CN102559500A

CN102559500A - 一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法

Info

Publication number: CN102559500A
Application number: CN2011104487357A
Authority: CN
Inventors: 樊明涛; 张国强
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: CN102559500B

Abstract

本发明涉及一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，该方法将酒酒球菌菌株经过富集培养至稳定前期，离心收集得菌泥，重悬于加入胁迫处理液的ATB培养基中，25℃条件下静置2h～3h，离心，收集菌体，在菌体中再加入适量的质量浓度为2％～5％的谷氨酸钠溶液作为冻干保护剂进行冷冻干燥，得冻干菌粉。该方法得到的冻干菌粉可作为直投式酒酒球菌发酵剂。本发明引入了胁迫预处理的思路，而且用谷氨酸钠作冻干保护剂，其作为味精的主要成分对人畜安全无害并具有多种保健作用，这一思路可以用于直接食用发酵剂的制作过程。

Description

一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法

技术领域

本发明属于葡萄酒冻干发酵剂、乳酸菌制品生产技术领域，具体涉及一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法。

背景技术

近年来，我国葡萄酒产量保持着强劲的增长势头，但葡萄酒行业所使用的苹果酸-乳酸发酵剂全部依赖国外进口，费用每年高达约六千万元人民币，并且随着葡萄酒产量的逐年增加，此项费用仍会进一步扩大。为了能够有效的控制苹果酸-乳酸发酵(MLF)，直投式乳酸菌发酵剂的生产和使用已引起了葡萄酒微生物工作者的广泛关注。

直投式发酵剂是指发酵活力强，活菌数高，在接种葡萄酒时可以直接使用，无须中间继代培养的一种安全高效的生物制品。制备直投式发酵剂的主要方法是冷冻干燥，然而冷冻干燥会对乳酸菌造成损伤，致使菌体冻干存活率降低，对生产十分不利。

另外，酒精发酵结束后的葡萄酒生境恶劣复杂，在人工直接接种的情况下，往往会造成菌体的大量死亡，而无法成功的启动MLF。根据相关文献报道，究其原因有两方面，一是实验室培养获得的菌体失去了对葡萄酒环境的天然抗性，造成接种存活率下降；二是菌体在冷冻干燥过程中受到损伤，导致冻干后存活细菌数减少。因此，制备高效的直投式葡萄酒乳酸菌发酵剂，除保证菌体的高密度培养外，更需注重培养条件对菌体接种存活率和冻干存活率影响的研究。那么怎样才能提高酒酒球菌发酵剂的存活率呢？有文献研究标明，酒酒球菌存在着胁迫交叉保护能力，即在给定胁迫的条件下进行培养，所得的菌体能增强对其他胁迫的抗性，这是由酒酒球菌本身的生理特性决定的。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种通过胁迫预处理从而提高酒酒球菌冻干存活及其发酵活性的方法。该方法不仅提高了酒酒球菌冻干存活率，增强了苹果酸乳酸发酵性能，而且明显改善了葡萄酒的口感和风味。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，其特征在于，该方法将酒酒球菌菌株经过富集培养至稳定前期，离心收集得菌泥，重悬于加入胁迫处理液的ATB培养基中，25℃条件下静置2h～3h，离心，收集菌体，在菌体中再加入适量的质量浓度为2％～5％的谷氨酸钠溶液作为冻干保护剂进行冷冻干燥，得冻干菌粉。

上述酒类酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD-2a，保藏号：CGMCC NO.0715。

上述离心收集条件为离心力为4000×g～6000×g，时间5min～15min，4℃离心。

所述的胁迫处理液为含有质量浓度为8％～10％乙醇的ATB培养基，或用盐酸调节ATB培养基的pH值至3.2-3.5，胁迫处理时间为2h～3h。

本发明的利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，所带来的技术效果是：

1、通过合适的胁迫预处理提高了酒酒球菌冻干存活率，谷氨酸钠用作冻干保护剂，其作为味精的主要成分对人畜安全无害并具有多种保健作用，采用该方法生产的冻干粉可作为直投式发酵剂，应用于葡萄酒的苹果酸乳酸发酵。

2、明显提高葡萄酒酿造过程中苹果酸乳酸发酵性能，可在20天内完成降酸过程，并显著增加葡萄酒的口感和风味。

3、操作简单、快捷，工艺合理，具有较强的工业化实施性。

具体实施方式

在以下的描述中，所述的ATB培养基为本领域已知的培养基，例如，中国专利(专利号：ZL 02123444.2)中所述的ATB培养基。

所用酒类酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD-2a(已于2002年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.0715)。

按照本发明的技术方案，一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，包括如下步骤：

1、菌泥收集与胁迫处理液制备

将冷冻保藏的酒酒球菌菌株转接至ATB培养基中，在25℃条件下活化7天，然后在同样的培养基中，再转接2次，每次分别培养80h。将第三次培养好的菌悬液，离心得菌泥。在制备的新鲜ATB培养基中加入一定量的乙醇或盐酸，即为胁迫处理液。

所用酒类酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD-2a(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.0715)，收集处于稳定前期的菌体，离心力为4000×g～6000×g，时间5-15min，4℃离心。胁迫处理液为新鲜配制的ATB培养基，加入乙醇，使乙醇的终浓度为8-10％；或者用盐酸调节pH为3.2-3.5。

2、保护剂选择

申请人选用多种食品级保护剂进行菌体冻干存活率的研究，经实验表明，最佳保护剂为2.5％谷氨酸钠。

保护剂	冻干存活率(％)
		10％葡萄糖	39.8±2.6
10％果糖	36±2.2
		10％麦芽糖	50.1±1.6
10％乳糖	58.9±1.8
		10％蔗糖	50.8±1.2
10％海藻糖	60.9±3.2
		10％葡萄聚糖	47.2±2.6
2.5％谷氨酸钠	69.5±2.7

[0024]

5.0％山梨糖醇	22.7±1.8
		5.0％甘露醇	18.7±1.9
ATB培养基	45.5±2.3

3、胁迫处理

在菌泥中加入胁迫处理液，25℃进行胁迫处理。胁迫处理时间为2-3h。

4、冷冻干燥

选用质量浓度为2.5％谷氨酸钠作为保护剂，与菌体混匀后室温静置20min～30min，放入真空冷冻干燥仪中冻干，复水后测定冻干存活率。在实验过程发现，为当胁迫处理液为ATB培养基中的乙醇终浓度为8-10％或者ATB培养基的pH3.2～3.5，胁迫处理2h～3h时，可以得到良好的冻干存活率。

5、发酵活性测定

经HPLC测定分析，经胁迫处理后的酒酒球菌冻干粉加入到葡萄酒中进行苹果酸乳酸发酵，与对照相比很明显缩短了MLF的时间，由原来的1～2个月缩短到15天～20天。

本发明引入了胁迫预处理的思路，胁迫预处理迫使菌体细胞及早启动防御机制，并修复受损细胞，所以能提高酒酒球菌冻干活性。将谷氨酸钠作为冷冻干燥保护剂，能够显著提高冷冻干燥过程中酒酒球菌细胞的存活率，经胁迫处理后的酒酒球菌冻干粉加入到葡萄酒中进行苹果酸乳酸发酵，与普通冷冻干燥冻干粉相比很明显缩短了苹果酸乳酸发酵的时间。而且用谷氨酸钠作冻干保护剂，其作为味精的主要成分对人畜安全无害并具有多种保健作用，这一思路可以用于直接食用发酵剂的制作过程。

以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，本发明不限于这些实施例。

实施例1：

将1000ml生长至稳定前期的酒酒球菌菌体在6000×g，4℃条件下离心10min，弃其上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥，在菌泥中加入100ml的ATB培养基，用盐酸调节ATB培养基的pH值至3.5，充分混匀，25℃静置2h。

将胁迫处理后的菌体以同样的条件离心后，生理盐水洗涤后收集菌泥，在菌泥中加入100ml的质量浓度为2.5％的谷氨酸钠溶液，混匀，室温静置20min后放入真空冷冻干燥仪中冻干28h，得冻干菌粉。

在冻干菌粉中加入100ml的ATB培养基复水后，平板菌落计数法计活菌数，普通冷冻干燥后的冻干菌粉中，酒酒球菌的活菌数为1.12×10¹⁰cfu/ml，而pH3.5的ATB培养基胁迫2h后再冻干的活菌数为1.26×10¹⁰cfu/ml。

将冻干菌粉复水后投入到1000ml酒精发酵结束后的葡萄酒中进行降酸，普通冷冻干燥后酒酒球菌冻干粉降酸完成时间为46天，而pH3.5的ATB培养基胁迫2h后的冻干菌粉完成降酸时间为20天。

实施例2：

将1000ml生长至稳定前期的酒酒球菌菌体在3000×g，4℃条件下离心15min，弃其上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥，在菌泥中加入100ml的含乙醇浓度为8％的ATB培养基，充分混匀，25℃条件下静置2.5h。

将胁迫处理后的菌体以同样的条件离心后，生理盐水洗涤后收集菌泥，菌泥中加入50ml的质量浓度为2.5％的谷氨酸钠溶液，混匀，室温静置30min后，放入真空冷冻干燥仪中冻干25h，得冻干菌粉。

在冻干菌粉中加入50ml的ATB培养基复水后，平板菌落计数法计活菌数，普通冷冻干燥后的冻干菌粉中，酒酒球菌的活菌数为2.24×10¹⁰cfu/ml，而乙醇浓度为8％的ATB培养基胁迫2.5h后冻干菌粉活菌数为2.55×10¹⁰cfu/ml。

将冻干菌粉复水后投入到500ml酒精发酵结束后的葡萄酒中进行降酸，普通冷冻干燥后酒酒球菌冻干粉降酸完成时间为40天，而乙醇浓度为8％的ATB培养基胁迫2.5h后的冻干菌粉完成降酸时间为16天。

实施例3：

将500ml生长至稳定前期的酒酒球菌菌体在3000×g，4℃离心10min，弃其上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥，在菌泥中加入100ml的含乙醇浓度为10％的ATB培养基，充分混匀，25℃静置2h。

将胁迫处理后的菌体以同样的条件离心后，生理盐水洗涤后收集菌泥，加入50ml 5％的谷氨酸钠溶液，混匀，室温静置30min后，放入真空冷冻干燥仪中冻干25h，得冻干菌粉。

在冻干菌粉中加入50ml的ATB培养基复水后，平板菌落计数法计活菌数，普通冷冻干燥后的冻干菌粉中，酒酒球菌的活菌数为1.12×10¹⁰cfu/ml，乙醇浓度为10％的ATB培养基胁迫2h后活菌数为1.3×10¹⁰cfu/ml。

将冻干菌粉复水后投入到1000ml酒精发酵结束后的葡萄酒中进行降酸，普通冷冻干燥后酒酒球菌冻干粉降酸完成时间为43天，而乙醇浓度为10％的ATB培养基胁迫2h后的冻干粉完成降酸时间为18天。

Claims

1.一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，其特征在于，该方法将酒酒球菌菌株经过富集培养至稳定前期，离心收集得菌泥，重悬于加入胁迫处理液的ATB培养基中，25℃条件下静置2h～3h，离心，收集菌体，在菌体中再加入适量的质量浓度为2％～5％的谷氨酸钠溶液作为冻干保护剂进行冷冻干燥，得冻干菌粉。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酒酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD-2a，保藏号：CGMCC NO.0715。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心收集条件为离心力为4000×g～6000×g，时间5min～15min，4℃离心。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胁迫处理液为含有质量浓度为8％～10％乙醇的ATB培养基，或用盐酸调节ATB培养基的pH值至3.2-3.5，胁迫处理时间为2h～3h。

5.权利要求1所述方法，制得的冻干菌粉用于葡萄酒的苹果酸乳酸发酵的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的冻干菌粉能够在20天内完成葡萄酒的苹果酸乳酸发酵。