CN102551661B - 一种荧光光谱内窥成像方法及*** - Google Patents

Abstract

本发明适用于光电检测领域，提供了一种荧光光谱内窥成像方法及***，所述荧光光谱内窥成像方法包括以下步骤：产生激发光；将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；调整所述多个子光束，使各子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品的子区域；利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像。本发明由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品光谱分辨的荧光图像，时间短、速度快，对生物体损伤小，有利于生物医学的研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。

Description

一种荧光光谱内窥成像方法及***

技术领域

本发明属于光电检测领域，尤其涉及一种荧光光谱内窥成像方法及***。

背景技术

荧光显微技术已经成为生命科学，尤其是细胞生物学研究的重要工具。多光子激发荧光显微技术具有对生命体的杀伤作用小，穿透深度大，具有层析能力等优点，已经成为生命科学研究的重要手段。荧光光谱图像能够为生物医学检测和分析提供结构和功能信息。

近年来，随着新型光纤和微制造技术的迅猛发展，光纤双光子荧光显微镜和内窥镜的研究使双光子荧光显微成像技术在活体的内部器官和活体动物中的研究成为可能。目前双光子荧光光谱内窥显微技术已经引起了国际上的高度重视，针对这一课题做出了大量的研究成果，在内窥***设计、扫描机制、光学传导和高数值孔径的微物镜及其应用等方面取得了很多研究成果。受到活体内窥应用条件限制，成像时间不宜过长。然而目前荧光光谱内窥成像的速度慢，效率低，耗时长，对生物体造成极大的影响。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种荧光光谱内窥成像方法，旨在解决现有荧光光谱内窥成像速度慢、效率低的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种荧光光谱内窥成像方法，包括以下步骤：

产生激发光；

将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；

调整所述多个子光束，使各子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品的子区域；

利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像。

本发明实施例的另一目的在于提供一种荧光光谱内窥成像***，所述***包括：

激发光源，用于产生激发光；

分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；

柔性介质，用于调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内；

聚焦元件，用于使各子光束聚焦于所述样品的子区域；

扫描元件，用于利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

双色镜及传像介质，用于将所述荧光从所述生物体内导出；

色散元件，用于使所述荧光沿光谱方向展开；

探测器，用于实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像；

所述双色镜设于所述扫描元件与聚焦元件之间。

本发明实施例将激发光分为与样品多个子区域一一对应的多个子光束，使该多个子光束传导至生物体内，各子光束聚焦于样品的子区域，形成多点激发荧光，导出荧光并将其沿光谱方向展开，由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品光谱分辨的荧光图像，时间短、速度快，对生物体损伤小，有利于活体和在体研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像方法的实现流程图；

图2是本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像***的结构及其光路图；

图3a是扫描元件对样品进行线扫描的位置图；

图3b是与图3a对应的光谱分辨的荧光图像；

图4a是扫描元件对样品进行线扫描的另一位置图；

图4b是与图4a对应的光谱分辨的荧光图像。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例将激发光分为与样品多个子区域一一对应的多个子光束，使该多个子光束传导至生物体内，各子光束聚焦于样品的子区域，形成多点激发荧光，导出荧光并将其沿光谱方向展开，由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品光谱分辨的荧光图像，时间短、速度快，对生物体损伤小，有利于活体和在体研究。

本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像方法包括以下步骤：

产生激发光；

将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；

调整所述多个子光束，使各子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品的子区域；

利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像。

本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像***包括：

激发光源，用于产生激发光；

分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；

柔性介质，用于调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内；

聚焦元件，用于使各子光束聚焦于所述样品的子区域；

扫描元件，用于利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

双色镜及传像介质，用于将所述荧光从所述生物体内导出；

色散元件，用于使所述荧光沿光谱方向展开；

探测器，用于实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像；

所述双色镜设于所述扫描元件与聚焦元件之间。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细描述。

图1示出了本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像方法的实现流程，详述如下：

在步骤S101中，产生激发光；

本发明实施例优选工作频率为76MHz，周期为120fs，中心波长为800nm的飞秒(超短)脉冲激光作为激发光，此激发光可实现荧光物质的双光子激发。通常，对脉冲激光进行扩束准直并调整其强度分布，形成强度均匀分布的平顶光束。

在步骤S102中，将激发光分为多个子光束，多个子光束对应于样品的多个子区域，样品内分布有荧光物质；

本发明实施例将强度均匀分布的激发光分为多个子光束，该多个子光束一一对应于具有荧光物质的样品的多个子区域。

在步骤S103中，调整多个子光束，使各子光束传导至生物体内并聚焦于样品的子区域；

本发明实施例使多个子光束并行传导至生物体内，各自聚焦于样品的子区域。具体地，先使多个子光束耦合进入柔性介质，多个子光束经由柔性介质并行进入生物体内，于生物体内多个子光束经聚焦形成激发光阵列点分别投射至与之对应的子区域。其中柔性介质为光子晶体光纤阵列，其输入端位于生物体外，输出端位于生物体内。

多个子光束耦合进入柔性介质之前，需对各个子光束进行准直，使各个子光束成为平行光。多个子光束从柔性介质输出之后，亦需对其进行准直，便于各子光束聚焦于与之对应的样品子区域。

在步骤S104中，利用多个子光束对样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

本发明实施例将扫描分为线扫描和步进扫描，具体过程如下：

1、线扫描

多个子光束经聚焦形成激发光阵列点投射至样品，沿样品纵向对各子区域进行线扫描，各子区域内的荧光物质在激发光阵列点的作用下发出荧光。此线扫描的速度快、时间短。

2、步进扫描

对各个子区域纵向的线扫描结束后，沿样品横向对各个子区域进行步进扫描即调整激发光阵列点在样品横向的位置。

循环执行上述线扫描和步进扫描，直至完成对样品各个子区域的扫描。应当理解，具体实施时还可以调换线扫描与步进扫描的方向。

在步骤S105中，实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像。

本发明实施例对样品各子区域扫描的同时，采集各子区域内荧光物质发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像。具体地，先导出各子区域内荧光物质发出的荧光，接着将荧光沿其光谱方向展开，然后采集光谱分辨的荧光信息，生成荧光图像。

本领域的普通技术人员应当理解，实现上述实施例方法中的全部或部分步骤可以通过程序来指令相关的硬件完成，该程序可以存储于一计算机可读取存储介质中，如ROM/RAM、磁盘、光盘等。

图2示出了本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像***的结构，为了便于说明，仅示出了与本发明实施例相关的部分。

本发明实施例提供的荧光光谱内窥成像***具有一激发光路和一探测光路。激发光路包括激发光源、扩束准直装置、整形器、分光器、准直透镜、第一耦合透镜、光子晶体光纤阵列、第一自聚焦透镜、扫描元件以及微物镜。探测光路包括微物镜、双色镜、第二自聚焦透镜、传像光纤束、第二耦合透镜、滤光元件、纠偏元件、色散元件、成像透镜以及探测器。其中微物镜为激发光路和探测光路所共用。

以下对激发光路的结构进行详细说明。

如图2所示，本发明实施例优选钛宝石飞秒激光器1作为激发光源，其可产生中心波长为800nm、频率为76MHz、周期为120fs的脉冲激光，该脉冲激光可实现荧光物质的双光子激发。脉冲激光经由扩束准直装置2变成所需尺寸的准直光。

本发明实施例中，整形器为光束整形器3，准直的脉冲激光经光束整形器3整形，形成强度均匀分布的平顶光束。分光器可为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器，本实施例优选微透镜阵列4，平顶分布的脉冲激光经微透镜阵列4被分成多个子光束，多个子光束对应样品12的多个子区域，本实施例中微透镜阵列4为3×3微透镜阵列即微透镜阵列具有九个微物镜。

其中准直透镜5的后焦面与微透镜阵列4的前焦面重合，子光束在微透镜阵列4的前焦面即在准直透镜5的后焦面聚焦，各子光束经准直透镜5均变为平行光的子光束。

上述多个子光束经第一耦合透镜6聚焦耦合进入光子晶体光纤阵列7。光子晶体光纤阵列7由多根光子晶体光纤等间距排列形成，光子晶体光纤的个数及其排列方式与微透镜阵列4的相同。多个子光束经光子晶体光纤阵列7传导至生物体内，从光子晶体光纤阵列7出射的多个子光束经第一自聚焦透镜8投射至扫描元件9。自聚焦透镜为折射率沿径向渐变的棒透镜，各子光束经第一自聚焦透镜8均变为平行光。各子光束经扫描元件9投射至具有荧光物质的样品12，样品12与扫描元件9之间设有起会聚作用的微物镜11。所述扫描元件9优选为MEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems，微机电***)扫描镜，MEMS扫描镜为二维扫描镜，即可对样品进行线扫描及步进扫描。多个子光束经扫描元件9对样品进行二维扫描，具体过程如下：

1、线扫描

多个子光束经微物镜11聚焦形成激发光阵列点投射至样品，沿样品12纵向对各子区域进行线扫描，各子区域内的荧光物质于激发光阵列点的作用下发出荧光形成荧光点阵，经扫描元件9线扫描即形成荧光线阵。此线扫描的速度快、时间短。

2、步进扫描

对各个子区域纵向的线扫描结束后，沿样品横向对各个子区域进行步进扫描即调整激发光阵列点于样品横向的位置。

循环执行上述线扫描和步进扫描，直至完成对样品各个子区域的扫描。应当理解，具体实施时还可以调换线扫描与步进扫描的方向。

各子光束经本激发光路传导后形成激发光阵列点投射于样品12的子区域，激发样品12内的荧光物质发出荧光。与此相对应地，该荧光亦具有多个子光束。扫描元件9进行线扫描的同时，由探测器20采集光谱分辨的荧光信息，生成荧光图像。该光谱分辨的荧光信息包括荧光的强度信息、光谱信息及其于样品中的位置信息。

以下对探测光路的结构进行详细说明。

本发明实施例探测光路中双色镜10设于扫描元件9与微物镜11之间，双色镜10对中心波长为800nm的脉冲激光高透，对波长为400～700nm的荧光高反，双色镜10与荧光之间的夹角为45°或135°。上述荧光由微物镜11收集，形成多束准直的荧光子光束，双色镜10将各荧光子光束从激发光路反射出来，经第二自聚焦透镜13聚焦于传像光纤束14的体内端。各荧光子光束由传像光纤束14从生物体内导出，经第二耦合透镜13转化成多路平行光，由滤光元件16滤除激发光及其它杂散光，经纠偏元件17(如扫描镜)投射至色散元件18，色散元件18将多束荧光子光束沿光谱方向展开形成光谱分辨的多线阵列，再由成像透镜19聚焦于探测器20的敏感面，记录光谱分辨的多线阵列的荧光强度信息，生成光谱分辨的荧光图像。

其中样品12内激发光阵列点的焦平面与传像光纤束14的体内端面互为共轭面，传像光纤束14的体外端面与探测器20的敏感面互为共轭面，也就是说从样品12不同位置激发出的荧光点阵经微物镜11和第二自聚焦透镜13聚焦到传像光纤束14体内端面的对应位置，经传像光纤束14传至其体外端面的对应位置，由色散元件18将荧光点阵沿光谱方向展开形成光谱分辨的荧光强度分布，再由成像透镜19聚焦到探测器20的对应位置。这样探测器20即可对样品12发出的荧光进行光谱探测，生成光谱分辨的荧光图像。

本发明实施例中，探测器20为用于生成光谱分辨的荧光图像的面阵探测器，面阵探测器优选为CCD相机或CMOS相机。面阵探测器与计算机21连接，计算机21用于存储、处理和读取探测器20所探测的光谱分辨的荧光图像，且由计算机21控制面阵探测器的曝光。

上述光谱方向与扫描元件9的扫描方向垂直，即如果扫描方向为X方向，则光谱方向应为Y方向。扫描元件9一开始线扫描，探测器20即开始曝光；扫描元件9线扫描使样品12产生了荧光线阵；扫描元件9对样品12完成一次线扫描时，探测器20一次曝光结束，此时记录一幅光谱分辨的荧光图像，该荧光图像对应于样品多条线位置，探测器20由此记录了样品12多条荧光线的信息，如图3a和图3b所示。之后，扫描元件(MEMS扫描镜)9沿另一方向Y+步进一个像素，纠偏元件17相应地沿Y-方向步进一个像素，使荧光线阵于探测器20的位置不变。然后，扫描元件(MEMS扫描镜)9开始重复上述线扫描过程，探测器20亦开始重复上述曝光过程，扫描元件(MEMS扫描镜)9对样品12线扫描完成，同时探测器20曝光结束，记录另一幅光谱分辨的荧光图像，该图像对应于样品12内另一组多条线位置，如图4a和图4b所示。重复上述过程，直至激发光阵列点扫描完整个样品12为止。至此，获取了样品12内所有点光谱分辨的荧光图像，通过算法重构即可获得样品12光谱分辨的荧光信息。

当扫描元件(MEMS扫描镜)9沿另一方向Y+步进一个像素时，可使探测器20相应地沿Y-方向步进一个像素，以使荧光线阵于探测器20的位置不变，即可省却纠偏元件17，简化荧光光谱内窥成像***，提高精度，节约成本。

本发明实施例将激发光分为与样品多个子区域一一对应的多个子光束，使该多个子光束传导至生物体内，各子光束聚焦于样品的子区域，形成多点激发荧光，导出荧光并将其沿光谱方向展开，由多个子光束对样品进行二维扫描，从而获取整个样品光谱分辨的荧光图像，时间短、速度快，对生物体损伤小，有利于活体和在体研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光光谱内窥成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

产生激发光；

将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；

调整所述多个子光束，使各子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品的子区域；

利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光，其中各子光束经MEMS扫描镜对所述样品进行扫描；

实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像，其中所述荧光先由微物镜收集，形成多束准直的荧光子光束，再由双色镜将各荧光子光束从激发光路反射出来，经第二自聚焦透镜聚焦于传像光纤束的体内端，所述样品内激发光阵列点的焦平面与传像光纤束的体内端面互为共轭面，所述传像光纤束的体外端面与探测器的敏感面互为共轭面；其中，所述调整所述多个子光束，使各子光束传导至生物体内并聚焦于所述样品的子区域的步骤具体为：

所述多个子光束耦合进入光子晶体光纤阵列，经由所述光子晶体光纤阵列进入生物体内，从所述光子晶体光纤阵列出射的多个子光束经第一自聚焦透镜投射至扫描元件，各子光束经所述第一自聚焦透镜均变为平行光，所述光子晶体光纤阵列由多根光子晶体光纤等间距排列形成；

于所述生物体内各平行光经微物镜聚焦形成激发光阵列点投射至所述样品。

2.如权利要求1所述的荧光光谱内窥成像方法，其特征在于，所述扫描分为线扫描和步进扫描，所述利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光的步骤具体为：

各子光束沿所述样品纵向线扫描对应子区域，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

所述线扫描结束后，沿所述样品横向对对应子区域进行步进扫描，即调整各子光束于所述样品横向的位置；

循环执行所述线扫描和步进扫描，直至完成对各个子区域的扫描。

3.如权利要求1所述的荧光光谱内窥成像方法，其特征在于，所述实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像的步骤具体为：

导出各子区域内荧光物质发出的荧光；

将所述荧光沿光谱方向展开；

实时采集光谱分辨的荧光信息，生成荧光图像。

4.如权利要求1所述的荧光光谱内窥成像方法，其特征在于，所述产生激发光的步骤之后还包括以下步骤：

对所述激发光进行扩束准直；

调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均匀；

所述实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像的步骤之前还包括以下步骤：

调整所述荧光，使所述荧光于探测器的位置不变。

5.一种荧光光谱内窥成像***，其特征在于，所述***包括：

激发光源，用于产生激发光；

分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域，所述样品内分布有荧光物质；

柔性介质，用于调整所述多个子光束，使所述多个子光束传导至生物体内；

聚焦元件，用于使各子光束聚焦于所述样品的子区域；

扫描元件，用于利用所述多个子光束对所述样品进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；

双色镜及传像介质，用于将所述荧光从所述生物体内导出；

色散元件，用于使所述荧光沿光谱方向展开；

探测器，用于实时采集扫描时发出的荧光，生成光谱分辨的荧光图像；

所述双色镜设于所述扫描元件与聚焦元件之间，所述柔性介质为由多根光子晶体光纤等间距排列形成的光子晶体光纤阵列。

6.如权利要求5所述的荧光光谱内窥成像***，其特征在于，所述激发光源与所述分光器之间还设有：

扩束准直装置，用于调整所述激发光的尺寸并进行准直；

整形器，用于调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均匀；

所述分光器与所述柔性介质之间还设有：

准直透镜，用于准直各子光束，使各子光束成为平行光；

第一耦合透镜，用于使各子光束耦合进入所述柔性介质；

所述柔性介质与所述扫描元件之间还设有：

第一自聚焦透镜，用于准直从所述柔性介质输出的各个子光束；

所述双色镜与所述传像介质之间还设有：

第二自聚焦透镜，用于使所述荧光聚焦于所述传像介质的体内端；

所述传像介质与所述色散元件之间还设有：

第二耦合透镜，用于准直从所述传像介质输出的荧光；

纠偏元件，用于调整所述荧光，使所述荧光于所述探测器的位置不变；

成像透镜，用于将所述荧光成像于所述探测器；

所述聚焦元件为微物镜。

7.如权利要求6所述的荧光光谱内窥成像***，其特征在于，所述分光器为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器，所述微透镜阵列的前焦面与所述准直透镜的后焦面重合，所述传像介质为传像光纤束。

8.如权利要求7所述的荧光光谱内窥成像***，其特征在于，所述荧光由所述微物镜收集，并形成多束准直的荧光子光束；所述双色镜将所述荧光子光束从激发光路反射出来，经所述第二自聚焦透镜聚焦于所述传像光纤束的体内端。

9.如权利要求8所述的荧光光谱内窥成像***，其特征在于，所述样品内激发光阵列点的焦平面与所述传像光纤束的体外端面互为共轭面，所述传像光纤束的体外端面与所述探测器的敏感面互为共轭面。

10.如权利要求5～9中任一项所述的荧光光谱内窥成像***，其特征在于，所述扫描元件一开始线扫描，所述探测器即开始曝光；所述扫描元件对所述样品完成一次线扫描时，所述探测器一次曝光结束；所述探测器曝光一次的时间与所述扫描元件线扫描一次的时间相同。