CN104862254B - 一株屎肠球菌hew‑a588及其应用 - Google Patents

一株屎肠球菌hew‑a588及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104862254B
CN104862254B CN201510275127.9A CN201510275127A CN104862254B CN 104862254 B CN104862254 B CN 104862254B CN 201510275127 A CN201510275127 A CN 201510275127A CN 104862254 B CN104862254 B CN 104862254B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hew
vref
fermentation
culture
rotating speed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510275127.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104862254A (zh
Inventor
李雪平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Haoshiwo Biological Technology Co., Ltd.
Leshan research of agricultural science institute
Original Assignee
Beijing Heswof Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Heswof Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Heswof Biotechnology Co ltd
Priority to CN201510275127.9A priority Critical patent/CN104862254B/zh
Publication of CN104862254A publication Critical patent/CN104862254A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104862254B publication Critical patent/CN104862254B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一株新分离的屎肠球菌(Enterococcus faecium)HEW‑A588，该菌具有显著的益生性以及抗逆性，由其制备的微生态制剂进入动物肠道，迅速活化、增殖，并能够形成有益优势菌群，维持肠道平衡，不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，提高经济效益等功效，有着良好的应用前景。

Description

一株屎肠球菌HEW-A588及其应用
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体地说，涉及一株屎肠球菌HEW-A588及其应用。
背景技术
屎肠球菌(Enterococcus faecium)，是人和动物肠道中的正常菌群，其生长繁殖速度快，为革兰氏阳性链球或球菌，多成对或短链状排列，通常不运动，无芽孢；其菌落呈圆形、乳白色，表面凸起，边缘整齐，湿润光泽。屎肠球菌可以产乳酸和抑菌物质，能够抑制肠道中致病菌及腐败菌的繁殖，降低腹泻率和死亡率，同时还可促进动物的消化吸收，改善肠道内微生态平衡，提高采食量及饲料转化率，提高免疫力并保障动物健康。屎肠球菌能够附着于肠道粘膜上并形成生物薄膜，抵御外界病原菌的入侵。
屎肠球菌是一种兼性厌氧乳酸菌，它还可用于改善食品、饲料的品质。相对于严格厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌、乳杆菌来说，屎肠球菌更便于生产和使用。大量研究表明，直接饲喂含有屎肠球菌的微生态制剂可提高畜禽的体增重，提高饲料利用率，降低腹泻率及死亡率。因此，屎肠球菌在畜牧生产中有广泛的应用前景。但大多益生菌对饲料加工中的制粒工艺的高温、运输及胃肠液和胆汁的耐受性较差，进入肠道的活乳酸菌的种类和数量不多，因此筛选获得耐高温、耐胃肠液和胆汁的乳酸菌可以解决这一系列的问题。
乳酸菌的来源很多，可购买工业菌株和标准菌株，也可以从自然环境、土壤、酸奶、泡菜等分离乳酸菌。然而益生菌最终是要饲喂动物，因此相对其他来源的菌株，动物无疑是最好的来源。来源于动物肠道的乳酸菌能够适应动物肠道环境，耐受胃酸和胆盐的消化。因此，从动物肠道分离和筛选的乳酸菌将是动物用益生菌筛选的重要研究方向。
现有的屎肠球菌耐热性、耐酸碱性、抑菌性能及发酵性能等都不理想，不能适应日益发展的工业化需求，尤其离目前饲料工业及畜牧养殖业目标还有一定差距，因此，分离、纯化更加适合畜牧业发展需求的益生屎肠球菌菌株成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株抗逆性和益生性强的屎肠球菌HEW-A588及其应用。
本发明的另一目的是提供由屎肠球菌HEW-A588制备的微生态制剂及动物饲料。
为了实现本发明目的，本发明提供的屎肠球菌(Enterococcus faeciums)HEW-A588是从健康仔猪直肠内容物中分离获得乳酸菌，经过菌落形态观察、产酸及抑菌性能测试等获得目标菌株，该菌株耐性强、抗逆性和益生性更显著。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.10547，保藏日期2015年2月9日。
菌株HEW-A588具有以下微生物学特征：革兰氏阳性菌，在MRS培养基上生长迅速，37℃培养24h形成乳白色、圆形、表面光滑湿润、凸起、边缘整齐、直径约1mm左右，菌落形态见图1，油镜下观察其菌体呈球形、成对成链或聚团排列、无芽孢，兼性厌氧生长；菌株HEW-A588生长温度范围：4℃-65℃，最适生长温度：20℃-45℃；生长适宜pH 1.5-11，最适pH值为6-8。部分生理生化特性见表1。
表1 屎肠球菌HEW-A588部分生理生化特性
鉴定项目 HEW-A588 鉴定项目 HEW-A588
革兰氏染色 + 乳糖 +
接触酶 - 麦芽糖 +
氧化酶 - 蔗糖 +
4℃生长 + 果糖 +
65℃生长 + 鼠李糖 -
pH11.0生长 + 棉籽糖 -
耐6.5％NaCl + 木糖 -
pH1.5生长 + 甘露醇 +
0.04％亚碲酸钾 - 山梨醇 +
精氨酸双水解酶 + 蜜二糖 -
葡萄糖 + 松三糖 -
***糖 + 海藻糖 +
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
将菌株HEW-A588的16S rDNA的序列与GenBank中已知序列进行Blast比对，从数据库中获得相关的种属的16S rDNA，构建***发育树，并通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16S rDNA序列等实验数据综合确定该菌株属于肠球菌属，最终确定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
本发明还提供由上述屎肠球菌(Enterococcus faecium)HEW-A588制备的微生态制剂。
本发明还提供了上述微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)发酵培养：将屎肠球菌HEW-A588的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；
2)发酵液经离心获得菌泥，然后经混合、制粒，包被，即得屎肠球菌HEW-A588微生态制剂。
步骤1)中所述种子液和发酵液的制备具体如下：取液氮中保藏的屎肠球菌HEW-A588甘油管，在37℃水浴锅中速溶后，通过在MRS平板上划线分离纯化，37℃培养24-48h；在无菌室平板上挑取生长旺盛的单菌落，接种于新鲜MRS斜面，37℃培养12-18h；在无菌室将试管中各加入2.0mL灭菌生理盐水，用接种环刮取菌苔，合并制成菌悬液；吸取菌悬液0.8mL接种于摇瓶培养基(300mL/1L三角瓶)中，pH6.3-7.8，28-45℃，转速100-300r/m培养5-24h，获得种子液。
其中，摇瓶培养基成分为：蔗糖1-5％，葡萄糖0.5-1.5％，蛋白胨1-3％，酵母膏0.5-2.0％，MgSO4·7H2O 0.1-0.5％，MnSO4·4H2O 0.01-0.05％，NaCl 0.5-2.0％，柠檬酸二铵0.1-0.5％，CaCO30.05-1.0％，余量为水，pH7.0±0.4。优选地，摇瓶培养基成分为：蔗糖1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨1.6％，酵母膏0.8％，MgSO4·7H2O 0.3％，MnSO4·4H2O0.02％，NaCl 0.5％，柠檬酸二铵0.1％，CaCO30.05％，余量为水，pH6.8±0.2。摇瓶培养条件优选为：pH6.8，37℃，转速150r/m培养6.5h。
发酵培养条件为：装液量为20-40L培养基，接种量为100-300mL种子液，pH6.3-7.8，28-45℃，转速100-300r/min发酵4-24h，得二级种子液；将二级种子液转接到2×104L发酵罐中，装液量70％，然后pH6.3-7.8，28-45℃，转速100-200r/min，发酵10-14h。
其中，发酵培养基成分为：绵白糖0.5-1.0％，柠檬酸钠0.5-1.5％，酵母膏1.0-2.0％，氯化镁0.04-0.08％，氯化钠0.05-0.3％，硫酸锰0.01-0.05％，磷酸氢二钾0.05-0.2％，柠檬酸铁铵0-0.008％，吐温-800.05-0.15％，余量为水，pH7.0±0.2。发酵条件优选为：装液量为20L培养基，接种量为100mL，pH6.8，37℃，转速120r/min发酵10h，得二级种子液；将二级种子液转接到2×104L发酵罐中，装液量70％，然后pH6.8，37℃，转速120r/min发酵10h。
本发明还提供所述屎肠球菌HEW-A588及其微生态制剂在制备动物饲料中的应用。
本发明还提供含有所述屎肠球菌HEW-A588及其微生态制剂的动物饲料。
本发明具有以下优点：
(一)本发明的屎肠球菌HEW-A588具有显著的益生性，能显著抑制猪牛常见8种致病菌的生长繁殖。
(二)本发明的屎肠球菌HEW-A588具有较强的抗逆性，能够耐高温(可耐受饲料加工制粒过程中高达80℃的温度)、耐酸、耐胆盐、耐干燥、遗传性能稳定、抵抗力强，无毒无害。
(三)本发明中利用屎肠球菌HEW-A588制备的微生态制剂进入动物肠道，迅速活化、增殖，并能够形成有益优势菌群，维持肠道平衡。
(四)本发明的屎肠球菌HEW-A588，具有显著的益生性以及抗逆性，不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，提高经济效益等功效，有着良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中屎肠球菌HEW-A588的菌落形态图。
图2为本发明实施例2中屎肠球菌HEW-A588的发酵生长曲线图。
图3为本发明实施例3中小鼠肠道大肠杆菌活菌数变化。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1 屎肠球菌HEW-A588的分离筛选和鉴定
1、屎肠球菌的分离纯化
在无菌条件下采集健康仔猪肠肠道内容物1g，置于盛有30mL MRS培养基的三角瓶中，富集培养10h，然后吸取1mL培养液于盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，此稀释度为10-1，依次稀释至10-6，选择10-3～10-6三个稀释度，吸取0.1mL涂布于KF链球菌琼脂平板上，将涂好的平板于37℃倒置培养24-48h后，用接种环挑取深红色且形态不同的菌落在MRS固体培养基平板上进行划线分离培养，经48h培养后，挑取生长旺盛的菌落，用接种环转接于MRS斜面培养基上作纯培养，重复传代纯培养3次，置于4℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察
将步骤1保存的斜面菌种，经3次活化后，接种于MRS液体培养基中，培养8-10h，制备得发酵液，取干净的载玻片，滴一滴发酵液于载玻片上，涂匀，干燥后固定，进行革兰氏染色。镜检选取革兰氏染色为阳性的球状菌株作为备用。
3、优良乳酸菌的筛选
(1)产酸能力测定：将步骤2筛选获得的革兰氏阳性球状菌株活化2-3代后，按1％(v/v)的接种量各自接至新鲜的MRS液体培养基中，37℃培养，分别0h、24h两个时间点用pH计鉴定、检测各实验菌株发酵液的pH值。选取产酸能力高的乳酸菌发酵液进行下一步测定。获得20株产酸能力强的菌株，最终编号为HEW-S12-1～HEW-S12-20。
(2)抑菌试验：在无菌操作台上，将致病菌菌悬液(浓度为109CFU/mL)与等体积灭菌后NA固体培养基(冷却至45℃)混匀，制备成4mm左右的，将灭菌的牛津杯放置在致病菌NA平板上，轻轻加压与培养基接触无空隙，数分钟后，分别向各小管中滴加200μL由步骤(1)筛选获得的20株菌的发酵液，勿使其外溢，37℃培养24-48h，并测量抑菌圈直径，每个乳酸菌发酵液做2个重复，用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小，取平均值，获得抑菌圈大的乳酸菌7株，并分别标号为HEW-S12-1、HEW-S12-5、HEW-S12-8、HEW-S12-14、HEW-S12-17、HEW-S12-19、HEW-S12-20。用接种环转接于MRS斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用，进行下一步研究。
(3)耐温性的筛选
取制备好的10mL步骤(1)中获得的菌株发酵液分别注入到试管中并编号，分别检测其活菌数，同时将同样装有10mL各菌株发酵液的试管置于85℃水浴锅中加热15min，取加热后的发酵液进行活菌检测，至少做3个重复，计算各菌株加热前后的活菌，并计算存活率。选择存活率在70％以上的菌株，最终获得5株菌HEW-S12-2、HEW-S12-5、HEW-S12-14、HEW-S12-16、HEW-S12-17。
(4)耐酸性的筛选
取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL步骤(1)获得的乳酸菌菌悬液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于37℃静置培养3h。取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，计算存活率，选择存活率在80％以上的菌株，获得4株菌为HEW-S12-3、HEW-S12-5、HEW-S12-16、HEW-S12-20。
(5)耐胆盐的筛选
用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将步骤(1)获得的乳酸菌菌悬液1.0mL接种到9mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存活菌数，计算存活率，筛选存活率80％以上的菌株，最终获得5株菌，为HEW-S12-1、HEW-S12-5、HEW-S12-8、HEW-S12-17、HEW-S12-20。
(6)目的菌株的确定
综合考虑各乳酸菌的产酸能力、耐高温、耐酸、耐胆盐和抑菌活性，最终获得一株菌HEW-S12-5(即HEW-A588)，其产酸能力较强，耐高温、耐酸和耐胆盐性能强，对猪牛常见8种致病菌的抑菌效果好。
所述KF链球菌琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，酵母粉1％，甘油磷酸钠1％，氯化钠0.5％，麦芽糖2％，乳糖1％，叠氮化钠0.04％，琼脂1.3％，溴甲酚紫0.0015％，余量为水，pH7.2±0.2。
所述MRS固体或斜面培养基组成为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，柠檬酸二铵0.2％，醋酸钠0.5％，牛肉膏1％，吐温-80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O0.0058％，MnSO4·4H2O 0.025％，琼脂粉1.5％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS液体培养基组成为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，柠檬酸二铵0.2％，醋酸钠0.5％，牛肉膏1％，吐温-80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.0058％，MnSO4·4H2O 0.025％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述NA固体培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
4、菌株属的鉴定
菌株HEW-A588具有以下微生物学特征：革兰氏阳性菌，在MRS培养基上生长迅速，37℃培养24h形成乳白色、圆形、表面光滑湿润、凸起、边缘整齐、直径约1mm左右，菌落形态见图1，油镜下观察其菌体呈球形、成对成链或聚团排列、无芽孢，兼性厌氧生长；菌株HEW-A588生长温度范围：4℃-65℃，最适生长温度：20℃-45℃；生长适宜pH值为1.5-11，最适pH值为6-8。
对HEW-A588菌株进行生理生化鉴定，过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验和硫化氢试验均为阴性，表明HEW-A588菌株为乳酸菌属。通过马尿酸盐水解试验、精氨酸水解试验、4℃和65℃生长试验，以及各类糖发酵试验，结果与《常见细菌***鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定》对照。鉴定结果显示HEW-A588菌株为屎肠球菌。该菌的部分生理生化特性见表1。
5、16S rDNA序列测定
采用改良CTAB法提取菌株HEW-A588的基因组DNA。利用通用引物对菌株HEW-A588的16S rDNA基因片段进行PCR扩增，PCR扩增体系(25μL)包括引物F和R各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10×Taq酶缓冲液2.5μL，Mg2+(25mmoL/L)1.5μL，菌株基因组DNA 50ng。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，53℃退火1min，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃温浴10min。反应结束后取3μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。所得PCR产物回收纯化，送生物工程(上海)有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与GenBank中的16SrDNA序列进行Blast分析比对，结果菌株HEW-A588与屎肠球菌的同源性达到99.97％。通过菌株HEW-A588的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株HEW-A588为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
实施例2 屎肠球菌HEW-A588微生态制剂的制备
1、屎肠球菌HEW-A588活性菌泥的制备
1.1制备屎肠球菌HEW-A588发酵液
取液氮中保藏的屎肠球菌HEW-A588甘油管，在37℃水浴锅中速溶后，通过在MRS平板上划线分离纯化，37℃培养24-48h；在无菌室平板上挑取生长旺盛的单菌落，接种于新鲜MRS斜面，37℃培养12-18h；在无菌室将试管中各加入2.0mL灭菌生理盐水，用接种环刮取菌苔，合并制成菌悬液；吸取菌悬液0.8mL接种于摇瓶培养基(300mL/1L三角瓶)中，pH6.8，37℃，150r/min振荡培养6.5h，得种子液。
摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验，取100mL摇瓶发酵种子液接种到50L发酵罐中，装液量为20L培养基、发酵温度为37℃，pH值6.8，搅拌转速120r/min，发酵时间10h，得二级种子液。将二级种子液转接到2×104L发酵罐中，装液量70％，然后pH6.8，37℃，转速120r/min发酵10h。摇瓶培养基成分为：蔗糖1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨1.6％，酵母膏0.8％，MgSO4·7H2O 0.3％，MnSO4·4H2O 0.02％，NaCl 0.5％，柠檬酸二铵0.1％，CaCO30.05％，余量为水，pH6.8±0.2。
50L发酵罐中试培养基成分为：绵白糖0.8％，柠檬酸钠1.0％，酵母膏1.5％，氯化镁0.06％，氯化钠0.1％，硫酸锰0.03％，磷酸氢二钾0.1％，柠檬酸铁铵0.004％，吐温-800.1％，余量为水，pH7.0±0.2。
发酵结束后，检测发酵液活菌数为2.0×1010CFU/mL，发酵生长曲线如图2所示，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
1.2菌液分离
将制备的屎肠球菌HEW-A588发酵液通过蠕动泵输送到高速管式离心机中进行菌液分离，16000r/min离心40min，得到屎肠球菌HEW-A588活性菌泥。
2、地衣芽孢杆菌活性菌泥的制备
2.1制备地衣芽孢杆菌发酵液
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养。取斜面保藏的地衣芽孢杆菌接种于300mL一级种子液体培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为25-45℃、初始pH7.1、180r/min，发酵时间8-20h，得到一级摇瓶种子液。将一级种子液转接到35L二级种子培养基中(50L发酵罐)，接种量为1.5％，发酵温度为35℃、初始pH值7.1，搅拌转速140r/min，培养8h得到二级种子液，将二级种子液转接到三级发酵培养基中(2×104L发酵罐)，接种后，罐温控制在35℃，pH7.2，搅拌转速在150r/m，培养40h得到地衣芽孢杆菌发酵液，发酵结束后，检测发酵液活菌数≥1.3×1010CFU/mL。
其中斜面培养基为常规牛肉膏蛋白胨培养基，种子培养基为葡萄糖1.5％，玉米淀粉0.5％，豆粕1.5％，酵母粉0.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，MnSO4·4H2O 0.05％，pH7.0±0.2。发酵培养基为：糖蜜2％，酵母膏0.4％，分析淀粉0.5％，NaCl 0.5％，MgSO4·7H2O0.05％，MnSO4·4H2O 0.05％，pH7.0±0.2。
2.2菌液分离
将制备的地衣芽孢杆菌发酵液通过蠕动泵输送到高速管式离心机，16000r/m离心40min，进行菌液分离，得到地衣芽孢杆菌活性菌泥。
3、酵母菌活性菌泥的制备
3.1制备酵母菌发酵液
将毕赤酵母菌按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养。取斜面保藏的毕赤酵母菌接种于300mL一级种子液体培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为30℃、pH 6.8、120r/min，发酵时间10-15h，得到一级摇瓶种子液。将一级种子液转接到35L二级种子培养基中(50L发酵罐)，接种量为2％，发酵温度为30℃、pH值6.8，搅拌转速100r/min，培养9h得到二级发酵液，将二级种子液转接到三级发酵培养基中(2×104L发酵罐)，接种后，罐温控制在30℃，pH6.8，搅拌转速在120r/m，培养60h得到酵母菌发酵液，发酵结束后，检测发酵液活菌数≥9.0×109CFU/mL。
其中斜面培养基为常规PDA培养基，种子培养基为葡萄糖1.5％，酵母提取物1％，大豆蛋白胨1％，NaCl 0.5％，pH6.8±0.2。发酵培养基为：糖蜜1.3％，酵母提取物0.7％，豆粉1.5％，NaCl 0.5％，pH6.8±0.2。
3.2菌液分离
将制备的酵母菌发酵液通过蠕动泵输送到高速管式离心机，13000r/m离心40min，进行菌液分离，得到酵母菌活性菌泥。
4、屎肠球菌HEW-A588微生态制剂的制备
4.1微囊包被
保护液的制备：甘油3％、麦芽糊精2％、海藻糖3％、玉米淀粉40％、微晶纤维素8％、聚乙烯吡咯烷酮5％、植物油3％，余量为水，充分搅拌使其溶解。
将屎肠球菌HEW-A588活性菌泥、地衣芽孢杆菌活性菌泥、酵母菌活性菌泥和保护液按0.6:2.2:0.5:1的重量比依次加入搅拌罐中，搅拌转速50r/m，40min后加水并调节物料湿度，控制在30％；得到微囊菌湿粉，待用。
4.2制粒包衣
将4.1制备的微囊菌湿粉和大豆分离蛋白按1：0.1的重量比投入制粒机内，调节粒度为30目左右，得到粒形半成品，待用。
4.3肠溶包衣
将4.2制备的粒形半成品，投入至旋流流化床制粒包衣机中干燥。干燥进风温度控制在60℃左右，出风温度控制在32℃以内，干燥时间60min；
包被剂溶液为：海藻酸钠6％、羧甲基纤维素钠6％、羟丙基甲基纤维素3％、果胶5％、卡拉胶3％、葡聚糖6％、低聚麦芽糖6％、脱脂奶粉10％，余量为水；
包被处理：启动侧喷包衣装置，进风温度控制在50℃，雾化压力为0.2MPa，将包被剂溶液以30mL/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料表面形成包衣膜层。经过50min得到40目屎肠球菌HEW-A588复合微生态制剂产品。
实施例3 小鼠攻毒试验
选取普通昆明小白鼠180只，18-20g，雌雄各半，常规饲养。饲养一周后，随机挑选120只分成两组，其中60只作为试验组(微生态制剂组，实施例2制备)，每天饲喂含有微生态制剂的饲料(15g微生态制剂/1kg饲料)，另60只作为对照组，饲喂常规饲料，自由采食，饲喂21天，每5天检测采集一次小白鼠粪便测大肠杆菌数量，并观察小白鼠的生长情况。取小鼠粪便约0.1g，于无菌操作台内加入几粒玻璃珠(以0.1g粪样加0.9mL稀释液)，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数。
给饲喂21天后的小白鼠腹腔注射大肠杆菌菌液，0.5mL/只，菌液浓度为(1～2×109cfu/mL)，观察小白鼠状态，统计死亡率。
小鼠肠道大肠杆菌活菌数变化如图3所示，对照组的大肠杆菌数变化不显著(P﹥0.05)，HEW-A588微生态制剂组大肠杆菌数从第6d开始到第21d逐渐下降(P﹤0.05)。饲喂HEW-A588微生态制剂之后肠道大肠杆菌数显著下降，可能是HEW-A588在肠道内迅速定植，竞争性抑制大肠杆菌的生长和繁殖；或是其分泌的抑菌物质和酸性物质，不利于大肠杆菌的存活。
HEW-A588微生态制剂组和对照组，饲喂21d，以大肠杆菌进行攻毒，通过每日观察，小鼠的发病症状有：精神萎靡不振、不活泼；表现呆滞、颤抖；蜷缩在一起，毛色不光泽，且背毛凌乱；食欲不佳、背部弓起突出。攻毒后，第1d，对照组开始有发病症状，且死亡9只，并且第2、3、4d各死亡15、7、5只，其他存活的也不同程度的出现了发病症状，四处逃窜，精神不振。HEW-A588微生态制剂组在第2、3d各死亡3、1只，其它小鼠24h内，精神不佳、不食、聚堆，之后逐渐恢复正常。
攻毒后各组死亡时间、死亡数及存活率如表2所示，小鼠攻毒前没有死亡，这说明HEW-A588菌株无毒，而且对大肠杆菌感染有一定的免疫预防效果，有效地降低了小白鼠受大肠杆菌感染时的发病率，延缓攻毒后的发病时间，从而有效提高了存活率。这可能是菌株HEW-A588在小鼠肠道内形成了优势菌，其分泌的酸性物质，使肠道中pH下降，不利于大肠杆菌的生长；其分泌的抑菌物质，抑制大肠杆菌的繁殖；其分泌的活性物质提高了小鼠的免疫能力。
表2 攻毒前、后的小鼠死亡情况
实施例4 断奶仔猪生长性能试验
试验选用同胎次、体重相近(杜洛克×长白×大白)三元杂交断奶仔猪(公母各半，28天断奶)120头，随机分成两组(对照组和试验组)，每处理6栏，每栏10头，在相同环境下进行饲养试验。对照组饲粮为基础饲粮(参照***饲养标准)，试验组饲粮中添加实施例2制备的微生态制剂，即在对照组的基础上每吨饲料添加100g微生态制剂。饲养28天，观察并记录仔猪的腹泻、粪便状态、皮毛色泽；记录每日每栏猪的耗料量，统计采食量；记录初始个体重、结束个体重。(表3)
表3 微生态制剂对断奶仔猪生长性能的影响
项目 对照组 试验组
初重(kg) 9.18±0.34 8.97±0.25
7天重(kg) 11.79±0.77 11.72±0.59
14天重(kg) 13.88±1.02 14.28±1.23
21天重(kg) 18.71±1.11 19.83±1.35
28天重(kg) 23.75±2.42a 24.69±2.51b
总采食量(kg) 34.31±2.04 34.07±2.17
料肉比 1.44±0.84b 1.37±0.86a
腹泻头数 17 3
腹泻次数 24 7
腹泻率 24.29％ 1.25％
注：以同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著(P<0.05)。
在实验过程中，试验组仔猪皮毛亮，形体健美，活泼好动。与对照组相比，饲料中添加微生态制剂后可显著提高试验组仔猪的日增重，显著降低料肉比0.07，显著降低腹泻率。(表4)
表4 屎肠球菌HEW-A588对仔猪生长环境的影响
项目 实验组猪舍 阴性对照组猪舍 标准值
空气中氨含量(mg/m3) 5.354±0.217b 8.425±0.381a ≤25.0
空气中硫化氢含量(mg/m3) 0.0213±0.001b 0.059±0.004a ≤10.0
空气中细菌含量(cfu/m3) 80.319±11.207b 48.215±12.359a ≤5×103
注：以同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例5 育肥猪生产性能试验
选取健康、体重70kg左右、公母比例一致、日龄相近的(杜洛克×长白×大白)三元商品育肥猪216头，完全随机分成3组(阳性对照组、阴性对照组和试验组)，每组12个栏，每栏6头猪。阴性对照组：试验饲粮为基础日粮(参照***饲养标准)；阳性对照组：试验饲粮添加抗生素，即在阴性对照组的基础上每吨饲料添加500g金霉素；试验组：试验饲粮添加实施例2制备的微生态制剂，即在对照组的基础上每吨饲料添加100g微生态制剂。试验猪采用封闭式圈舍，每日喂4次，自由采食和饮水，每日清扫圈舍至少3次，饲喂30天。饲养管理及其免疫程序与猪场日常管理相同，定期消毒，发现猪生病及时治疗。
每天观察猪的精神状态和肤色，试验当天早晨空腹称重，记录每天投料量和剩料量，试验结束后次日清晨空腹称重；记录各组腹泻发生情况；计算日采食量、日增重、料重比和腹泻率。(表5)
表5 微生态制剂对育肥猪生长性能的影响
项目 阴性对照组 阳性对照组 试验组
初重/kg 72.57±7.96 72.85±8.05 72.88±6.91
末重/kg 96.58±11.23 98.21±6.57 98.84±8.58
日采食量/(g/d) 4488.70±54.96 4542.88±60.42 4581.14±50.72
日增重/(g/d) 1577.08±93.26 1647.50±125.16 1659.54±140.74
料肉比 2.85±0.59a 2.76±0.48b 2.76±0.36b
试验头数 72 72 72
腹泻头数 11 3 3
腹泻率/％ 15.28％a 4.17％b 4.17％b
死亡头数 1 0 0
皮肤毛色 一般 一般 皮毛红亮
注：以同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表5可知，阳性对照组和试验组日采食量均比与阴性对照组有显著提高，分别较阴性对照组显著提高4.47％、5.23％；阳性对照组和试验组料肉比分别均对照组显著降低0.09；与对照组相比，阳性对照组和试验组均显著降低了腹泻率。试验过程中，通过观察猪的健康活力及生长情况发现试验组的猪皮毛红亮，精神状态良好。
实施例6 母猪繁殖性能试验
选择胎次接近、健康状况良好的长×大二元杂交哺乳母猪48头，平均分成两组，每组24头，4栏，每栏6头，试验从产仔前15天至哺乳仔猪28日龄断奶结束，对照组为基础日粮，试验组为基础日粮添加实施例2制备的微生态制剂，即在对照组的基础上每吨饲料添加100g微生态制剂。
由于微生态制剂是在妊娠后期开始饲喂，因此微生态制剂没有对产仔数产生显著的影响。但试验期间，试验组母猪比对照组平均日采食量显著增加10.78％(P<0.05)，平均仔猪初生重增加80g(P<0.05)。母猪生产性能的提高需要一段漫长的时间，整个试验期较短，因此微生态制剂对母猪生产性能发挥了一定的作用，而且对母猪的便秘和产后疾病控制也起了一定的作用。在基础日粮中添加微生态制剂后，可显著降低妊娠期母猪和哺乳期母猪便秘率(P<0.05)，显著提高了母猪的健康水平和自身免疫力，减少助产率(P<0.05)，并有效降低母猪产后产道炎的发生率(P<0.05)。可见，在基础日粮中添加微生态制剂能够有效抑制病原微生物的生长繁殖，提高机体免疫力，有效预防疾病，促进肠道蠕动，对母猪便秘、子宫炎的发生率起到了有效预防的效果。(表6)
表6 乳仔猪专用微生态制剂Z800-200对母猪繁殖性能的影响
项目 对照组 试验组
母猪平均日采食量(kg/头/天) 5.75±0.24a 6.37±0.28b
产仔数(头/窝) 11.87±1.27a 12.12±1.32a
健仔数(头/窝) 10.79±1.14a 11.58±1.25b
平均仔猪出生重(kg/头) 1.29±0.11a 1.37±0.07b
妊娠母猪便秘(头) 5 1
妊娠母猪便秘率(％) 20.83±1.32a 4.17±0.43b
哺乳母猪便秘(头) 9 2
哺乳母猪便秘率(％) 37.50±1.22a 8.33±0.43b
母猪助产情况(头) 8 3
助产率(％) 33.33±1.87a 12.5±1.07b
产道炎(头) 7 3
发病率(％) 29.17±0.67a 12.5±0.47b
注：以同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著(P<0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.屎肠球菌(Enterococcus faecium)HEW-A588，其保藏编号为CGMCC No.10547。
2.由权利要求1所述屎肠球菌HEW-A588制备的微生态制剂。
3.权利要求2所述微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)发酵培养：将屎肠球菌HEW-A588的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；
2)发酵液经离心获得菌泥，然后与地衣芽孢杆菌活性菌泥、酵母菌活性菌泥和保护液混合，制粒，包被，即得屎肠球菌HEW-A588微生态制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中用于制备种子液的摇瓶培养基成分为：蔗糖1-5％，葡萄糖0.5-1.5％，蛋白胨1-3％，酵母膏0.5-2.0％，MgSO4·7H2O0.1-0.5％，MnSO4·4H2O 0.01-0.05％，NaCl 0.5-2.0％，柠檬酸二铵0.1-0.5％，CaCO30.05-1.0％，余量为水，pH7.0±0.4；摇瓶培养条件为：pH6.3-7.8，28-45℃，转速100-300r/min培养5-24h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中用于制备种子液的摇瓶培养基成分为：蔗糖1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨1.6％，酵母膏0.8％，MgSO4·7H2O 0.3％，MnSO4·4H2O 0.02％，NaCl 0.5％，柠檬酸二铵0.1％，CaCO3 0.05％，余量为水，pH6.8±0.2；摇瓶培养条件为：pH6.8，37℃，转速150r/min培养6.5h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中发酵培养基成分为：绵白糖0.5-1.0％，柠檬酸钠0.5-1.5％，酵母膏1.0-2.0％，氯化镁0.04-0.08％，氯化钠0.05-0.3％，硫酸锰0.01-0.05％，磷酸氢二钾0.05-0.2％，柠檬酸铁铵0-0.008％，吐温-800.05-0.15％，余量为水，pH7.0±0.2；发酵条件为：装液量为20-40L培养基，接种量为100-300mL种子液，pH6.3-7.8，28-45℃，转速100-300r/min发酵4-24h，得二级种子液；将二级种子液转接到2×104L发酵罐中，装液量70％，然后pH6.3-7.8，28-45℃，转速100-200r/min，发酵10-14h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，发酵条件为：装液量为20L培养基，接种量为100mL，pH6.8，37℃，转速120r/min发酵10h，得二级种子液；将二级种子液转接到2×104L发酵罐中，装液量70％，然后pH6.8，37℃，转速120r/min发酵10h。
8.权利要求1所述屎肠球菌HEW-A588、权利要求2所述微生态制剂在制备动物饲料中的应用。
9.含有权利要求1所述屎肠球菌HEW-A588、权利要求2所述微生态制剂的动物饲料。
CN201510275127.9A 2015-05-26 2015-05-26 一株屎肠球菌hew‑a588及其应用 Active CN104862254B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510275127.9A CN104862254B (zh) 2015-05-26 2015-05-26 一株屎肠球菌hew‑a588及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510275127.9A CN104862254B (zh) 2015-05-26 2015-05-26 一株屎肠球菌hew‑a588及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104862254A CN104862254A (zh) 2015-08-26
CN104862254B true CN104862254B (zh) 2018-02-16

Family

ID=53908435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510275127.9A Active CN104862254B (zh) 2015-05-26 2015-05-26 一株屎肠球菌hew‑a588及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104862254B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282072B (zh) * 2016-11-04 2019-12-20 北京好实沃生物技术有限公司 一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用
CN108179122B (zh) * 2016-12-08 2021-02-02 中国农业大学 一种高粘附益生性屎肠球菌及其应用
CN106978369A (zh) * 2017-04-12 2017-07-25 福建奥姆龙生物工程有限公司 一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺
CN108207791B (zh) * 2017-12-29 2020-11-24 武汉轻工大学 新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法
CN108949613B (zh) * 2018-06-13 2021-03-23 湖北华大瑞尔科技有限公司 一种辅助抗生素的益生菌制剂及其制备方法
CN108753650B (zh) * 2018-06-13 2020-02-14 青岛蔚蓝生物股份有限公司 屎肠球菌以及由其制备的复合微生态制剂
CN109897800B (zh) * 2019-03-13 2020-10-27 西安交通大学 一株富硒坚强肠球菌a8-1及其应用
CN113604405B (zh) * 2019-11-29 2023-11-28 天津生机集团股份有限公司 一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途
CN113801809B (zh) * 2021-07-23 2024-04-26 聊城大学 一种屎肠球菌及其应用
CN114451486A (zh) * 2022-01-21 2022-05-10 江西好实沃生物技术有限公司 一种菌酶复合型饲料添加剂及其制备方法和应用
CN115011508B (zh) * 2022-05-05 2024-02-09 国家粮食和物资储备局科学研究院 屎肠球菌、其微胶囊制剂和制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040079302A (ko) * 2003-03-07 2004-09-14 (주)바이오솔루션 인간 피부 유래의 신규한 박테리오신 및 여드름치료제로서의 용도
CN102031235A (zh) * 2010-11-09 2011-04-27 中国农业大学 一种粪肠球菌anse228及其应用
CN102093967A (zh) * 2010-12-02 2011-06-15 中国农业科学院特产研究所 一株水貂源屎肠球菌及其应用
CN102391962A (zh) * 2011-11-03 2012-03-28 北京龙科方舟生物工程技术中心 一种屎肠球菌制剂及其生产工艺
CN102747003A (zh) * 2011-12-29 2012-10-24 武汉华大瑞尔科技有限公司 一株益生屎肠球菌的筛选及应用
CN103468615A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 内蒙古农业大学 一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法
CN103820363A (zh) * 2014-01-27 2014-05-28 福建省农业科学院生物技术研究所 一种屎肠球菌菌粉的制备与应用
CN103981115A (zh) * 2013-12-24 2014-08-13 北京伟嘉人生物技术有限公司 一株高抗逆性屎肠球菌及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040079302A (ko) * 2003-03-07 2004-09-14 (주)바이오솔루션 인간 피부 유래의 신규한 박테리오신 및 여드름치료제로서의 용도
CN102031235A (zh) * 2010-11-09 2011-04-27 中国农业大学 一种粪肠球菌anse228及其应用
CN102093967A (zh) * 2010-12-02 2011-06-15 中国农业科学院特产研究所 一株水貂源屎肠球菌及其应用
CN102391962A (zh) * 2011-11-03 2012-03-28 北京龙科方舟生物工程技术中心 一种屎肠球菌制剂及其生产工艺
CN102747003A (zh) * 2011-12-29 2012-10-24 武汉华大瑞尔科技有限公司 一株益生屎肠球菌的筛选及应用
CN103468615A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 内蒙古农业大学 一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法
CN103981115A (zh) * 2013-12-24 2014-08-13 北京伟嘉人生物技术有限公司 一株高抗逆性屎肠球菌及其应用
CN103820363A (zh) * 2014-01-27 2014-05-28 福建省农业科学院生物技术研究所 一种屎肠球菌菌粉的制备与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株鸡源屎肠球菌的分离及鉴定;杜志琳等;《饲料研究》;20150331(第5期);第7-9页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104862254A (zh) 2015-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104862254B (zh) 一株屎肠球菌hew‑a588及其应用
CN106282072B (zh) 一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用
CN104293696B (zh) 一株粪肠球菌hew-a131及其应用
CN106399196B (zh) 一株植物乳杆菌hew-a490及其应用
CN101638627B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用
CN102120975B (zh) 一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用
CN103275907B (zh) 一种解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用
CN105002155B (zh) 一种猪用益生菌剂及其制备方法
CN108504601A (zh) 一株乳酸片球菌hew-ap27及其应用
CN108373984A (zh) 一种副干酪乳杆菌及其应用
CN101671638B (zh) 一种双歧杆菌新菌株及其发酵制备方法与应用
CN109306329B (zh) 枯草芽孢杆菌及其应用
CN105062933A (zh) 一种罗伊氏乳杆菌及其应用
CN105543126A (zh) 一种植物乳杆菌jm113及其应用
CN101974463B (zh) 罗伊氏乳杆菌及其复合活菌制剂
CN102559560B (zh) 一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌及其制剂和应用
CN102936568B (zh) 鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂及其制备方法和应用
CN103087964A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其微生态制剂和在动物饲料中的应用
CN108085261A (zh) 一株酿酒酵母及其培养物和在饲料中的应用
CN115094012B (zh) 凝结芽孢杆菌bc-hyc株菌剂的制备方法及应用
CN113549574B (zh) 一种凝结芽孢杆菌及其应用
CN105010770A (zh) 一种羔羊教槽料及其羔羊教槽方法
CN101392223A (zh) 一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法
CN105994941A (zh) 一种微生物发酵制备的无抗饲料
CN102517227B (zh) 粪肠球菌及其应用与其饲料添加剂和发酵剂

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Xueping

Inventor after: Chen Xianxin

Inventor before: Li Xueping

CB03 Change of inventor or designer information
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180517

Address after: 100089 9, 903, 1 building, 59 street, Haidian District, Beijing.

Co-patentee after: Leshan research of agricultural science institute

Patentee after: Beijing Haoshiwo Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 100044 Haidian District, Beijing, sorghum Bridge 59, No. 903

Patentee before: Beijing Haoshiwo Biological Technology Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right