CN106119281A - 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法，该方法的主要步骤包括：采用小麦成熟种子，经过水浸种、催芽后冷处理，横切其胚芽鞘，裸露出茎尖，作为转化受体材料，通过农杆菌的真空处理介导进行遗传转化，将转化的材料置于适宜生长环境，待植株生长后，通过转基因的鉴定，从而获得转基因小麦植株。本发明方法无需进行小麦愈伤组织的培养，减少了各种因素对小麦遗传转化的影响，避免了组织培养过程玻璃化，褐化，细胞突变等问题，优化了小麦遗传转化的条件，降低小麦遗传转化的经济成本，有效克服了小麦基因型对转化效率的制约，可快速大量的获得转基因小麦植株，对培育优质新品种小麦以及进行小麦遗传转化研究具有重大价值。

Description

一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域和植物基因工程领域，具体是一种快速高效农杆菌介导的小麦遗传转化方法。

背景技术

小麦作为世界上重要的粮食作物之一，是人类获取蛋白质与热量的主要来源之一。根据国际粮食政策研究所预测，世界小麦需求量将以每年1.6％的速度增长，但近十多年来，由于耕地面积的不断减少和人口数量的持续增长，培育出优质，高产的小麦是一个急需解决的问题。传统的小麦杂交育种过程缓慢，存在基因连锁和生殖隔离的缺点，很难产生新品质的小麦。借助于一些理化条件的诱变育种，需要大量材料，并且难以控制诱变的方向，有益突变率较低，难于进行筛选。以细胞融合的方式获得杂种细胞，培养并发育成植株的细胞工程育种，技术复杂，难度较大，会导致生物品系减少，个体生存能力下降。目前，采用基因工程的技术获得小麦新品种是最高效的育种方式之一。

1992年，世界上才成功获得第一例转基因小麦，作为最后一个转化成功的重要和谷类粮食作物，其转化效率较低，重复性较差，转化规模较小，主要是因为两方面：一方面小麦属于六倍体作物，且遗传背景复杂，其基因组较大(16000Mb)，是玉米基因组的7倍，水稻基因组的35倍。且重复序列较多。另一方面小麦的遗传转化过程中DNA导入频率低，并且转化后小麦愈伤组织的再生能力不强，有较强的基因型依赖性。所以导致小麦的遗传转化研究起步较晚，进展缓慢。转化效率远远低于其他植物如玉米水稻等。目前为止小麦转化的方法有：花粉管通道法，显微镜注射法等，基因枪法，电击穿孔法，PEG法等，目前小麦转化普通采用的两种方法是基因枪法与农杆菌介导法。但是，基因枪法经济成本较高，容易造成外援基因丢失，导致基因沉默。而农杆菌介导法具有操作简单，成本低，***拷贝数较少，并能转化一些相对较大的DNA片段等优点，近年来，通过农杆菌侵染小麦愈伤组织的方法已经广泛的用于小麦遗传转化。但是该方法受到都须通过组织培养和植株再生途径，操作过程中要求严格，消耗时间长，工作量大，容易出现玻璃化，褐化，细胞突变等问题。且小麦本身具有较强的基因特异性，其基因组相对于其他作物较大，也增加了转化的难度。因此，能够创制出不依赖组织培养技术的小麦植株水平的转化技术具有重大的意义。

Erwin Smith在一个世纪前对植物病原体进行研究时，发现了一种个革蓝氏阴性的植物病原菌—根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，研究发现：在植物受到损伤的情况下，农杆菌能够侵染大多数双子叶植物和部分单子叶植物，植物受伤部位便会产生一种特异的生物碱—冠瘿碱，进入农杆菌细胞内。从而导致携带有外源基因的Ti质粒上的T—DNA转移到受体细胞中，并整合到受体细胞的染色体上。农杆菌介导法的小麦遗传转化研究所采用的受体材料有很多，包括：幼穗、幼胚、成熟胚、胚性愈伤组织、根尖、茎尖等。研究表明：上述材料来源植物的不同生长发育阶段，具有时空差异性，针对不同的材料需采取了不同转化以及培养方法，操作过程较为繁琐，为了提高转化效率，获得新的小麦品种。应该采用较为理想的遗传转化材料，其应具有以下优点：第一，材料处理方式相对均一，具有高重复性与普遍性。第二，材料分化程度低，细胞全能性强，具有发育成完整植株的可能性。第三，材料容易获取，减少取材对实验的影响，便于进行实验。第四，材料相对较大，有利于遗传转化成功。由于小麦成熟个体较大，材料均一，重复性高，且易获得，易保存，细胞全能性强，是进行小麦遗传转化研究的理想材料。研究表明，传统小麦农杆菌遗传转化往往需要借助植物组织培养技术，而其中小麦受体基因型是影响农杆菌转化效率的重要因素之一，不同小麦受体基因型对农杆菌的敏感性不同，转化效率也显著不同，研究表明，只有部分小麦基因型的受体材料再生频率高，绝大多数具有重要经济价值的小麦，其基因型差异较大，再生性能差，仍然难以进行转化，因此，建立一个转化受体基因型依赖程度较低的小麦遗传转化方法具有重大意义。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明提供了一种小麦遗传转化方法，避免了传统小麦遗传转化方法中的缺点，包括植物组织培养中严格无菌条件，培养过程中生长周期长，所需经济成本高，对材料的状态和基因型要求较高等，建立了一种简单方便高效快速的农杆菌介导小麦茎尖的遗传转化方法。

一种快速高效的农杆菌介导小麦茎尖遗传转化方法，采用以下步骤：

1)取小麦成熟种子萌发，得到其发芽期个体，低温处理；

2)以发芽期的小麦个体作为实验材料，横切其部分胚芽，将裸露的茎尖分生组织作为遗传转化受体；

3)通过真空渗透处理的方式，将农杆菌导入小麦茎尖分生组织细胞，使农杆菌携带的目的基因的T-DNA***植物基因组；

4)将小麦移入适宜生长的土壤，对其进行常规管理，并对其进行鉴定，挑选出转基因小麦植株。

所述小麦种子萌发的方法为无需消毒处理，直接以20-25℃自来水浸泡破肚露白后置于培养皿中20-25℃催芽生根。

所述低温处理为4℃低温保存试验材料36-48小时。

所述低温处理时胚芽长度为1.5-2.0cm。

所述遗传转化受体是带有完整胚根、胚乳的切除胚芽后的茎尖分生组织。

所述步骤(3)真空渗透处理方法为将暴露出茎尖分生组织的小麦材料用YEP液体培养基培养的农杆菌菌液浸泡，抽真空处理。

所述YEP农杆菌菌液其OD₆₀₀为0.5，农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮(AS)和表面活性剂(Silwet L-77)，以增加转化效率。

所述抽真空处理的条件为：1.5Kpa压强下浸泡5min。

所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404，携带杜仲几丁质酶基因EuCHIT1及卡那霉素(Kanamycin Monosulfate)抗性基因的pSH-35S-CHIT1载体。

所述小麦品种为紫粒麦。

本发明以小麦成熟种子为材料，经过催芽处理和低温处理后，横切其茎尖分生组织，以此为受体；不需要无菌环境，在真空条件下，利用农杆菌介导，采用真空处理将外源基因导入小麦基因组，从而获得转基因小麦。

本发明无需经过组织培养，受小麦基因型影响程度低，种子萌发后可直接进行操作，具有以下优点：

第一、操作简单。除了农杆菌的培养外，其他步骤无需在无菌环境下操作，避免了植物组织培养过程必须的培养基配制、外植体消毒、愈伤组织诱导、继代、共培、筛选、再生芽诱导、生根等一系列繁琐过程。

第二、生长周期短。从浸种到获得转基因植株，只需小麦一个生长周期，相对于传统的组织培养的方法所需时间较短。

第三、重复性与普遍性高。受转化材料基因型的影响较小，且对材料的处理方式统一，简便，易重复，转化效率高，T1代种子转化率为11％。

第四、经济效益高。直接采用农杆菌菌液浸染小麦遗传转化受体，利用土壤培养小麦，减少了传统转化过程中植物组织培养所需的一系列人力物力投入，可大幅度减少遗传转化成本。

本发明的用语及培养基：

本发明中农杆菌培养一般采用YEP培养基(酵母提取物10g/L+蛋白胨10g/L+NaCl5g/L，pH 7.2，固体培养基中加入15g/L琼脂)培养。

附图说明

图1 pSH-35S-EuCHIT植物表达载体，

图2紫粒麦种子，

图3 GUS染色呈阳性的转基因紫粒麦叶片，

图4 GUS染色呈阳性的转基因紫粒麦幼穗，

图5野生型植株与转基因紫粒麦幼穗GUS染色对比，

图6 EuCHIT1基因PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。

实施例：采用本方法获得紫粒麦转基因植株.

1.小麦遗传转化受体准备

取紫粒麦成熟种子(见图2所示)，清水浸泡于25℃下，12h后取出破肚露白的种子，吸出多余水分置于培养皿中催芽生根2d，待胚芽长度长到1.5-2.0cm，置于4℃下低温处理2d，用手术刀从茎尖茎环处将胚芽及胚芽鞘切除，从而暴露其茎尖分生组织。

2.农杆菌培养及活化

根瘤农杆菌菌株LBA4404，携带杜仲几丁质酶基因EuCHIT1(申请号2015108620543、2016102991953)的pSH-35S-EuCHIT载体，见图1所示，划线接种到YEP固体培养基中(含20mg/L利福平(Rif)+50mg/L卡那霉素(Kan)上。置于培养箱，28℃黑暗条件下培养2d后，取出培养基并挑取单菌落至5ml YEP液体培养基中(含20mg/L利福平Rif+50mg/L卡那霉素Kan)，摇床(180rpm，28℃)振荡培养24h后，取50μl菌液加入到50ml YEP培养基中(含20mg/L Rif，50mg/L Kan)，摇床(180rpm，28℃)振荡培养12h后，观察其菌液浓度，并测其OD₆₀₀值，直到菌液OD600＝0.5。

3.小麦的遗传转化

将准备好的小麦材料放入YEP农杆菌菌液，按200μl/L的浓度加入表面活性剂(SILWET1-77)以及1ml/L的浓度加入乙酰丁香酮(AS)，于15Kpa压强下真空处理5min，倒掉菌液，置于干净培养皿中，加入少许水，为了农杆菌携带的质粒能整合到植物基因组中，放置于25℃黑暗条件下培养3d，(因为光照会使得农杆菌的质粒脱落，转化率就会降低，另外植物切割以后较为脆弱，暗培养能帮助其恢复到正常的生长状态。)

4.转基因小麦植株鉴定。

将培养后的小麦移栽到土壤中，常规肥水管理。等待其生长，并对其小麦幼嫩叶片以及幼穗进行GUS组织化学染色检测，具体方法如下：剪取小麦幼嫩叶片或幼穗少许，放入1.5mlPCR管中，加入20ul的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)染色液，37℃放置12h,吸出X-Gluc，加入200ul的乙醇(75％)溶液，将其叶绿素脱尽，与对照组对照，筛选出蓝色的阳性植株。见图3、图4、图5所示。即叶片，幼穗显示为蓝色的阳性小麦为转基因植株。结果表明，共GUS组织化学染色处理小麦幼穗162株，其中18株幼穗染液呈蓝色，阳性植株占11.1％。

转基因植株PCR检测

取GUS染色检测呈阳性的植株，采用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN公司)试剂盒提取小麦叶片的DNA。具体方法如下：

(1)取GUS检测阳性的小麦新鲜叶片100mg，剪碎至研钵中，加入液氮，充分研磨。

(2)将研磨后的叶片，加入装有400μl缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)的2ml离心管，旋涡振荡1min，室温放置10min。

(3)加入130μl缓冲液LP2，移液枪吹打混匀，旋涡振荡1min。

(4)12,000rpm离心5min，将上清移至新的2ml离心管中。

(5)加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15sec，直至出现絮状沉淀。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复上一步操作。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

农杆菌质粒提取，采用TIANGEN公司质粒小提试剂盒提取，具体方法如下：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

(2)取过夜培养的菌液1-5ml，加入离心管中，12,000rpm离心1min，吸取上清。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充***解。

(5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP 3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP 3放入收集管中。

(7)向吸附柱CP 3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP 3放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)将吸附柱CP 3放入收集管中，12,000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CP 3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。

对EUCHIT1基因进行PCR检测，分别将转基因小麦DNA，农杆菌质粒产物，野生型小麦DNA作为模板进行PCR扩增；其基因引物由上海英俊生物有限公司合成。引物序列为:Forward:5，-CGGGATCCCGATGGCGAAGACTAGTAGAAACGCAC-3，：Reverse primer:5，-CGGAATTCCGTATGGAACCCATAAATCTCAGGAAG-3，pcr反应程序为：预热98℃10S；(98℃10S；55℃30S；72℃1min)30个循环反应；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR反应完毕后，取5μl扩增产物，1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，Bio-Rad凝胶成像***仪下观察并照相。见图6。利用特异性引物对筛选获得的小麦植株进行PCR扩增，得到大小约为1000bp左右的目标条带，表明农杆菌携带的几丁质酶基因已经成功导入到小麦植株中。

Claims (10)

1.一种快速高效的农杆菌介导小麦茎尖遗传转化方法，采用以下步骤：

1)取小麦成熟种子萌发，得到其发芽期个体，低温处理；

2)以发芽期的小麦个体作为实验材料，横切其部分胚芽，将裸露的茎尖分生组织作为遗传转化受体；

3)通过真空渗透处理的方式，将农杆菌导入小麦茎尖分生组织细胞，使农杆菌携带的目的基因的T-DNA***植物基因组；

4)将小麦移入适宜生长的土壤，对其进行常规管理，并对其进行鉴定，挑选出转基因小麦植株。

2.根据权利要求1所述的方法，所述小麦种子萌发的方法为无需消毒处理，直接以20-25℃自来水浸泡破肚露白后置于培养皿中于20-25℃催芽生根。

3.根据权利要求1所述的方法，所述低温处理为4℃低温保存试验材料36-48小时。

4.根据权利要求3所述的方法，所述低温处理时胚芽长度为1.5-2.0cm。

5.根据权利要求1所述的方法，所述遗传转化受体是带有完整胚根、胚乳的切除胚芽后的茎尖分生组织。

6.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)真空渗透处理方法为将暴露出茎尖分生组织的小麦材料用YEP液体培养基培养的农杆菌菌液浸泡，抽真空处理。

7.根据权利要求6所述的方法，所述YEP农杆菌菌液其OD₆₀₀为0.5，农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮和表面活性剂Silwet L-77。

8.根据权利要求6所述的方法，所述抽真空处理的条件为：1.5Kpa压强下浸泡5min。

9.根据权利要求1所述的方法，所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404，携带有杜仲几丁质酶基因EuCHIT1及卡那霉素(Kanamycin Monosulfate)抗性基因的pSH-35S-CHIT1载体。

10.根据权利要求1所述的方法，所述小麦品种为紫粒麦。