CN1680426B - 防止抗体变性的精制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用蛋白A亲和层析色谱法的抗体的精制方法，具体而言，涉及提供一种抗体的回收率良好、并且不会发生变性的洗脱缓冲液的技术。其解决手段为，在使用蛋白A亲和层析色谱精制抗体的时候，使用pH调整至4.0～5.0的含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的微酸性缓冲液，洗脱抗体并防止回收的抗体发生变性的精制方法。

Description

防止抗体变性的精制方法
技术领域
本发明涉及一种使用蛋白A亲和层析色谱法进行精制抗体的方法，具体涉及一种洗脱缓冲液。
技术背景
抗体作为治疗药品、临床检查用试剂、研究用试剂应用极为广泛，对它的需求也日益增高。来源于微生物的Fc受体的Staphyrococcal Protein A(以下称为蛋白A)因对多种抗体的Fc区域具有极高的亲和性，因此使用将该蛋白A作为配体固定化的载体的亲和层析色谱法(称为蛋白A亲和层析色谱)已成为工业规模的抗体制造工艺的核心技术(例如，参照非专利文献1、非专利文献2)。蛋白A具有的高亲和性可提高单位时间的生产效率，并有助于对来源于原料的杂质进行高度的淘汰去除。但是，使用此蛋白A的亲和层析色谱仍残留有来源于抗体特性的问题，并对抗体制造产生了制约。本发明解决了有关该抗体特性的问题，并改善了抗体的制造使其更为稳定。
因蛋白A在中性pH下表现出对Fc区域的极高的亲和性，将含有抗体的精制原料在中性pH下装载于装填有蛋白A固定化载体的柱等等中，使用中性pH的缓冲液进行充分的洗涤将来源于原料的杂质除去后，再使用酸性pH的、具体为不到pH2.5～4的洗脱缓冲液将抗体从柱上洗脱。在酸性pH条件下洗脱的抗体中残留的来源于原料的杂质仅为数百ppm的水平，商业生产上可利用的各种蛋白A固定化载体基本上没有性能的差别(例如参照非专利文献3、4)。目前，适用于抗体的商业生产的蛋白A固定化载体可由AmershamBiosciences公司、Millipore公司、PE Biosystems公司等处购得。但是，使用这些载体进行抗体精制时都存在一个不可避免问题，那就是从载体上洗脱回收的抗体将与高度酸性的缓冲液接触，该接触将改变抗体的高级结构，进一步导致频繁地发生结合·凝集的情况。对于酸性pH引起的抗体结构的变化进行了很多研究，但仍未提出与构造变化或结合·凝集反应相关的诸多问题的解决方法。与酸性pH接触后抗体如何产生问题，主要作为实用上的问题有J.M.Sarciax等(参照非专利文献5)和M.Paborji等(参照非专利文献6)的报告。酸性pH引起抗体高级结构的改变，已被以Buchner等人进行的几个研究为代表进行了证明(参照非专利文献7、8、9)。另外，也有Vlasov等的研究(参照非专利文献10、11、12)表明，即使抗体与酸性pH环境接触一次后不发生结合·凝集而回到中性pH后，其本来的抗体结构仍不能恢复。因此，从保证抗体的品质进行精制的目的出发，与酸性pH接触决不是优选的方法，必须有一种不必与酸性pH接触的新型精制技术。
为解决上述问题，迄今为止进行了很多研究，以下对几个研究的例子进行概括，同时记载目前技术中的问题。
(1)以中性缓冲液从蛋白A上洗脱抗体的方法
R.Bywater等，根据蛋白A与抗体Fc区域的结合中有酪氨酸残基的参与的发现，使用含有酪氨酸的二肽(0.1M甘氨酰酪氨酸，pH7.0)代替酸性洗脱缓冲液可将抗体从蛋白A结合载体上洗脱回收(参照非专利文献13、14)。但是，此条件下有只能回收20～35％的抗体的限制，并不被认为是实用的方法。
B.Seed等，根据蛋白A与抗体Fc区域的结合中有组氨酸残基的参与的发现，使用不是组氨酸本身，但相当于该残基的咪唑溶液(1～5M、pH6～9)代替酸性洗脱缓冲液将抗体从蛋白A结合载体上洗脱回收(参照专利文献1)。但是，此技术需要1～5M(充分的回收需要3M或3M以上)的高浓度的咪唑进行洗脱。咪唑在其他的精制方法中，例如为精制结合有组氨酸标记的融合蛋白的金属螯合亲和层析色谱法中，也作为洗脱缓冲液使用，但咪唑本身对蛋白质具有变性作用是该领域的研究者共知的常识，并不适用于作为精制抗体的洗脱缓冲液。从此方面考虑，并不能认为是实用的方法。
(2)以改变了蛋白A的氨基酸序列的人工配体进行代替使用的方法
S.Hober等在蛋白A与抗体Fc结合区域中，着眼于区域B，设计制造出改变了此B区域的一部分氨基酸序列的人工Z区域。将此Z区域作为配体固定化的载体可在中性pH条件下与抗体良好的结合，可使用pH4.5的温和的微酸性缓冲液代替酸性洗脱缓冲液，可有效的回收结合的抗体(参照非专利文献15)，但是，该Z区域在中性pH下对于抗体的亲和性比蛋白A具有的亲和性大幅降低，伴随抗体结合量的降低将产生生产效率降低的大问题。另外，亲和性的降低与原料中的杂质的淘汰去除能力的降低也有关，也留下了产品品质保持方面的问题。从此方面考虑，并不能认为是实用的方法。
M.G.Gore等，根据蛋白A与抗体Fc区域的结晶结构解析的结果，设计制造出多种将参加两分子结合的蛋白A侧的疏水性残基分别置换为组氨酸的变异蛋白A。其中，将蛋白A的21、79位残基的亮氨酸置换为组氨酸的变异体蛋白A，仅使缓冲液的pH从8降至5，便使其对抗体Fc区域的亲和性降低至原来的1/50。实际上使用pH5的温和的微酸性缓冲液代替酸性洗脱缓冲液时，可以有效地回收结合在该变异体蛋白A上的抗体(参照非专利文献16)。但是，此变异体蛋白A在pH8的条件下对抗体Fc区域的亲和性，降低至蛋白A具有的亲和性的1/5，与上述Z区域同样有生产效率和杂质淘汰率低下的大问题。从此方面考虑，并不能认为是实用的方法。
(3)使用有机化学制造的配体代替蛋白A的方法
E.Boschettir等，设计了一种与蛋白A无关、伴随pH的变化改变疏水性的化合物，该化合物对于Fc区域表现出pH依存性的变化的亲和性，并开发出将该化合物作为配体进行结合的精制抗体用载体(参照非专利文献17)。此载体可作为MEP HYPERCEL从BIOSEPRA公司购得。该载体中，可使用更温和的微酸性缓冲液(pH4～5)代替酸性洗脱缓冲液回收结合在其上的抗体，但是其pH依存性的亲和性变化没有蛋白A那么激烈，不能以浓缩的形式对抗体进行洗脱和回收。另外，结合的选择性比蛋白A大大降低，不能对来源于原料的杂质进行高度的去除。虽然设定适合精制原料的特别洗涤条件(使用有机酸等)可以改善精制效果，但即便如此，与蛋白A的精制效果相比还是相去甚远，因此并没有在工业生产上使用其来代替蛋白A。
L.R.Dowd等设计了一种模仿蛋白A对抗体Fc区域的结合部分的肽，并发展此结构，制造了一种可完全以有机化学方法合成的蛋白A模仿配体(
Figure G2005100046699D00031
；参照非专利文献18)。结合与此合成配体的抗体，通常在10mM柠檬酸钠、pH3.0的条件下进行洗脱和回收，但在聚乙二醇的共存下也可以使用中性缓冲液。但是，由于它的结合选择性比蛋白A大大降低，对来源于原料的杂质的淘汰能力完全比不上蛋白A。与上述MEP Hypercel同样，由于这些配体的首要目的是以不使用蛋白性质配体的蛋白A进行开发的，因此不可避免其精制效率、杂质淘汰能力的低下。这些合成的配体在工业生产上仍未代替蛋白A进行使用，也不是作为解决酸性洗脱缓冲液带来的问题的合适的手段。
(4)使用蛋白A和酸性缓冲液，并稳定抗体的方法
如上所述，提出有效替代蛋白A和酸性洗脱缓冲液的精制抗体的方法并不容易，因此，提出了防止与酸性洗脱溶液接触后产生的抗体变性(结构变化或结合·凝集反应)的方法。
Higuchi等提出了在使用酸性洗脱缓冲液回收结合在蛋白A上的抗体后，直接在其中加入聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、或乙二醇等多元醇化合物作为稳定剂，可抑制结合·凝集反应的发生(参照专利文献2)的方法。通过此方法，虽可在与酸性缓冲液接触后在尽量短的时间内加入稳定剂以抑制结合·凝集的发生，但并不能抑制在上述酸性pH下产生的结构本身的变化。另外，对于pH的变化引起的蛋白质的变性的对策，通常认为比起通过由Higuchi等提出的一类以多元醇等稳定剂进行防止的策略，更应该防止pH的变化本身(参照非专利文献19)。因此，此技术并不能成为解决酸性洗脱缓冲液带来的问题的根本方法。
R.W.Rosenstein等提出了一种在充填了结合了蛋白A的载体的柱的后端直线连接缓冲液置换用柱，使从蛋白A上洗脱的抗体的缓冲液在极短的待机时间中被中性pH缓冲液置换的方法(参照专利文献3)。此方法虽然使接触时间变得极短，但并不能抑制抗体结构本身的变化，与上述Higuchi等的方法相同，并不能成为解决酸性洗脱缓冲液带来的问题的根本方法。
[参考文献]
[专利文献1]WO 94/07912
[专利文献2]特开平2-273194
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[非专利文献15]J.Chromatogr.76(2000)233-244
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[非专利文献17]Trends Biotechnol.20(2002)，333-337
[非专利文献18]
Figure G2005100046699D00051
：nature biotechnology16(1998)，190-195
[非专利文献19]John Carpenteret al.：PharmaceuticalResearch 14(1997)，969-975
发明内容
基于以上现有技术，为解决酸性洗脱缓冲液所带来的问题的方法概括如下。
为活用蛋白A与抗体Fc区域的高亲和性，使用蛋白A本身作为与抗体结合的配体。结合抗体后，在不会使抗体发生变性、结合·凝集反应的温和的微酸性、或中性pH缓冲液中，添加用于使蛋白A和抗体Fc之间的亲和性充分降低的抗体脱离促进剂。
即，本发明提供了一种抗体的精制方法，其中，在使用蛋白A亲和层析色谱精制抗体时，使用pH调整至4.0～5.0的含有精氨酸或/及精氨酸衍生物的微酸性缓冲液，洗脱抗体并防止回收的抗体变性。
本发明还提供了一种精制抗体的制造方法，其包含以下工序：将抗体装载于蛋白A亲和层析色谱柱的工序；使装载于该柱上的抗体，与pH调整至4.0～5.0的含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的缓冲液接触，使该抗体从柱上洗脱的工序；以及回收精制抗体的工序。
本发明使抗体从蛋白A固定化载体上的洗脱·回收可以在pH4.0～5.0的微酸性精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液中进行，此采用精氨酸和/或精氨酸衍生物作为洗脱促进剂的技术，完全不会影响对于中性条件下的蛋白A的抗体的亲和性，因此完全保留了蛋白A具有的高精制效率和对杂质的淘汰能力。
在洗脱中使用的精氨酸和/或精氨酸衍生物不会引起抗体高级结构的不稳定，因此，可以防止抗体变性的发生。另外，精氨酸和/或精氨酸衍生物可通过脱盐等操作容易的与抗体分离。
附图说明
[图1]表1(实验条件1～4)的回收抗体的凝胶过滤HPLC
以表1的实验条件1～4回收的抗体(18μg)以文中的条件进行凝胶过滤HPLC分析。横轴表示保留时间(分)。实验条件2的下方表示仅分析洗脱缓冲液的分析结果(空白对照)。在保留时间24分钟附近的峰是因洗脱缓冲液引起的。
精制抗体标准品色谱图上粗箭头所示的峰为抗体。而细箭头所示位置为抗体的结合·凝集体洗脱的位置。
[图2]表2的精氨酸洗脱缓冲液中使用的抗体的蛋白A亲和层析色谱
以表2的实验编号1、2的条件在箭头所示的位置洗脱抗体。峰下方的横线部分作为抗体组份回收，并供分析用。
[图3]表2(实验编号1、2)的回收抗体的凝胶过滤HPLC
以表2的实验编号1、2回收的抗体(18μg)以文中的条件进行凝胶过滤HPLC分析。横轴表示保留时间(分)。空白对照的结果如上所知，在保留时间24分钟附近的峰是因洗脱缓冲液引起的。
实验编号1的色谱图上粗箭头所示的峰为抗体。而细箭头所示位置为抗体的结合·凝集体洗脱的位置。
[图4]表3(实验编号1、2)的回收抗体的凝胶过滤HPLC
以表3的实验编号1、2回收的抗体(约2.5μg)以文中的条件进行凝胶过滤HPLC分析。横轴表示保留时间(分)。实线的箭头表示的峰为抗体。虚线的箭头所示的位置为抗体结合物洗脱的位置。
[图5]表4(实验编号1、2)的回收抗体的凝胶过滤HPLC
以表4的实验编号1、2、3回收的抗体(约2.5μg)以文中的条件进行凝胶过滤HPLC分析。横轴表示保留时间(分)。箭头表示的峰为抗体。实线的箭头表示的峰为抗体。虚线的箭头所示的位置为抗体结合物洗脱的位置。
[图6]参考例
将1000ml与实施例3和4同样的培养上清液装载于蛋白A层析柱上，使用与实施例3和4同样的方法对以表3(实验编号1)的洗脱条件(0.1M柠檬酸钠，pH2.9)回收的抗体进行凝胶过滤HPLC分析。实线的箭头所示的峰为抗体，虚线的箭头所示的峰为抗体结合物。
具体实施方式
本发明中使用的抗体脱离促进剂为作为天然氨基酸中的1种的精氨酸和/或对精氨酸进行化学修饰的精氨酸衍生物。精氨酸衍生物为除了精氨酸以外，乙酰精氨酸、N-丁酰精氨酸、N-新戊酰精氨酸等酰化精氨酸，除去羧基的胍基丁胺，导入羟基代替α-氨基的精氨酸等。它们可以与酸成盐的形态进行使用。作为可与它们成盐的酸有盐酸、硫酸等。作为抗体脱离促进剂，优选精氨酸衍生物，更优选酰化精氨酸，尤其优选N-丁酰精氨酸、N-新戊酰精氨酸。使用这样的抗体脱离促进剂，可以极度降低抗体发生变性、结合·凝集的危险性，因此尤其优选。
另外，含有本发明使用的精氨酸和/或精氨酸衍生物的溶液为pH4.0～5.0，优选为pH4.3～4.7的微酸性缓冲液，并可添加磷酸缓冲液等。通过使用此pH范围内的缓冲液，可以极度降低抗体发生变性、结合·凝集的危险性，因此优选。另外，pH的调节可使用盐酸或硫酸等无机酸、醋酸等有机酸等进行。
并且，精氨酸或/及精氨酸衍生物的浓度为，表现出与作为抗体的酸性洗脱缓冲液被广泛使用的pH3.5的柠檬酸钠缓冲液同样的抗体回收率、并且不会引起抗体发生结合·凝集的浓度即可，例如0.1～4.0M，优选为0.3～3.0M，更优选为1～2M精氨酸或/及精氨酸衍生物的浓度。
当然，该缓冲液中也可含有精氨酸或/及精氨酸衍生物以外的物质，只要不会阻害使用蛋白A亲和层析色谱的抗体精制即可。此类物质可举出例如氯化钠等。
另外，蛋白A层析柱可使用市售的产品，例如HiTrapr-ProteinAFF(Amersham Biosciences制)等。
另外，作为本发明使用的抗体，只要是已知可适用于蛋白A的抗体，不管其型(class)/亚型(subclass)皆可适用，结合有这些Fc区域的抗体关联蛋白质也同样可以适用。另外，无论精制原料的纯度怎样，都可以适用。例如，天然的人抗体或以基因重组法制备的人源化抗体或人类型抗体，鼠的单克隆抗体等，更具体可举出Muramomab(商品名：Orthclone OKT3)、Rituximab(商品名：Ritaxan)、Basiliximab(商品名：Simulect)、Daclizumab(商品名：Zenapax)、Palivizumab(商品名：Synagis)、Infliximab(商品名：Remicade)、Gemtuzumab zogamion(商品名：Mylotarg)、Alemtuzumab(商品名：Mabcampath)、Adalimumab(商品名：Humira)、Omalizumab(商品名：Xolair)、Vevacizumab(商品名：Avastin)、Cetuximab(商品名：Erbitux)等。产业上最为有用的人源化或人类型抗体，已知它们对蛋白A的亲和性更高，从蛋白A柱上进行洗脱需要比小鼠单克隆抗体时所要求的酸性更强的缓冲液。因此，本发明对人源化或人类型抗体可以发挥其最大的价值。
另外，目前采用的使用蛋白A精制抗体的操作条件，除上述以外，也可直接使用采用本发明的精氨酸和/或精氨酸衍生物的抗体洗脱法。
例如，将小鼠单克隆抗体溶解于含有3M NaCl的20mM甘氨酸/NaOH缓冲溶液中，或以此溶液稀释至10倍。将其装载于以相同缓冲液平衡的蛋白A层析柱中(例如HiTrapr-Protein AFF；AmershamBiosciences制)。装载可以通过使该缓冲液流过蛋白A层析柱来进行，也可使流过层析柱的该缓冲液再度流过层析柱，使层析柱上该抗体的负载量增多。使用相同缓冲液充分过柱清洗，将来源于原料的抗体以外的杂质洗掉后，以调整至pH4.0～5.0(优选为pH4.3～4.7)的0.1～3M(优选为0.3～3M，更优选为1～2M)的精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液进行过柱，回收洗脱的抗体。另外，通过本发明的方法，将回收的抗体以凝胶过滤层析色谱进行分析，得到了与天然状态的抗体相同的保留时间和相同的峰的形状的洗脱结果，并未发生抗体的高级结构变化或结合·凝集的情况。
另外，如上所述，对于本发明使用的抗体，除上述的单克隆抗体以外，天然人类抗体，或以基因重组法制备的人源化、或人类型抗体(以上总称为人抗体)的精制同样可以使用精氨酸和/或精氨酸衍生物进行实施。将溶解于磷酸缓冲液等中性pH缓冲液的，或以该溶液稀释至10倍的人抗体的溶液装载于以相同缓冲液平衡的蛋白A层析柱中(例如HiTrapr-Protein AFF；Amersham Biosciences制)。使用相同缓冲液充分过柱清洗，将来源于原料的抗体以外的杂质洗掉后，和上述小鼠单克隆抗体的精制方法同样，以调整至pH4.0～5.0(优选为pH4.3～4.7)的0.1～3M(优选为0.3～3M，更优选为1～2M)的精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液进行过柱，回收洗脱的抗体。将回收的抗体以凝胶过滤层析色谱进行分析，得到了与天然状态的抗体相同的保留时间和相同的峰的形状的洗脱结果，并未发生抗体的高级结构变化或结合·凝集的情况。另外，有报道说可保持抗体的高级结构的pH下限为4左右。
另外，普遍知道使用酸性pH的柠檬酸缓冲液等进行洗脱·回收的抗体溶液在短时间内很容易发生结合·凝集，因此建议在洗脱后立即将溶液的pH调整至中性。但是，在大规模的抗体制造中调整pH是困难的，而且也应充分预料pH调整引起的pH的急剧变化反而导致的抗体变性的危险。本发明的使用pH4.0～5.0的精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液进行抗体洗脱·回收，可解决以上酸性缓冲液具有的问题。
使用本发明的方法得到的精制抗体，可以得到癌、免疫疾病、生活习惯病等各种疾患的治疗药物、临床检查用试剂、研究用试剂。这些医药组合物可以加入至以本发明的方法得到的精制抗体中，也可含有赋形剂或载体等。
以下以实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[实施例1]
在溶解于等渗磷酸钠缓冲液中的精制后的抗血管性假血友病因子单克隆抗体(小鼠抗体，亚型IgG1：WO 96/17078)5.28mg/ml的0.57ml(抗体3mg)中，添加6.43ml含有3M NaCl的20mM甘氨酸/NaOH缓冲液，将pH调整至8.9，合计添加7ml。将此溶液以0.5ml/min的流速装载于以相同缓冲液平衡的HiTrapr-Protein AFF、1ml大小(Amersham Biosciences制)柱上，以相同缓冲液5ml过柱洗净，进行再平衡。以表1所示的洗脱缓冲液以0.5ml/min装载于此柱，脱离·洗脱的抗体以波长280nm的紫外吸收为指标进行回收。测定得到的抗体溶液的紫外吸收，1mg/ml的抗体溶液所示的吸光度为1.4，计算出蛋白质的浓度，求得本层析色谱中回收的抗体量。所有操作均在5℃下进行。
采用精氨酸或精氨酸衍生物的小鼠单克隆抗体的洗脱·回收结果，以作为抗体的酸性洗脱缓冲液常用的0.1M柠檬酸钠、pH3.5下的洗脱·回收作为比较对照，在表1中总结表示。各实验的回收率以相对于作为原料负载3mg抗体的回收组份中的抗体量的比率来表示。
如使用0.36M以上的精氨酸(L-Arginine，味之素制)，在pH4.30或pH4.30以上的微酸性pH条件下，其对小鼠单克隆抗体的回收效率完全不逊色于使用目前的酸性洗脱缓冲液。
以精氨酸洗脱·回收的单克隆抗体以凝胶过滤层析色谱(柱，Superdex 75HR 10/30，Amersham Biosciences制；洗脱液，0.2M磷酸钠缓冲液，pH4.0)分析的结果在图1中表示。仅确认精制抗体标准品的色谱图上粗箭头所示的与天然状态的抗体完全一致的峰，未发现超出分析法的检测下限(1％)的结合·凝集体(在精制抗体标准品的色谱图上细箭头所示的位置洗脱)，因此可以确认没有结构变化或结合·凝集的发生。尤其是以2M的精氨酸、pH4.7的条件下可回收小鼠单克隆抗体，意味着可以完全解决因接触酸性缓冲液伴随的结构变化的问题，并可得出这是一种极为有效的精制手段这一结论。在冷藏保存使用0.1M柠檬酸钠、pH3.5进行洗脱·回收的抗体(表1，实验编号11)，结果溶液渐渐白浊，残留于上清液的抗体量降为刚洗脱后的1/5。而另一方面，使用1M精氨酸pH4.30(表1，实验编号1)，及2M精氨酸pH4.67(表1，实验编号2)洗脱·回收的抗体即使同样的冷藏保存也不会发生白浊的现象，抗体量也无变化。这表明使用精氨酸进行抗体的洗脱·回收，其洗脱·回收后的抗体比使用柠檬酸等现有的缓冲液得到的抗体的保存性高。
与上述精氨酸的洗脱相同，使用0.36M的乙酰精氨酸(N α-Acetyl-L-Arginine，Sigma-Aldrich制)即使在pH4.35下也可以有效地回收小鼠单克隆抗体。而使用1M缺少羧基的精氨酸的胍基丁胺(Agmatine，味之素制)在pH4.32下也可以有效地回收小鼠单克隆抗体。以乙酰精氨酸、或胍基丁胺回收的单克隆抗体使用上述凝胶过滤层析色谱分析时，仅确认了与天然状态的抗体完全一致的峰，并未发现超出分析法的检测下限(1％)的结合·凝集体。综上所述，可以确认与精氨酸一样，使用精氨酸的衍生物进行抗体的洗脱·回收时，也没有发现抗体的结构变化或结合·凝集的发生。
表1.采用精氨酸、及精氨酸衍生物进行的小鼠单克隆抗体的洗脱
[实施例2]
将来源于小鼠骨髓瘤的细胞于无血清培养基中培养一周，得到含杂质的培养上清液60ml。将其以0.5ml/min的流速装载于使用等渗磷酸钠缓冲液平衡的HiTrapr-Protein AFF、1ml大小(AmershamBiosciences制)柱上，得到60ml连续组份。可将此连续组份作为完全不含有细胞产生的抗体的模型培养上清液进行操作。在60ml此模型培养上清液中添加10.5g NaCl，在5℃下静置搅拌·溶解。接着在5℃下放置30分钟，确认气泡消失后，添加3mg与实施例1中使用的同样的精制小鼠单克隆抗体(5.28mg/ml，0.57ml)，再加入1.2ml pH8.7的1M Tris HCl，静静搅拌后使用0.5M NaOH调整至pH8.9。将其0.5ml/min的流速装载于使用10ml缓冲液(20mMGly/NaOH，3M NaCl，pH8.9)平衡的HiTrapr-Protein AFF、1ml大小(Amersham Biosciences制)柱上，使用相同缓冲液洗柱直至基线恢复。然后使用表2所示的洗脱缓冲液进行洗脱，确认以实施例1同样的方法进行的单克隆抗体的回收率。从回收组分的吸光度计算出AJvW-2浓度、回收率。全部操作均在5℃下进行。
表2示出回收的结果，图2示出实际的色谱图，图3示出回收的单克隆抗体的凝胶过滤层析色谱的分析结果。各实验中的回收率以相对于作为原料负载的3mg抗体的回收组分中的抗体量的比率表示。蛋白A层析柱上装载含杂质的的抗体溶液时，也可与实施例1同样的使用含精氨酸的微酸性缓冲液进行有效的回收。如图3所示，实验编号1及2的两者中，回收的抗体组分中仅确认了实验编号1的色谱图上粗箭头所示的与天然状态的抗体完全一致的峰(参照图1、精制抗体标准品的色谱图)，没有检测出超过分析法敏感度的结合·凝集体(在实验编号1的色谱图上细箭头所示的位置洗脱)，完全避免了与酸性缓冲洗脱液接触时引起的结构变化的危险性，是极为有效的抗体精制手段。
表2.使用精氨酸从含有杂质的原料中洗脱小鼠单克隆抗体
[实施例3]
将产生人CD18(integrin β2 subunit)对应的人源化抗体6E6的基因重组CHO细胞(US 5854070；ATCC Number CRL-11398)，在添加了10％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的培养基(αMEM)中，使用培养转瓶在37℃下培养4天，得到足够高的细胞密度。然后交换至添加了2％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的新鲜培养基(味之素，ASF104)中，在37℃继续培养3天，得到含抗体的培养上清液。在32m l此培养上清液中添加1M pH8.5 TrisHCl将pH调整至7.5后，以0.4ml/min的流速装载于使用等渗磷酸缓冲液平衡的r-Protein AFF柱上(0.5cm直径×1cm长，0.2ml大小：Amersham Biosciences公司)。使用相同缓冲液洗柱直至UV吸收的基线恢复后，使用表3所示的洗脱缓冲液进行洗脱。全部操作均在5℃下进行。分别在80μl回收的组份中添加20μl pH8.5的1M TrisHCl进行中和，将其中的80μl注入凝胶过滤层析色谱柱中(柱，TSK G3000SWXL TOSOH制：洗脱液，0.1M磷酸钠，pH6.8)。得到的结果在表3和图4中表示。如表3所示，使用柠檬酸钠缓冲液和精氨酸盐酸盐缓冲液回收的人源化抗体的量大致相同。因为不清楚原料的培养上清液中含有的人源化抗体6E 6的量，因此本实验不能计算出正确的回收率，但已知两种洗脱条件具有大致相同的能力。如图4所示，以两种洗脱条件得到的组份中的抗体纯度(实线箭头所示部分为抗体)大致相等，两个峰的柱保留时间完全一致。另外，虚线箭头所示的位置为抗体结合物的洗脱位置。以蛋白A层析柱的抗体负载量少的此次为例，柠檬酸钠和精氨酸盐酸盐的双方都未产生相对于抗体的量的5％或5％以上的抗体结合物，仅在柠檬酸钠(实验编号1)中发现极少的抗体结合物峰(虚线的箭头)。以上的结果表明，使用微酸性精氨酸缓冲液可从蛋白A上有效的洗脱回收人源化抗体。
表3.通过柠檬酸钠和精氨酸的缓冲液洗脱人源化抗体
[实施例4]
三种精氨酸衍生物通过以下方法制备。
N-丁酰精氨酸(Nα-Butyroyl-L-Arginine)：将精氨酸溶解于水/2-丙醇后，将反应***调整至pH11、10～15℃。在氢氧化钠水溶液中保持pH和温度，滴加丁酰氯进行反应。反应结束后，使用阳离子交换树脂进行精制，得到白色固体。使用反相HPLC、1H-NMR确认结构和纯度。
N-新戊酰精氨酸(Nα-Pivaloyl-Arginine)：将精氨酸溶解于水/2-丙醇后，将反应***调整至pH11，10～15℃。在氢氧化钠水溶液中保持pH和温度，滴加新戊酰氯进行反应。反应结束后，使用阳离子交换树脂进行精制，得到白色固体。使用反相HPLC、1H-NMR确认结构和纯度。
L-Arginic acid：将L-精氨酸盐酸盐溶解于浓硝酸/浓盐酸(1∶2)后，60℃下加热30分钟后放冷。滤取析出的固体，溶解于水后，加热回流至原料完全消失。浓缩反应体系，对析出的固体以水进行反复的重结晶得到白色固体。使用反相HPLC、1H-NMR确认结构和纯度。
将产生人CD18(integrin β2 subunit)对应的人源化抗体6E6的基因重组CHO细胞(US 5854070；ATCC Number CRL-11398)，在添加了10％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的培养基(αMEM)中，使用培养转瓶在37℃下培养4天，得到足够高的细胞密度。然后交换至添加了2％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-LowIgG型)的新鲜培养基(味之素，ASF104)中，在37℃继续培养3天，得到含抗体的培养上清液。在48ml此培养上清液中添加1M pH8.5TrisHCl将pH调整至7.5后，以0.4ml/min的流速装载于使用等渗磷酸缓冲液平衡的r-Protein AFF柱上(0.5cm直径×1cm长，0.2ml大小：Amersham Biosciences公司)。使用相同缓冲液洗柱直至UV吸收的基线恢复后，将流速变更为0.2ml/min，使用表4所示的洗脱缓冲液进行洗脱。全部操作均在5℃下进行。分别在80μl回收的组份中添加20μl pH8.5的1M TrisHCl进行中和，将其中的80μl注入凝胶过滤层析色谱柱中(柱，TSK G3000SWXLTOSOH制：洗脱液，0.1M磷酸钠，pH6.8)。得到的结果在表4和图5中表示。
表4.采用精氨酸衍生物的人源化抗体的洗脱
Figure G2005100046699D00161
如表4所示，使用3种精氨酸衍生物回收的人源化抗体的量大致相同，因此证明这些精氨酸衍生物具有大致相同的洗脱能力。如图5所示，3种精氨酸衍生物得到的组份中的抗体纯度(实线箭头所示部分为抗体)大致相等，每个峰的抗体峰保留时间与实施例3的柠檬酸钠洗脱峰完全一致。另外，虚线箭头所示的位置为抗体结合物的洗脱位置，但此次3种条件中的任意一种，都未产生相对于抗体的量的5％或5％以上的抗体结合物。以上的结果表明，使用微酸性精氨酸衍生物可从蛋白A上有效的洗脱回收人源化抗体。
另外，作为参考例，使用1000ml实施例3及4中使用的相同的培养上清液装载于HiTrapr-Protein AFF、1ml大小(AmershamBiosciences公司)，以等渗磷酸缓冲液充分洗净后，以表3实验编号1同样的方法以pH2.9的0.1M柠檬酸钠进行洗脱。柱上负载的抗体量达到了实施例3、4的各条件的20倍以上。将得到的抗体组分以实施例3相同的方法进行滴定中和后，注入凝胶过滤HPLC，其结果在图6中表示。实线箭头所示为抗体，虚线箭头所示为抗体的结合物，表明因酸性缓冲液(柠檬酸钠)的影响产生了抗体结合物。

Claims (14)

1.一种抗体的纯化方法，该方法包含：
a)将含有所述抗体的起始物质装载于蛋白A亲和层析柱，
b)使用pH4.0～5.0、含有精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液从上述柱上将所述抗体洗脱下来，所述的精氨酸衍生物选自：酰化的精氨酸、精胺和arginic acid。
c)回收所述抗体。
2.如权利要求1所述的抗体的纯化方法，其中，所述的精氨酸或精氨酸衍生物的浓度为0.1-4.0M。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，精氨酸用于洗脱所述抗体。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，酰化的精氨酸用于洗脱所述抗体。
5.一种纯化的抗体的制造方法，其包含以下工序：将抗体装载于蛋白A亲和层析柱的工序；使装载于蛋白A亲和层析柱上的抗体与pH4.0～5.0的、含有精氨酸或精氨酸衍生物的缓冲液接触，使该抗体从柱上洗脱的工序，所述的精氨酸衍生物选自：酰化的精氨酸、精胺和arginic acid；以及回收抗体的工序。
6.如权利要求5所述的方法，其中，缓冲液的pH为4.3～4.7。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中，精氨酸用于洗脱所述抗体。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中，酰化的精氨酸用于洗脱所述抗体。
9.如权利要求5或6所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物的浓度为0.1～4.0M。
10.如权利要求7所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物的浓度为0.1～4.0M。
11.如权利要求8所述的方法，其中，精氨酸或精氨酸衍生物的浓度为0.1～4.0M。
12.如权利要求5或6所述的方法，其中，所述的抗体是人源化抗体或人型抗体。
13.如权利要求7所述的方法，其中，所述的抗体是人源化抗体或人型抗体。
14.如权利要求8所述的方法，其中，所述的抗体是人源化抗体或人型抗体。
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