KR20160057657A - 벼 유래 종자 특이적 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래 종자 특이적 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 성숙 종자의 배(embryo) 및 배반(scuttellum) 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 OsPHS1(Oryza sativa Pre Harvest Sprouting 1) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.
본 발명의 벼 종자에서 특이적으로 발현되는 OsPHS1 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자의 배 및 배반 조직에서 주요하게 발현시킬 수 있도록 조절함으로써, 종자 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장 조절 등 작물의 형질 개량에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 성숙 종자 내에서의 목적유전자 기능 분석에도 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

벼 유래 종자 특이적 프로모터 및 이의 용도{Seed―specific promoter derived from Oryza sativa and use thereof}

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래 종자 특이적 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 성숙 종자의 배(embryo) 및 배반(scuttellum) 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 OsPHS1(Oryza sativa Pre Harvest Sprouting 1) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.

일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.

둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.

셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.

특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다.

첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(대한민국 등록특허 제0429335호). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.

셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.

이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.

그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터를 개발하기 위하여 벼 종자의 수발아 표현형을 보이는 돌연변이체를 분석하여 예의 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 주요하게 성숙 종자의 배 및 배반 조직에서 발현시킬 수 있는 OsPHS1 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 벼의 성숙 종자의 배 및 배반 조직에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터와 벡터를 이용하여 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 벼 성숙 종자의 배(embryo) 또는 배반(scutellum) 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "배(embryo)"란 종자가 발아하여 어린 식물이 되는 부분으로, 나중에 성숙하여 잎, 줄기, 뿌리가 되는 부위이며, "배반(scutellum)"이란 종자의 내유를 구성하고 있는 일부분으로, 식물을 숙성시키는 효소를 가지고 있는 부위이다.

본 발명에서 용어 "프로모터"란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

본 발명의 프로모터는 식물체의 특정 부위, 특히 성숙 종자의 배(embryo) 및 배반(scutellum) 조직에서만 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어“상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 벼 종자의 배, 배반 또는 배반 유래 분열조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 벼 종자의 배, 배반 또는 배반 유래 분열조직에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 OsPHS1 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 벼 종자의 배, 배반 또는 배반 유래 분열조직에서 특이적으로 발현되었고, 종자의 배반에서 유래한 분열세포에서 특이적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 5).

본 발명의 조직 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 OsPHS1 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "재조합 발현 벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 조직 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되기를 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.

또한, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택할 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, G418, 카나마이신(kanamycin), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(cholramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 OsPHS1 프로모터를 Gus 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pBGWFS7-pOsPHS1을 제조하였다(실시예 2-1 및 도 3).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsPHS1 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 조직 특이적으로, 특히 성숙 종자의 배 또는 배반조직에서 특이적으로 발현되는 것을 의미한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 의미한다.

상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용하였다(실시예 2-2).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsPHS1 프로모터 및 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환 식물을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물은 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 OsPHS1 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 벼(Oryza sativa)에 접종하여 형질전환 식물체를 제작하였다(실시예 3-1).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 단백질이 벼 성숙 종자의 배 또는 배반 조직에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

b) 상기 재조합 발현 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 형질전환시켜 형질전환된 아그로박테리움을 제조하는 단계; 및

c) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 감염시키는 단계.

본 발명에서 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 벼 성숙 종자의 배 또는 배반 조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼 종자의 배, 배반 또는 배반 유래 분열조직에서의 목적 단백질 특이적 발현용 OsPHS1 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환하여 벼의 종자의 배, 배반 또는 배반 유래 분열조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 목적 단백질은 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.

본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 특정 부위, 예를 들면 종자, 잎 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 종자에서 발현시킴으로써 종자와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.

본 발명의 벼 종자에서 특이적으로 발현되는 OsPHS1 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자의 배 및 배반 조직에서 주요하게 발현시킬 수 있도록 조절함으로써, 종자 특이물질 생산, 휴면, 발아 및 생장 조절 등 작물의 형질 개량에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 성숙 종자 내에서의 목적유전자 기능 분석에도 유용하게 쓰일 수 있다.

도 1은 본 발명의 OsPHS1 프로모터의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 OsPHS1 프로모터에서 발견된 종자 발아와 관련된 모티프(motif)를 나타낸 도이다.
도 3은 게이트웨이 시스템을 통해 제조된 벼 형질전환용 OsPHS1 프로모터의 발현 벡터 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 형질전환 벼의 게놈 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 OsPHS1 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 게놈 DNA 의 PCR 에 의한 OsPHS1 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석

실시예 1-1: OsPHS1 프로모터 영역의 PCR 증폭

농촌진흥청에서 분양받은 벼 수발아 돌연변이 종자로부터 total RNA를 분리하여 QRT-PCT 방법으로 유전자 발현 양상을 분석하여 OsPHS1(Oryza sativa Pre Harvest Sprouting 1) 유전자를 선발하였다. 상기 선발된 OsPHS1 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여, 번역시작 상위염기서열 2022kb의 염기서열 정보를 벼 게놈 데이타베이스(genome database)에서 추출하고, 상기 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 디자인하여 정방향 프라이머(forward primer) OsPHS1P-F: 5'-CACCCAGACTACAGTCGTCATCCAGAATATGC-3'(서열번호 2)와 역방향 프라이머(reverse primer) OsPHS1P-R: 5'-GGCCGGCGCGCGCGCTCTCCGGAGTTCAATTGG-3'(서열번호 3)를 합성하였다. 상기 합성한 프라이머 세트를 이용하여 동진 벼의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Primestar 중합효소(polymerase)(Takara사)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR의 반응조건은 94℃에서 5분간 변성한 후, 94℃에서 30초, 57℃에서 40초, 72℃에서 2분을 총 40회(cycle) 반복하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 7분간으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동 한 후 OsPHS1 프로모터로 추정되는 밴드를 잘라내어 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다.

실시예 1-2: OsPHS1 프로모터 영역의 클로닝 ( cloning ) 및 염기서열 분석

상기 실시예 1-1에서 증폭된 OsPHS1 프로모터 영역의 PCR 산물을 게이트웨이 도너 벡터(pENTER/D-TOPO, Invitrogen)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였으며, 이에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 OsPHS1 프로모터 유전자를 확보하였다(도 1).

실시예 1-3: OsPHS1 프로모터 영역의 모티프( motif ) 검색

상기 실시예 1-2에서 확보된 OsPHS1 프로모터 유전자 내에 존재하는 조절인자를 확인하기 위해, PLACE(Plant Cis-acting Elements database: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 프로그램을 이용하여 유전자 발현 모티프를 분석하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 종자 또는 배 특이적 반응 모티프(GLMHVCHORD 또는 DPBFCOREDCDC3)가 존재함을 확인하였으며, Amylase box, GARE(GA responsive element), ABRE(ABA responsive element) 등 종자 발아와 휴면 조절에 관여하는 호르몬에 반응하는 모티프도 존재함을 확인하였다. 이를 통하여, OsPHS1 프로모터가 종자에서 특이적으로 발현을 유도할 수 있고, 종자의 발아, 휴면 및 생장 조절에 관여할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 형질전환 벡터( vector ) 및 형질전환체 제작

실시예 2-1: OsPHS1 프로모터 운반체 제작

상기 실시예 1-1에서 분리한 OsPHS1 유전자의 프로모터를 이용하여 리포터(repoter) 유전자 GUS를 발현시키기 위하여 제조합 발현 벡터를 구축하였다.

구체적으로, 게이트웨이 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터(PSB 사, Plant System Biology)에 상기 프로모터가 삽입된 재조합 벡터를 제작하였다(도 3).

실시예 2-2: 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens ) 형질전환체 제작

상기 실시예 2-1에서 제작된 OsPHS1 프로모터 발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하기 위하여, 동결-해동(freeze-thaw) 방법을 사용하여 형질전환하였다.

구체적으로, 동결과 해동(freeze and thaw)을 2 내지 3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g/1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂2H₂O 0.265g, FeSO₄.7H₂O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

실시예 3: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작 및 분석

실시예 3-1: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작

상기 실시예 2-2에서 제작한 OsPHS1 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 이용하여, 동진벼의 캘루스(callus)에 접종하여 감염시킨 후, PPT(phosphinothricin, 포스피노트리신) 6㎍/L의 조건에서 형질전환체를 선발하고, 최종적으로 상기 선발된 형질전환체를 온실에서 생육하여 형질전환된 벼를 제조하였다.

구체적으로, 아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 2N6 배지에서 동진벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 N6 배지 (Duchefa 사 vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 2 mg/L 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃에서 3 내지 4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, 2N6 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다. 형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(co-culture) 시킨 후 3일간 암 배양하였다. 멸균수에 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 2N6 배지에 세포탁심(cefotaxime)과 PPT(포스피노트리신, phosphinothricin)가 6 ㎍/L로 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 2N6배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 2N6배지에 옮겨 2 주간 암 배양하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 MSR 배지(Duchefa MS 배지에 말토스(maltose)와 솔비톨(sorbitol) 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.

실시예 3-2: OsPHS1 프로모터 삽입 벼 형질전환체 분석

상기 실시예 3-1에서 OsPHS1 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 제작한 형질전환 벼에, OsPHS1 프로모터 발현 벡터가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-1에서 제작한 OsPHS1 프로모터가 도입된 벼 형질전환체의 게놈(genomic) DNA를 분리하여 PCR 분석을 수행하였다.

구체적으로, Inclone Genomic DNA prep kit(Inclone Cat# IN1003-0200)을 사용하여 상기 OsPHS1 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 잎에서 게놈 DNA를 추출하고, 상기 단편을 증폭하기 위한 도입 벡터에 존재하는 부분(GUSA-anti) 및 프로모터 부분(OsPHS1P-5)에 존재하는 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 상기 합성한 프라이머 세트인, GUSA-Anti: 5'-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3'(서열번호 4)와 OsPHS1P-5: 5'-GCCATGGCTTGAAGATAGGTTGCC-3'(서열번호 5)를 이용하여 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR은 PCR 증폭 조건으로 94℃에서 5분간 가열한 다음, 94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 40초 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 30회(cycle) 반복한 후, 이를 72℃에서 7분간 더 가열하는 조건으로 진행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 PCR 산물은 전기영동 장치를 이용하여 1% 아가로즈 겔 상에 전개한 후 UV 하에서 전개된 반응 산물의 밴드를 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조구로 사용한 원품종(wild type, WT)인 동진벼에서는 PCR 증폭 산물이 나타나지 않은 데 반해, OsPHS1 프로모터 발현 벡터가 삽입된 형질전환 벼에서는 PCR 증폭 산물 밴드가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, OsPHS1 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 생산한 형질전환 벼에, OsPHS1 프로모터 발현 벡터가 제대로 삽입되었음을 알 수 있었다.

실시예 4: OsPHS1 프로모터의 GUS 염색에 의한 발현 분석

OsPHS1 프로모터의 조직 발현 검정을 위해, 상기 실시예 3-2에서 OsPHS1 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼를 GUS 단백질 염색법으로 분석하였으며, 이때, OsPHS1 프로모터가 작동되는 부위는 GUS 염색에 의해 파란색으로 염색되었다.

상기 프로모터의 발현을 분석한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 포장에서 2달 정도 자란 벼의 잎에서는 GUS 염색이 관찰되지 않았으나, 성숙한 종자에서는 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 종자 내에서도 배유(endosperm)에는 거의 염색되지 않았고, 배(embryo)와 배반(scutellum)에서만 특이적이고 강하게 염색됨을 확인할 수 있었다.

또한, 형질전환 벼의 성숙 종자를 2N6배지에서 치상하면 배반조직에서 캘러스가 유도되는데, 이렇게 유도한 캘러스 조직에서 매우 강한 GUS 염색을 확인하였다. 반면, 성숙되지 않은 벼의 이삭과 수술, 암술 등 대부분의 생식기관에서는 GUS 염색이 거의 관찰되지 않았고, 발달 초기의 종자(개화 2일 후, 2 days after flowering; 2DAF)에서 또한 GUS 염색이 관찰되지 않음을 확인하였다. 아울러, OsPHS1 프로모터가 삽입된 형질 전환 벼를 2주 동안 키운 유묘의 줄기, 잎과 뿌리 등 대부분의 영양기관(vegetative organ)에서도 GUS 염색이 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 통하여, OsPHS1 프로모터가 대표적인 단자엽 식물인 벼에서 목적 유전자를 주요하게 성숙 종자의 배, 배반 및 배반 유래 캘러스 조직에서 발현시킬 수 있음을 알 수 있었다.

LB: left T-DNA border
Bar: bialaphos resistance gene
35S: cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promotor
attB1: gateway attB1
pOsPHS1: OsPHS1(Oryza sativa Pre Harvest Sprouting 1) promoter
attB2: gateway attB2
egfp: enhanced green fluorescence protein
gusA: beta-glucuronidase A
T35S: CaMV 35S terminator
RB: right T-DNA border

<110> Republic of Korea <120> Seed-specific promoter derived from Oryza sativa and use thereof <130> P14R12D1320 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2022 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS1 promoter <400> 1 cagactacag tcgtcatcca gaatatgctg aacggcaagt cttcgaattg aatacgtata 60 gttgaagttg ttcttttctc caatagagca tggggtcaat tccctgcgtg ttctctgata 120 gagtagaaaa gaagtggtta cgttactgct taatcagggt tttaacaaag ctgatggaaa 180 ccgctcggtt ttgcacaaat cggttaagta aaaaaaaaac tcaattttga caaaatttag 240 tcgaatttca caagtattaa ttcagctatt tcgtgaaaac taagaaaact gctctggagt 300 ttttgaaggc gtttttttta gagtcaatcc attttatgac atcgacaaaa cgcgggttct 360 acaatatgcc actgacaaaa ctcagttcca cactatacca tcgaatgact cattttcttc 420 cttatatgcc atcgacgtta gtcaaccgcc gttaaaagat gaaaaatgac cattttaccc 480 ctagcataaa attgagattt tgcataatgc catatcgcgg taaaaaaatc ttggatgata 540 aaaagacaag caatttcaat ttttcatcaa tgagaataaa tagtgaatca tgatcagtga 600 aatcgatgag gatgcatcgt accctagggg taaaatagac atttttttgc tcttaacaga 660 atttgactaa ctgttgactg gcggcgatgg catgtaagga agaaaagtag ttgttcgatg 720 gtatattata gaactgagct ttatcaatgg tatattgttg aatccatgct ttgtcaatgg 780 catagaatgg attatctctt tttttttaac cctgctgctt actccctcca tcctataaaa 840 aaccaaccta atactggatg tgatacatcc tagtactact aatctggaca tacctctgtc 900 cagattcatt gtactagaat gcgtcacatc caattctaga ttcgtttttt tggacggagg 960 gagtacatct ttgttaacat aatctgatgt gagactggtc accaaatata tatatttgca 1020 cttcctgaat tttgtgtgct ctctttgtgg gtagtgttac gtgctattta ttgagcggat 1080 atttgtaata agtggttgta acttctttga agtaaaggtc gagctttatt ctatctaaaa 1140 atatatttgg tcactaaata attgtacgaa catatacagg agaaagtcaa cactagcaac 1200 tttataattg ccacgagtgt caactgtacg tacacaatga cagtaatgat tgtggcagtc 1260 tattgtttat aacgcactac tgtgctagct gtatagaata cgtatctata tacctcgagt 1320 ttacgtatta tacacctcaa atacttgatt tggtgacata tactgtacca gtttgatcca 1380 ctctctttct gaagggagac gggcaatttt tcgttagacg atgacggcga cggagaggtg 1440 gtctctatac gcacgcacat acataagcgt gtgtatattc acggatttag tcgagttttt 1500 tctatgtctt cttttgattc accaaacgaa gcattggtcc ttttgaaatt agcaaggggg 1560 taatcattta ggtgagccat tagggcgctt gaagggtcac ttatgaatat agtacaatca 1620 tgctcctaat acacacgcta ctcttgattt gcaggaacac tgtcggaaac tgcacagtat 1680 ttcttgattt gcgaatggta gagtttacta cacatgtggc aacaccaggg attaatctac 1740 ctctatcact gtcctgactg aatactcgag acacctcctc ttgaaacatt cagaactcga 1800 ggtaattaag ctgaatgagt actattatat cgataaaaca atggattgcc atggcttgaa 1860 gatgagttgc cggcaattga gggacctgat cctgcgcgac gcgacgcccc agaagggatt 1920 tctctttgtt atccactgcc ccctctcgag tcgagataaa aaaccacatg ccgcttgccg 1980 tcttcctgcc caattgaact ccggagagcg cgcgcgccgg cc 2022 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS1P-F <400> 2 cacccagact acagtcgtca tccagaatat gc 32 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS1P-R <400> 3 ggccggcgcg cgcgctctcc ggagttcaat tgg 33 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSA-Anti <400> 4 cgcgatccag actgaatgcc c 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS1P-5 <400> 5 gccatggctt gaagataggt tgcc 24

Claims (8)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 벼 성숙 종자의 배(embryo) 또는 배반(scutellum) 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터.
   
2. 제1항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
   
3. 제2항의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것인 형질전환체.
   
5. 제2항에 따른 벡터 또는 제3항에 따른 형질전환체로 형질전환된 형질전환 식물체.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것인 형질전환 식물체.
   
7. a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
   b) 상기 재조합 발현 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 형질전환시켜 형질전환된 아그로박테리움을 제조하는 단계; 및
   c) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 감염시키는 단계;
   를 포함하는, 목적 단백질이 벼 성숙 종자의 배 또는 배반 조직에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법.
   
8. 제1항의 프로모터 및 제2항의 벡터로 벼를 형질전환하여 벼 성숙 종자의 배 또는 배반 조직에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.

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