CN104630292A - 一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，它涉及一种制备丁酸的方法。本发明的目的是要避免传统方法中纤维素酶的大量使用，完成丁酸的中温混合菌群发酵制备过程，降低制备成本。本发明采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，配制种子培养基和发酵培养基。其主要步骤如下：A、将富集的菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；B、将步骤A培养的菌群接种于发酵培养基，140rpm进行厌氧发酵，制备丁酸；C、将步骤B培养的菌群接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵。

Description

一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种制备丁酸的方法。
背景技术
丁酸是一种重要的化工原料，广泛用于化工产品、食品和药品等行业。从物理化学角度，丁酸较乙酸更适合作为生产生物燃料的中间产物，因为丁酸具有更长的碳链和更低的O/C比，能够增加能量的密度。并且丁酸含量高的混合羧酸可以用来生产聚羟基丁酸酯(PHB)，其可以作为生物可降解塑料的原料。目前，丁酸的工业生产主要采用源于石油化工的正丁醛氧化法。与化学法相比，生物发酵法具有原料广泛、环境友好和可持续等优点。目前生物发酵产丁酸的研究主要是以淀粉、糖蜜、乳清、马铃薯、纤维素水解物为原料。每年通过光合作用产生的生物质约200亿t，其中大部分为木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源。如果以木质纤维素为原料发酵生产丁酸，不仅可保证相关产业的良性可持续发展，同时也可大幅降低原料成本，提高市场竞争力。已有的利用木质纤维素生产丁酸的研究中，一般是先利用纤维素酶将木质纤维素水解为葡萄糖、木糖等单糖，再利用微生物发酵产丁酸。而纤维素酶的高成本被认为是生物转化木质纤维素的最大障碍。筛选和利用可以直接降解木质纤维素的丁酸发酵菌群，则是攻克这一障碍的有效途径之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种中温条件下利用不明确混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，避免传统方法中纤维素酶的大量使用，完成丁酸的中温混合菌群发酵制备过程，降低制备成本。
本发明的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
二、将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；
三、将步骤二培养后的菌群接种于发酵培养基，在140rpm转速条件下进行厌氧发酵，制备丁酸；
四、将步骤三制备的丁酸接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵；
其中，步骤二中厌氧培养条件为：混合菌群培养温度为35℃，培养时间为14d；
步骤三中接种的种子发酵液的体积为10mL，厌氧培养条件为：培养温度为35℃，培养时间为7d；
步骤四中发酵液的体积为发酵***体积的5％，厌氧培养条件为：35℃培养，培养时间为7～15d。
本发明包含以下有益效果：
本发明所采用的混合菌群富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，其主要步骤如下：
A、将混合菌群接种于种子培养基，进行厌氧培养；
B、将步骤A培养的混合菌群接种于发酵培养基中进行厌氧液态发酵，制备丁酸；
本发明采用预处理秸秆为原料，大幅降低原料成本；利用菌群中的微生物产生纤维素酶，避免商业酶制剂带来的高昂成本；利用筛选的菌群，降低中间产物对纤维素酶活性的抑制。本发明使用农业废弃秸秆为原料进行丁酸的生物发酵制备，对资源的再生利用及无污染新资源的开发都具有重要意义。
附图说明
图1丁酸发酵装置。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
二、将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；
三、将步骤二培养后的菌群接种于发酵培养基，在140rpm转速条件下进行厌氧发酵，制备丁酸；
四、将步骤三制备的丁酸接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵；
其中，步骤二中厌氧培养条件为：混合菌群培养温度为35℃，培养时间为14d；
步骤三中接种的种子发酵液的体积为10mL，厌氧培养条件为：培养温度为35℃，培养时间为7d；
步骤四中发酵液的体积为发酵***体积的5％，厌氧培养条件为：35℃培养，培养时间为7～15d。
本实施方式步骤一中所述的初始菌群筛选过程为：将采集的样品置于以水稻秸秆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养基中添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月(淘汰源于沼气渣、水沟底泥、灌木丛土壤和腐叶的富集培养物，保留源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、和腐木的富集培养物)，然后将第17代(即培养5个月)的牛粪、玉米地土壤和腐木富集培养物以及第20代(即培养5个月)的猪粪堆肥富集培养物等比例混合，然后以水稻秸秆为碳源的富集培养基作为传代培养的培养基进行传代培养3个月，即得初始菌群。这5个混合菌群的纤维素降解能力趋于稳定，并最终进入基于丁酸发酵能力的复筛。
对个筛选的初始菌群的液相发酵产物进行测试，其中，源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木组合的混合菌群丁酸产量最高，为6.0g/L同时丁酸比例也最高，为75.4％。
本实施方式所述的初始菌群包含：梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)和颤螺旋菌属(Oscillospira)。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的初始菌群包含以下菌株：纤维素降解菌、半纤维素降解菌、丁酸发酵菌、乙酸发酵菌和其它产酸发酵菌；
其中，纤维素降解菌包括：化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所装芽孢杆菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假单胞菌(Pelomonassaccharophila)、纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和Clostridiumphytofermentans；
半纤维素降解菌包括：Bacteroides graminisolvens、Clostridium xylanolyticum、和Ruminobacillusxylanolyticum；
氨基酸降解菌包括：Aminobacterium colombiense和Proteiniphilum acetatigenes；
丁酸发酵菌包括：柔嫩梭菌(Clostridium leptum)和Roseburia intestinali；
乙酸发酵菌包括：Clostridium hathewayi和Bacteroides oleiciplenus；
其它产酸发酵菌包括：Oscillibacter valericigenes、Clostridiales bacterium、Bacteroidetesbacterium和Sedimentibacter sp。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的种子培养基是以PCS培养基为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸秆为原料，其配制方法为：在1L培养基中加入：10g预处理过的稻草、5g蛋白胨、1g酵母粉、5g NaCl、2g CaCO3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115℃灭菌20分钟。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的发酵培养基是为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸秆为原料，其配制方法为：在1L培养基中加入：20g预处理过的稻草、5g蛋白胨、1g酵母粉、5g NaCl、2g CaCO3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115℃灭菌20分钟。其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
1、配制种子培养基
种子液体培养基具体配制方法如下：
在1L培养基中加入：10g NaOH预处理过的稻草，5g蛋白胨，1g酵母粉，5g NaCl，2gCaCO3，0.5g半胱氨酸。通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态。每150mL血清瓶中装100mL培养基，密封，115℃灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均在厌氧条件下进行。
2、配制发酵培养基
发酵培养基具体配制方法如下：
在1L培养基中加入：20g NaOH预处理过的稻草，5g蛋白胨，1g酵母粉，5g NaCl，2gCaCO3，0.5g半胱氨酸。通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态。每500mL血清瓶中装200mL培养基，密封，115℃灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均在厌氧条件下进行。
3、发酵工艺
(1)采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
其中，步骤一中所述的初始菌群筛选过程为：将采集的样品置于以水稻秸秆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养基中添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月(淘汰源于沼气渣、水沟底泥、灌木丛土壤和腐叶的富集培养物，保留源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、和腐木的富集培养物)，然后将第17代(即培养5个月)的牛粪、玉米地土壤和腐木富集培养物以及第20代(即培养5个月)的猪粪堆肥富集培养物等比例混合，然后以水稻秸秆为碳源的富集培养基作为传代培养的培养基进行传代培养3个月，即得初始菌群。这5个混合菌群的纤维素降解能力趋于稳定，并最终进入基于丁酸发酵能力的复筛。
对个筛选的初始菌群的液相发酵产物进行测试，其中，源于牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木组合的混合菌群丁酸产量最高，为6.0g/L同时丁酸比例也最高，为75.4％。
(2)将富集的菌群接种于种子培养基，静置厌氧培养；培养温度为35℃，培养时间为14d。
(3)将发酵培养基200mL装入500mL的血清瓶中，115℃灭菌20分钟。将种子培养基加入血清瓶中，接种量5％(v/v)，140rpm进行厌氧液态发酵，培养温度为35℃，培养时间为7d，每24h取样一次，测定丁酸浓度，同时在N2保护下，加入CaCO3调节发酵***的pH至5.5～6.0。
(4)采用GC法测定丁酸含量，以N2为载气，进样量1μL，测定丁酸浓度。丁酸终浓度为7.6g/L。
本实施例所述的富集的菌群包含：梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)和颤螺旋菌属(Oscillospira)；
具体包含以下菌株：纤维素降解菌、半纤维素降解菌、丁酸发酵菌、乙酸发酵菌和其它产酸发酵菌；
其中，纤维素降解菌包括：化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所装芽孢杆菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假单胞菌(Pelomonassaccharophila)、纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和(Clostridiumphytofermentans)；
半纤维素降解菌包括：(Bacteroidesgraminisolvens)、(Clostridium xylanolyticum)、和(Ruminobacillusxylanolyticum)；
氨基酸降解菌包括：(Aminobacterium colombiense)和(Proteiniphilum acetatigenes)；
丁酸发酵菌包括：柔嫩梭菌(Clostridium leptum)和(Roseburia intestinali)；
乙酸发酵菌包括：(Clostridium hathewayi)和(Bacteroides oleiciplenus)；
其他产酸发酵菌包括：(Oscillibacter valericigenes)、(Clostridiales bacterium)、(Bacteroidetes bacterium)和(Sedimentibacter sp)。
实施例2
1、种子培养基配制同实施例1。
2、发酵培养基配制同实施例1。
3、发酵工艺
(1)使用的槽式搅拌反应器总容积为22L，发酵体积为20L，接种量为5％(v/v)。反应器外壁缠绕电热丝，通过温控仪将反应***控制在35±1℃。pH控制在6.0～6.2之间。
(2)通过补料分批发酵模式进行发酵。在补料分批发酵模式中，第4天开始，每天排出3L发酵液，同时补充3L新鲜培养基，包含90g/L预处理水稻秸秆和5g/L蛋白胨。
(3)丁酸含量测定方法同实施例1，丁酸累计产量为1004g。

Claims (8)

1.一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，以PCS培养基为基础，以预处理稻草秸秆为原料，配制种子培养基和发酵培养基；
二、将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养；
三、将步骤二培养后的菌群接种于发酵培养基，在140rpm转速条件下进行厌氧发酵，制备丁酸；
四、将步骤三制备的丁酸接种到槽式搅拌反应器中，进行丁酸发酵；
其中，步骤二中厌氧培养条件为：混合菌群培养温度为35℃，培养时间为14d；
步骤三中接种的种子发酵液的体积为10mL，厌氧培养条件为：培养温度为35℃，培养时间为7d；
步骤四中发酵液的体积为发酵***体积的5％，厌氧培养条件为：35℃培养，培养时间为7～15d。
2.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中所述的初始菌群包含以下菌株：纤维素降解菌、半纤维素降解菌、丁酸发酵菌、乙酸发酵菌和其它产酸发酵菌；
其中，纤维素降解菌包括：化糖梭状芽胞杆菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所装芽孢杆菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假单胞菌(Pelomonas saccharophila)、纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和Clostridium phytofermentans；
半纤维素降解菌包括：Bacteroides graminisolvens、Clostridium xylanolyticum、和Ruminobacillus xylanolyticum；
氨基酸降解菌包括：Aminobacterium colombiense和Proteiniphilum acetatigenes；
丁酸发酵菌包括：柔嫩梭菌(Clostridium leptum)和Roseburia intestinali；
乙酸发酵菌包括：Clostridium hathewayi和Bacteroides oleiciplenus；
其它产酸发酵菌包括：Oscillibacter valericigenes、Clostridiales bacterium、Bacteroidetesbacterium和Sedimentibacter sp。
3.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中的种子培养基是以PCS培养基为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸秆为原料，其配制方法为：在1L培养基中加入：10g预处理过的稻草、5g蛋白胨、1g酵母粉、5g NaCl、2g CaCO3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115℃灭菌20分钟。
4.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中的发酵培养基是为基础配置的种子培养基，以预处理稻草秸秆为原料，其配制方法为：在1L培养基中加入：20g预处理过的稻草、5g蛋白胨、1g酵母粉、5g NaCl、2g CaCO3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115℃灭菌20分钟。
5.根据权利要求3或4所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于所述的预处理稻草秸秆处理过程如下：将采集的水稻秸秆切割成10～15cm；将切割后的稻草秸秆置于质量百分含量为1％的NaOH溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水彻底清洗至其pH为中性后，进行挤干，置于4℃中保存，即完成；其中，稻草秸秆与NaOH溶液的质量体积比为1g：15mL。
6.根据权利要求1所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于步骤一中所述的初始菌群筛选过程为：将采集的样品置于以水稻秸秆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养基中添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月，然后将培养后的牛粪、玉米的土壤和腐木富集培养物以及的猪粪堆肥富集培养物等比例混合，然后以水稻秸秆为碳源的富集培养基作为传代培养的培养基进行传代培养3个月，即得初始菌群；其中，采集的样品是从牛粪、沼气渣、猪粪堆肥、水沟底泥、玉米地土壤、灌木丛土壤、腐木以及腐叶中采集的。
7.根据权利要求6所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于所述的以水稻秸秆为碳源的富集培养基其配制方法为：在1L培养基中加入：10g预处理过的稻草、5g蛋白胨、1g酵母粉、5g NaCl、2g CaCO3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10分钟，以保持培养基厌氧状态，密封，115℃灭菌20分钟。
8.根据权利要求7所述的一种利用混合菌群发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其特征在于所述的预处理稻草秸秆处理过程如下：将采集的水稻秸秆切割成10～15cm；将切割后的稻草秸秆置于质量百分含量为1％的NaOH溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水彻底清洗至其pH为中性后，进行挤干，置于4℃中保存，即完成；其中，稻草秸秆与NaOH溶液的质量体积比为1g：15mL。
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