CN106811471A - 水稻spl7基因在调控株型中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻SPL7基因在调控株型中的应用。所述的基因能调控水稻株型。SPL7基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:1；其编码的蛋白质如序列表中的SEQ ID NO:3所示。将SPL7基因的完整蛋白质编码区序列置于组成型启动子35S的控制下在水稻中超量表达，转基因植株相对于野生型对照，分蘖减少、穗部分枝减少和穗粒数减少，表明SPL7基因可以用于调控水稻的株型。SPL7基因的完整蛋白质编码区序列如SEQ ID NO:2所示。本发明不仅阐述了SPL7基因在调控水稻株型中的生物学功能，同时也提供了一种改良水稻株型的方法。

Description

水稻SPL7基因在调控株型中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻SPL7基因在调节植物株型中的应用。通过转基因的方法，在水稻中超量表达SPL7基因的蛋白质编码区可以减少水稻的分蘖、减少穗部枝梗数和减少穗粒数，这些结果表明SPL7基因在水稻株型的遗传改良中具有一定的利用价值。
背景技术
水稻是世界上最主要的粮食作物之一，有超过一半的人口以其为主食，因此水稻的产量高低对社会发展有着重要的影响。随着世界人口的持续增长，耕地面积的不断减少和环境污染的日益加重，培育出具有更高单产并且环境友好的水稻新品种对于保障我国的粮食安全具有重要的战略意义。
水稻的产量与其株型密切相关，以理想株型为改良目标的育种模式在农业生产上受到高度的重视。水稻的株型主要包含株高、分蘖、穗部分枝及粒数、根形态以及器官的大小和角度等内容(Wang and Li，Molecular basis of plant architecture.Annu RevPlant Biol,2008,59:253-279)。其中株高、分蘖、穗型和粒重长期以来都是遗传改良的重要目标性状。株高是与水稻产量、光合作用以及与抗倒伏性密切相关的性状，上个世纪以降低株高为育种目标的第一次“绿色革命”极大的提高了全球农作物的产量。随着遗传学和分子生物学的发展，现已阐明激素特别是赤霉素和油菜素甾醇在调节植物的株高中发挥关键的作用(Wang and Li,Molecular basis of plant architecture.Annu Rev Plant Biol,2008,59:253-279)。
水稻分蘖是由茎基部的腋芽在适宜的条件下长出的，一般包括分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长两个发育过程。目前已经克隆了多个与分蘖发育有关的基因，比如MOC1、LAX1、LAX2、TAB1等基因控制分蘖芽的起始发育(Komatsu et al.,LAX and SPA:majorregulators of shoot branching in rice.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100:11765-11770；Li et al.,Control of tillering in rice.Nature,2003,422:618-621；Tabuchi et al；LAX PANICLE2of rice encodes a novel nuclear protein andregulates the formation of axillary meristems.Plant Cell,2011,23:3276-3287；Tanaka et al.,Axillary meristem formation in rice requires the WUSCHELortholog TILLERS ABSENT1.Plant Cell,2015,27:1173-1184)。而近些年鉴定出的一种新的植物激素独脚金内酯则在控制水稻分蘖芽长出的过程中发挥核心的调控作用。水稻中长期遗传学研究收集的系列矮化突变体在解析独脚金内酯的合成和信号转导中发挥了重要的作用。独脚金内酯是一类倍半萜烯化合物，由胡萝卜素合成而来。水稻中D17/HTD1，D10和D27控制独脚金内酯的合成(Arite et al.,DWARF10,an RMS1/MAX4/DAD1ortholog,controls lateral bud outgrowth in rice.Plant J,2007,51:1019-1029；Lin et al.,DWARF27,an iron-containing protein required for the biosynthesis ofstrigolactones,regulates rice tillers bud outgrowth.Plant Cell,2009,21:1512-1525；Zou et al.,The rice HIGH-TILLERING DWARF1encoding an ortholog ofArabidopsis MAX3is required for negative regulation of the outgrowth ofaxillary buds.Plant J,2006,48:687-698)，而D3，D14和D53编码的蛋白质则控制独脚金内酯的信号转导(Arite et al.,d14,a strigolactone-insensitive mutant of rice,shows an accelerated outgrowth of tillers.Plant Cell Physiol,2009,50:1416-1424；Ishikawa et al.,Suppression of tiller bud activity in tillering dwarf ofrice.Plant Cell Physiol,2005,46:79-86；Jiang et al.,DWARF 53acts a repressorof strigolactone signaling in rice.Nature,2013,504:401-405；Zhou et al.,D14-SCF(D3)-dependent degradation of D53regulates strigolactone signaling.Nature,2013,504:406-410)。
水稻的穗是农业生产上收获的目的器官，其形态和组成直接决定了水稻的产量。水稻的穗是一种圆锥花序，由花序分生组织发育而来，其一般可以产生一次枝梗和二次枝梗，在少数情况下也可以产生更高级的枝梗，枝梗会进一步的发育成为小穗进而产生花，花器官开花受精以后就会形成稻米。与拟南芥等植物不同，水稻穗型的发育过程是由一系列分生组织命运转变决定的。在合适的内外环境条件下，水稻由营养生长进入生殖生长，与此同时，顶端分生组织也会转变为花序分生组织，由花序分生组织产生一次枝梗分生组织，在产生一定数量的一次枝梗分生组织以后，花序分生组织会发生退化。而一次枝梗分生组织会产生更高级的二次枝梗分生组织，也会直接分化出小穗分生组织，而二次枝梗分生组织会重复一次枝梗分生组织的发育模式，最终枝梗分生组织都转变为小穗分生组织。而小穗分生组织则会产生花分生组织，进而产生花器官的分化。不同分生组织的转变时间在很大程度上决定了水稻的穗型(Kyozuka et al.,Control of grass inflorescence form bythe fine-tuning of meristem phase change.Curr Opin Plant Biol,2014,17:110-115)。如果花序分生组织维持的时间较长，就会产生更多的一次枝梗；而如果小穗分生组织分化被推迟的话，就可能产生更多的二次枝梗甚至三次枝梗，从而产生更多的穗粒数。鉴于穗型在农业生产上的重要意义，科学家已经发现了大量的控制穗型发育的基因，并且一些基因已经在育种实践中得到了应用(Zhang and Yuan,Molecular control of grassinflorescence development.Annu Rev Plant Biol,2014,65:553-578)。
microRNA(miRNA)是一类长度大约在20-24个核苷酸的内源性非编码的RNA分子。自从1993年在线虫中克隆了第一个编码miRNA基因以来，在几乎所有研究过的高等生物中都发现了大量的编码miRNA的基因存在。miRNA往往通过调节mRNA的稳定性或者调控蛋白质翻译过程来控制靶基因mRNA的活性，从而调节包括生长、发育、代谢、响应环境等在内的各个生命活动过程。因为其强大的生物学功能和复杂的调控机制，miRNA相关的研究已经成为当今生命科学的热门领域之一，并且有可能在农作物的遗传改良中发挥重要的作用。microRNA156(miR156)是一类在各个高等植物物种中高度保守的小RNA，在水稻中，有11个SPL家族的转录因子受其调控(Xie et al.,Genomic organization,differentialexpression,and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcriptionfactors and microRNA156in rice.Plant Physiol,2006,142:280-293)，其中2个靶基因SPL14/IPA1和SPL16的功能已经得到解析(Jiao et al.,Regulation of OsSPL14 byOsmiR156defines ideal plant architecture in rice.Nat Genet,2010,42:541-544；Miura et al.,OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivityin rice.Nat Genet,2010,42:545-549；Wang et al.,Control of grain size,shape andquality by OsSPL16in rice.Nat Genet,2012,44:950-954)，但是剩余的9个受miR156调控的SPL基因的功能依然是未知的。本发明阐述了受miR156调控的SPL7基因可以有效的调节水稻的株型，因此在水稻的遗传改良中具有潜在的利用价值。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种SPL7基因在调节水稻株型中的应用。本发明的另外一个目的是提供了一种通过SPL7基因来调节水稻株型的遗传转化载体和方法。SPL7基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，也包括与SEQ ID NO:1所示的DNA序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因***、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明还包括SPL7基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO:3所示，也包括与SEQID NO:3所示的蛋白质序列具有90％以上同源性的蛋白质序列，也包括因***、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能改变的蛋白或蛋白类似物。SPL7基因的蛋白质编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过超量表达SPL7基因的蛋白质编码区显著的减少了水稻的分蘖数、穗部枝梗数和穗粒数，这些结果表明SPL7基因在水稻育种中可能具有重要的利用价值。本发明提供的SPL7基因可用于与其它调控元件，如组成型启动子(如CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因表达载体；也可通过转基因技术、反义RNA、RNAi、锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和CRISPR(ClusteredRegularly Interspersed Short Palindromic Repeats)/Cas9等技术对其操控以调控水稻的株型。
实现本发明的具体技术步骤如下：
1、利用基因芯片数据和实时荧光定量PCR技术检测SPL7基因的表达模式；具体方法在实施例1中有详细描述。
2、利用PCR的方法从水稻幼穗RNA反转录而来的cDNA中扩增SPL7基因的蛋白质编码区；具体方法在实施例2中有详细描述。
3、将SPL7基因的蛋白质编码区连接到pCAMBIA1301S载体上，构建超量表达载体35S:SPL7OE；具体方法在实施例3中有详细描述。
4、利用优化过的农杆菌介导的转基因方法(Lin and Zhang,Optimising thetissue culture conditions for high efficiency transformation of indicarice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)将表达载体35S:SPL7OE导入水稻受体中花11，获得转化植株；具体方法在实施例4中有详细描述。
5、借助PCR的方法分析鉴定阳性转基因植株和共分离检测，并对T1代单株进行表型鉴定和统计分析；具体方法在实施例5中有详细描述。
6、利用实时荧光定量PCR的方法检测35S:SPL7OE转基因植株中的SPL7基因的表达量；具体方法在实施例6中有详细描述。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1、本发明阐述了水稻SPL7基因在调控水稻株型中的功能。
2、本发明将SPL7基因的蛋白质编码区导入水稻，实现了对水稻株型的遗传改良。
3、本发明创造了一种利用SPL7基因来对水稻进行遗传改良的方法。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是SPL7基因的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO:2是SPL7基因的蛋白质编码区的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO:3是SPL7基因编码的蛋白质序列。
图1：SPL7基因与microRNA156核苷酸配对示意图。
图2：SPL7基因的表达模式。附图标记说明：
图2中的A图：在来自明恢63的25个组织中，受microRNA156调控的10个SPL基因的基因芯片信号值的聚类图。芯片数据来自公开的数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)。
图2中的B图：在来自水稻品种中花11的16个组织中SPL7基因的表达模式。愈伤取样于继代后20d；胚芽和胚根取样于萌发后48h；苗顶端分别取样于萌发后20d和40d；根、叶片、叶鞘、节间、节、穗轴和花取样于抽穗期；种子取样于受精后7d；幼穗分别取样于1mm、4-5mm和10mm的长度。数据显示的是3个重复的平均值±标准误。SA：苗顶端；YP：幼穗；DAG：萌发后天数。
图3：表达载体35S:SPL7OE构建过程示意图。附图标记说明：
图3中的A图：***表达载体35S:SPL7OE的包含有SPL7蛋白质编码区的DNA片段示意图
图3中的B图：用于构建表达载体35S:SPL7OE的空载体pCAMBIA1301S的结构示意图。
将图3中的A图所示的片段通过KpnI和BamHI双酶切***图3中的B图所示的载体pCAMBIA1301S的KpnI和BamHI酶切位点中间形成转化用的表达载体35S:SPL7OE。
图4：本发明构建的表达载体35S:SPL7OE图谱。
图5：野生型中花11(WT)与35S:SPL7OE超量表达(SPL7OE)的植株的表型比较。附图标记说明：
图5中的A图：野生型中花11(WT)与35S:SPL7OE超量表达(SPL7OE)的植株的株高和分蘖的形态比较。
图5中的B图：野生型中花11(WT)与35S:SPL7OE超量表达(SPL7OE)的植株的穗型比较。
图6：利用实时荧光定量PCR检测野生型中花11(WT)与35S:SPL7OE超量表达(SPL7OE)植株中SPL7基因的表达量。数据显示的是3个重复的平均值±标准误。
具体实施方式
实施例1：SPL7基因的时空表达模式
基于申请人实验室前期的水稻全生育期基因表达谱分析的结果，有3个受miR156调控的SPL基因在幼穗中特异高表达，并且它们的表达量随着幼穗发育的进程逐渐下调(Wang et al.,A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycleof rice.Plant J,2010,61:752-766)，因此申请人设想这3个基因参与调控水稻的幼穗发育过程。其中一个成员SPL7基因的功能是未知的，本发明具体分析该基因的生物学功能和在水稻遗传改良中潜在的利用价值。
SPL7基因受miR156调控，其与miR156之间的核苷酸配对关系见图1。根据水稻基因组注释的结果(http://rice.plantbiology.msu.edu/),SPL7基因的登录号为LOC_Os04g46580，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示。为了分析SPL7基因的功能，申请人首先分析了该基因的表达模式。
为实现上述目的，申请人利用公开的数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn；Wanget al.,A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle ofrice.Plant J,2010,61:752-766)来分析SPL7基因的表达模式。该数据库收录了来自两个籼稻品种珍汕97和明恢63覆盖全生育期的多个组织的芯片数据。本发明具体分析了来自明恢63的25个组织(详细信息见表1)中的SPL7以及其它9个受miR156调控的SPL基因的表达模式，利用层次聚类的方法对芯片数据进行分析，结果如图2中的A图所示，其表明SPL7基因在早期发育的幼穗中(panicle1-panicle4)特异高表达。
表1用于SPL基因表达模式分析的明恢63的芯片数据来源信息
申请人进一步利用实时荧光定量PCR的方法检测了SPL7基因的表达模式。为实现该目的，首先设计了如下引物：
SPL7QRTF(正向引物)：5'-CTGCTGCTGTGTAACGACGCTA-3'，
SPL7QRTR(反向引物)：5'-GCACACGGACGGACCTATGTGTAA-3'；
UbiF(正向引物):5'-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3'，
UbiR(反向引物):5'-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3'；
其中引物组合SPL7QRTF和SPL7QRTR扩增的是SPL7基因，而引物组合UbiF和UbiR扩增的是ubiquitin基因，并且利用ubiquitin基因的表达量作为实时荧光定量PCR的平衡化内参。
申请人分别采集了来自水稻品种中花11(中国农业科学院作物科学研究所)的继代20d的愈伤、萌发后48h的胚芽和胚根、萌发后20d和40d的苗顶端、抽穗期的根、叶片、叶鞘、节间、节、穗轴和花、开花后7d的种子，以及长度分别在1mm、4-5mm和10mm的幼穗，并且抽提这16个样品的RNA进行反转录以进行实时荧光定量PCR分析。具体的操作步骤如下：
(1)提取RNA
抽提上述来自水稻品种中花11的16个组织的RNA，RNA抽提用的试剂是购买自Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)。
(2)反转录合成cDNA第一链
步骤如下：1)取抽提的总RNA 2μg，加入DNaseI 1μl,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂，工作浓度为0.01％)处理过的水到10μl，混匀后于室温放置15min以去除残留的基因组DNA；2)15min后加入0.2M EDTA 1μl，并于65℃水浴中孵育10min以去除DNaseI的活性；3)加入1μl引物oligo(dT)15，并于65℃水浴中孵育10min以破坏RNA的二级结构，然后冰上放置5min；4)加入5x first strand buffer 4μl，0.1MDTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1μl，反转录酶1μl，混匀后置于42℃水浴锅内温浴1.5h；5)反应结束后将反转录产物置于90℃干浴3min以灭活反转录酶；6)向反转录产物中加入120μl水，混匀后-20℃保存反应最终产物。反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。
(3)实时荧光定量PCR扩增
以步骤(2)反转录而来的cDNA为模板，分别利用引物组合SPL7QRTF和SPL7QRTR、UbiF和UbiR进行实时荧光定量PCR扩增。实时荧光定量PCR相关试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10s，进入循环后95℃变性5s，60℃退火延伸40s，45个循环。以引物组合UbiF和UbiR扩增的结果为内参平衡化各个样品的结果，并且将愈伤中的SPL7基因的表达量设置为1计算其余各个组织中SPL7基因的相对表达量。实时荧光定量PCR的结果如图2中的B图所示，其表明SPL7基因在发育的幼穗中高表达，该结果与上述来自芯片检测的结果是吻合的。
实施例2：水稻SPL7基因的蛋白质编码区的克隆
为了分析SPL7基因的功能，本发明采用水稻幼穗的RNA经过反转录得到的cDNA为模板，利用SPL7基因的特异引物，通过PCR的方法分离克隆SPL7基因的蛋白质编码区，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。为实现该目的，本发明采用购买自Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒抽提来自水稻品种中花11的长度在1mm左右的幼穗的RNA，抽提的具体操作过程见相关试剂的说明书。RNA抽提完成以后，利用同实施例1相同的方法进行反转录合成cDNA第一链。
为了扩增SPL7基因的蛋白质编码区，我们设计了如下的引物：
SPL7OEF(正向引物):5'-GGTACCATGGAAGGAAACGGCTGCG-3'(下划线序列为KpnI识别位点)；
SPL7OER(反向引物):5'-GGATCCTCAGACCACGCGGGCGCCCT-3'(下划线序列为BamHI识别位点)；
该对引物可以扩增出SPL7基因的起始密码子到终止密码子之间的蛋白质编码区段，其序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
以反转录而来的cDNA为模板，用引物SPL7OEF和SPL7OER进行PCR扩增。PCR反应总体积为20μl，包含cDNA模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物SPL7OEF和SPL7OER各0.3μl，ExTaq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃2min，⑤从②－④循环38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测，回收长度为1095bp(1083bp的目标DNA区段加上引物上附加的两个限制性酶切位点12bp)的DNA片段。将回收的PCR产物连接到T-A克隆载体pGEMT-vector上(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，利用载体上T7和SP6引物对该PCR产物进行测序验证，将包含该PCR产物的重组质粒命名为TA-SPL7。
实施例3：SPL7基因的超量表达载体构建
用KpnI和BamHI双酶切质粒TA-SPL7(所述的KpnI和BamHI购买自宝生物工程大连有限公司，具体用法与用量参考该公司相应产品的说明书，质粒TA-SPL7来自实施例2，如图3中的A图所示)，回收包含SPL7基因的蛋白质编码区的1095bp的DNA片段，然后与经过KpnI和BamHI双酶切的载体质粒pCAMBIA1301S利用T4DNA连接酶(购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。载体pCAMBIA1301S是被公开报道过(Zhou etal.,Over-expression of aspartate aminotransferase genes in rice resulted inaltered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds.TheorAppl Genet,2009,118:1381-1390)的载体，其基本骨架来源于澳大利亚CAMBIA实验室(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的pCAMBIA1301，通过加入35S启动子实现对转化基因的表达调控，其结构如图3中的B图所示。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加400μl LB培养基复苏45min，涂于含50mg/L的卡那霉素的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16h(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过KpnI和BamHI双酶切筛选阳性克隆，并将所得的表达载体命名为35S:SPL7OE，其结构如图4所示。
实施例4：转基因水稻的获得
将表达载体35S:SPL7OE(来自实施例3)通过农杆菌EHA105介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购买自丹麦的罗氏制药有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田，得到转基因植株。农杆菌遗传转化的方法和所用的试剂及配方是根据Hiei等人的报道优化而来(Hiei et al.,Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282；Lin and Zhang,Optimising the tissueculture conditions for high efficiency transformation of indica rice.PlantCell Rep,2005,23:540-548)。
本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：
(1)试剂和溶液缩写
6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)
(2)主要溶液配方
1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]
逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]
室温下溶解并定容至1000ml。
3)Fe2-EDTA贮存液(100X)
在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g
在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73g
在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MSmax母液(10X)
室温下溶解并定容至1000ml。
6)MSmin母液(100X)
室温下溶解并定容至1000ml。
7)2,4-D贮存液(1mg/ml)
2,4-D 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)
6-BA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
9)NAA贮存液(1mg/ml)
NAA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
10)IAA贮存液(1mg/ml)
IAA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)
葡萄糖 125g
蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液
AS 0.392g
DMSO 10ml
分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
氢氧化钾(KOH)5.6g
蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。
14)KT贮存液(1mg/ml)
KT 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
(3)培养基配方
1)诱导培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
5)悬浮培养基
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlAS贮存液。
6)选择培养基
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)
蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。
本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化的步骤如下：
(1)愈伤诱导
1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(HgCl2)15min
2)灭菌水洗种子4-5次；
3)将种子放在诱导培养基上；
4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。
(2)愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。
(3)预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4d，温度26±1℃。
(4)农杆菌培养
1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA1052d，温度28℃；
2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3h。
(5)农杆菌侵染
1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；
2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；
3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；
4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2d，温度19-20℃。
(6)愈伤洗涤和选择培养
1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30min；
3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)
(7)分化
1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7d；
2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5－7周。
(8)生根
1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；
2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
(9)移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载至大田。
实施例5：转基因水稻的鉴定与表型观察
抽提T0代35S:SPL7OE转化植株(来自实施例4)叶片的总DNA，然后用PCR方法对超表达SPL7的T0代转化植株进行阳性检测。
PCR阳性检测利用β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的引物进行，GUS引物的序列如下：
GUS-F(正向引物):5'-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3'，
GUS-R(反向引物):5'-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC-3'；
DNA抽提方法为CTAB法(Zhang et al.,Genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis.TheorAppl Genet,1992,83:495-499)。以水稻35S:SPL7OE转化植株叶片总DNA为模板，用引物GUS-F和GUS-R进行PCR扩增。PCR反应总体积为20μl，包含DNA模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物GUS-F和GUS-R各0.3μl，rTaq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃1min，⑤从②－④循环38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。
PCR检测结果表明，GUS阳性的转基因植株相对于阴性植株而言，全部表现为分蘖减少、穗部枝梗减少和穗粒数减少，其表型见图5。
为了进行表型统计分析，申请人对T0代阳性植株分单株收种子，并且继续种植T1代的转基因材料，对T1代的植株也进行GUS基因的PCR扩增以检测分离单株的阴阳性，进行转基因事件和表型变化的共分离检测，以及统计表型数据。申请人将3个独立转化而来的35S:SPL7OE的T0植株的种子经过浸种、催芽后播种于秧田，20d以后移栽至大田获得T1代转基因植株。种植密度为15厘米×24厘米，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，在一个有安全防护设施条件下按常规的水稻种植方法进行田间管理。利用PCR的方法检测GUS基因进行阴阳性鉴定，并且分析PCR检测结果与表型的对应关系。分析结果表明在T1代分离出来的所有GUS阳性单株相对于阴性单株而言，全部表现为分蘖减少、穗部枝梗减少和穗粒数减少，表明SPL7的转基因事件同本发明所指的株型变化(分蘖减少、穗部枝梗减少和穗粒数减少)是共分离的。考察和记录T1代相关植株的表型变化的数据，包括分蘖数、每穗一次枝梗数、每穗二次枝梗数和每穗颖花数，并以每个家系分离出来的的GUS阴性单株为对照，分别进行统计学分析，其结果见表2。
表2超量表达35S:SPL7OE(SPL7OE)的T1代阳性和阴性单株的表型统计值
表2的说明：(+)和(-)分别表示转基因阳性和阴性单株。利用t测验进行统计学分析，a,b,c分别表示P<0.05,0.01和0.001的显著水平。
实施例6：转基因水稻中SPL7基因的表达量分析
除了利用GUS引物进行PCR扩增检测35S:SPL7OE转基因植株的阴阳性外，申请人还进一步利用实时荧光定量PCR的方法检测了转基因植株中SPL7基因的表达量。其具体的操作方法同实施例1所述。
利用购买自Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒抽提来自野生型中花11和转基因阳性植株叶片的RNA(具体操作步骤见试剂盒说明书)，利用实施例1所述的反转录的方法合成cDNA的第一链，然后利用下述引物进行实时荧光定量PCR检测，实时荧光定量PCR的方法也如实施例1所述。
所用到的引物：
SPL7QRTF(正向引物)：5'-CTGCTGCTGTGTAACGACGCTA-3'，
SPL7QRTR(反向引物)：5'-GCACACGGACGGACCTATGTGTAA-3'；
UbiF(正向引物):5'-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3'，
UbiR(反向引物):5'-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3'；
其中引物组合SPL7QRTF和SPL7QRTR扩增的是SPL7基因，而引物组合UbiF和UbiR扩增的是ubiquitin基因。利用ubiquitin基因的表达量作为实时荧光定量PCR的平衡化内参，并且将SPL7基因在野生型中花11中的相对表达量设置为1。实时荧光定量PCR的结果见图6，其表明SPL7基因在35S:SPL7OE的转基因植株上调表达。

Claims (4)

1.一种SPL7基因在调控水稻株型中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.一种SPL7基因在调控水稻株型中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种植物表达载体35S:SPL7OE，其特征在于，该载体包含有权利要求1所述的SPL7基因的CDS序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
4.一种改良水稻的方法，包括构建植物表达载体和农杆菌介导的遗传转化，其特征在于，所述的方法为包括通过超量表达SPL7基因，改良包括减少分蘖数、减少穗部枝梗数和减少穗粒数，或者与采用与SPL7基因具有90％以上同源性的基因，通过***、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或其衍生物来转化水稻。
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