CN102559511B - 高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用。该菌于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为：CGMCC No.5209。该肉座菌能产生一种新型的β-葡萄糖苷酶，该酶的酶活高达482.1U/mL，最适反应pH值为4.8，最适反应温度为70℃，在50℃时酶活能够显示高度稳定性，适合于高温水解；乙醇浓度为10％对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍，反应体系中乙醇浓度30％以内不会对酶活造成抑制，并在水解生物质原料时，能有效消除纤维二糖抑制，提高乙醇产量，消除终端产物抑制。预期可以降低纤维素乙醇的生产成本，加快其产业化进程。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵及其酶工程化应用领域，具体涉及一种高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌(Hypocrea sp.)W63及所产的β-葡萄糖苷酶，以及该β-葡萄糖苷酶在同步糖化发酵上的应用。
背景技术
β-葡萄糖苷酶，英文名称β-glucosidase，简称BG，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键，从而释放出葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，几乎在所有生物体中都有，因其来源不同而性质各异，在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。
在纤维素酶水解纤维素的过程中，纤维素类物质经酶促作用成葡萄糖至少需要三种酶的协同作用，葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖释放葡萄糖是一个关键限速步骤。目前，市场上应用的β-葡萄糖苷酶在水解过程中，β-葡萄糖苷酶活性易受水解产物葡萄糖的抑制，而纤维二糖又是纤维素酶系中其他酶的抑制剂，从而会造成整个纤维素的水解过程受到抑制；其次，在产纤维素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量都很低(除黑曲霉外)，远达不到实际应用的水平；再次，在大量的反应过程中，热处理会使大部分的β-葡萄糖苷酶酶活性丧失。一般来说，来自植物的β-葡萄糖苷酶最适温度在40℃左右，大多数微生物来源的β-葡萄糖苷酶的最适作用温度在50℃左右。目前，制约纤维素乙醇产业化的一个关键瓶颈就是纤维素酶的使用成本较高。其中缺乏有效的商业化β-葡萄糖苷酶是一个关键因素。因此，开发寻找嗜温、耐醇、高活性的β-葡萄糖苷酶对于加快纤维素乙醇的产业化进程，预期将会有很大的促进作用。
除了在纤维素降解中的应用外，β-葡萄糖苷酶还有多种用途。在果汁行业中，人们利用β-葡萄糖苷酶对糖苷键的作用增加果汁的香气；在食品行业中，人们利用它对一些生氰物质降解以脱除食品加工原料的毒性。因此，通过高通量筛选技术筛选高效产酶菌株，对于探索β-葡萄糖苷酶的多样化应用具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌(Hypocrea sp.)W63，该菌于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5209。
本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63是从枯枝烂叶、土壤、真菌子实体等材料中筛选培养出来。其真菌分类学表明：该菌菌丝体呈白色，菌落小而致密，呈棉絮状，可产绿色孢子。PDA培养基培养1天开始长白色菌丝，培养3天以上开始长绿色孢子。该菌菌丝体及孢子如图1所示。
本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63的分类学地位根据下述方法确定：
常规方法提取该真菌的18s rDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列已提交到GenBank，其序列登记号为JN935058，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的18S rDNA序列，构建***发育树，如图2所示。经比较分析，本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63属于肉座菌属，将其命名为肉座菌(Hypocreasp.)W63，该菌于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5209。
本发明的第二个目的是提供了一种以肉座菌(Hypocrea sp.)W63为发酵菌株，经液体发酵而制得的β-葡萄糖苷酶。
根据β-葡萄糖苷酶特异性底物4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside(pNPG)的测定反应，发现本发明的肉座菌Hypocrea sp.W63能高产β-葡萄糖苷酶，该酶的液体发酵最高酶活高达482.1U/mL(在1min内催化产生1μmol/L对硝基酚的量定义为一个酶单位)，最适反应pH值为4.8，最适反应温度为65℃，葡萄糖反馈抑制作用明显；乙醇浓度为10％对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍，乙醇耐受能力高达30％。目前已经报道的β-葡萄糖苷酶，酶活一般不超过300U，其最适反应温度一般在50℃，在乙醇浓度8％以下会对β-葡萄糖苷酶酶活有促进作用，但随着乙醇浓度的增加，就会对β-葡萄糖苷酶的酶活产生抑制作用。因此，本发明的肉座菌Hypocrea sp.W63所产的β-葡萄糖苷酶与现有报道中的β-葡萄糖苷酶具有明显的区别，是一种新型的嗜温、耐乙醇的β-葡萄糖苷酶。
本发明的第三个目的是提供本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63在制备β-葡萄糖苷酶上的应用。
本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63制备的β-葡萄糖苷酶可以应用在纤维素乙醇的生产上。将秸秆气爆粉碎，然后加入酵母菌、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶制剂进行发酵，有利于纤维素同步糖化发酵应用，能有效消除纤维二糖抑制，提高乙醇产量，消除终端产物抑制。
本发明的第四个目的是提供本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63生产的β-葡萄糖苷酶在木质纤维素原料同步糖化发酵上的应用。
本发明筛选的肉座菌(Hypocrea sp.)W63，该菌能产生一种新的β-葡萄糖苷酶，该酶的酶活高达482.1U/mL(在1min内催化产生1μmol/L对硝基酚的量定义为一个酶单位U)，最适反应pH值为4.8，最适反应温度为70℃，在50℃时酶活能够显示高度稳定性，适合于高温水解；乙醇浓度为10％对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍，反应体系中乙醇浓度30％以内不会对酶活造成抑制，并在水解生物质原料时，能有效消除纤维二糖抑制，提高乙醇产量，消除终端产物抑制。预期可以降低纤维素乙醇的生产成本，加快其产业化进程。
本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5209。
附图说明
图1是本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63的电镜扫描图，其中，A的放大倍数为7500，B的放大倍数为12500，C的放大倍数为15000，D的放大倍数为30000；
图2是应用本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63的18S rDNA***发育树；
图3是本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63产的β-葡萄糖苷酶的pH值及pH稳定性；
图4是温度对本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63产的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图5是本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63产的β-葡萄糖苷酶对乙醇的耐受性；
图6是添加本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63产的β-葡萄糖苷酶对同步糖化发酵效果的影响，其中实心曲线代表总糖含量，空心曲线代表乙醇浓度。
具体实施方式：
以下实施例子是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：菌株的筛选
取样枯枝烂叶、土壤、真菌子实体等材料。直接置于刚果红初筛培养基，该培养基的配方是：每升培养基中含有KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，纤维素粉(微晶纤维)2.0g，刚果红0.2g，琼脂18～20g，余量为水，自然pH值。30℃培养2～5d，挑取水解透明圈较大的单菌落在PDA培养基上纯化，纯化的菌株进行PDA斜面保存。
菌株产β-葡萄糖苷酶活力复筛：将PDA斜面保存的纯化菌株分别接种到等量的复筛发酵培养基中，30℃，120rpm，培养48h。冷冻离心取上清液，即为粗酶液，分别用标准pNPG法测定各菌株产的粗酶液的β-葡萄糖苷酶活力。具体方法为：用移液枪吸取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入到0.9mL pH5.0的0.2mol/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液中，于50℃恒温水浴5min，再迅速加入已预热5～10min的1mL 5mmol/L的pNPG溶液，用秒表精确计时反应10min，立即加入3mL 1mmol/L的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于400nm处测光吸收值(OD)。然后选择β-葡萄糖苷酶活力较高的菌株使用PDA斜面保存。所述的复筛发酵培养基为每升培养基含有KH2PO4 2g，(NH4)2SO4 2.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，稻秆50g，余量为水。
经筛选获得1株β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株。采用改良CTAB法提取该菌株总DNA，选择扩增真菌18S rDNA序列的通用引物NS1(5′-GTATCATATGCTTGTCTC-3′)和NS8(5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′)对肉座菌(Hypocrea sp.)W63总DNA进行18SrDNA序列的扩增。在20μL的PCR反应体系中含有10×Buffer 2μL(含MgCl2，2.5mmol/L)，dNTP(10mmol/L)0.4μL，引物(NS1和NS8)量各为20pmol，rTag(5U/μL)0.2μL，约50ng的模板DNA，其余体积以无菌超纯水补足。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物采用DNA凝胶回收试剂盒进行割胶回收。纯化产物连接到pMD18-T-Vecter，连接产物转化到Escherichiacoli JM109感受态细胞，进行氨卡青霉素选择和蓝白斑的筛选。挑取单克隆菌液进行测序。经测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列已提交到GenBank，其序列登记号为JN935058，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的18S rDNA序列，构建***发育树，如图2所示。经比较分析，该菌属于肉座菌属，将其命名为肉座菌(Hypocrea sp.)W63，该菌于2011年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.5209。
实施例2：β-葡萄糖苷酶制剂的制备及其酶活力、酶学性质测定
1.β-葡萄糖苷酶制剂的制备：将肉座菌(Hypocrea sp.)W63活化，经种子培养，种子培养基为每升培养基含土豆浸汁200g，葡萄糖20g，余量为水，115℃灭菌30min。30℃，120rpm，培养3天，获得种子培养液。将种子培养液以5％(v/v)的接种量接种到发酵培养基中，该发酵培养基的配方为每升培养基含有KH2PO4 2g，(NH4)2SO4 2.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3g，稻秆50g，微量元素液200μL(CuSO4 0.1g，MnSO4 0.1g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2 0.1g，定容至100mL，水100mL)。30℃，120rpm，发酵5d，然后收取发酵液，8000rpm 4℃冷冻离心5min，取上清即为β-葡萄糖苷酶制剂，4℃保存备用。
2.β-葡萄糖苷酶的酶活力测定：用4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside(pNPG)作为底物，反应体系为2mL，先将1mL pNPG(5mmol/L)和0.9mL pH 5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液混匀，再加入0.1mL适当稀释的上一步骤得到的β-葡萄糖苷酶制剂，50℃反应10min，立即加入3mL1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于400nm处测光吸收值(OD)。经测定，经步骤1得到的肉座菌(Hypocrea sp.)W63产的β-葡萄糖苷酶制剂的活力达到482.1U/mL，具有较高的酶活力。
酶活定义：在1min内催化产生1μmol/L对硝基酚的量定义为一个酶单位。
3.β-葡萄糖苷酶的酶学性质的测定：β-葡萄糖苷酶制剂，按pNPG测定方法，其他条件不变情况下，调节不同pH缓冲液、不同温度、不同乙醇浓度进行酶活测定反应，以测得最高酶活为100％，该条件为测得β-葡萄糖苷酶最适反应条件；稳定性研究：调节不同pH缓冲液、不同温度、不同乙醇浓度条件下，酶制剂保存1h后进行酶活测定，以测得最高酶活为100％，为测得β-葡萄糖苷酶的pH、温度稳定性结果。
结果表明，本发明的肉座菌(Hypocrea sp.)W63产的β-葡萄糖苷酶的最佳反应pH为4.8，且在pH4.8的条件下保持酶活稳定(如图3所示)，最适反应温度为65℃(如图4所示)；耐乙醇浓度高达30％，其中乙醇浓度为10％对酶活力有较明显的促进效果(如图5所示)。目前已经报道的β-葡萄糖苷酶，酶活一般不超过300U，其最适反应温度一般在50℃，在乙醇浓度8％以下会对β-葡萄糖苷酶酶活有促进作用，但随着乙醇浓度的增加，就会对β-葡萄糖苷酶的酶活产生抑制作用。因此，本发明的肉座菌Hypocrea sp.W63所产的β-葡萄糖苷酶与现有报道中的β-葡萄糖苷酶具有明显的区别，是一种新型的嗜温、耐乙醇的β-葡萄糖苷酶。该β-葡萄糖苷酶具有较强的嗜温、耐温、耐乙醇性能，尤其适合应用于木质纤维素原料的同步糖化发酵应用中。
实施例3：β-葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵
1.底物：气爆秸杆粉碎至60目，105℃烘干至恒重。
2.酵母菌用YPD液体培养基30℃培养24h活化。
3.向反应体系加入纤维素酶30FPU/g底物酶量，50℃预水解24h。
4.再加入实施例2的β-葡萄糖苷酶制剂30FPU/g底物到反应体系中，按5％(v/v)的接种量接种活化后的酵母至反应体系中，37℃发酵，以接种酵母时计为0h，于0，4，8，12，24，48，96，120h定点取样，HPLC检测乙醇、还原糖含量。
上述的反应体系为：500mL摇瓶中装反应液200mL，该反应液中含有气爆秸秆20g、无机盐成分((NH4)2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.025g/L)，酵母膏1.0g/L，余量为pH 4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
以不加本发明的β-葡萄糖苷酶制剂作为阴性对照，和添加商业生产的β-葡萄糖苷酶(购自sigma公司)作为阳性对照，研究肉座菌Hypocrea sp.W63菌株所产β-葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵的效果。
结果如图6所示，筛选所得肉座菌Hypocrea sp.W63菌株产β-葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵中，发酵至120h得乙醇最高产量，所产乙醇含量高达41.25g/L，与阴性、阳性对照相比，乙醇产量提高近2倍。由此可见本发明肉座菌Hypocrea sp.W63菌株所产的β-葡萄糖苷酶性质均有利于纤维素同步糖化发酵应用，能有效消除终端产物抑制。并且该菌株所产的β-葡萄糖苷酶酶活力较高，应用于同步糖化发酵过程具有明显的促进效果，对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。
上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (2)
1.一种肉座菌（Hypocrea sp.）W63，其保藏号为：CGMCC No.5209。
2.权利要求1所述的肉座菌（Hypocrea sp.）W63在生产β-葡萄糖苷酶上的应用。
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