CN102573819A - 乙酰肝素酶活性抑制剂以及含有该乙酰肝素酶活性抑制剂的皱纹改善剂和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乙酰肝素酶活性抑制剂，其包含下述式(I)所示的4-烷基间苯二酚作为活性成分。

Description

乙酰肝素酶活性抑制剂以及含有该乙酰肝素酶活性抑制剂的皱纹改善剂和药物组合物
技术领域
本发明涉及以4-烷基间苯二酚为活性成分的乙酰肝素酶活性抑制剂、以及使用了上述乙酰肝素酶活性抑制剂的皱纹改善剂和药物组合物。
背景技术
乙酰肝素酶是特异性地分解各种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素链的酶，其存在于血小板、白血球、内皮细胞、平滑肌细胞等各种细胞中。特别是对于皮肤而言，在构成表皮的表皮角质形成细胞、真皮的成纤维细胞和血管内皮细胞等中产生。此外已知，在各种癌细胞中产生也高。
作为乙酰肝素酶的分解底物的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是存在于各种动物组织的细胞表面、细胞外基质中的高分子，已知其具有使硫酸乙酰肝素结合性的生长因子(bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)等)在细胞外蓄积等作用。
在表皮与真皮的边界部存在的表皮基底膜上存在作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之一的串珠素(perlecan)，通过使硫酸乙酰肝素结合性生长因子与表皮基底膜结合，来控制表皮与真皮之间的生长因子的移动。此外明确了，串珠素也控制生长因子对与基底膜结合的表皮基底细胞的作用，对表皮的良好增殖、分化而言是必须的。因此，由乙酰肝素酶的活化或表达增强引起的串珠素的硫酸乙酰肝素链的分解，使蓄积的生长因子的释放以及表皮与真皮之间的生长因子的控制崩溃，发生表皮的分化、增殖控制的失败和真皮的肥厚，促进皱纹的形成(参照PCT/JP2009/056717)。换言之，如果抑制乙酰肝素酶活性，则伴随硫酸乙酰肝素的分解的生长因子的游离被抑制，因此能够控制表皮与真皮之间的生长因子的移动，进而认为对皮肤的抗老化有益。
此外，乙酰肝素酶也暗示出与癌的恶性度的关联。已知，特别是乙酰肝素酶的产生高的癌细胞，其增殖性、转移性高，血管新生的诱导能力也高(非专利文献1)。此外还已知乙酰肝素酶具有促进创伤治愈的作用(非专利文献2)。因此，如果可以有效地抑制乙酰肝素酶活性，则对抑制癌细胞的增殖或转移、抑制血管新生等用途也是有效的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Vlodavsky I.，et al.，Semin Cancer Biol.，2002；12(2)：121-129
非专利文献2：Zcharia E.，et al.，FASEB J.2005Feb；19(2)：211-21
发明内容
发明所要解决的课题
从以上背景出发，要求能够有效率地抑制乙酰肝素酶活性的物质。
本发明是鉴于上述课题而提出的，其目的在于，提供能够有效率地抑制乙酰肝素酶活性的乙酰肝素酶活性抑制剂、以及使用了上述乙酰肝素酶活性抑制剂的皱纹改善剂和药物组合物。
用于解决课题的方法
本发明者进行了深入研究，结果发现，规定的4-烷基间苯二酚可以有效率地抑制乙酰肝素酶活性。
即，本发明的主旨如下所述。
(1).一种乙酰肝素酶活性抑制剂，其包含下述式(I)所示的4-烷基间苯二酚作为活性成分，
式中，R表示碳原子数1～6的直链或支链的烷基。
(2).根据(1)所述的乙酰肝素酶活性抑制剂，式(I)中，R为碳原子数2～4的直链或支链的烷基。
(3).根据(2)所述的乙酰肝素酶活性抑制剂，式(I)的4-烷基间苯二酚为4-异丁基间苯二酚。
(4).一种药物组合物，是用于治疗、改善或预防与乙酰肝素酶活性有关的状态或症状的药物组合物，其包含(1)～(3)的任一项所述的乙酰肝素酶活性抑制剂作为有效成分。
(5).根据(4)所述的药物组合物，其用于治愈创伤、抑制癌细胞的增殖或转移、或抑制血管新生。
(6).一种皱纹改善剂，是预防或抑制皱纹形成的皱纹改善剂，其包含(1)～(3)的任一项所述的乙酰肝素酶活性抑制剂作为有效成分。
发明的效果
由于本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂能够有效率地抑制乙酰肝素酶活性，因此可以作为例如皱纹改善剂的有效成分而适用于预防或抑制皱纹(特别是大皱纹)的形成等，或者作为药物组合物的有效成分而适用于治疗、改善或预防与乙酰肝素酶活性有关的状态或症状等。
附图说明
图1是表示正常人角质形成细胞的紫外线照射和未照射条件下的乙酰肝素酶活性的差异的图。
图2是正常人臀部组织的紫外线照射部位和未照射部位的乙酰肝素酶和硫酸乙酰肝素的免疫染色图像。
图3中(a)、(b)均是表示模拟皮肤模型的示意图。图3(a)表示基底膜片不含硫酸乙酰肝素的“硫酸乙酰肝素分解模型”(硫酸乙酰肝素(-))，图3(b)表示基底膜片不含硫酸乙酰肝素的“正常模型”(硫酸乙酰肝素(+))。
图4是表示使用了图3(a)、(b)的模拟皮肤模型的VEGF的透过性的评价结果的图。
图5是表示使用了图3(a)、(b)的模拟皮肤模型的血管新生的评价结果的照片。
图6是表示图5的照片中的血管面积的分析结果的图。
具体实施方式
本发明者为了探索能够有效率地抑制乙酰肝素酶活性的物质，以乙酰肝素酶活性的抑制度作为指标，对各种化合物进行了筛选，结果发现了显著地抑制乙酰肝素酶活性的特定的间苯二酚衍生物，从而完成了本发明。
以前完全不知道间苯二酚衍生物显示乙酰肝素酶活性的抑制作用。日本特开平2-49715号公报和日本特开2006-124358号公报中公开了将特定的间苯二酚衍生物用于美白剂，日本特开2007-254412号公报中公开了将特定的间苯二酚衍生物用于以预防、改善皱纹为目的的皮肤外用剂，但均未公开乙酰肝素酶活性的抑制作用。
特别是，日本特开2007-254412号公报中暗示出，细胞内的肝素(硫酸乙酰肝素的一种)的存在会促进胶原纤维素结构的崩溃，导致皱纹的形成(参照[0006]等)，在此基础上通过间苯二酚衍生物来降低细胞内的肝素，防止上述胶原纤维素结构的崩溃，但是这与本发明中公开的间苯二酚衍生物的乙酰肝素酶活性的抑制作用完全不同。即，其原因是，本发明中，通过乙酰肝素酶活性的抑制，来抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素链的分解，因此细胞中的硫酸乙酰肝素(肝素等)的存在量反而维持高的值。
即，本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂包含下述式(I)所示的4-烷基间苯二酚作为活性成分。
Figure BDA0000148618000000051
式中，R表示碳原子数1～6的直链或支链的烷基。作为例子，可列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、仲己基等。其中，优选为碳原子数2～4的直链或支链的烷基，例如乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基，特别优选为异丁基。即，作为式(I)的4-烷基间苯二酚，最优选为4-异丁基间苯二酚。
对式(I)的4-烷基间苯二酚的制造方法没有限制，可列举使饱和羧酸或饱和羧酸卤化物与间苯二酚在氯化锌或氯化铝等路易斯酸存在下进行弗瑞德-克来福特反应，将生成的4-酰基间苯二酚用锌汞齐/盐酸还原的方法(日本特公平6-51619号公报，美国专利第2093778号说明书)；将氧化铝作为催化剂，使间苯二酚与正己醇在液相中在200～400℃反应来直接制造4-正己基间苯二酚的方法(英国专利第1581428号说明书)；使用选自特定金属的氧化物和氢氧化物中的一种以上作为催化剂，使醇为超临界状态与间苯二酚进行反应来制造4-烷基间苯二酚的方法(日本特开2002-167344号公报)等。
本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂可以单独包含1种式(I)的4-烷基间苯二酚，也可以以任意组合和比率包含2种以上式(I)的4-烷基间苯二酚。
本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂中的式(I)的4-烷基间苯二酚的含量只要是对有效地发挥乙酰肝素酶活性的抑制作用而言为充分的量即可，没有特别的限定，只要根据乙酰肝素酶活性抑制剂的用途来适当选择即可。但是，一般而言，使式(I)的4-烷基间苯二酚相对于乙酰肝素酶活性抑制剂整体的比率通常为0.0001质量％以上且通常为1质量％以下，其中0.0001质量％以上且0.2质量％以下是优选的。在使用2种以上式(I)的4-烷基间苯二酚的情况下，只要使它们的总量满足上述范围即可。
此外，本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂，在实质上不损害由式(I)的4-烷基间苯二酚带来的乙酰肝素酶活性的抑制作用的范围内，除了式(I)的4-烷基间苯二酚以外，还可以含有其它任意的成分。作为其它成分，可列举具有乙酰肝素酶活性的抑制作用的其它化合物(其它活性成分)、药物上能够容许的载体和/或辅助剂。上述其它成分可以单独使用1种，也可以以任意组合和比率使用2种以上。
对本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂没有特别的限定，但可以作为化妆品、准药品、药物组合物等、或者作为它们的配合成分来使用。
配合本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂作为有效成分的药物组合物(本发明的药物组合物)可以用于治疗、改善或预防与乙酰肝素酶活性有关的各种状态或症状。这里，作为“与乙酰肝素酶活性有关的状态或症状”，可列举例如皮肤的老化、癌细胞的增殖或转移、血管新生等。因此，本发明的药物组合物适用于例如皮肤老化的改善或预防(抗老化)、癌细胞的增殖或转移的抑制、血管新生的抑制等。
皮肤的老化从宏观上来看年龄增长是重要的因素，但除此以外，也可列举氧化、干燥、太阳光(紫外线)等作为与皮肤老化有关的直接因素。作为皮肤老化的具体现象，已知以透明质酸为代表的粘多糖类的减少、胶原的交联反应、由紫外线引起的细胞损伤等。
进行了以抑制、改善由皮肤伤害导致的、或者由紫外线暴露引起的皮肤老化导致的肌肤的皱纹、小皱纹、松弛等目的的各种研究。其结果是阐明了例如透明质酸的产生促进(日本特开2001-163794号公报)、基质-金属蛋白酶(MMP)的产生和/或活性的抑制(日本特表2000-503660号公报)、胶原的产生促进、酯酶活性的抑制(日本特开平11-335235号公报)、血管新生的抑制(WO03/84302，日本特愿2003-581562号公报)、***扩张抑制(参照K.Kajiya et al.，Am.J.Pathol.，2006，169(4)：1496-1503.)等是有效的。
这些研究分成谋求着眼于表皮或表皮细胞的小皱纹等的抑制、改善的研究、和谋求着眼于包含血管、***的真皮变化的抑制的大皱纹等的抑制、改善的研究这两种。表皮的变化传递到真皮，从而诱导包含血管、***的真皮的变化，但该过程与乙酰肝素酶密切相关。
实际上，本发明者等以前明确了，通过将乙酰肝素酶活性抑制剂涂布在小皱纹模型上从而具有显著的抗皱纹效果(PCT/JP2009/056717)。
如实施例项中详述地那样，本发明者等这次明确了，如果对培养正常角质形成细胞照射紫外线，则正常角质形成细胞的乙酰肝素酶活化(参照图1)。此外明确了，通过对人的皮肤照射紫外线，使得在表皮中乙酰肝素酶的量增加，基底膜的硫酸乙酰肝素降低(参照图2)。因此明确了，不仅是小皱纹模型，由紫外线也会使乙酰肝素酶活化。
此外，如果乙酰肝素酶活化，则基底膜硫酸乙酰肝素被分解，因此本发明者等制作基底膜包含硫酸乙酰肝素的正常模型和基底膜不含硫酸乙酰肝素的硫酸乙酰肝素分解模型作为模拟皮肤模型，进行VEGF的透过性和血管新生的评价。其结果明确了，与正常模型相比，硫酸乙酰肝素分解模型中VEGF的透过性增大，血管新生被诱导(参照图3～6)。
迄今为止，矢野等人明示通过紫外线在真皮中诱导血管新生，真皮发生变化对大皱纹形成是重要的(日本特愿2002-580892)，因此发现乙酰肝素酶是不仅与小皱纹形成而且与大皱纹形成密切相关的酶。即，抑制乙酰肝素酶活性不仅对由干燥引起的小皱纹的预防是有效果的，而且对由长期日光暴露等引起的大皱纹的预防也是有效果的。
另外，在本说明书中“抗老化”是指，通过抑制与由年龄增长、光老化引起的基底膜蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素的分解所导致的硫酸乙酰肝素结合性生长因子的游离相伴随的皮肤变化，具体是指表皮分化异常、真皮血管新生、***扩张、弹性蛋白分解，来防止、改善皮肤的皱纹、松弛、硬化等，维持有弹力的年轻健康的肌肤的状态。
本发明的药物组合物的施用途径和剂型都不限定，只要根据其用途来适当选择即可。作为施用途径的例子，可列举经口施用、非经口施用(静脉施用、腹腔内施用等)、局部施用(皮肤外用等)等。作为剂型，在经口施用的情况下，可列举片剂、包衣片、糖衣片、颗粒剂、散剂、胶囊剂(例如硬或软明胶胶囊)等固体制剂、内服液体制剂、糖浆剂等液体制剂(溶液、悬浮液)等形态。在非经口施用的情况下，可列举注射液等形态。在局部施用的情况下，可列举将溶液系、增溶溶解系、乳化系、粉末分散系、水-油二层系、水-油-粉末三层系等制成贴剂、软膏、乳膏、乳液、化妆水、凝胶、气雾剂等的形态。
本发明的药物组合物中的本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂的配合量也未限定，只要根据药物组合物的用途、剂型、施用形态等来适当选择即可。例如，在本发明的药物组合物为皮肤外用剂的情况下，本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂的配合量在皮肤外用剂全量中作为干燥质量(固体成分质量)通常为0.0001质量％以上且通常为1质量％以下，其中0.0001质量％以上且0.2质量％以下的范围是优选的。如果配合量小于上述范围，则有本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂的效果不能充分地发挥的倾向，另一方面，即使超过上述范围来配合，也有得不到与配合量对应的效果提高的倾向，此外，也有制剂化困难的倾向。
此外，本发明的药物组合物中，在不实质上损害本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂的乙酰肝素酶活性的抑制作用的范围内，除了本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂以外，还可以配合其它1种或2种以上任意成分。对其它成分没有特别的限定，只要根据药物组合物的用途、剂型、施用形态等来适当选择即可，作为例子，可列举药物上能够容许的载体和/或辅助剂。作为辅助剂，可列举例如稀释剂、粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、防腐剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、pH调节剂等。
作为具体例，在将本发明的药物组合物作为皮肤外用剂的情况下，可以根据需要适当配合外用剂中通常使用的成分，例如，美白剂、保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、着色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。此外，也可以适当配合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等螯合剂、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等防腐剂、咖啡因、丹宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类、视黄酸、视黄醇、乙酸视黄醇酯、十六烷酸视黄醇酯等维生素A衍生物类等。
另一方面，在将本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂用于化妆品或准药品的情况下，优选作为皱纹改善剂的有效成分的使用。配合了本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂作为有效成分的皱纹改善剂(本发明的皱纹改善剂)可以用于皱纹的形成的预防或抑制等。另外，如上所述，皱纹分成由于干燥等而在表皮形成的小皱纹和由于紫外线等而在真皮形成的大皱纹，本发明的皱纹改善剂均能够适用，对由紫外线等引起的大皱纹的改善是特别有效的。
对本发明的皱纹改善剂的施用途径和剂型都没有限定，只要根据其用途来适当选择即可。作为施用途径的例子，可列举经口施用、局部施用等。作为剂型的例子，除了关于药物组合物列举的上述的各种剂型之外，关于经口施用，还可列举对各种食品、饮品的添加等。
对本发明的皱纹改善剂中的本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂的配合量也没有限定，只要根据皱纹改善剂的用途、剂型、施用形态等来适当选择即可。
此外，本发明的皱纹改善剂中，在实质上不损害本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂的乙酰肝素酶活性的抑制作用的范围内，除了本发明的乙酰肝素酶活性抑制剂以外，还可以配合其它1种或2种以上任意成分。对其它成分没有特别的限定，只要根据皱纹改善剂的用途、剂型、施用形态等来适当选择即可。
以上，列举具体例对本发明进行说明，但以上的具体例终究是例示，本发明在不偏离权利要求范围的范围内，能够加入任意的变更来实施。
以下，列举实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于下述的实施例。
实施例1
以乙酰肝素酶活性的抑制率为指标的评价
将A431细胞(浸润性人上皮癌细胞)在加入了10％血清的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)中培养。将培养细胞用裂解缓冲液(Lysis Buffer)(50mM Tris，0.5％TritonX-100，0.15M氯化钠，pH4.5)增溶溶解，用刮刀回收后，进行冲吸，在冰上静置30分钟。然后，以10,000rpm离心10分钟来除去不溶解物，回收上清液作为细胞提取液。采用BCA蛋白质定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit，PIERCE，CA46141)测定该细胞提取液中的蛋白质量。
接下来，将上述的A431细胞提取液用分析缓冲液(50mM HEPES，50mM乙酸钠，150mM氯化钠，9mM氯化钙，0.1％BSA)稀释成500μg/mL。接着，将试验对象的化合物溶解在DMSO中，按照形成0.0005质量％、0.005质量％和0.05质量％的比率那样添加在该稀释细胞提取液中，进行混合，制作试样溶液(DMSO的终浓度5％)。关于对照溶液，对稀释细胞提取液以终浓度为5％混合DMSO。将这些试样溶液和对照溶液以100μL/孔的比例接种到生物素化硫酸乙酰肝素固定化板上。在37℃反应2小时，用PBS-T洗涤3次，然后以100μL/孔的比例加入10,000倍稀释HRP-抗生物素蛋白(Vector，A-2004)/PBS-T，在37℃反应1小时。再次用PBS-T洗涤3次，以100μL/孔的比例加入TMB试剂(BIO-RAD，172-1066)进行反应，用1N硫酸使反应停止，然后测定475nm的吸光度(OD475)。
然后，在上述的A431细胞提取液的通过分析缓冲液进行的梯度稀释液(细胞提取液浓度500μg/mL，50μg/mL，5μg/mL，0.5μg/mL)中，不添加试验对象的化合物，而以终浓度为5％添加DMSO，进行混合(标准曲线用溶液)。关于该标准曲线用溶液，采用与上述同样的步骤进行对生物素化硫酸乙酰肝素固定化板的接种以后的处理，测定OD475。
接下来，基于标准曲线用溶液的OD475的值来作出蛋白质浓度的标准曲线，使用该标准曲线，由以各添加浓度添加了试验对象化合物的试样溶液的OD475的值算出各试样溶液的蛋白质浓度。然后，关于对照用溶液，也同样地算出蛋白质浓度。由各试样溶液的蛋白质浓度与对照用溶液的蛋白质浓度的比率(％)求出各试样溶液的乙酰肝素酶活性的抑制率。
另外，关于以上的步骤，要参照日本特表2003-502054号公报。
采用以上步骤对4-异丁基间苯二酚的乙酰肝素酶活性抑制作用进行了试验。将结果示于表1中。由表1可知，4-异丁基间苯二酚显示在添加浓度0.0005％时为37.64％，在添加浓度0.05％时为94.74％的抑制率，表明了有效地抑制了乙酰肝素酶活性。
[表1]
表1乙酰肝素酶活性的抑制率
  化合物   添加浓度   抑制率
  4-异丁基间苯二酚   0.0005％   37.64％
  4-异丁基间苯二酚   0.005％   75.98％
  4-异丁基间苯二酚   0.05％   94.74％
实施例2
由紫外线引起的乙酰肝素酶的活性变化的评价
将正常人角质形成细胞在正常角质形成细胞用培养基EpiLife中培养。将培养基暂时置换成PBS然后照射50mJ的UVB，在培养1小时、2小时、4小时后将细胞用裂解缓冲液(Lysis Buffer)增溶溶解，使用所得的溶液作为紫外线照射组的试样溶液。此外，使用将培养基暂时置换成PBS，不照射紫外线的溶液作为对照用溶液。使用这些试样溶液和对照用溶液，与实施例1同样地进行处理，测定OD475。基于所得的OD475的值，与实施例1同样地评价乙酰肝素酶活性。将其结果示于图1中。结果表明，与未照射紫外线的对照相比，紫外线照射组中，乙酰肝素酶显著活化。
紫外线照射人皮肤中的乙酰肝素酶和硫酸乙酰肝素的免疫染色
向20多岁的人臀部照射2MED的紫外线2天后采用活组织检查来采集照射部位和附近的未照射紫外线的臀部皮肤，采用AMeX法制作蜡块。制作3μm的组织切片，实施乙酰肝素酶和硫酸乙酰肝素的免疫染色。将所得的免疫染色图像示于图2中。表明了，紫外线照射部位中，与未照射部位相比，乙酰肝素酶的量增加了，此外，硫酸乙酰肝素的量降低了。
根据硫酸乙酰肝素的有无进行的VEGF的透过性和血管新生的评价
将硫酸乙酰肝素2mg和琼脂糖10mg加热溶解在PBS1ml(1％琼脂糖溶液)中，然后涂布在小室(insert)(コ一ニング社制24孔用Transwell)上，形成包含硫酸乙酰肝素的片。此外，作为对照，除了不使用硫酸乙酰肝素而仅使用琼脂糖以外，通过同样的步骤来形成不含硫酸乙酰肝素的片。这样，制作出将小室内当作表皮侧、将片当作基底膜、将孔当作真皮侧的模拟皮肤模型(图3a，b)。
这样获得的模拟皮肤模型，可以作为根据当成基底膜的片(以下称为“基底膜片”)中的硫酸乙酰肝素的有无来评价VEGF的透过性和血管新生的评价***而使用。另外，以下的记载中，将基底膜片中包含硫酸乙酰肝素的模拟皮肤模型设为“正常模型”，将基底膜片中不含硫酸乙酰肝素的模拟皮肤模型设为“硫酸乙酰肝素分解模型”。
首先，为了评价VEGF的透过性，在各模型的表皮侧(小室内)添加10μg/mL的VEGF水溶液，在室温静置3小时，用VEGF ELISA试剂盒(R&D systems)检测真皮侧的孔内的VEGF浓度。将其结果示于图4中。正常模型中，与硫酸乙酰肝素分解模型相比，VEGF的透过量显著减少了。
接下来，为了评价血管新生，在各模型的表皮侧(小室内)添加100μg/mL的VEGF水溶液，放置在血管新生试剂盒(クラボゥ社)中培养11天后，拍摄培养物的光学显微镜照片。将所得的图像示于图5中。硫酸乙酰肝素分解模型中，观察到了浓度依赖性地显著的血管新生，但正常模型中，未观察到血管新生。
此外，使用血管新生试剂盒用分析软件(クラボゥ社)，分析图5的图像的血管面积。将其结果示于图6中。硫酸乙酰肝素分解模型中，与正常模型相比，观察到了显著的血管面积的增加，表明了血管新生显著发生。
产业可利用性
本发明适合用于以与乙酰肝素酶活性有关的状态或症状的治疗、改善或预防为目的，具体是以皮肤老化的改善或预防(抗老化)、创伤治愈、癌细胞的增殖或转移的抑制、血管新生的抑制等为目的的药物组合物等领域。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种乙酰肝素酶活性抑制剂，其包含下述式(I)所示的4-烷基间苯二酚作为活性成分，
Figure FDA0000148618060000011
式中，R表示碳原子数1～6的直链或支链的烷基。
2.根据权利要求1所述的乙酰肝素酶活性抑制剂，式(I)中，R为碳原子数2～4的直链或支链的烷基。
3.根据权利要求2所述的乙酰肝素酶活性抑制剂，式(I)的4-烷基间苯二酚为4-异丁基间苯二酚。

Claims (6)

1.一种乙酰肝素酶活性抑制剂，其包含下述式(I)所示的4-烷基间苯二酚作为活性成分，
Figure FDA0000148617990000011
式中，R表示碳原子数1～6的直链或支链的烷基。
2.根据权利要求1所述的乙酰肝素酶活性抑制剂，式(I)中，R为碳原子数2～4的直链或支链的烷基。
3.根据权利要求2所述的乙酰肝素酶活性抑制剂，式(I)的4-烷基间苯二酚为4-异丁基间苯二酚。
4.一种药物组合物，是用于治疗、改善或预防与乙酰肝素酶活性有关的状态或症状的药物组合物，其包含权利要求1～3的任一项所述的乙酰肝素酶活性抑制剂作为有效成分。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其用于治愈创伤、抑制癌细胞的增殖或转移、或抑制血管新生。
6.一种皱纹改善剂，是预防或抑制皱纹形成的皱纹改善剂，其包含权利要求1～3的任一项所述的乙酰肝素酶活性抑制剂作为有效成分。
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