CN102533845B

CN102533845B - 一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法

Info

Publication number: CN102533845B
Application number: CN201110459360.4A
Authority: CN
Inventors: 李新玲; 闫玉清; 徐香玲
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2031-12-31
Also published as: CN102533845A

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法。该方法包括以下步骤：1)将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，然后将接种后的所述小麦幼胚进行共培养使所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合；2)将经过步骤1)共培养的所述小麦幼胚直接接种于长苗培养基中培养，即得到具有根、茎和叶的转基因小麦幼苗。本发明的方法具有以下优点：适应性广，适合于多个小麦品种的转化；操作简单，不经过愈伤组织诱导和植株再生的步骤即可得到转基因植株；转化周期短，从侵染至获得具有根茎叶的转基因小麦幼苗仅需11-14天。本发明对于小麦品种的遗传改良、获得转基因小麦的新种质具有十分重要的意义。

Description

一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法。

背景技术

小麦是人类赖以生存的重要禾谷类作物之一，在世界范围内种植面积及总产量均超过了其它农作物，它的遗传改良始终是人们努力的重要目标。传统的小麦育种技术存在着育种周期偏长、增产潜力有限等局限性，随着生物技术的发展，利用基因工程技术对小麦进行品种改良越来越受到重视。在植物基因转化***的研究方面，小麦相对于其它禾谷类作物如水稻、玉米等，表现出滞后性和困难性。小麦遗传转化研究始于20世纪80年代末期，由于小麦不是农杆菌的天然宿主，且小麦原生质体再生又相对困难，所以直到1992年Vasil等人成功地将GUS和Bar基因通过基因枪法导入小麦胚性愈伤组织，并获得转基因植株以后，有关小麦转基因的报道才开始增多。目前，转基因水稻已经进入中间试验和安全性评价阶段，而小麦转基因的研究明显落后，还处于转化体系的建立和完善阶段。

植物基因工程中，利用农杆菌介导的基因转移是目前研究的最多、转化机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。与基因枪转化法相比，农杆菌转化法具有很多的优势，如可以导入大片段目的基因，且目的基因多为单拷贝或低拷贝；容易排除冗余的质粒DNA序列；***边界多为T-DNA的边界序列，重排率低等。能否将这一方法用于小麦等单子叶植物的基因转移成为90年代前后研究的热点。当时，一种倾向性的观点是认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌介导转化单子叶植物几乎不可能或没有可能性。这种观点的代表人物是曾在小麦等禾谷类作物组织培养与基因枪转化方面卓有建树的瑞士科学家Potrykus，他在国际权威杂志Bio/Technology和Nature上发表了他的悲观论点。随着农杆菌介导的石刁柏转基因植株的获得，特别是农杆菌介导的转基因水稻和转基因玉米植株的获得，不仅改变了单子叶植物不是农杆菌天然寄主的观点，而且证明农杆菌介导法完全可以用于禾本科作物的遗传转化。然而，迄今为止小麦的农杆菌转化仍然是世界上的一道难题。近年来，国内外很多的研究小组从小麦基因型、农杆菌菌株、共培养条件、外植体类型等多角度进行了大量的研究和探索，提出了很多套遗传转化体系，但都没有任何一套能被广泛的使用。

目前，用于农杆菌介导转化的小麦外植体多为幼胚和成熟胚所形成的胚性愈伤组织，它们均需经过离体组织培养再生出转基因植株。然而，小麦的不同基因型对于植株的再生有着很大的影响，这进一步限制了通过组织培养途径获得转基因小麦。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法，该方法不经过愈伤组织形成的步骤，具有适应性广、操作简单、转化周期短的优点。

本发明所提供的方法是通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞，包括如下步骤：

1)将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，然后将接种后的所述小麦幼胚进行共培养使所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合；

2)将经过步骤1)共培养的所述小麦幼胚直接接种于长苗培养基中培养，即得到具有根、茎和叶的幼苗。

在上述方法中，为了防止小麦幼胚经农杆菌侵染后易褐化死亡，在步骤1)所述将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚之前，所述小麦幼胚还经过12-24小时、如24小时的预培养；

所述预培养具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述小麦幼胚用预培养培养基在25℃下暗培养12-24小时、如24小时；所述预培养培养基的基础培养基可为MS培养基。

在上述方法中，所述农杆菌可为发根农杆菌，如发根农杆菌R1000。

在上述方法中，所述小麦幼胚为开花后13-15天的所述小麦幼胚。

在上述方法中，步骤1)所述将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，按照包括如下步骤的方法进行：将所述小麦幼胚浸泡于所述重组农杆菌的菌液中5～10分钟，如5分钟；所述重组农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.5～0.6，如0.6。

在上述方法中，在所述浸泡期间用超声波处理含有所述小麦幼胚的所述菌液20～30s，如20s，所述超声波的频率为27kHz、功率为80w。

在上述方法中，步骤1)所述共培养具体可按照包括如下步骤的方法进行：将步骤1)所述接种后的所述小麦幼胚用共培养培养基进行培养，为了防止所述接种后的所述小麦幼胚褐化，在所述共培养的培养基中可添加抗氧化剂，所述抗氧化剂具体可为二硫苏糖醇；为了促进所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合，在所述共培养的培养基中还可添加乙酰丁香酮。

在上述方法中，步骤1)所述共培养的时间为2-3天，如3天。

在上述方法中，为了去除非转化细胞，在步骤2)所述的长苗培养基中可含有筛选转化体的选择压力，为了抑制农杆菌的生长，在步骤2)所述的长苗培养基中还可添加抑制农杆菌生长的抗生素。

在上述方法中，所述预培养培养基具体可为含水解酪蛋白1.0g/L和2，4-D 2mg/L的MS培养基，pH5.8；所述共培养的培养基具体可为含乙酰丁香酮150μmol/L和二硫苏糖醇1g/L的MS培养基，pH5.2；所述长苗培养基具体可为含头孢霉素200mg/L和潮霉素100mg/L的MS培养基，pH5.8。

本发明所述的方法中不包括形成愈伤组织的步骤。

本发明的方法可应用于所有小麦，尤其适合于普通小麦。

本发明的方法具有以下优点：适应性广，适合于多个小麦品种的转化；操作简单，不经过愈伤组织诱导和植株再生的步骤即可得到转基因植株；转化周期短，从侵染至获得具有根茎叶的转基因小麦幼苗仅需11-14天。本发明对于小麦品种的遗传改良、获得转基因小麦的新种质具有十分重要的意义。

附图说明

图1为T₀代转基因小麦植株的PCR检测。其中，1为分子量标准DL2000(从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)，2-4分别为空白对照、阳性对照、阴性对照，5-9分别为各品种的T₀代转基因植株东农7742-24、Hite-17、龙麦9814-41、龙麦26-5、龙辐麦10-32。

图2为T₀代转基因小麦植株的Southern杂交检测。其中，1-3分别为阳性对照、阴性对照、分子量标准pBR328/BamH I+Bg I+Hinf I(从上到下依次为4907bp、2176bp、1766bp、1230bp、1033bp和653bp)；4-8分别为各品种的T₀代转基因阳性单株：东农7742-24、Hite-17、龙麦9814-41、龙麦26-5和龙辐麦10-32。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所使用的小麦品种、质粒及发根农杆菌详细如下：

东农7742：李新玲，徐香玲，张楠楠.转几丁质酶基因的小麦后代遗传分析和抗病性鉴定.植物生理学通讯，2008，44(1)：75-78，公众可从哈尔滨师范大学获得。

Hite：李新玲，曲敏，徐香玲，李集临.Ri质粒介导的几丁质酶基因转化小麦的研究.植物研究，2006，26(3)：297-301，公众可从哈尔滨师范大学获得。

龙麦9814：李新玲，曲敏，闫玉清，徐香玲.影响小麦成熟胚培养及植株再生因素的研究.植物研究，2005，25(1)：49-52，公众可从哈尔滨师范大学获得。

龙麦26：李新玲，曲敏，闫玉清，徐香玲.影响小麦成熟胚培养及植株再生因素的研究.植物研究，2005，25(1)：49-52，公众可从哈尔滨师范大学获得。

龙辐麦10：邢全华，王广金，石金锋，王岳光，李忠杰，梁凤山，金德敏，王斌.β-1，3-葡聚糖酶基因高效表达载体的构建及对小麦的转化.遗传学报，2003，30(8)：717-722，公众可从哈尔滨师范大学获得。

质粒pMLH7133-Chi：李新玲，曲敏，徐香玲，李集临.Ri质粒介导的几丁质酶基因转化小麦的研究.植物研究，2006，26(3)：297-301，公众可从哈尔滨师范大学获得。

发根农杆菌R1000(Agrobacterium rhizogenes strain R1000)：李新玲，曲敏，徐香玲，李集临.Ri质粒介导的几丁质酶基因转化小麦的研究.植物研究，2006，26(3)：297-301，公众可从哈尔滨师范大学获得。

本发明所使用的基础培养基MS培养基的配方如表1：

表1.MS培养基配方

YEB液体培养基：牛肉膏5g/L，酵母粉1g/L，蔗糖5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO₄494.94mg/L，pH7.2。

YEB固体培养基：上述YEB液体培养基中添加琼脂10g/L。

实施例1、利用发根农杆菌对小麦进行几丁质酶基因转化

一、含有目的DNA的重组发根农杆菌的构建

用于转化发根农杆菌的重组载体是pMLH7133-Chi，该载体上的目的基因为几丁质酶基因(Chi)，该载体上的标记筛选基因为潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因。

将重组载体pMLH7133-Chi转入发根农杆菌R1000(Agrobacterium rhizogenes strainR1000)得到含有几丁质酶基因的重组发根农杆菌R1000/pMLH7133-Chi。具体方法如下：(1)从含50mg/L链霉素的YEB固体平板上挑取发根农杆菌R1000单菌落，接种于含有10ml YEB液体培养基(含50mg/L链霉素)的试管中，28℃振荡培养过夜；(2)取400μl菌液接种于40ml含50mg/L链霉素的YEB液体培养基中，培养4-6h至对数期(OD₆₀₀＝0.5)；(3)冰浴30min，取1.5ml菌液加入到无菌离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；(4)沉淀用800μl 150mmol/L CaCl₂重新悬浮，4℃，3000rpm离心5min，弃上清；(5)沉淀用800μl 20mmol/L CaCl₂重新悬浮，按每管200μl分装到1.5ml的无菌离心管中；(6)向200μl农杆菌感受态细胞中加入1μg重组载体pMLH7133-Chi，冰上放置30min；(7)液氮中冷冻2min，取出后立即置于37℃水浴中2min；(8)加800μl YEB液体培养基，28℃振荡培养1-2h；(9)取200μl涂布于含50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素的YEB固体培养基上，同时用无菌水代替DNA设一负对照，置28℃培养箱中；(10)挑取上述培养获得的单菌落，28℃液体YEB培养基中振荡培养，提取质粒DNA，进行PCR扩增鉴定重组发根农杆菌R1000/pMLH7133-Chi，PCR扩增的方法与下述步骤三相同。

二、含有目的DNA的重组发根农杆菌转化小麦

分别以小麦东农7742、Hite、龙麦9814、龙麦26、龙辐麦10的幼胚为外植体，利用含有几丁质酶基因(Chi)的重组发根农杆菌R1000/pMLH7133-Chi将几丁质酶基因转入小麦细胞中，以不含有质粒pMLH7133-Chi的发根农杆菌R1000进行转化为对照，转化方法如下：

1、外植体获取及预培养：取开花后13-15天的小麦未成熟种子；无菌条件下，先用70％乙醇消毒30s，无菌水洗3次，再用0.1％HgCl₂消毒12min，无菌水洗5次；然后从未成熟种子中剥离出长为1.5mm-2.0mm的幼胚，接种于预培养培养基上，25℃、暗培养24小时；

预培养培养基：含1.0g/L水解酪蛋白和2mg/L 2，4-D的MS培养基，pH5.8。

2、侵染与共培养：将经步骤1预培养的幼胚浸泡于OD₆₀₀为0.6的含重组发根农杆菌R1000/pMLH7133-Chi的侵染液中5min，期间用频率和功率分别为27kHz和80w的超声波处理20s，然后接种于共培养培养基上，25℃、暗培养3天；

侵染液的制备方法如下：取步骤一得到的重组发根农杆菌R1000/pMLH7133-Chi菌液，划线接种于含有50mg/L链霉素和50mg/L潮霉素的YEB固体培养基上，28℃暗培养1天，挑取单菌落，接种于5mL含有50mg/L链霉素和50mg/L潮霉素的YEB液体培养基中，28℃、黑暗、200rpm振荡过夜培养，再将该5mL培养液全部加到100ml含150μmol/L乙酰丁香酮、50mg/L链霉素和50mg/L潮霉素的YEB液体培养基中扩大培养，待农杆菌生长到对数生长期时，室温、4000rpm离心5min收集菌体，重悬于含150μmol/L乙酰丁香酮的MS培养基中，调OD₆₀₀值为0.6；

共培养培养基：含150μmol/L乙酰丁香酮和1g/L二硫苏糖醇的MS培养基，pH5.2。

3、长苗：将经步骤2共培养的小麦幼胚用无菌水清洗2-3次，接种于含有抗生素的长苗培养基上，25℃、每天光照16小时(光照强度4000Lux)、黑暗8小时，培养7-10天，获得具有根、茎和叶的转基因小麦幼苗；

长苗培养基：含200mg/L头孢霉素和100mg/L潮霉素的MS培养基，pH5.8。

4、移栽壮苗：将步骤3得到的转基因小麦幼苗移栽到含蛭石的小钵中，每天浇1/10不含琼脂的MS培养基并定时补水，温室培养获得T₀代转基因小麦植株。

各品种小麦的幼胚经不含有质粒pMLH7133-Chi的发根农杆菌R1000侵染后，在步骤3的筛选后全部死亡，无幼苗获得。各品种小麦的侵染幼胚数、获得的T₀代转基因小麦植株数的统计结果见表2。

三、转基因小麦的PCR检测

1、PCR模板：用SDS法提取的实施例1获得的各T₀代转基因小麦植株叶片的总DNA、用SDS法提取的未进行农杆菌转化的小麦品种东农7742的植株叶片总DNA(阴性对照)和质粒pMLH7133-Chi(阳性对照)。

2、PCR引物：几丁质酶基因的两端序列：5’-GCA GTG TGG AAG GCA AGC AG-3’(序列表中的序列1)和5’-CTG AGA GGT GAC AAG GTC AG-3’(序列表中的序列2)。

3、PCR程序：PCR反应程序为：94℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃60s，30个循环，再72℃5min。

4、结果：PCR扩增的目的片段大小为1100bp；1％琼脂糖凝胶电泳检测各样品模板的PCR产物，共获得东农7742转基因阳性植株5株，Hite阳性植株6株，龙麦9814为2株，龙麦26为3株，龙辐麦10为3株，平均转化率为1.02％，结果如图1和表2所示。

上述SDS法提取DNA的具体过程如下：(1)取再生植株幼叶约100mg，放入1.5ml离心管中，液氮或石英砂研磨；(2)加入提取缓冲液600μl，混匀，室温反应30min；(3)4℃，13000rpm离心5min，取上清；(4)加入等体积的酚氯仿(酚∶氯仿＝1∶1)，轻轻颠倒3-5min；(5)4℃，13000rpm离心5min，小心吸取上清；(6)加入等体积的氯仿，轻轻颠倒3-5min；(7)4℃，13000rpm离心5min，水相以等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇醇沉，缓缓混匀，4℃置10min以上。此步可过夜；(8)4℃，13000rpm离心10min，弃上清，以70％乙醇洗涤沉淀并抽干；(9)加入30-50μl TE溶解沉淀，加1μl RNase A 37℃温浴30min；(10)取5-10μl DNA电泳检测。

提取缓冲液：200mmol/L Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS，pH7.5。

TE：10mmol/L(pH8.0)Tris-HCl，1mmol/L(pH8.0)EDTA。

转化率＝(PCR阳性植株数/侵染的幼胚数)×100％。

表2.T₀代转基因小麦的PCR扩增结果

基因型	侵染的幼胚数	T₀代转基因小麦植株数	PCR阳性植株数	转化率(％)
					东农7742	494	159	5	1.01
Hite	408	153	6	1.47
					龙麦9814	251	95	2	0.79
龙麦26	290	82	3	1.03

龙辐麦10	411	126	3	0.73
					合计	1854	615	19	1.02

四、转基因小麦的Southern杂交

1、探针的制备：使用地高辛标记检测试剂盒(Roche，Cat.No.11745832910)合成杂交探针，方法如下：加入1μg几丁质酶基因DNA(以质粒pMLH7133-Chi为模板，按照步骤三的方法得到的PCR扩增产物)于0.2ml离心管内，用ddH₂O补充使终体积到16μl，在沸水浴中加热10min使DNA变性并快速在冰上冷却，加入4μl Mix Dig-HighPrime，混匀并短暂离心，37℃放置1h，加入2μl 0.2M的EDTA(pH＝8.0)或65℃加热10min以终止反应，-20℃冻存备用。

2、Southern杂交：由于限制性内切酶BamHI和SacI在质粒pMLH7133-Chi的T-DNA上存在单酶切位点，且这两个酶切位点位于几丁质酶基因(1.1kb)的两侧，本实验用限制性内切酶BamHI和SacI同时酶切步骤一获得的19个T₀代转基因小麦植株叶片总DNA、质粒pMLH7133-Chi(阳性对照)、未进行农杆菌转化的小麦品种东农7742的植株叶片总DNA(阴性对照)；按照萨姆布鲁克的方法(分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2005年，p495-499)进行Southern杂交检测。

3、结果：如图2所示。19个PCR呈阳性的T₀代转基因小麦植株均出现了1条1.1kb左右的杂交带，而阴性对照植株无任何杂交带。

五、转基因小麦的几丁质酶活力测定

与抗病有关的几丁质酶主要是内切几丁质酶，且质粒pMLH7133-Chi中所携带的菜豆几丁质酶基因编码的几丁质酶亦为内切几丁质酶。采用氨基葡萄糖法分别测定8株T₀代转基因小麦植株(转化株)叶片的几丁质酶活力，分别以未进行农杆菌转化的小麦植株(对照株)为对照，测定方法如下：

1、几丁质酶的提取及处理

①分别称取T₀代转基因小麦植株和对照株的叶片2g，放入预冷的研钵中，并加入6ml 0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)及少许石英砂，冰浴中研磨成匀浆；②4℃，12000rpm离心15min，上清液即为粗酶液；③取1ml粗酶液，加1ml 0.5％壳聚糖(pH6.0)和2ml 0.2M醋酸钠(pH5.2)，混匀。同时用不含粗酶液的壳聚糖和醋酸钠混合液做空白对照；④37℃水浴2h，4℃，12000rpm离心5min，取上清液备用。

0.5％壳聚糖：预先用5％冰醋酸浸泡4h，当充分溶解后，用NaOH调pH6.0。

2、外切几丁质酶活力测定

①取1ml步骤1得到的上清液于试管中，加1ml H₂O及1ml乙酰丙酮试剂，摇匀；②用玻璃球封住试管口，沸水中加热20min，然后冷却至室温；③加5ml无水乙醇和1ml 1％对二甲氨基苯甲醛(DMAB试剂)，再以无水乙醇补足至总体积10ml，充分混匀；④65℃-70℃水浴10min，加速CO₂释放，然后冷却至室温，530nm处测定溶液吸光值。用水代替各样品的粗酶液做空白对照。

乙酰丙酮试剂：1ml重蒸乙酰丙酮溶于50ml 0.5M Na₂CO₃溶液中，使用前配制。

DMAB试剂：0.8g对-二甲基氨基苯甲醛溶于30ml乙醇中，加30ml浓盐酸，溶液呈淡黄色。

3、总几丁质酶活力测定

①取1ml步骤1得到的上清液于试管中，加100μl 1M磷酸缓冲液(pH7.1)和70μl 3％蜗牛酶，摇匀；②37℃水浴2h，加水至总体积为2ml；③65℃-70℃水浴10min，加速CO₂释放，冷却至室温，530nm处测定溶液吸光值。用水代替各样品的粗酶液做空白对照。

4、内切几丁质酶活力计算

根据标准曲线方程：Y＝329.82X-3.3249(X代表OD₅₃₀值，Y代表氨基葡萄糖量(μg)，直线相关系数r＝0.9923)，将测定得到的每个样品的总几丁质酶活力和外切几丁质酶活力的OD₅₃₀值分别换算成氨基葡萄糖产量，再以每小时分解胶体壳聚糖产生1μg氨基葡萄糖记为一个酶活力单位(U)。

根据公式：内切几丁质酶活力(U)＝总几丁质酶活力(U)-外切几丁质酶活力(U)；

5、结果：见表3。结果表明，不同品种的T₀代转基因小麦植株的内切几丁质酶活力都明显地高于对照株，并且至少是对照株的2倍以上，说明外源的几丁质酶基因已在T₀代转基因小麦中表达。

表3.转基因小麦的内切几丁质酶活力

Claims

1.培育转基因小麦的方法，通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，然后将接种后的所述小麦幼胚进行共培养使所述重组农杆菌的T-DNA与所述小麦的染色体整合；

2）将经过步骤1）共培养的所述小麦幼胚直接接种于长苗培养基中培养，即得到具有根、茎和叶的转基因小麦幼苗；

所述共培养的培养基为含乙酰丁香酮150μmol/L和二硫苏糖醇1g/L的MS培养基，pH5.2；所述长苗培养基为含头孢霉素200mg/L和潮霉素100mg/L的MS培养基，pH5.8；

在步骤1）所述将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚之前，所述小麦幼胚还经过12-24小时的预培养；所述预培养培养基为含水解酪蛋白1.0g/L和2,4-D 2mg/L的MS培养基；

所述农杆菌为发根农杆菌；

所述小麦幼胚为开花后13-15天的所述小麦幼胚；

步骤1）所述将含有目的DNA的重组农杆菌接种于小麦幼胚，按照包括如下步骤的方法进行：将所述小麦幼胚浸泡于所述重组农杆菌的菌液中5～10分钟；所述重组农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.5～0.6；

在所述浸泡的同时用超声波处理含有所述小麦幼胚的所述菌液20～30秒；

步骤1）所述共培养的时间为2-3天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述小麦为普通小麦。