CN101793829A - 一种荧光显微成像方法及*** - Google Patents
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Abstract
本发明适用于荧光显微成像，提供了一种荧光显微成像方法及***。本发明与现有技术的区别在于，通过分光器使激发光形成激发光阵列点，所述激发光阵列点将样品的成像视场分成多个子区域，利用线扫描方式形成多线并行激发多光子荧光，采用色散元件把荧光按不同波长区分开，由探测器并行记录荧光光谱信息，实现对样品全光谱范围内高光谱分辨的多光子荧光显微快速成像。
Description
技术领域
本发明属于荧光显微成像技术，尤其涉及一种荧光显微成像方法及***。
背景技术
荧光光谱仪已经被广泛应用于生物医学和物质相互作用研究。每一种分子或原子都有自己的光谱特征，在紫外光、可见光或者近红外光激发下，会产生可见的荧光，因此，荧光光谱可以用于物质成份和结构识别，例如，氨基酸、蛋白质、脂类和生物聚合物。其中，近红外光(700-1000nm)能够显著提高样品的荧光成像深度和空间分辨率，减少对活体样品的损伤，提供更高的图像信噪比，而且一个波长能够同时激发具有不同吸收光谱的多种荧光团。因此，双光子激发荧光测量能够为生物医学检测和分析提供高时空分辨率的功能信息，并有望在蛋白质间相互作用的研究、癌症的早期诊断和组织鉴别等生物学和临床医学领域获得重要的应用。
目前双光子激发荧光光谱测量通常是基于色散棱镜、多组干涉滤光片分光、滤光片转盘和液晶可调滤光片等结合光电倍增管或雪崩管探测器的单点扫描测量技术，需要多次重复激发以实现不同波长探测，即每获得一种波长荧光就需要激发样品一次，这样势必对样品损伤危害增大，而且前后两次测量的生理条件可能不同影响测量结果。采用多个干涉滤光片将发射荧光按波长分成多路分别探测，需要获得的光谱段越多，探测单元就越多，结构复杂。
我们已经报道了多参量多焦点荧光显微成像技术，该技术具有同时获得光谱和寿命的特点。利用针孔阵列形成阵列点并行双光子激发，荧光由自制的扫描相机记录，在扫描相机前放置色散棱镜对光谱色散，扫描相机记录的图像一维为光谱信息，另一维为荧光寿命信息，该方法图像传感器CCD相机每幅图像只能获得样品的阵列点阵位置处光谱和寿命信息，如果要获得二维样品信息，必须对各子区域内对阵列点逐点移动，并且阵列点每移动一个位置需要记录一幅图像，例如，对于512x512图像，阵列点为4x4，需要记录16384幅图像，导致成像速度慢，特别对获得生物样品影响明显。实际上，有些情况仅仅需要快速获得光谱信息，而荧光寿命信息并不重要，如多色标记、荧光比率测量等。这些情况下，需要发展快速的多光谱同时测量方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种荧光显微成像方法及***，旨在解决现有荧光显微成像方法及***光谱测量效率低的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种荧光显微成像方法，包括以下步骤：产生激发光；分光，将所述激发光分成多个子光束；调整光路，将所述多个子光束调整至并聚焦于具有荧光标记物的样品，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，所述多个子光束作用于样品，使所述荧光标记物发出荧光；扫描，各个所述子光束同时对各个子区域进行线扫描，所述线扫描结束后，调整所述多个子光束的位置，重复所述线扫描；导出所述荧光，将所述荧光从激发光路反射出来；分解所述荧光，将所述荧光按不同波长区分开；探测所述荧光，将各种不同波长的荧光会聚于探测器；读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光。
一种荧光显微成像***，包括：激发光源，用于产生激发光；分光器，用于将所述激发光分成多个子光束；第一扫描镜和第二扫描镜以及显微物镜，将所述多个子光束调整至并聚焦于具有荧光标记物的样品，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，所述多个子光束作用于样品，使所述荧光标记物发出荧光；双色镜，将所述荧光从激发光路反射出来；色散元件，将所述荧光按不同波长区分开；成像透镜，用于将各种不同波长的荧光会聚于探测器；探测器，用于探测各种不同波长的荧光；计算机，用于读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光光谱信息。
本发明通过分光器使激发光形成激发光阵列点，所述激发光阵列点将样品的成像视场分成多个子区域，利用线扫描方式形成多线并行激发多光子荧光，采用色散元件把荧光按不同波长区分开，由探测器并行记录荧光光谱信息，实现对样品全光谱范围内高光谱分辨的多光子荧光显微快速成像。此外，所述子光束进行线扫描时，对样品不同位置处荧光标记物的激发具有一定的时间间隔即引入了线内点间到达样品的时间，大大减小了由柱面镜产生的线内点间的串扰，提高了空间分辨率和图像对比度。因此，本发明对生物医学领域研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的荧光显微成像***的结构图；
图2是本发明实施例提供的荧光显微成像***的光路图；
图3a是第一扫描镜在第一个扫描周期的光谱信息；
图3b是第一扫描镜在第二个扫描周期的光谱信息。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例与现有技术的区别在于，通过分光器使激发光形成激发光阵列点，所述激发光阵列点将样品的成像视场分成多个子区域，利用线扫描方式形成多线并行激发多光子荧光，采用色散元件把荧光按不同波长区分开，由探测器并行记录荧光光谱信息，实现对样品全光谱范围内高光谱分辨的多光子荧光显微快速成像。
一种荧光显微成像方法，包括以下步骤：产生激发光；分光，将所述激发光分成多个子光束；调整光路，将所述多个子光束调整至并聚焦于具有荧光标记物的样品，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，所述多个子光束作用于样品，使所述荧光标记物发出荧光；扫描，各个所述子光束同时对各个子区域进行线扫描，所述线扫描结束后，调整所述多个子光束的位置，重复所述线扫描；导出所述荧光，将所述荧光从激发光路反射出来；分解所述荧光，将所述荧光按不同波长区分开；探测所述荧光，将各种不同波长的荧光会聚于探测器；读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光。
一种荧光显微成像***，包括：激发光源，用于产生激发光；分光器，用于将所述激发光分成多个子光束；第一扫描镜和第二扫描镜以及显微物镜，将所述多个子光束调整至并聚焦于具有荧光标记物的样品，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，所述多个子光束作用于样品，使所述荧光标记物发出荧光；双色镜，将所述荧光从激发光路反射出来；色散元件，将所述荧光按不同波长区分开；成像透镜，用于将各种不同波长的荧光会聚于探测器；探测器，用于探测各种不同波长的荧光；计算机，用于读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光光谱信息。
本发明实施例提供的荧光显微成像***具有一激发光路和一探测光路；所述激发光路包括激发光源、扩束准直装置、整形器、分光器、准直器件、第一扫描镜和第二扫描镜以及显微物镜；所述探测光路包括显微物镜、第二扫描镜、双色镜、滤光片、色散元件、成像透镜以及探测器；所述第二扫描镜以及显微物镜为激发光路和探测光路共有。
如图1和图2所示，本发明实施例激发光路中所述激发光源为钛宝石飞秒激光器101，所述钛宝石飞秒激光器101的工作频率为76MHz，其产生中心波长为800nm的脉冲激光，脉冲周期为120fs，此种激光可实现荧光标记物的双光子激发。所述扩束准直装置由扩束准直透镜102和扩束准直透镜103构成，所述扩束准直装置将所述激光的直径扩大到合适的尺寸并进行准直。所述整形器为光束整形器104，经准直的脉冲激光经所述光束整形器104整形，形成强度平顶分布的光束，经整形后所述激光的强度分布均匀。所述分光器为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器，本实施例优选微透镜阵列105，平顶分布的激光经微透镜阵列105被分成多个子光束，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，本实施例中所述微透镜阵列105为4×4微透镜阵列即所述微透镜阵列105具有16个微透镜。所述准直器件为管镜106，所述管镜106的后焦面与所述微透镜阵列105的前焦面重合，所述子光束在所述微透镜阵列105的前焦面即在所述管镜106的后焦面聚焦，各所述子光束经所述管镜106均变为平行光的子光束。所述子光束的传输光路上设有第一扫描镜107，经所述第一扫描镜107调整后的光路上设有第二扫描镜113，具有荧光标记物的样品116设在经所述第二扫描镜113调整后的光路上，所述样品116与第二扫描镜113之间设有显微物镜114，本实施例中所述显微物镜114的后焦面与所述管镜106的前焦面重合，所述子光束经本激发光路传输后于所述样品处聚焦，激发样品内的荧光标记物。
本发明实施例探测光路中所述双色镜112设于所述第一扫描镜107与第二扫描镜114之间，所述双色镜112对中心波长为800nm的脉冲激光高透，对波长为400～700nm的荧光高反，所述双色镜112与所述子光束之间的夹角为45°或135°，所述双色镜112将所述荧光从激发光路反射出来。经所述双色镜112反射后，所述荧光的传输光路上设色散元件，所述色散元件为色散棱镜或者光栅，本实施例中所述色散元件优选色散棱镜109，所述色散棱镜109将所述荧光按不同波长区分开，以便探测器识别荧光光谱信息。按不同波长区分开的荧光的传输光路上设成像透镜110，所述成像透镜110将各种不同波长的荧光按其波长和空间位置会聚于探测器；探测器为面阵探测器111，所述面阵探测器111为CCD或CMOS相机，本实施例中所述面阵探测器111优选CCD，所述面阵探测器111用于探测各种不同波长的荧光，同时记录所述荧光的空间位置。所述面阵探测器111与计算机117连接，所述计算机117用于读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光光谱信息，由所述计算机117控制所述面阵探测器111的曝光时间；所述计算机117亦可控制所述第一扫描镜107和第二扫描镜113。所述色散棱镜109与所述双色镜112之间设滤光片，所述滤光片为干涉滤光片108，所述干涉滤光片108将反射回来的激光以及其它杂散光过滤掉，避免干扰。
本发明实施例中所述面阵探测器111的曝光时间大于等于所述第一扫描镜107的一个扫描周期，所述面阵探测器111的曝光时间优选为所述第一扫描镜107扫描周期的整数倍。本实施例中开始曝光，所述第一扫描镜107作顺(逆)时针快速扫描，所述第一扫描镜107归位时作逆(顺)时针快速扫描，所述第一扫描镜107扫描时，所述第二扫描镜113必须静止，此时所述子光束对样品的子区域在垂直方向上作线扫描，图3a所示为第一扫描镜107在第一个扫描周期的光谱信息。所述第一扫描镜107完成一个周期的线扫描，所述面阵探测器111曝光结束，记录一幅图像，此时所述第二扫描镜113开始一个步进扫描，所述第二扫描镜113步进扫描的方向与所述第一扫描镜107扫描的方向相互垂直，所述第二扫描镜113完成一个步进扫描后，所述第一扫描镜107重复所述线扫描，图3b所示为第一扫描镜107在第二个扫描周期的光谱信息。通过所述第二扫描镜113的步进扫描即可实现对整个样品的扫描，获得整个样品的光谱信息。所述第一扫描镜107的扫描周期为所述第一扫描镜107作顺时针或逆时针扫描的时间的整数倍，本实施例中所述第一扫描镜107的扫描周期优选为所述第一扫描镜107作顺时针扫描与逆时针扫描的时间之和。当然所述第一扫描镜107可以完成多个扫描周期后，所述第二扫描镜113才开始一个步进扫描。
本发明同样对于512x512图像，阵列点为4x4，仅需记录128幅图像，成像速度大幅提高。此外，所述第一扫描镜107动作时，所述子光束进行线扫描时，对样品不同位置处荧光标记物的激发具有一定的时间间隔即引入了线内点间到达样品的时间，大大减小了由柱面镜产生的线内点间的串扰，提高了空间分辨率和图像对比度。本方法及***具有能够快速获得可见光波段的全部光谱信息，其光谱分辨率小于3nm，因此，该技术对生物医学领域研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种荧光显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
产生激发光；
分光，将所述激发光分成多个子光束；
调整光路，将所述多个子光束调整至并聚焦于具有荧光标记物的样品，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，所述多个子光束作用于样品，使所述荧光标记物发出荧光；
扫描，各个所述子光束同时对各个子区域进行线扫描，所述线扫描结束后，调整所述多个子光束的位置，重复所述线扫描；
导出所述荧光，将所述荧光从激发光路反射出来；
分解所述荧光，将所述荧光按不同波长区分开；
探测所述荧光，将各种不同波长的荧光会聚于探测器；
读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光。
2.如权利要求1所述的荧光显微成像方法，其特征在于，所述产生激发光的步骤之后还包括以下步骤：
调整所述激发光的尺寸并进行准直；并调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均匀。
3.如权利要求1所述的荧光显微成像方法，其特征在于，所述导出所述荧光，将所述荧光从激发光路反射出来的步骤之后还包括以下步骤：
过滤所述荧光，将杂散光去除。
4.如权利要求1所述的荧光显微成像方法，其特征在于，所述分光，将所述激发光分成多个子光束的步骤之后还包括以下步骤：
准直各个所述子光束。
5.一种荧光显微成像***，其特征在于，所述***包括：
激发光源，用于产生激发光；
分光器，用于将所述激发光分成多个子光束；
第一扫描镜和第二扫描镜以及显微物镜，将所述多个子光束调整至并聚焦于具有荧光标记物的样品，所述多个子光束对应所述样品的多个子区域，所述多个子光束作用于样品，使所述荧光标记物发出荧光；
双色镜，将所述荧光从激发光路反射出来；
色散元件，将所述荧光按不同波长区分开；
成像透镜，用于将各种不同波长的荧光会聚于探测器；
探测器，用于探测各种不同波长的荧光；
计算机，用于读取、存储和处理所述探测器探测到的荧光光谱信息。
6.如权利要求5所述的荧光显微成像***，其特征在于，所述***还包括：
扩束准直装置，用于调整所述激发光源产生的激发光的尺寸并进行准直；和
整形器，用于调整所述激发光源产生的激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均匀。
7.如权利要求5所述的荧光显微成像***，其特征在于，所述***还包括：
滤光片，用于将所述荧光中的杂散光去除。
8.如权利要求5所述的荧光显微成像***，其特征在于，所述***还包括：
准直器件，用于准直各个所述子光束。
9.如权利要求5所述的荧光显微成像***，其特征在于，所述探测器的曝光时间大于等于所述第一扫描镜的一个扫描周期，所述第一扫描镜完成一个周期的线扫描或多个周期的线扫描后，所述第二扫描镜开始一个步进扫描，所述第二扫描镜完成一个步进扫描后，所述第一扫描镜重复所述线扫描；所述第一扫描镜扫描的方向与所述第二扫描镜步进扫描的方向相互垂直；所述双色镜设于所述第一扫描镜与第二扫描镜之间，所述双色镜对所述激发光高透，对所述荧光高反。
10.如权利要求8所述的荧光显微成像***，其特征在于，所述准直器件为管镜；所述分光器为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器；所述管镜的后焦面与所述微透镜阵列的前焦面重合，或所述管镜的前焦面与所述显微物镜的后焦面重合；所述色散元件为色散棱镜或者光栅；所述探测器为面阵探测器。
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