CN112852863B - 一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用 - Google Patents

一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用。属于瞬时转化技术领域。包括：取处于初花期的文冠果花序放入100g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培养箱培养；侵染液侵染文冠果花瓣；将侵染后的文冠果花序依次放入放入50g/L和100g/L的葡萄糖溶液中培养；重复步骤(2)～(3)两次，完成瞬时转化；置于光照培养箱中继续培养。本发明通过前后不同浓度高渗葡萄糖溶液处理，一方面加大转化效率，另一方面缩短花色观察时间；在侵染液中加入葡萄糖加快目的基因对花色的调控，缩短周期；瞬时表达质粒注射的方法，避免了原有的农杆菌介导的瞬时转化过程中因农杆菌、震荡、抽真空对花瓣造成的损伤，具有遗传转化周期短、效率高的优点。

Description

一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用
技术领域
本发明涉及瞬时转化技术领域，更具体的说是涉及一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用。
背景技术
文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)属无患子科文冠果属，是木本油料植物。文冠果花色多样，花色转变明显，同一花序实现多花期，多花色(绿色、黄绿色、浅红色、***等颜色)；通常两年生可开花结果，是林木上研究花色转变的理想生物材料。但由于文冠果转基因技术不是很成熟、周期较长，通过传统的遗传转化方法研究基因的花色调控机制较为困难。
瞬时转化是一种快速有效的研究目的基因功能的转化方法，目前在多种植物的叶、根、茎、愈伤组织中得到应用。
现有技术中的瞬时转化方法多为农杆菌介导的瞬时转化，在该转化过程中农杆菌、震荡、抽真空等均会对花瓣造成的损伤，影响瞬时转化效果。
综上，如何提供一种损伤小、效率高的文冠果花瓣瞬时转化方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用。本发明方法可以实现目的基因在文冠果花中的瞬时转化，是快速研究其花色转变功能、直接观测表型的有利手段。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种文冠果花瓣瞬时转化方法，包括如下步骤：
(1)取处于初花期的文冠果花序，放入80～120g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培养箱中培养2～3天；
(2)使用侵染液侵染文冠果花瓣；
(3)将侵染后的文冠果花序依次放入40～60g/L和80～120g/L的葡萄糖溶液中培养；
(4)重复步骤(2)～(3)两次，完成瞬时转化；
文冠果一个花序不是同时开花，只能分次侵染(第1次，第2次，第3次)，但一个花瓣只侵染一次。
(5)将完成瞬时转化的文冠果花序置于光照培养箱中继续培养7～10天。
优选的，所述步骤(2)的具体操作为：用无菌针30度倾斜轻刺花瓣基部偏上1～2cm处的表面薄膜，用无菌注射器吸取所述侵染液，对准伤口部位缓慢注入花瓣中，并使所述侵染液浸润整个花瓣。
优选的，所述步骤(3)的具体操作为：将侵染后的文冠果花序放入40～60g/L的葡萄糖溶液中，室温暗处培养12～24h；之后转入80～120g/L的葡萄糖溶液中，置于光照培养箱中继续培养2～4天。
优选的，所述侵染液中包括如下质量浓度的成分：IL-60-BS 2～5μg/mL、pIR-目的基因8～12μg/mL、MgCl210 mM、MES 10mM、Ace 40～60μM和葡萄糖3～6％。
侵染液中葡萄糖的加入，加快目的基因的表达和对花色的调控，缩短周期，保证了瞬时表达载体的作用时间。
优选的，所述pIR-目的基因的制备方法如下：
(1)扩增目的基因片段并连接到PMD19-T克隆载体上，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经PCR验证，得到PMD-目的基因载体；
(2)将pIR空载体与PMD-目的基因载体经限制性内切酶酶切，两个回收产物使用连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经PCR验证，得到pIR-目的基因载体；
(3)利用质粒提取试剂盒提取pIR-目的基因载体，得到pIR-目的基因。
优选的，所述侵染液的配置方法为：向蒸馏水中加入IL-60-BS、pIR-目的基因、MgCl2、MES和葡萄糖，于暗处静置2～3h，使用前加入Ace。
侵染液中葡萄糖的加入，加快目的基因的表达和对花色的调控，缩短周期，保证了瞬时表达载体的作用时间。
优选的，一种文冠果花瓣瞬时转化方法，包括如下步骤：
(1)取处于初花期的文冠果花序，放入100g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培养箱中培养2～3天；
(2)用无菌针30度倾斜轻刺花瓣基部偏上1～2cm处的表面薄膜，用无菌注射器吸取所述侵染液，对准伤口部位缓慢注入花瓣中，并使所述侵染液浸润整个花瓣；
所述侵染液中包括如下质量浓度的成分：IL-60-BS 3μg/mL、pIR-目的基因10μg/mL、MgCl210 mM、MES 10mM、Ace 50μM和葡萄糖5％
(3)将侵染后的文冠果花序放入50g/L的葡萄糖溶液中，室温暗处培养12～24h；之后转入100g/L的葡萄糖溶液中，置于光照培养箱中继续培养2～4天；
(4)重复步骤(2)～(3)两次，完成瞬时转化；
(5)将完成瞬时转化的文冠果花序置于光照培养箱中继续培养7～10天。
优选的，在光照培养箱中培养时，光照16h、黑暗8h交替培养。
上述文冠果花瓣瞬时转化方法在研究基因的花色调控机制中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明通过前后不同浓度高渗葡萄糖溶液的处理，一方面加大转化效率，另一方面缩短花色观察的时间；另外在侵染液中加入葡萄糖加快目的基因对花色的调控，缩短周期；瞬时表达质粒注射的方法，避免了原有的农杆菌介导的瞬时转化过程中因农杆菌、震荡、抽真空等对花瓣造成的损伤，且具有遗传转化周期短、效率高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例及对比例花瓣中XsbHLH42的表达水平结果，其中实验组1#为侵染第1次结果，实验组2#为侵染第2次结果，实验组3#为侵染第3次结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所需材料均采购自市售渠道；
实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例
(一)克隆文冠果XsbHLH42基因
利用TBtools比对得到文冠果XsbHLH42序列；根据pIR载体和XsbHL H42基因的限制性酶切位点，设计基因引物时引入EcoRI和HindIII酶切位点，以文冠果cDNA为模板，以F：GAATTCATGGCTGCGCCGCCGAGTA；SEQ ID No.1，R：AAGCTTTTATTTAGAGAAGATTGAAC；SEQ IDNo.2为引物，扩增得到XsbHLH42基因目的片段，使用胶回收试剂盒对扩增产物进行回收，回收产物连接到PMD19-T克隆载体上，得到PMD-XsbHLH42载体，连接产物转化大肠杆菌感受态Trans 5ɑ，经PCR验证及测序成功后，得到序列如下：
ATGGCTGCGCCGCCGAGTAGCCGACTTCAAAGTATGCTGCAGGAGGCGGTGCAATCAGTTCAATGGACTTACAGTCTATTTTGGCAAATTTGTCCACAGCAAGGGATCCTAATATGGGGAGATGGGTATTATAATGGAGCAATCAAGACTAGAAAAACAGTTCAACCAATGGAGGTTAGTGCGGAGGAAGCGTCCCTGCAAAGAAGCCAGCAGCTTAGAGAGCTTTACGAGTCATTGTCGGCCGGAGAGACGAACCAGCCAGCAAGGAGGCCTTGTGCGGCCTTGTCGCCGGAAGACTTAACGGAGTCCGAGTGGTTCTATTTGATGTGTGTGTCCTTCTCTTTCCCTCCTGGGCTTGGGTTACCAGGAAAGGCTTATGCAAGGCGGCAACATGTATGGCTTACAGGAGCAAACGAGGTTGACAGCAAAACCTTCTCTAGAGCAATTCTTGCCAAGAGTGCTCGTATACAGACTGTGCTATGCATTCCTCTTCTTGACGGCGTCGTTGAACTTGGCACAACGGAGAGGGTTCAAGAGGACCTTGGATTAGTCCAACAAATCAAGAGCTTCTTCACAGACCAACACCACCCAAACCCTCAACCACCAAAACCAGCTCTCTCCGAGCACTCCACCTCCAATCCCGTCACGTCATCTGACCACCGGCGCTTCCACTCACCTCCTATTCCCGCCATGTATGCCGCTGTTGACCCACCAGTCAACCCCAACCAAGAAGACGAAGATGATGATGATGAAGAAGAAGAGGAAGAAGACGAAGAAGACGATGAAGAGGAGCACGAGTCCGACTCTGAAGCCGAAACGGGTCGTAACAGCAGCCAAGCCGGTGCTCAAAACCCTCCAGCCGTGCCCGCAGCTGTGGCTGAACCGAGTGAGCTCATGCAGCTGGAGATGTCTGAGGATATCCGGGTTGGATCGCCAGACGATGCGTCGAATAATTTGGACTCAGATTTTCATTTGCTGGCCGTGAGCCAAGCCGGGAACCCGAGTGATCACCAGAGGCGTGCTGACTCGTTCAGAGCGGAGTCGAGTAGAAGATGGCCGATGCTACAAGAGCCATTGAGTAGTGGTCTTCAACTTCAACTACCTCCTTCAGTTTCAGGACAAGTTGGATTAGAAGAATTGACACAAGAAGACACTCACTACTCCCAAACAGTCTCAACCATTCTCCAAAAGCAGGCAACACGGTGGGCCGAGTCATCATCCACAGGATATGTCACCTACTCAACCCAATCAGCGTTTGCCAAGTGGACAAACCGCTCGGATCTCCACATCCTGACACCCGTTGAAGGCACGTCTCAGTGGCTCCTAAAGTACATTTTATTCAGCGTACCGTTTCTACACAGCAAATACCGTGATGAAAACTCGCCCAAGTCACGTGACGCCAGCGGCGACGCGGTCTCCAAGTTCCGGAAGGGGACCCCACAAGACGAGCTGAGCGCCAACCACGTGCTGGCGGAGCGCCGCCGCCGGGAGAAGCTGAATGAGAGGTTCATCATTTTACGGTCATTAGTCCCGTTCGTCACTAAAATGGACAAGGCCTCCATATTGGGTGACACTATCGAGTACGTCAAACAGTTACGTAAAAAGATACAGGATCTTGAGTCTCGTAACAAGCAGATGGAGGCTGATCAACGGCCAAGATTGTCGGACTCCCCAAGGACTAGTAGTGGTTTGAAAGAGCAAAGAAGTGGGCTGACTGTTTTGGAACGGGCACGGGTGGGTCCTCCTGGACCAGGGTCTGATAAGAGGAAGATGAGAATAGTGGAGGCAAGTGGCGGCGGTGCAAAGCCTAAGTCGGTGGAGTCACCGCCGCCACCACCACCAACAATAACAACAACTGCAACAACGACGGCAACTGCGGTACAGGTGTCGATAATCGAGAGTGATGCCCTGGTGGAGCTGCAATGTGGGTATAGAGAAGGGTTGTTGCTTGATATCATGAAAATGCTAAGGGAGCTTCTGATTGAGGTCACATGCAGTTCAATCTTCTCTAAATAA；SEQ ID No.3。
(二)构建文冠果XsbHLH42过表达载体pIR-XsbHLH42
1、用EcoRI和HindIII限制性酶酶切pIR空载体和PMD-XsbHLH42载体，酶切产物分别用胶回收试剂盒进行回收，2个回收产物用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态Trans 5ɑ，经PCR验证，得到pIR-XsbHLH42载体。
2、利用质粒提取试剂盒，大量提取IL-60-BS和pIR空载体以及pIR-XsbHLH42载体的质粒，浓缩使其浓度达到100μg/mL。
(三)pIR-XsbHLH42的瞬时转化
1、取含初花期花和花蕾的文冠果花序，放入100g/L葡萄糖溶液中，置于光照培养箱(16h光照、8h黑暗交替)中3天，待初花期花未产生花色转变或花蕾开放后，取出。
2、去除已发生花色转变的单花，用无菌针30度倾斜轻刺花瓣基部偏上1～2cm处(注意只刺破花瓣表面的薄膜，勿刺穿花瓣)，用无菌注射器(不含针头)吸取侵染液对准伤口部位缓慢注入花瓣中，并使侵染液浸润整个花瓣(切勿用力和过快，造成花瓣损伤)，已注射好的花做好标记。其中：
实验组侵染液包括如下质量浓度的组分：3μg/mL IL-60-BS，10μg/mL pIR-XsbHLH42，10mM MgCl2，10mM MES，50μM Ace，5％葡萄糖。
对照组侵染液包括如下质量浓度的组分：3μg/mL IL-60-BS，10μg/mL pIR，10mMMgCl2，10mM MES，50μM Ace，5％葡萄糖。
注：侵染液(不含Ace)配置完成后，于暗处静置2～3h，注射前加入Ace。
3、将侵染后的文冠果花序放入50g/L葡萄糖溶液中，于室温(25℃)暗处培养1天，后移到光照培养箱(16h光照、8h黑暗交替)100g/L葡萄糖溶液中继续培养3天。
4、待出现新开的并未花色转变的文冠果花后，取出，按步骤2注射新开的花，后按步骤3培养，重复2次(文冠果一个花序不是同时开花，只能分次侵染，但一个花瓣只侵染一次)，完成瞬时转化。
5、将完成瞬时转化的文冠果花序放入20g/L葡萄糖溶液中，于光照培养箱(16h光照、8h黑暗交替)中继续培养一周。
对比例1
步骤(三)中侵染液组分中不包含葡萄糖，侵染液为(3μg/mL IL-60-BS，10μg/mLpIR-XsbHLH42，10mM MgCl2，10mM MES，50μM Ace)，其他步骤同实施例1。
对比例2
步骤(三)中采用同一浓度的葡萄糖处理文冠果花序，具体为步骤1中文冠果花序放入100g/L葡萄糖溶液中，步骤3将侵染后的文冠果花序放入100g/L葡萄糖溶液中，其他步骤同实施例1。
对比例3
步骤(三)中侵染液组分中不包含葡萄糖，侵染液为(3μg/mL IL-60-BS，10μg/mLpIR-XsbHLH42，10mM MgCl2，10mM MES，50μM Ace)，以及采用同一浓度的葡萄糖处理文冠果花序，具体为步骤1中文冠果花序放入100g/L葡萄糖溶液中，步骤3将侵染后的文冠果花序放入100g/L葡萄糖溶液中；其他步骤同实施例1。
瞬时转化结果分析
提取实施例1和对比例1～3中对照组和实验组3次瞬时转化花瓣的RNA，经反转录获得其cDNA；以cDNA为模板，F：TTGAACTTGGCACAACGGAGAGG；SEQ ID No.4，R：TGACGGGATTGGAGGTGGAGTG；SEQ ID No.5为引物进行RT-PCR检测，分析对照组和实验组3次瞬转的花瓣中XsbHLH42的表达水平。用2-ΔΔCT法计算目的基因XsbHLH42的相对表达量，XsACTIN作为内参基因，引物为：
F：AGAGATTCCGTTGCCCAGAA；SEQ ID No.6；
R：CCACCACTGAGCACAATGTT；SEQ ID No.7。
结果如图1所示。
结果表明，在实施例1中，与对照组相比，实验组的XsbHLH42表达量在3次瞬时转化的花瓣中明显升高，实现了XsbHLH42在文冠果花瓣中的瞬时过量表达；对比例1和对比例3中，实验组第3次瞬时转化的花瓣中XsbHLH42的表达量明显低于前两次的表达量和实施例1实验组中第3次的表达量，说明侵染液中葡萄糖的加入，缩短了XsbHLH42的转化和表达时间；对比例2和对比例3中，实验组3次瞬时转化的花瓣中XsbHLH42的表达量明显低于实施例1实验组中的表达量，说明不同浓度的葡萄糖处理增加了转化效率。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种文冠果花瓣瞬时转化方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatgg ctgcgccgcc gagta 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcttttat ttagagaaga ttgaac 26
<210> 3
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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gcaaagccta agtcggtgga gtcaccgccg ccaccaccac caacaataac aacaactgca 1860
acaacgacgg caactgcggt acaggtgtcg ataatcgaga gtgatgccct ggtggagctg 1920
caatgtgggt atagagaagg gttgttgctt gatatcatga aaatgctaag ggagcttctg 1980
attgaggtca catgcagttc aatcttctct aaataa 2016
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgaacttgg cacaacggag agg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgacgggatt ggaggtggag tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agagattccg ttgcccagaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaccactga gcacaatgtt 20

Claims (5)

1.一种文冠果花瓣瞬时转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取处于初花期的文冠果花序，放入80～120g/L的葡萄糖溶液中，移入光照培养箱中培养2～3天；
(2)使用侵染液侵染文冠果花瓣：
用无菌针30度倾斜轻刺花瓣基部偏上1～2cm处的表面薄膜，用无菌注射器吸取所述侵染液，对准伤口部位缓慢注入花瓣中，并使所述侵染液浸润整个花瓣；
所述侵染液中包括如下质量浓度的成分：IL-60-BS 2～5μg/mL、pIR-目的基因8～12μg/mL、MgCl2 10mM、MES 10mM、Ace 40～60μM和葡萄糖3～6％；
(3)将侵染后的文冠果花序依次放入40～60g/L和80～120g/L的葡萄糖溶液中培养：
将侵染后的文冠果花序放入40～60g/L的葡萄糖溶液中，室温暗处培养12～24h；之后转入80～120g/L的葡萄糖溶液中，置于光照培养箱中继续培养2～4天；
(4)重复步骤(2)～(3)两次，完成瞬时转化；
(5)将完成瞬时转化的文冠果花序置于光照培养箱中继续培养7～10天。
2.如权利要求1所述的一种文冠果花瓣瞬时转化方法，其特征在于，所述pIR-目的基因的制备方法如下：
(1)扩增目的基因片段并连接到PMD19-T克隆载体上，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经PCR验证，得到PMD-目的基因载体；
(2)将pIR空载体与PMD-目的基因载体经限制性内切酶酶切，两个回收产物使用连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经PCR验证，得到pIR-目的基因载体；
(3)利用质粒提取试剂盒提取pIR-目的基因载体，得到pIR-目的基因。
3.如权利要求2所述的一种文冠果花瓣瞬时转化方法，其特征在于，所述侵染液的配置方法为：向蒸馏水中加入IL-60-BS、pIR-目的基因、MgCl2、MES和葡萄糖，于暗处静置2～3h，使用前加入Ace。
4.如权利要求1～3任意所述的一种文冠果花瓣瞬时转化方法，其特征在于，在光照培养箱中培养时，光照16h、黑暗8h交替培养。
5.如权利要求1～3任意所述的一种文冠果花瓣瞬时转化方法在研究基因的花色调控机制中的应用。
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