的发酵产气率。

Description

兼性厌氧微生物复合菌剂及其制备方法和其在降解秸秆中的应用

技术领域

本发明涉及一种兼性厌氧微生物复合菌剂，本发明还涉及该复合菌剂的制备方法和其在降解秸秆中的应用。

背景技术

农作物秸秆的有机成分主要为纤维素、半纤维素，其次为木质素、蛋白质、氨基酸、树脂、单宁等。因为秸秆组分结构特殊，秸秆中的木质素很难被酸与酶降解。木质素与半纤维素以共价键方式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分子接触；另一方面，木质素的非水溶性、化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性。

近年来，秸秆的利用方式在我国主要包括作为能源、还田、饲料、用于工业原料(造纸)等。目前主要的秸秆能源化利用技术主要有秸秆直燃供热技术、秸秆气化集中供气技术、秸秆发酵制沼气技术等。然而沼气发酵过程中纤维素的降解是通过多种厌氧或兼性厌氧的水解或发酵性微生物合成的纤维素酶进行的。在厌氧条件下，纤维素多数处于结晶态，葡萄糖单体以β-1,4苷键联结，与半纤维素、木质素相联结等结构特性而难以被降解。

纤维素的好氧或厌氧降解过程实质上就是微生物所产生的纤维素酶类分解纤维素的过程。利用秸秆发酵生产沼气，水解阶段中起主要作用的是利用纤维素的微生物，自然界中能够降解和利用纤维素的微生物种类很多，目前有很多针对纤维素酶菌株的筛选的科技成果和应用，但多为好氧性微生物，而沼气发酵是在厌氧环境中进行，因此兼性厌氧高活性纤维素酶细菌成为利用秸秆发酵生产沼气的关键环节。

瘤胃中含有大量能够通过纤维素酶降解纤维素的厌氧微生物，利用微生物厌氧发酵秸秆生产生物沼气不仅能使生物质资源循环利用和得到深度开发，而且还能缓解能源危机，改善生态环境。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种兼性厌氧微生物复合菌剂，这种复合菌剂能使农作物秸秆更好的分解，提高厌氧发酵沼气产气率；为此，本发明还提供该兼性厌氧微生物复合菌剂的制备方法和其在降解秸秆中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种兼性厌氧微生物复合菌剂，所述复合菌剂由纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌组成；所述纤维单胞菌是从牛瘤胃液中筛选分离得到的。

进一步地，所述复合菌剂中各组分的体积比如下：纤维单胞菌：黄孢原毛平革菌：白腐真菌：枯草芽孢杆菌=20-30:15-25:15-30:20-30。

进一步地，所述复合菌剂中各组分的接种量如下：纤维单胞菌30%，黄孢原毛平革菌20%，白腐真菌25%，枯草芽孢杆菌25%。

本发明的第二个目的是提供该兼性厌氧微生物复合菌剂的制备方法，将纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌分别扩大培养后按配比混合接种于混合发酵培养基中，初始pH7.0，通气量0.5v/v·min，转速200r/min，37℃培养24~48h，使其菌液的活菌数量达到25亿个每毫升，完成兼性厌氧微生物复合菌剂的制备。

本发明的第三个目的是提供兼性厌氧微生物复合菌剂在降解秸秆中的应用。

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂中各个菌种的作用如下：

纤维单胞菌：该菌株在有氧及无氧条件下都能生长并代谢产酸，能分解秸秆中的纤维素及半纤维素。

白腐真菌：该菌株能够分泌胞外氧化酶降解木质素,且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力。

黄孢原毛平革菌：该菌株功能同白腐真菌，主要降解木质素。

枯草芽孢杆菌：该菌株是一种好氧产芽孢的杆状细菌，在此主要功能是分解半纤维素。

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂能很好的降解农作物秸秆，并提高农作物秸秆的发酵产气率。

附图说明

图1为本发明的实施例2-5中制备的兼性厌氧微生物复合菌剂降解秸秆木质纤维素的对比图。

图2为本发明的实施例2-5中制备的兼性厌氧微生物复合菌剂降解秸秆后接入猪粪发酵30天的累积产沼气对比图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法和所用的试剂及设备，如无特别说明，均为常规方法、常规试剂和设备。

本发明使用的菌种或试剂：

1、白腐真菌（White-rot fungi）：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CICC 40299;

2、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CICC 40719；

3、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CICC 10090。

本发明实施例中，应用的培养基配方如下：

1、纤维单胞菌初筛培养基（g/L）：羧甲基纤维素钠5.0g；硫酸铵2.0g；磷酸二氢钾2.0 g；七水硫酸镁1.0 g；七水硫酸铁10.0mg；氯化锰5mg；氯化钠3.0g；琼脂粉20.0g；蒸馏水 1L；调pH值6.7。

2、纤维单胞菌复筛培养基（g/L）：蛋白胨2.0g；酵母膏1.0g；羧甲基纤维素钠5.0g；硫酸铵2.0 g；磷酸二氢钾2.0 g ；七水硫酸镁1.0 g；七水硫酸铁10.0mg；氯化锰5mg ；氯化钠3.0 g ；琼脂粉20.0g；蒸馏水 1L；调pH值 6.7。刃天青0.2％（配制后储存于冰箱内）1 mL，在1L的大三角瓶中将培养基煮沸10min后通入氮气驱氧5min再加入质量百分比为0.05%的L－半胱氨盐酸盐。

3、纤维单胞菌发酵产酶培养基（g/L）：蛋白胨3.0g；酵母3.0g；羧甲基纤维素钠5.0g；硫酸铵2.0g；磷酸二氢钾2.0g；七水硫酸镁1.0 g；七水硫酸铁10.0mg；氯化锰5mg ；氯化钠3.0g ；琼脂粉 20.0g；蒸馏水1L；调pH值为6.7。

4、黄孢原毛平革菌培养基（g/L）：葡萄糖 20g；体积百分含量为20%的马铃薯汁 1L； KH₂PO₄ 3g； MgSO₄·7H₂O 1.5g；维生素B1微量；琼脂15g。

5、白腐真菌培养基（g/L）：葡萄糖 20g；体积百分含量为20%的马铃薯汁 1L； KH₂PO₄ 3g； MgSO₄·7H₂O 1.5g；维生素B1微量；琼脂15g。

6、枯草芽孢杆菌培养基（g/L）：氯化钠 0.5g；牛肉膏 1g；蛋白胨 1g；琼脂 2g；水100mL；pH 7.2。

7、混合发酵培养基（g/L）：葡萄糖10.0g，羧甲基纤维素钠5.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏1.0 g，硫酸铵 2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，七水硫酸镁1.0 g，七水硫酸铁10.0 mg，氯化锰5 mg，氯化钠10.0 g；蒸馏水1000 ml，pH7.0-7.2。

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂由以下物质组成：纤维单胞菌、白腐真菌、黄孢原毛平革菌、枯草芽孢杆菌。

实施例1

原料的制备

1、纤维单胞菌的分离方法如下：

（1）初筛：

吸取0.5ml牛瘤胃液加入到49.5ml含有玻璃珠的生理盐水中，作为10^-2稀释度，振荡10 min混匀并将上清液10^-3、10^-4、10^-5稀释，各取0.2ml稀释液，采用纤维单胞菌初筛培养基稀释涂布，每个稀释度作2 次重复，37℃培养48 h，挑取生长较快的菌株进行纯化，采用刚果红平板脱色法从中共分离出20株能产生透明圈的菌株，在此条件下产生透明圈的菌株即为纤维单胞菌，经重复比较有5株透明圈与菌落直径比较大的菌株，分别编号为05、16、21、37、43，其中菌株16号的比值最大，证明16号菌株的产纤维素酶的能力最佳。选择此菌株接种到纤维单胞菌初筛培养基斜面，4℃保存。

表1 菌株透明圈（D）与菌落直径(d)比

Figure 2012100408238100002DEST_PATH_IMAGE001

上述5株菌株均在刚果红平板形成红色浓郁的透明圈，其中16号菌株的透明圈直径与菌落直径比值最大，可以初步判断这株菌的产纤维素酶较强。

（2）复筛：

配制纤维单胞菌复筛培养基，装量于Hungate厌氧管中并用氮气（纯度为99.9%，并经除氧铜柱除氧）进行体系气体置换15min，Hungate厌氧管用橡胶塞密封后加盖于121℃灭菌30分钟，无菌操作下将初筛得到的菌株用接种环从富集平板上沾取少量的菌株接入厌氧管中滚管，用橡胶塞封口加盖置于37℃培养，直至滚管上长出菌落为止，挑取菌落再进行分离纯化，多次稀释涂布挑选菌种，直到在显微镜下观测的菌种形态一致，最终保存。

分离得到的纤维单胞菌兼性菌菌株特征：菌株在纤维单胞菌复筛培养基中培养2周后，形成的菌落呈圆形或同心圆，不透明、不光滑、表面湿润、边缘完整、产黄色素，直径为0.8~3.7mm，水解圈直径为3.0~13.0mm；菌株细胞呈短杆状，兼性厌氧，革兰氏染色阳性，大小为0.35μm~1.2μm，少部分菌体产芽孢，能运动，无鞭毛，多数单生，少数成对或成串，通过生理生化实验及分子学初步鉴定确定其为纤维单胞菌（Cellulomonas）。

2、纤维单胞菌的扩大培养：

在250mL的三角瓶中加入50mL纤维单胞菌初筛培养基，121℃灭菌30min后，将复筛后得到的纤维单胞菌菌株接种至纤维单胞菌初筛培养基中，摇床转速200r/min，温度37℃，培养时间24 h，即得种子液。将种子液按6%的接种量接入装有50ml（250mL）纤维单胞菌发酵产酶培养基的250mL三角瓶中，摇床转速200r/min温度37℃进行培养，培养后采用菌落计数法计数，使每毫升培养液的纤维单胞菌菌数在10⁹以上。

3、白腐真菌的扩大培养：

将白腐真菌菌种无菌操作接种于白腐真菌培养基中，制备斜面保藏菌种，摇床转速200r/min，温度37℃，培养时间24 h，即得种子液。将种子液按4%的接种量接入装有50ml白腐真菌培养基的250ml三角瓶中，摇床转速200r/min，温度37℃进行培养，培养后采用菌落计数法计数，使每毫升培养液的白腐真菌菌数在10⁹以上。

4、黄孢原毛平革菌的扩大培养：

将黄孢原毛平革菌菌种无菌操作接种于黄孢原毛平革菌培养基中，制备斜面保藏菌种，摇床转速200r/min，温度37℃，培养时间24 h，即得种子液。将种子液按4%的接种量接入装有50ml黄孢原毛平革菌培养基的250ml三角瓶中，摇床转速200r/min，温度37℃进行培养，培养后采用菌落计数法计数，使每毫升培养液的黄孢原毛平革菌菌数在10⁹以上。

5、枯草芽孢杆菌的扩大培养：

将枯草芽孢杆菌无菌操作接种于枯草芽孢杆菌培养基中，制备斜面保藏菌种，将斜面菌种无菌操作接种于装有50ml 枯草芽孢杆菌培养基的250ml三角瓶中，转速200r/min，37℃恒温培养24h。

实施例2

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂的制备

将实施例1中各单独扩大培养的菌种纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌的种子液分别按接种量20%、15%、15%、20%混合接种于1L混合发酵培养基中，初始pH7.0，通气量0.5v/v·min，转速200r/min，37℃培养24~48h，使其菌液的活菌数量达到25亿个每毫升。

实施例3

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂的制备

本实施例与实施例2中的不同之处在于：各单独扩大培养的菌种纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌的种子液分别按接种量25%、20%、20%、25%混合，其余步骤均相同。

实施例4

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂的制备

本实施例与实施例2中的不同之处在于：各单独扩大培养的菌种纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌的种子液分别按接种量30%、20%、25%、25%混合，其余步骤均相同。

实施例5

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂的制备

本实施例与实施例2中的不同之处在于：各单独扩大培养的菌种纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌的种子液分别按接种量30%、25%、30%、30%混合，其余步骤均相同。

实施例6

本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂降解秸秆实验：

将100g小麦秸秆原料破碎，加入尿素水溶液，使***中总固体含量保持在20%左右，分别接入4%（体积百分数）实施例2-5中制备的本发明的兼性厌氧微生物复合菌剂，对照组不添加菌剂，于烧杯中拌匀加盖塑料薄膜进行堆沤，37℃堆沤5天，取样测秸秆木质素、纤维素及半纤维素的含量及降解率。记录结果如表2和图1。

表2

。

由表2和图1可知：四种复合菌剂降解秸秆的效率各不相同，木质素、纤维素及半纤维素的降解率分别能达到21%-30%、33%-43%、20%-36%，其中实施例4制备的兼性厌氧微生物复合菌剂的降解效率最好。

实施例7

应用本发明的方法制备的兼性厌氧微生物复合菌剂堆沤秸秆产沼实验：

将50g猪粪分别接入经本发明的实施例2-5制备的兼性厌氧微生物复合菌剂堆沤处理完成后的小麦秸秆中，搅拌均匀，密封加塞，置于37℃水浴锅中进行产沼实验，采用水压式法收集发酵产生的气体。根据量筒中收集饱和食盐水的体积计量每日产生气体的体积。从进行厌氧发酵的第1天开始，每天定时记录各套装置的产气量，记录30天。每组试验3次重复，测得的各试验指标都是3次试验的平均值。结果如图2所示，平均累积产气量分别为4268ml、5104ml、6354ml、5678ml，说明本发明的实施例4制备的兼性厌氧微生物复合菌剂更能够有效提高秸秆发酵产气率。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种兼性厌氧微生物复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂由纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌组成；所述纤维单胞菌是从牛瘤胃液中筛选分离得到的。

2.根据权利要求1所述的兼性厌氧微生物复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂中各组分的体积比如下：纤维单胞菌：黄孢原毛平革菌：白腐真菌：枯草芽孢杆菌=20-30:15-25:15-30:20-30。

3.根据权利要求2所述的兼性厌氧微生物复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂中各组分的接种量如下：纤维单胞菌30%，黄孢原毛平革菌20%，白腐真菌25%，枯草芽孢杆菌25%。

4.权利要求1-3任一所述的兼性厌氧微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：将纤维单胞菌、黄孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢杆菌分别扩大培养后按配比混合接种于混合发酵培养基中，初始pH7.0，通气量0.5v/v·min，转速200r/min，37℃培养24~48h，使其菌液的活菌数量达到25亿个每毫升，完成兼性厌氧微生物复合菌剂的制备。

5.权利要求1-3任一所述的兼性厌氧微生物复合菌剂在降解秸秆中的应用。