CN102575258A - 将dna引入植物细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于简化和有效将外源基因物质引入植物细胞的方式和方法。尤其是，本发明结合种子启动和基于病毒的DNA构建物用于有效地将异源DNA引入植物。

Description

将DNA引入植物细胞
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，尤其涉及用于简化和有效将外源(exogenous)基因物质引入植物细胞的方式和方法。
背景技术
携带一种或多种可表达的异源基因的植物具有多种潜在优势。携带基因表达盒(cassette)的植物可携带一种或多种赋予所期望的特性的基因，包括，例如，除草剂、杀虫剂或昆虫耐受性；对压力的耐受性；增强新鲜产品(水果、蔬菜、种子等)的香味和/或贮存期限，以及扩大合成可用于被人类和/或动物消耗或用作在各种工业中(化妆品、制药、营养制品、食品、纸、纤维等)的原料的植物内源性和/或外源性(foreign，外来)的蛋白、糖类、脂肪酸类或第二代谢产物的能力。
电流转化技术(Current transformation technologies)为获得具有期望特性的工程植物带来了机会，且植物转化的主要进展已在近些年出现。最常见的技术是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导。其他转化方法是直接DNA转移，包括微注射、电穿孔、粒子轰击和病毒载体(BirchR G.1997.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：297-326)。除病毒载体之外，以上技术的应用引起外源DNA穿透进入已处理的细胞/组织、其整合入已处理的植物的基因组中和转基因植物的再生。然而，在许多主要的农作物植物中，仍然存在严重的基因型限制。一些农业重要农作物植物的转化仍旧是既困难又耗时。另外，在所有前面所提到的技术中，转化使用营养组织(包括胚)进行，且转化效率非常低，并需要选择标记，而且来自转化的细胞或组织的植物的成功再生率是相当低的。
并不总是需要将外源DNA整合入植物基因组，尤其是当基因改良(GMO)的植物引起经济和政治问题时。在这些情况中，需要能够不***宿主基因组而表达一种(或多种)异源基因的方法。
属于本发明的一些发明人的国际(PCT)申请公开No.WO2007/141790公开了改良的基于双粒病毒组的构建物(construct，构建体)，其能够在已处理的植物内从一个植物细胞扩散至其他植物细胞，且同时将外源DNA引入该植物细胞而不引起病理学病毒症状。该外源DNA被表达于该植物组织但不整合入该植物的基因组中。该构建物(也指的是作为表达载体，IL-60是其中一个例子)包含干扰双粒病毒组复制酶基因的异源多聚核苷酸序列，以致其侧面与编码双粒病毒组复制酶或与复制酶相关蛋白的非连续核酸序列相接(侧接，flank)。
种子启动是用于处理植物种子，使得它们能够经历在播种或种植上与非处理种子相比更快和更均匀的萌芽的操作。另外，启动提供了可选的使用杀菌剂/农药/肥料或其他化学制品(如作为商标的包衣、造粒、作色，以及其他)的并行处理，提供保护和/或协助萌芽、发芽、以及成苗。
启动使得种子能够吸收足够的水以使它们能够开始发芽前的代谢过程，然后在此状态下停滞它们。所吸收的水量(含有或不含有有益化学制品)必须仔细控制，因为太多仅会使得种子萌芽，而太少会引起种子老化。一旦吸收了正确的水量，种子可能会被播种或干回至原来的水含量用于储存。启动的种子通常萌芽和发芽更快并更均匀，且幼苗活力典型地比未启动的种子更高，尤其是在最适度以下的(suboptimal，次于最适度的)条件下。通过启动获得的益处，如萌芽速度和均匀性，通常是由于DNA修复过程、蛋白水合酶的激活和在萌芽早期阶段发生的另外的过程的起始(起动)。
用于受控的水吸收的三种主要技术包括用水溶液启动、用水合固体颗粒***启动或通过与水受控的水合启动。用溶液启动是基于将种子浸入渗透溶液中，典型地PEG溶液，特征在于渗透势能够获得限制的吸涨，其不足于完全水合和种子萌芽。选择性地，通过将种子与水合的吸收介质，如粘土或泥炭(e.g.，U.S.Patent No.4,912,874)混合而达到相同的效果。与水溶液受控的水合可以，例如，通过利用半透膜以调节水从给定渗透压的溶液至种子的转移(U.S.Patent No.5,992,091)来实现。启动在各种温度和通气方法下(如搅拌、振荡、鼓泡等)，利用任何用于受控的水吸收的技术(Taylor A G.et al.1998.Seed Science Technology 8：245-256)进行。
已公开在上面所描述的常规转化技术和种子启动之间的联合。例如，美国专利No.6,646,181公开了将基因引入植物的方法，包括在植物的种子中包含大量4C DNA的阶段同步植物发育的阶段，并转染该种子的细胞，其中同步发育阶段包括将颗粒固体基质材料与种子启动量的水混合，并且将种子在足够产生大量的种子细胞以达到期望的细胞周期阶段的时间和温度条件下通风。
美国专利申请公开No.2006/0005273公开了适于转化的玉米外植体。该外植体包含纵向分为两半的玉米种子，其中***暴露了盾片(scutellum)、胚芽鞘环(coleoptilar ring)和茎端顶端分生组织(shoot apicalmeristem)，其中的每一种独立地适于转化。在用或者愈合组织启动介质或者芽启动介质***之前启动种子增加转化之后的愈合组织和芽诱导频率。
美国专利申请No.20100154083公开了利用种子启动筛选、鉴定、选择、分离、和/或再生靶向整合事件的组合物和方法。种子启动提供对稳定整合入种子基因组的位点专一的重组酶介导整合(在可操作性地连接至在种子中活跃的启动子的靶点部位)的选择标记的种子的鉴定。
这些联合方法采用已知的转化方法并旨在增加外源基因整合入植物基因组的有效性。如上面所描述的，可用的方法具有关于应用性和有效性的局限性。另外，将外源DNA整合入植物基因组并不总是需要的。
存在对用于简化和有效将DNA引入植物细胞且进一步能够实现有效植物再生的工具和方法公认的需要，并且这些工具和方法将高度有益。
发明内容
本发明提供了用于简化和有效将异源DNA递送入植物细胞、部分、组织、器官、或整个有机体，尤其是完整种子内的种子胚的细胞的方式和方法。包含引入的异源DNA的种子易于在标准生长条件下长成成熟植物，不需要再生培养和锻炼条件。
本发明一部分是基于出乎意料的发现：在种子启动期间通过补充含有基于病毒的DNA构建物，尤其是具有基于双粒病毒组的表达构建物的启动介质而将异源DNA引入植物种子是可能的。作为以下例证说明，本发明现在显示，补充具有基于双粒病毒组的称为IL-60的构建物，其包含侧面与编码双粒病毒组复制酶或复制酶相关蛋白的非连续核酸序列相接的异源多聚核苷酸序列，引起该DNA构建物在种子细胞内的吸收、复制、和无症状的扩散(spreading)。
本发明的教导优于以前已知的用于植物细胞转化或外源DNA引入的方法，因为DNA是被引入能够自然发育为整个植物的完整种子的胚。本发明对于DNA引入的教导不涉及损伤细胞(如在直接DNA转移时出现的，尤其是采用经轰击时)或细胞功能。此外，在采用基于双粒病毒组的表达构建物时，异源DNA不***植物基因组，再次防止了伴随DNA引入细胞的损伤，该损伤典型地引起细胞周期停滞和凋亡或程序性细胞死亡。本发明的简单方法可以被用于任何感兴趣的植物的种子，且是快速和高效的。在使用异源DNA不***植物基因组的DNA构建物时，该方法另外的优点为植物表达所期望的但不定义为基因改良的产物。
因此，根据一个方面，本发明提供了用于将异源DNA引入植物种子胚的至少一个细胞的方法，包括将植物的种子与含有包含异源DNA的基于病毒的DNA构建物的启动介质在能够启动的条件下接触，由此获得包含异源DNA的种子胚。
根据某些实施方式，该方法另外包括提供用于后续的种子萌芽和生长的适当条件的步骤，以便获得包含异源DNA的植物或其部分。
根据某些实施方式，基于病毒的DNA构建物包含能够复制并无症状地将该构建物扩散至邻近的植物细胞的病毒基因或其部分。
根据典型的实施方式，DNA构建物为基于双粒病毒组的构建物。根据这些实施方式，该构建物包含侧面与编码双粒病毒组复制酶或与复制酶关联的蛋白的非连续核酸序列相接的异源DNA。
根据另外的实施方式，该构建物进一步包含编码改良双粒病毒组外壳蛋白(CP)的多聚核苷酸序列。根据典型的实施方式，改良的双粒病毒组外壳蛋白编码核苷酸在编码N-末端的100个氨基酸的核苷酸中包含突变或缺失。
根据进一步典型的实施方式，表达构建物进一步包含编码改良双粒病毒组V2蛋白的多聚核苷酸序列。
根据另外典型的实施方式，表达构建物进一步包含编码改良双粒病毒组C4蛋白的多聚核苷酸序列。根据这些实施方式，改良的双粒病毒组C4蛋白包含突变或缺失。根据某些实施方式，表达构建物进一步包含细菌的多聚核苷酸序列。
根据当前特定优选的实施方式，双粒病毒组是番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)。根据这些实施方式，基于双粒病毒组的构建物选自由具有在SEQ OD NO：1中所列的核酸序列IL-60和具有在SEQ ID NO：2中所列的核酸序列IL-60-BS所组成的组。
根据某些实施方式，DNA构建物设计为表达构建物，以致异源DNA被表达在植物细胞内。根据这些实施方式，该DNA构建物进一步包含选自由增强子、启动子、和转录终止序列所组成的组中的至少一种调控元件。
根据另外的实施方式，DNA构建物进一步包含用于鉴定包含异源DNA的种子和植物的标记。
异源DNA可以编码任何期望的产物，包括肽、多肽、蛋白和RNAs。蛋白或RNAs可以是植物来源或其他来源，包括但不限于细菌和哺乳动物来源。根据某些实施方式，DNA编码选自由反义RNA、dsRNA、siRNA等组成的组中的抑制RNA使得靶基因的表达被沉默。根据其他实施方式，异源DNA编码这样的产物，其表达赋予期望的农学特性，包括，但不限于，对生物或非生物应激的抗性、提高的产率、提高的生产质量、和优选的生长模式等。根据另外的实施方式，被编码的蛋白产物可用于化妆品业或制药业。还根据进一步的实施方式，被编码的蛋白增强植物细胞和组织内期望的代谢产物的产生。
还根据其他的实施方式，异源DNA不编码期望的产物，但仅作为对于种子来源或对于由所述种子生长的植物的标记，例如，防止专利种子、植物和组织的非法销售。
异源DNA在细胞和源于其的细胞中短暂表达或其可结合入细胞基因组。异源基因可作为***的或非***的DNA序列存在于植物细胞的细胞质、其细胞器或细胞核中。
根据当前优选的实施方式，DNA构建物是设计使得异源DNA不结合入细胞基因组的基于双粒病毒组的构建物，但该构建物能够在从包含所述异源DNA的种子所生长的植物的细胞内复制并扩散。
根据本发明的教导可以使用任何本领域中普通技术人员已知的启动***或条件，包括包含具有足够渗透势的水溶液的***和包含固体微粒的***。介质的水势能够保证不足以完成种子吸涨而仅允许萌芽的最初阶段但不出现胚根(完成萌芽)的水吸收。该***和条件典型地根据植物种子的种类选择。
还根据另外的实施方式，本发明提供了由本发明方法所生产的种子，该种子包括包含异源DNA的基于病毒的DNA构建物，以及由所述种子产生的植物或其部分。
根据某些实施方式，植物种子是单子叶来源。根据其他实施方式，植物种子是双子叶来源。
本发明的其他的目的、特征和优点由于下面的描述和附图将变得更加清楚。
附图说明
图1证明了种子启动(priming)对于萌芽(germination)均匀性的作用。
图2是在本文中所描述的种子启动实验中使用的基于双粒病毒组的构建物的图例说明。图2A：IL-60-BS。图2B：pIR-GUS。
图3示出通过PCR所检测的在种子在基于双粒病毒组的构建物的存在下启动后在番茄真叶(true tomato leaves)中所存在的GUS序列。虚线箭头和实线箭头分别指示1,500bp的大小标记(size marker)的位置和GUS(ca.1,800bp)的位置(泳道1)。泳道8和12是阴性对照：分别来自由非处理种子所生长的植物和来自由用无DNA构建物吸涨的种子所生长的植物的PCR。
图4A和4B示出种子在IL-60-BS和pIR-GUS的存在下启动后，用于GUS活性而染色的番茄叶子的横截面图(图4B mag.X40)。
具体实施方式
定义
本文中所使用的术语“启动”指的是播种前种子以促进萌芽和幼苗生根的受限的水合处理，和在完全水合和萌芽之前种子内发生的生物化学的、生理学的、和生物的过程。启动过程控制并处理种子的水利用性，致使水利用性足够起始并影响早期的萌芽事件，但不足于允许胚根出现。取决于植物种类和栽培要求，以上所描述的受限的水合后，接着是部分或完全的干燥，致使种子可以进一步储存直至播种的短或长的时期。
作为本文中使用的，术语“启动介质”是指引起与水受限的水合的溶液(无机的，如盐/营养素，或有机的，如，PEG)或者固体颗粒***(例如包含高岭土)。这样介质的实例在Taylor G P.et al.(1998.Seed ScienceTechnology 8：245-256)中详细说明。
术语“能够启动的条件”指的是用于利用任何本领域中已知的用于受控的水吸收的技术促使种子启动的介质组合物(如，渗透性PEG或其他组分溶液、固体水吸收剂等)；持续时间；温度；明/暗制度；和通气(如，搅拌、振荡、鼓泡等)的适合条件。
术语“处理的植物”指的是其中引入了异源DNA的植物，不管该异源DNA是否整合入该植物的基因组、该植物的细胞器，或保持游离在细胞质中，或作为在细胞核中没有整合的附加体(或游离体)而存在。
本文中使用的术语“植物”是以其广泛的意义。其包括，但不限于，木质的、草本的、多年生的或一年生植物的任何种类。其还指大多数的植物细胞，其大部分分化为存在于任何植物发育阶段的结构。这样的结构包括，但不限于，根、茎、枝、叶、花、花瓣、果实、任何贮藏器官(如，块茎、球茎、球根、假茎、叶等)。术语“植物组织”包括分化的或未分化的植物组织，包括存在于根、枝、叶、花粉、种子和瘤、以及培养细胞(如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织等)中的那些(植物组织)。植物组织可以在植物内，在器官培养、组织培养、或细胞培养内。作为本文中使用的术语“植物部分”指的是植物器官或植物组织。
术语“基因”指的是包含对于RNA或多肽的产生所必须的编码序列的核酸(如DNA或RNA)序列。该术语包括天然以及人造的(合成的)基因。多肽可以由全长编码序列或由其任何部分所编码。术语“其部分”关于基因使用时，指的是那个基因的大小范围从几个核苷酸至全部基因序列减去一个核苷酸的片段。因此，“包含基因的至少一部分的核酸序列”可包括该基因的片段或完整基因。
术语“基因”还包括结构基因的编码区并包括处于邻近编码区在5′和3′末端两者的任一个距离约1Kb的序列。处于编码区的5′端且出现在mRNA上的序列是指作为5′非-翻译(或非翻译)序列(5′UTR)。处于编码区的3′端或编码区的下游且出现在mRNA上的序列是指作为3′非-翻译(或非翻译)序列(3′UTR)。
本文中使用的术语“核酸”指的是线性或支链的、单链或双链的、或这些的混合的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA混合物。
术语“异源DNA”或“外源DNA”指的是在其自然环境中不存在的多聚核苷酸(即，被人类技术改变了的)。例如，异源DNA包括来自一种物种的、引入另外的物种的多聚核苷酸。异源DNA还包括已通过某种方式改变了的有机体天然存在的多聚核苷酸(如，突变、加入多重复制、连接非-天然启动子或增强子序列等)。异源DNA可包括植物细菌和哺乳动物来源的基因序列。基因序列可包括cDNA形式的基因；该cDNA序列可以以或者正义(以产生mRNA)或者反义定向(以产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)表达。异源植物基因区别于内源植物基因，因为异源基因序列典型地连接包含调控元件的核苷酸序列，如非天然发现的与对于由异源基因所编码的蛋白的基因或与染色体中的植物基因序列相关的启动子、或与非天然发现的染色体部分相关的(如在基因不正常表达的基因座中表达的基因)启动子。
术语“构建物”在本文中以它的广义使用，指的是人工组合的或分离的包含感兴趣(interst)异源DNA的核酸分子。一般，构建物可包含异源DNA，典型地感兴趣DNA(gene of interst)、在某些情况下还可以是感兴趣基因和适当的调控基因的标记基因。应理解，在构建物中包含的调控序列是可选的，例如，在待使用宿主细胞的调控序列的情况下可不要求(使用)这样的序列。该术语构建物包括载体，但不应视为对其的限制。
术语“可操作连接”指的是在单一核酸片段上的相关核酸序列的连接，以至于一个的功能被其他所调控。例如，一个启动子在其能够调控编码序列的表达的时候与那个编码序列操作连接(即，该编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以以正义或反义方向操作连接至调控序列。
作为本文中使用的术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”，指的是处于DNA聚合物的蛋白编码区的5′末端(即，在前面)的DNA序列。自然中已知的大部分启动子的位置在转录区的前面。启动子充当开关，激活基因的表达。如果基因被激活，也就是要转录、或参加转录。转录涉及从基因开始的mRNA合成。启动子，因此，担当转录调控元件且还提供用于起始将基因转录为mRNA的位点。启动子可衍生于来自其天然基因的完整体、或由衍生于天然发现的不同启动子的不同元件组成、或甚至包含合成DNA段。本领域普通技术人员理解，不同启动子可在不同组织或细胞类型、或在不同的发育阶段、或响应不同的环境条件中指导基因的表达。进一步公认，因为在大多数情况，正确的调控序列的边界还没有完全定义，一些变体的DNA片段可具有相同的启动子活性。引起基因在大多数细胞类型中在大部分时间表达的启动子通常称为“组成型(constitutive)启动子”。可用于植物细胞的各种类型的新启动子在不断地被发现，可在Okamuro J K和Goldberg R B(1989)Biochemistry of Plants15：1-82在找到很多实例。
作为本文中使用的，术语“增强子”指的是能够促进启动子活性的DNA序列，且可以是启动子的固有元件或***增强子以增强启动子组织特异性水平的异源元件。
作为本文中使用的，术语“表达”，指的是产生功能终产物，如mRNA或蛋白。
用于实施本发明的优选模式
本发明提供了用于将外源DNA引入植物细胞或组织的方法。本发明的方法能够以简单、易于使用、廉价、广泛可行、且有效的方式产生包含异源DNA的种子和植物。根据本发明的方法，将期望的DNA引入种子，然后由种子生长植物，因此相当地增加DNA引入的效率并节省昂贵的且有时困难的植物再生过程。
根据一个方面，本发明提供了用于将外源DNA引入植物种子胚的至少一个细胞的方法，包括将植物种子与含有包含异源DNA的基于病毒的DNA构建物的启动介质在能够启动的条件下接触，由此获得包含异源DNA的种子胚。
根据某些实施方式，基于病毒的DNA构建物包含能够复制且无症状地将该构建物扩散(或传播)至邻近的植物细胞的病毒基因或其部分。
根据某些实施方式，该方法进一步包括提供用于后续的种子萌芽和生长的适当条件，以便获得包含异源DNA的植物或其部分。
术语“包含异源基因”在关于植物或种子使用时指的是在其一个或多个细胞中包含至少一种异源DNA的植物或种子。该术语广泛地指在其至少一个细胞中包含至少一种异源DNA的植物、植物结构、植物组织、植物种子、或植物细胞。该术语包括DNA被引入的原代细胞、以及源生于该细胞的培养物和植物，不考虑转移的数量。由于故意的或非有意的突变，所有后代的DNA含量可不精确地相同。与被引入DNA的原代细胞中所筛选的具有相同功能的突变后代包含于转化体(transformant)的定义中。
将外源DNA引入细胞可以是稳定的或短暂的。术语“短暂的”指的是将一种或多种外源多聚核苷酸在不将外源多聚核苷酸整合入宿主细胞的基因组中的情况下引入细胞。这种类型的DNA引入还可以称作“短暂转化”。术语“短暂转化细胞”因此指的是短暂***一种或多种外源多聚核苷酸的细胞。短暂转化的细胞典型地指的是作为“非转基因的”或“非基因改良的(非-GMO)”。相反，稳定DNA***指的是引起“稳定转化的”细胞或组织的“稳定转化”，且指的是将一种或多种外源多聚核苷酸***或整合入细胞的基因组。术语“稳定转化细胞”指的是将一种或多种外源多聚核苷酸稳定整合入基因组DNA或细胞器DNA(叶绿体和/或线粒体)的细胞。包含稳定转化了外源DNA的细胞的植物或其部分通常指的是作为“转基因植物”、“转基因植物细胞”、或在本发明的背景中的“转基因种子”。
本发明的基于病毒的DNA构建物能够***地、无症状地在被引入的植物中扩散。作为本文中使用的，术语“***地、无症状地扩散(spread，传播，散布)”指的是基于病毒的载体例如从胚细胞扩散(或传播)至发育的叶子的细胞而不诱导病毒的特有发病症状的能力。DNA构建物可进一步传递给包含异源DNA的植物的后代。不期望被任何的具体原理或作用机制束缚，这样的转移可由基于病毒的DNA构建物扩散入植物的生殖(再生性)细胞而引起。
根据当前某些优选的实施方式，DNA构建物是基于双粒病毒组基因组分，如在国际(PCT)申请公开No.WO2007/141790中所公开的，其全部内容在此通过参考并入。构建物包含侧面与编码双粒病毒组复制酶的非连续核酸序列相连接的异源多聚核酸序列。
根据其他的实施方式，构建物进一步包含编码改良的双粒病毒组外壳蛋白(CP)的多聚核苷酸序列。根据典型的实施方式，改良的双粒病毒组外壳蛋白具有在SEQ ID NO：3中所列的氨基酸序列。根据其他的实施方式，改良的双粒病毒组外壳蛋白编码多聚核苷酸在编码N-末端100个氨基酸的核苷酸中包含突变或缺失。
根据进一步典型的实施方式，表达构建物进一步包含编码改良的双粒病毒组V2蛋白的多聚核苷酸序列。根据典型的实施方式，改良的双粒病毒组V2蛋白具有在SEQ ID NO：4中所列的氨基酸序列。
根据另外典型的实施方式，表达构建物进一步包含编码改良的双粒病毒组C4蛋白的多聚核苷酸序列。根据典型的实施方式，改良的双粒病毒组C4蛋白具有在SEQ ID NO：5中所列的氨基酸序列。根据这些实施方式，改良的双粒病毒组C4蛋白包含突变或缺失。
将清楚地理解，其他携带长异源多聚核苷酸并能够复制和无症状地扩散的基于病毒的构建物也包含于本发明的教导之内。作为本文中使用的，术语“长异源多聚核苷酸”指的是至少1kb长的多聚核苷酸，典型地至少5kb长，更典型地6kb长。
根据某些典型的实施方式，DNA构建物是基于番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)。每种构建物的实例是在图2中所描述的IL-60-BS(具有在SEQID NO：2中所列的核酸序列)和pIR-GUS(具有在SEQ ID NO：8中所列的核酸序列)。
将根据本发明的教导所使用的基于双粒病毒组的构建物引入种子胚细胞，且不整合入细胞的基因组。因此，由包含异源DNA的种子所生长的植物以及由此生长的植物指的是非基因改良的植物。
基因改良的植物的农业应用是公众辩论的问题，且在许多国家是不被法律或规则接受。反对转基因植物的应用的主要考虑是对转基因谱系的不恰当选择(由于隐蔽的有害的位置效应)、与杂草和其他农作物可能的异体受精(或杂交)、由于重组(而造成)的进一步的基因组改变(尤其是在***了异源基因的复制时)和外源序列向植物和土壤微生物的可能转导的恐惧。将抗微生物-抗性基因引入食物和环境也是关注的问题。
生物-安全性和环境状况只能随着时间在实际的、仔细控制的实地试验之后得出结论。构建物清除这样的实验取决于基于硬性实验室数据的评估。本发明方法的一个优势源于基于TYCLV的构建物显示出环境友好并易于生物-安全性-评估实地试验的发现。双粒病毒组不是种子-可传播的(Kashina et al.2003.Phytoparasitica 31：188-199)。载体形式IL-60-BS和pIR即使在植物被克隆有大量的昆虫载体的时候也不是昆虫-可传播的。因此，基于TYCLV的构建物是高度适于植物转化的。
在被处理的种子的细胞中存在的异源DNA，不论短暂表达或稳定整合，可以通过采用任何本领域普通技术人员已知的适合方法验证。细胞的稳定转化可以通过分离基因组DNA并采用与能够和一种或多种异源多聚核苷酸结合的核酸序列的DNA印迹杂交(Southern blot hybridization)或采用与适当引物的聚合酶链反应以扩增外源核苷酸序列而检测。转化DNA的表达可以通过，例如，酶联免疫吸附测试(ELISA)检测，其检测由一种或多种异源多聚核苷酸所编码的多肽的存在，或通过检测由外源多聚核苷酸编码的蛋白的活性。
选择性地，外源DNA可以包含标记(marker)。标记提供了对表达标记的细胞、植物、和/或种子的鉴定和/或选择。标记可以编码在被表达足够的水平时给予对选择剂的抗性的产物。这样的标记和它们相应的选择剂包括，但不限于，除草剂抗性基因和除草剂；抗生素抗性基因和抗生素；以及其他化学抗性基因与它们相应的化学试剂。细菌药物抗性基因包括，但不限于，新霉素磷酸转移酶II(nptII)，其给予对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素、和G418的抗性，以及潮霉素磷酸转移酶(hph)，其给予对潮霉素B的抗性。还可以赋予对来自几个组的除草剂的抗性，包括氨基酸合成抑制剂、光合作用抑制剂、脂抑制剂、生长调节剂、细胞膜破坏剂、色素抑制剂、幼苗生长抑制剂，包括但不限于咪唑啉酮、磺脲类、***并嘧啶、草甘膦、稀乐定、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、草丁膦(glufosinate)、草胺膦(phosphinothricin)、三嗪类、溴苯腈等。
标记的另外的类型为表达可以通过优选在提供适当的底物之后产生颜色的生化反应检测的标记。实例为GUS(β-葡萄糖苷酸酶)报告***、荧光素-荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)***等。
根据某些实施方式，DNA构建物进一步包含调控元件，包括，但不限于，启动子、增强子、和终止信号。
最常用的启动子为胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert et al.，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5745-5749)、章鱼碱合酶(octapine synthase，OCS)启动子、花椰菜花叶病毒组启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton et al.，1987 Plant MoI Biol.9：315-324)、CaMV 35S启动子(Odell et al.，1985 Nature 313：810-812)、以及玄参花叶病病毒35S启动子、来自核酮糖二磷酸羟化酶小亚基的轻诱导型启动子、Adh启动子(Walker et al.，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：6624-66280)、蔗糖合酶启动子(Yang et al.，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：4144-4148)、R基因复合体启动子(Chandler et al.，1989 Plant Cell 1：1175-1183)、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。其他常用启动子为，对于洋芋ADPGPP基因的启动子类、蔗糖合酶启动子、颗粒结合型淀粉合成酶启动子、谷蛋白基因启动子、玉米糯质基因启动子(maize waxy promoter)、脆基因启动子(Brittle gene promoter)、以及超甜基因启动子(Shrunken 2 promoter)、酸性几丁质酶基因启动子、和玉米蛋白启动子(15kD、16kD、19kD、22kD、和27kD；Perdersen et al.1982 Cell 29：1015-1026)。很多启动子在国际专利申请公开No.WO 00/18963中所描述。
“3’非编码序列”指的是位于编码序列下游的DNA序列，且包含多聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多聚腺苷酸化信号通常特征在于影响多聚腺苷酸束加入至mRNA前体的3’末端。不同3’非编码序列的应用由Ingelbrecht I L.等例证说明(1989.Plant Cell 1：671-680)。
本发明的方法可以用于引入任何其存在和/或表达具有益处的多聚核苷酸，包括给予植物期望的(多种)性质，如(a)对生物的和非生物的应激条件的抗性，如对昆虫、线虫、由病毒、细菌、真菌以及其他病原害虫的抗性，对特定(多种)除草剂的抗性，(b)对不利条件的适应如耐盐性、耐干旱性、寒热耐性；(c)提高的产率质量性状，包括但不限于颜色、硬度、成份(包括糖类、挥发性物质、油类、脂肪酸类和/或酸类)的类型和含量、大小、生长速度、侏儒生长习性、出芽时间、果实出现和成熟时间；营养或商业价值；(d)提高的食用产率的产量，或提高对于生物制药业和化妆品业任一方以蛋白、次级代谢产物的形式的次级代谢产物的产量和(e)获得期望的生长习性，包括有限型、亚有限型和无限型(如对于番茄)、侏儒和标准(如对于玉米)以及植物活力。被引入的DNA还可以给予基因沉默，以致异源DNA是以反义的siRNA、dsRNA的形式；或用于生产用于工业的原材料，包括但不限于纤维、木材、油类、树脂等，以及由遗传因子支配和/或由基因和环境相互作用的其他植物特性。
被表达的多聚核苷酸序列可以编码可从非生物的应激因素如干旱、热或冷冻中保护植物的分子。实例包括来自短角床杜父鱼(MyoxocephalusScorpius)(WO 00/00512)或多刺床杜父鱼(M.octodecemspinosus)的抗冻多肽、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转录激活子CBFI、谷氨酸脱氢酶(WO 97/12983、WO 98/11240)、钙依赖性蛋白激酶基因(WO 98/26045)、钙神经素(WO 99/05902)、来自酵母菌的酪蛋白激酶(WO 02/052012)、法呢酰基转移酶(WO 99/06580)、铁蛋白(Deak M.et al.1999.NatureBiotechnology 17：192-196)、草酸氧化酶(WO 99/04013)、DREBIA因子(Kasuga M.et al.1999.Nature Biotech 17：276-286)、甘露酶基因或海藻糖合成基因如海藻糖-磷酸合酶或海藻糖-磷酸磷酸酶(WO 97/42326)或通过抑制基因如海藻糖酶(WO 97/50561)。
被表达的多聚核苷酸序列可以是用于食物和食品安全的代谢酶。实例包括植酸酶(GenBank Ace.No.：A 19451)和纤维素酶。
被表达的多聚核苷酸序列可以通过直接攻击病原体，打开宿主防御或通过产生特定代谢物或蛋白的积累，给予对病毒、真菌、昆虫、线虫和其他病原体和疾病的抗性。实例包括硫代葡萄糖酸盐类(防御食草动物)、壳多糖酶或葡聚糖酶或破坏寄生虫的细胞壁的其他酶、核糖体钝化蛋白(RIPS)以及其他植物抗性蛋白和在植物被微生物或由化学地(例如，水杨酸、茉莉酸、或乙烯)伤害或攻击时所诱发的应激反应的蛋白、或来自非植物资源的溶菌酶如T4-溶菌酶或来自各种哺乳动物的溶菌酶、除虫蛋白如苏云金芽孢杆菌内毒素、α-淀粉酶抑制剂或蛋白酶抑制剂(豇豆胰蛋白酶抑制剂)、外源凝集素类如小麦凝集素(wheatgerm agglutinin)、siRNA、反义RNA、核糖核酸酶或核酶。另外的实例是编码木霉chit42内切几丁质酶(Trichoderma harzianum chit42 endochitinase)(GenBank Ace.No.：S78423)或来自高粱(Sorghum bicolor)(GenBank Ace.No.：U32624)的N-羟基化的、多功能细胞色素P-450(CYP79)蛋白的核酸、或其功能等同物。
对害虫例如，如在稻米植物中的稻米害虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)的抗性可以通过表达雪莲花(Galanthus nivalis，普通雪莲花)外源凝集素(Rao et al.1998.Plant J 15(4)：469-77)实现。
编码鳞翅类-特异性苏云金芽孢杆菌δ-内毒素(lepidoptera-specificBacillus thuringiensis delta-endotoxins)的合成cryIA(b)和cryIA(c)基因的表达，可以带来在各种植物中对昆虫害虫的抗性(Goyal R K.et al.2000.Crop Protection 19(5)：307-312)。
适合病原体防御的另外的基因包括“聚半乳糖醛酸酶-抑制蛋白”(PGIP)、奇(异果)甜蛋白(thaumatine)、转化酶和抗微生物肽类如乳铁蛋白(Lee T J.et al.2002.J Amer Soc Horticult Sci 127(2)：158-164)。被表达的多聚核苷酸序列可以引起化学物质如生育酚类、生育三烯酚类或类胡萝卜素类的积累。这样的多聚核苷酸的一个实例是八氢番茄红素。优选的是编码水黄水仙八氢番茄红素脱氢酶(Narcissus pseudonarcissus phytoenedesaturase)(GenBank Ace.No.：X78815)的核酸或其功能等同物。被表达的多聚核苷酸序列可以用于营养制品的生产，例如，如由脂肪酸延伸酶和/或去饱和酶所生产的多不饱和脂肪酸类(花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸)，或用于生产营养价值提高了的蛋白例如，如，具有高必需氨基酸含量(例如巴西坚果的高-甲硫氨酸2S白蛋白基因)。优选的是编码巴西胡桃(Bertholletia excelsa)高-甲硫氨酸2S白蛋白(GenBank Ace.No.：AB044391)、立碗藓属(Physcomitrella patens)δ-6-酰基-脂去饱和酶(GenBank Ace.No.：AJ222980)、被孢霉菌(Mortierella alpina)δ-6-去饱和酶(Sakuradani et al.1999.Gene 238：445-453)、漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)A5-脂肪酸去饱和酶(des-5)(GenBank Ace.No.：AF078796)、被孢霉菌δ-5-去饱和酶(Michaelson et al.JBC 273：19055-19059)、漂亮新小杆线虫δ-6-延伸酶(Beaudoin et al.2000.PNAS97：6421-6426)、立碗藓属δ-6-酰基-延伸酶(Zank et al.2000.BiochemicalSociety Transactions 28：654-657)的多聚核苷酸序列、或这些的功能等同物。
被表达的多聚核苷酸序列可以用于生产高质量的蛋白和用于工业目的的酶(例如酶类如脂肪酶)或作为药物(例如，如抗体、凝血因子类、干扰素类、淋巴因子、集落刺激因子、纤溶酶原激活剂、激素类或疫苗类，例如，由Hood E E.等1999.Curr Opin Biotechnol 10(4)：382-60))和Ma J K.等(1999.Curr Top Microbiol Immunol 236：275-92)所描述的)。例如，已可能由转基因玉米植物中的鸡白蛋白和细菌P-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)大规模生产重组的抗生物素蛋白(Hood et al.1999.Adv Exp Med Biol 464：127-47；Review)。
被表达的多聚核苷酸序列还可以用于在正常包含更少的储存蛋白或储存脂类的细胞中获得增加的可储存性，以增加这些物质(如乙酰-CoA羧化酶)的产率。优选的多聚核苷酸序列是编码紫苜蓿乙酰-CoA羧化酶(accase)(GenBank Ace.No.：L25042)的那些(序列)，或其功能等同物。
另外可表达的多聚核苷酸的实例包括乙型肝炎表面抗原(Kumar GBSet al.2005.PLANTA 222(3)：484-493)、除草剂抗性(Duke，S O.2005.PestManagement Science 61(21)：1-218)、干扰素(Edelbaum，O.et al.1992.J.Interferon Res.12：449-453)、T7-RNA聚合酶(Zeitoune et al.1997.PlantScience 141：59-65)。
可以被表达于本发明的转化植物中的多聚核苷酸的进一步实例是在Dunwell J M.2000.J Exp Bot.51：487-96中所提到的实例。
根据本发明的教导，被转化入植物细胞的异源DNA还可以用于减少(抑制)靶基因的转录和/或翻译。因此，DNA构建物可以包含表达引起PTGS(转录后基因沉默)或TGS(转录沉默)作用并因此减少内源基因的表达的异源DNA。这样的减少可以通过例如，反义RNA或双链RNA的表达实现，其中每一种具有与待抑制的内源靶基因的同源性。而且，适当反义RNA的表达可以通过称为共抑制的方式(EP申请公开No.0465572)引起内源基因表达的减少。尤其优选的是用于经RNA干扰(RNAi)减少靶基因的基因表达的双链小干扰RNA(siRNA)。利用具有双链结构的RNA用于抑制单个靶基因的方法，其中靶基因和RNA双链区域具有至少部分的相同性，是本领域普通技术人员已知的。
以下提供了可以通过根据本发明的教导用适当的异源DNA转化植物种子获得基因表达的减少的应用实例。
可以实现延迟果实成熟或改良成熟的表型(延长成熟，更后衰老)，能够例如通过减少选自由以下基因所组成的组中的基因的表达：多聚半乳糖醛酸酶、果胶脂酶、(β-1，4)葡聚糖酶(纤维素酶)、β-半乳聚糖酶(β-半乳糖苷酶类)，或乙烯生物合成的基因如1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶、腺苷甲硫氨酸水解酶(SAMase)、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因，类胡萝卜素生物合成的基因例如，如前-八氢番茄红素生物合成或八氢番茄红素生物合成的基因例如八氢番茄红素去饱和酶，以及O-甲基转移酶类、酰基载体蛋白(ACP)、延伸因子、生长素诱导的基因、半胱氨酸(巯基)蛋白酶类、淀粉磷酸化酶、丙酮酸脱羧酶、查耳酮还原酶(chalcone reductases)、蛋白激酶类、生长素相关基因、蔗糖转运蛋白、分生组织形式基因(meristem pattern gene)。另外的优势基因例如在国际(PCT)申请公开WO 91/16440、WO 91/05865、WO 91/16426、WO 92/17596、WO 93/07275或WO 92/04456中所描述的。尤其优选的是用于防止细胞降解以及植物和果实(例如番茄)变烂(mushiness)的聚半乳糖醛酸酶表达的降解。核酸序列如番茄聚半乳糖醛酸酶基因(GenBankAcc.No.：x14074)的核酸序列或其同源物(homologs)可以优选用于该目的。
编码储存蛋白的基因的基因表达的减少具有很多优点，例如，如，变应原潜在性的减少或关于其他代谢物(例如，如油或淀粉含量)的组分或数量的改良。
对植物病原体如蜘蛛、真菌、昆虫、线虫、原生动物、病毒、细菌和疾病的抗性可以通过减少对于生长、存活、特定发育阶段(例如蛹化)或特定病原体的繁殖重要的基因的基因表达实现。这样的减少可以带来以上所提到的阶段的完全抑制，或者以上所提到的阶段的延迟。它们可以采取植物基因的形式，其例如使得穿入病原体成为可能，但还可能是同源病原体基因。被转化或表达的异源核酸序列(例如双链RNA)是直接对抗病原体基因，以致中断病原体的生命周期。
病毒抗性可以例如通过减少病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒蛋白酶等的表达实现。大量的植物病毒和适合的靶基因是本领域的普通技术人员已知的。
不期望的、变应原的、或有毒的植物组分例如，如硫代葡糖酸盐类或patatin(在马铃薯中发现的一种糖蛋白)的减少。(特别地在WO 97/16559中)描述了适合的靶基因。优选用于减少变应原蛋白的靶基因在例如由Tada Y et al.(1996)FEBS Lett 391(3)：341-345或Nakamura R(1996)BiosciBiotechnol Biochem 60(8)：1215-1221所描述。
延迟的衰老信号。适合的靶基因尤其是桂皮烯醛基-CoA：NADPH还原酶或桂皮烯醛基-醇脱氢酶。(尤其在WO 95/07993中)描述了另外的靶基因。
通过减少苏氨酸生物合成增加甲硫氨酸的含量，例如，通过减少苏氨酸合酶的表达(Zeh M et al.2001.Plant Physiol 127(3)：92-802)。
植物种子是完全自足独立的生殖单元，通常由通过有性受精(sexualfertilization)，或通过无性种子繁殖(单性生殖)产生的合子胚、营养素的贮藏物质(storage reserves)(在结构中指的是子叶、胚乳、或雌配子体)、以及包裹贮藏物质和胚的保护性种皮组成。在自然中，种子的成熟通常由一段时间内的逐步的水分流失至5-35％含水量之间的水平完成。一旦达到这些低含水量水平，植物种子可以长期储存。
有性合子的和无性的植物种子的萌芽通常由一种或多种环境诱因触发，如水、氧气、最适温度或冷/热处理、和光照以及其持续时间。种子通过一系列事件的方式萌芽，以由休眠期的干燥种子吸收水(吸涨)开始，然后通过最终引起胚沿着其轴延伸和后代发育的各种生物物理学、生物化学、和生理学事件按顺序进行。
种子萌芽的连续过程可以分为三个阶段。阶段一指的是吸涨，且特征在于快速起始将水吸入种子中。在阶段一发生的其他重要的事件是核DNA和线粒体DNA损伤修复的起始，其可以在种子脱水和/或成熟过程中发生，且随后由存在的mRNA协助开始蛋白质的合成。
阶段二特征在于水吸收速率的显著减少(即吸涨已经完成)。这通过激活或新形成特异水解在胚中的碳水化合物、蛋白、和脂类的复合营养物质的酶的合成实现。这些复合营养物质的水解提供了要求用于种子胚呼吸和生长的底物。
阶段三特征在于水吸收速率的第二快速增加。在阶段三中吸收的水主要是用于在胚的根和苗端的分生细胞***的起始，并用于沿着胚轴吸收进入细胞。胚的轴细胞吸收的水施加膨压引起轴细胞延长。该净效应是胚延长达到穿过种皮而出芽的程度。穿过种皮的芽或根的伸出表明萌芽的完成和幼苗生长和发育的开始。
对于种子萌芽的速度和成功显著地变化，取决于各种因素，如种子发育和成熟环境条件的残余影响、在种子成熟过程中所合成的贮藏物质化合物的量、储存时间、储存环境的质量(如温度和湿度)以及在萌芽过程中主要的环境条件。从商业角度来看，期望降低萌芽失败的风险，并确保种子快速且均一地发芽和萌芽。
对于最佳的种子萌芽性能的商业需要已导致在本领域中已知的对于合子种子“种子启动”过程的发展。该术语(“种子启动”)可以定义为受限的水吸收，其足够起始(启动)萌芽的早期事件，但不足于允许胚根突出，优选之后进行干燥。几种原理技术被商业使用以完成种子启动。不考虑使用的特定方法，种子启动的基本原理是：(1)通过控制对于种子可利用的水特定且唯一地激活萌芽的初级阶段，和(2)通过外部的启动过程起始萌芽过程随后通过干燥或部分干燥步骤停滞。
意外地，本发明现在显示在种子启动介质中包含基于病毒的DNA构建物引起种子对该DNA的吸收，以致该DNA进入种子细胞。没有期望被任何特定原理或作用机制束缚，该现象可能归因于能够将异源DNA引入种子细胞的病毒元件。
根据本发明的教导，可以使用任何本领域普通技术人员已知的用于种子启动的方法。启动可以在各种温度和通气(如搅拌、振摇、鼓泡等)下利用任何用于受控的水吸收技术进行：用溶液启动(无机的，如盐/营养素，或有机的，如，PEG)或用固体颗粒***启动或通过与水受控的水合，例如在Taylor，A G.et all 1998.Seed Science Technology 8：245-256中所描述的。
启动基质特征在于其有效的渗透势。有效的渗透势通常低于水势，可用于种子吸涨，允许或引起限制量的水进入种子中，达到足够用于萌芽的起始步骤而没有根的实际突出的水平，即以便启动种子。种子萌芽仅在对于种子可用的水达到足够用于生理发育的位势(potential，水势)(植物种类之间不同)的时候发生。典型地，该值落在0至-2mPa之间。正在使用许多提供适当渗透势的启动基质，包括水、含有一种或多种溶质的水、固体基质等。例如，启动基质可以包含渗透物质的充气溶液，有机物质(organic nature)如聚乙二醇(PEG)(参见美国专利No.5,119,598)、甘油、甘露醇、或无机盐(如磷酸氢二钾、硝酸钾等)(或盐的组合)的充气溶液。选择性地，种子可以利用固体基质启动。固体基质物质应具有以使种子能够吸涨的高持水性。在该方法中，启动基质可以包含用以吸收水然后将水传递给种子的吸收介质如粘土、蛭石、珍珠岩、锯末屑、玉米轴、和/或泥炭(参见美国专利No.4,912,874)。水合程度是通过改变介质的水含量和介质/种子比控制。还已知在PEG 6000和蛭石或其他材料的浆体中吸涨种子的方法(参见U.S.Patent No.5,628,144)。还在其他的方法中，启动采用调节水从具有给定渗透压特征的溶液向种子转移的半透膜(例如，美国专利No.6,453,609)。可选地，启动基质可以包含各种添加剂、化学制品、和/或化合物，包括表面活性剂、选择剂、杀菌剂、改变渗透势的试剂、渗透保护剂、帮助干燥或在干燥时保护种子的试剂、增强种子加工(seedprocessing)的试剂、延长储存期限的试剂、增强包衣或灌注的试剂、增强种子萌芽的试剂等。启动基质可以包含杀菌剂，例如赛仑(thiram)、克菌丹(captan)、甲霜灵(metalaxyl)、五氯硝基苯、胺苯氮磺钠(fenaminosulf)、杀菌剂或其他防腐剂。另外，生长调节剂或激素，如赤霉素类或赤霉酸、细胞激肽类、脱落酸抑制剂、2-(3，4-二氯苯氧)三乙胺(DCPTA)、硝酸钾、和乙烯磷(ethaphon)也可以存在于启动基质中。其他可选的试剂包括甘油、聚乙二醇、甘露醇、DMSO、曲拉通X-100、吐温-20、NP-40、离子化合物、非离子化合物、表面活性剂、洗涤剂等。足够产生启动的种子的时间允许萌发前代谢过程在种子内发生至任何水平，包括胚根立即突出之前。产生启动的种子的时间取决于具体的种子种类、其状态或条件、以及启动基质的水势。而对于给定的种子类型，典型的水量和介质水势对于一些种子是普遍已知的，往往最好在容易测定的水势和温度的范围内测试新种子的小样，以测定提供适当的种子吸涨和获得的萌芽前事件的温度、水势、和时间的条件。启动方法所实施的温度可能随待处理的种子而变化，但典型的(通常)是在18℃至30℃之间。启动的种子可通过根发芽所表明的萌芽保持在启动基质中。由该方法产生的种子可以进一步干燥(如在美国专利No.4,905,411中所描述的)。
检测种子是否已经启动的方法是本领域中所已知的。例如，可以通过进行萌芽测试而实施最佳启动处理。(参见，例如，Jeller H.et al.2003.BrazJ Biol 63：61-68)另外，已知萌发或启动的分子标记。参见，例如，Job et al.2000.Seed Biology：Advances and Applications，Eds.Black et al.，CABIInternational，Wallingford，UK，pp.449-459；De Castro R D.et al.2000.PlantPhysiol 122：327-336；Bradford et al.2000.Seed Biology：Advances andApplications，Eds.Black et al.，CABI International，Wallingford，UK pp.221-251；和Gallardo K.et al.2001 Plant Physiol 126：835-848。
启动后，可以使种子萌芽，或可以干燥被启动的种子。对于干燥过程的适当条件(温度、相对湿度、和时间)将取决于种子而变化且可以经验确定(参见，例如，Jeller et al.2003.ibid)干燥启动的种子包括种子的表面干燥或，选择性地，将种子干燥至它的最初含水量。干燥的种子可以立刻萌芽或可以在适当条件下储存。已知对于各种种子的萌芽条件。在确定适当萌芽条件中的一个因素是阈值萌芽温度范围，其是对于一个物种的温度范围，在该温度范围该物种的种子将在预定的湿度水平且有足够的氧气的条件下萌芽。另外一个因素是阈值萌芽湿度范围，其是对于一个物种的湿度范围，在该湿度范围内该物种的种子将在给定的温度且有足够的氧气的条件下萌芽。已知对于各种种子的阈值萌芽温度范围和/或阈值萌芽湿度范围值，以及对于任何给定种子和品种经验测定这些条件的方法。
本发明的方法显著减少了用于将(一种或多种)异源基因引入植物细胞、感兴趣植物的生成、选择、以及繁殖所要求的时间。对于由在培养中的组织分化引起的体细胞克隆变异的可能性是无效的。在使用基于双粒病毒组的构建物时，植物包含外源DNA，同样每个感染良性微生物的组织也包含，但该处理的植物不是基因改良的。本发明的方法可以彻底减少繁殖的时间和花费，因为其促进(一种或多种)感兴趣基因在任何要求的植物种类中的表达，因此增加需要的性状如对生物的/非生物应激条件的抗性/耐性、对于任何给定的环境和市场等提高产率和质量，只要已知控制期望性质的基因。相似地，根据本发明的教导引入的异源DNA，在需要时(如绿背番茄在意大利是被期望的，但在美国是不被接受的))可以引起(一种或多种)特定过程的沉默。
提供以下实施例以更加完整地说明本发明的一些实施方式。然而，它们不应被任何方式理解为限制本发明的广泛范围。本领域的普通技术人员在不背离本发明范围的情况下，能容易地设计出在本文中所公开的原理的变体和改变。
实施例
实施例1：利用不含有外源DNA的启动介质启动
如先前所描述的(Khan，AA.1992.Horticultural Reviews，Vol.14，ed.J.Janick.New York：John Wiley，pp.131-181；Taylor G.et al.1998.SeedScience Technology 8：245-256)(有一些改变)，进行番茄种子在聚乙二醇(PEG)存在的条件下的启动。
50份番茄种子(batches of 50 tomato seeds)在由0.1M Ca(NO3)2；0.1MMES(4-吗啉乙磺酸)；15mM MgCl2和25％(溶液T2)或20％(溶液T3)的PEG 8000组成的溶液中吸涨。溶液T2和溶液T3的渗透压分别是-1.25mPa和-1.2mPa。同一品种同一批种子的未处理的干燥种子用作对照。在20℃的恒温下实施，每天光照12小时，并且温和搅拌4或6天以获得适当的通气。将种子放在补充有3毫升无菌水的3M滤纸上，并每天记录发芽速度。该数据(图1)表明与对照(成功的萌芽)相比，启动种子的发芽均匀性显著增加。
实施例2：利用启动介质将IL-60构建物引入种子
用含有25％PEG的启动溶液启动番茄种子并如在上面实施例1中描述的，在20、40和60μg的每种IL-60-BS(SEQ ID NO：2)和pIR-GUS(SEQ ID NO：8)DNA构建物存在的情况下萌发。这些构建物分别在图2A和2B中图解。构建物还在通过引用并入本文中的国际(PCT)专利申请公开WO 2007/141790中描述。未处理的种子和在相同条件下启动但不含有DNA构建物的种子作为对照。
萌芽六天后，将幼苗移植到包含10升土壤的盆中并放置在25℃的温室中。种植21天后，从真叶(ture leaves)(第三个或以上的真叶)中提取DNA并用一下引物进行PCR用于GUS测试：
正向引物：ATTGATCAGCGTTGGTGGGA(SEQ ID NO：6)和反向引物：TGCGGTCGCGAGTGAAGATC(SEQ ID NO：7)，旨在放大存在于pIR-GUS DNA构建物中的完整gus基因。正向PCR反应确认在真叶中存在GUS DNA序列。这些结果显示基于IL-60载体的DNA构建物利用以上启动方法(过程)引入到种子(一个或多个)细胞中。引入的DNA复制、扩散并表达于整个植物***。这样的测试结果的实例在图3中示出。
实施例3：外源基因的表达
如上面实施例2中所描述的IL-60家族的DNA构建物(IL-60-BS与pIR-GUS组合)促进存在于pIR-GUS DNA构建物中并经由启动引入的外源(foreign，外来)基因gus基因的表达。
针对β-葡萄糖苷酸酶(GUS)，根据Jefferson R A.et al.(1987.EMBOJ 6：3901-3907)染色如以上实施例2中所描述的获得的植物的番茄叶子。
叶组织的蓝色染色明确表明GUS蛋白的表达(图4A-B)。
实施例4：在改良的启动条件下来自IL-60载体的特定DNA的表达
如在实施例2中与包含5％PEG并加入75％二甲基亚砜(DMSO)以获得-0.131mPa(1.296 Atm.，根据Christopher et.al Macromolecules 2003.36：6888-6893)的最终渗透势的基础启动溶液进行启动。在这个改良的启动溶液，按如在上面实施例2和3中所描述的GUS表达所指示的，IR-GUSDNA引入并复制。
具体实施方式的以上描述将充分显露本发明的一般本质，其他人可以通过应用当前的知识，在没有过度实验和在不背离一般概念的情况下，很容易地改变这样的具体实施方式和/或使这样的具体实施方式适应进行各种各样的应用，因此这样的应用和改变应当，并且意欲包含于所公开的实施方式的等价物的含义和范围之内。应理解本文所采用的措词或术语是为了描述而并非限制。用于实行各种所公开的功能的方法、材料和步骤可采取各种不背离本发明的替代形式。
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Claims (29)

1.一种用于将异源DNA引入植物种子胚中的至少一个细胞的方法，包括使植物种子与包括包含所述异源DNA的基于病毒的DNA构建物的启动介质在能够启动的条件下接触，由此获得包含所述异源DNA的种子胚。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供用于后续的种子萌芽和生长的适当条件，以便获得包含所述异源DNA的植物或其部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基于病毒的DNA构建物包含能够复制并无症状地将所述构建物扩散至邻近的植物细胞的病毒基因或其部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述DNA构建物为基于双粒病毒组的构建物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述DNA构建物包含侧面与编码双粒病毒组复制酶或复制酶相关蛋白的非连续核酸序列相接的异源DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述DNA构建物进一步包含编码改良的双粒病毒组外壳蛋白(CP)的多聚核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述改良双粒病毒组外壳蛋白在编码N-末端的100个氨基酸的核苷酸中包含突变或缺失。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述DNA构建物进一步包含编码改良的双粒病毒组V2蛋白的多聚核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述DNA构建物进一步包含编码改良的双粒病毒组C4蛋白的多聚核苷酸序列。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述DNA构建物进一步包含细菌的多聚核苷酸序列。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其中，所述双粒病毒组是番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述DNA构建物为基于双粒病毒组的构建物，其选自由具有在SEQ OD NO：1中所列的核酸序列的IL-60和具有在SEQ ID NO：2中所列的核酸序列的IL-60-BS所组成的组。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA构建物是表达构建物，因此所述异源DNA被表达在所述植物细胞内。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述DNA构建物进一步包含选自由增强子、启动子、和转录终止序列所组成的组中的至少一种调控元件。
15.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建物进一步包含用于鉴定包含所述异源DNA的所述种子和植物的标记。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源DNA编码选自由肽、多肽、蛋白和RNA分子所组成的组中的产物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述肽、多肽或蛋白在化妆品业或制药业中是有用的。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述RNA分子是选自由反义RNA、dsRNA和siRNA组成的组中的抑制RNA。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述被编码的产物赋予选自由对生物或非生物应激的抗性、提高的产率、提高的生产质量、和优选的生长模式所组成的组中的期望的农学特性。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源DNA在所述种子胚的至少一种细胞和源于其的细胞中短暂表达。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源DNA结合入所述种子胚的至少一个细胞和源于其的细胞的基因组中。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述启动介质具有能够使种子吸涨但不使胚根出现的水势。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述启动介质是含水溶液。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述启动介质是固体基质。
25.一种通过权利要求1所述的方法制备的种子，其中，所述种子包括所述包含异源DNA的基于病毒的DNA构建物。
26.由根据权利要求25所述的种子生长的植物或其部分，其中，所述植物或其部分包括所述包含异源DNA的基于病毒的DNA构建物。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子是单子叶植物来源。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子是双子叶植物来源。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子是球果来源。
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